Artykuł badawczy

Ekspresja, znaczenie kliniczne i rola w ocenie skuteczności immunoterapii cząsteczki kostymulującej LLT1 w raku żołądka

618 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68827

⸱

10 października 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 2Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 3Jiangsu Institute of Clinical Immunology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 4Jiangsu Key Laboratory of Clinical Immunology, Soochow University, 5Jiangsu Key Laboratory of Gastrointestinal Tumor Immunology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym badaniu bada się LLT1 jako biomarker immunoterapii predykcyjnej w raku żołądka za pomocą multiomiki i analiz klinicznych. Badanie ocenia rolę LLT1 w unikaniu odpowiedzi immunologicznej i modulacji mikrośrodowiska guza, aby ułatwić precyzyjne podejście do immunoterapii w celu poprawy wyników leczenia.

Streszczenie

LLT1 to nowa cząsteczka immunologicznego punktu kontrolnego i potencjalny cel terapeutyczny. Immunoterapia poprawiła wyniki w zaawansowanym raku żołądka; Jednak wielu pacjentów nie reaguje na leczenie lub rozwija się oporność, brakuje też biomarkerów predykcyjnych. Rola LLT1 w unikaniu odpowiedzi immunologicznej przez raka żołądka i jego wpływ na odpowiedź immunoterapeutyczną pozostają niejasne. Aby to ocenić, ekspresję LLT1 przeanalizowano w zestawie danych gruczolakoraka żołądka Cancer Genome Atlas (TCGA) przy użyciu wielu algorytmów (TIMER, CIBERSORT i ESTIMATE) w celu ilościowego określenia infiltracji komórek odpornościowych. Ekspresję białek zwalidowano za pomocą immunohistochemii (IHC) w 268 próbkach gruczolakoraka żołądka oraz za pomocą immunofluorescencji multipleksowej (MIF) w 115 tkankach po immunoterapii. Zintegrowane dane transkryptomiczne i proteomiczne przeanalizowano pod kątem powiązań z cechami mikrośrodowiska guza i wynikami immunoterapii klinicznej. Wyniki wykazały, że wysoka ekspresja białka LLT1 była istotnie związana z mniej zaawansowanymi cechami guza (mniejsza głębokość inwazji i przerzuty do węzłów chłonnych; P < 0,05) i dłuższe przeżycie całkowite (P = 0,012). Poziomy mRNA i białka LLT1 korelowały z większą infiltracją limfocytów T CD8 + i makrofagów M1 oraz podwyższoną ekspresją PD-L1 w mikrośrodowisku guza. W pierwszej kohorcie 198 pacjentów z dostępnymi danymi prognostycznymi, pacjenci z wysoką ekspresją LLT1 (n = 117) wykazywali istotnie dłuższe przeżycie całkowite w porównaniu z osobami z niską ekspresją (n = 81). W drugiej kohorcie pacjentów leczonych skojarzoną immunoterapią i chemioterapią nowotwory z wysoką ekspresją LLT1 (n = 48) miały dłuższe przeżycie wolne od progresji (P = 0,014) niż te z niską ekspresją LLT1 (n = 67). U pacjentów skutecznych w immunoterapii (n=62) w porównaniu z pacjentami opornymi na leczenie (n=53) zaobserwowano istotny wzrost (P < 0,05) populacji komórek odpornościowych PD-1+CD161+. Podsumowując, ekspresja LLT1 jest obiecującym biomarkerem korzystnego rokowania w raku żołądka. Według naszej wiedzy jest to pierwsze badanie, które wykazało, że ekspresja LLT1 przewiduje poprawę odpowiedzi na skojarzoną chemioterapię i immunoterapię w raku żołądka, co potwierdza jej potencjał w kierowaniu strategiami immunoterapeutycznymi.

Wprowadzenie

Rak żołądka i przełyku, w szczególności rak żołądka (GC), wyróżnia się tym, że jestpiątą najczęstszą postacią raka na świecie ipiątą najbardziej śmiertelną. Globalne statystyki pokazują, że każdego roku identyfikuje się około 1 miliona nowych przypadków, przy czym Azja Wschodnia ponosi nieproporcjonalną część choroby, przyczyniając się do ponad połowy globalnej zachorowalności1. W przypadku osób, u których zdiagnozowano GC we wczesnym stadium, perspektywa przeżycia jest znacznie korzystna, a ponad 90% osiąga 5-letnie wskaźniki przeżycia po endoskopowym rozwarstwieniu podśluzówkowym (ESD) lub radykalnej interwencji chirurgicznej2. Jednak subtelne przedstawienie początkowych objawów często prowadzi do rozpoznania miejscowo zaawansowanej lub przerzutowej fazy 3,4. Perspektywy dla pacjentów w tych zaawansowanych stadiach są tragiczne, a ci, którzy nie są leczeni, doświadczają mediany całkowitego przeżycia (OS) wynoszącej zaledwie 6 miesięcy. Nawet przy podawaniu skojarzonych schematów chemioterapii opartych na fluorouracylu i platynie, mediana OS jest jedynie wydłużona do okołoroku 5.

Ostatnio nastąpiła znacząca zmiana w leczeniu raka żołądka w późnym stadium, dzięki nowym lekom zwanym inhibitorami immunologicznych punktów kontrolnych. Są one podobne do magicznej kuli dla komórek rakowych, które mają pewien marker, PD-L1, pojawiający się na nich - co najmniej wynik 1 w skali Combined Positive Score (CPS). Terapie te są również bardzo skuteczne w przypadku nowotworów, które są wymieszane w swoim DNA, co nazywa się wysoką niestabilnością mikrosatelitarną (MSI-H). To nowe podejście sprawia, że pacjenci mają więcej czasu 6,7. Kluczowe badania kliniczne wskazują, że w kohorcie PD-L1-dodatniej osoby z CPS 10 lub wyższym uzyskują wyraźniejszy wzrost przeżycia po leczeniu przeciwciałami monoklonalnymi PD-1 8,9. Niemniej jednak obecna immunoterapia nadal stoi przed wieloma wyzwaniami klinicznymi: obiektywnymi wskaźnikami odpowiedzi (ORR) na ogół poniżej 20%, wskaźnikami oporności wtórnej sięgającymi 40%-60%, niedoskonałymi systemami przewidywania biomarkerów (istniejące biomarkery mogą zidentyfikować tylko 30%-40% potencjalnych beneficjentów) oraz trudnościami w radzeniu sobie ze zdarzeniami niepożądanymi związanymi z odpornością (irAEs)10,11,12,13,14. Chociaż podwójna blokada immunologicznego punktu kontrolnego (np. połączone hamowanie PD-1/CTLA-4) lub schematy chemoimmunoterapii mogą zwiększyć wskaźniki odpowiedzi do 40%-60%, około połowa pacjentów nadal nie osiąga trwałych korzyści klinicznych15. W związku z tym ustanowienie precyzyjnych systemów klasyfikacji opartych na cechach multiomicznych, odkrycie nowych biomarkerów predykcyjnych oraz identyfikacja nowych immunologicznych punktów kontrolnych stały się kluczowymi kierunkami badań mających na celu poprawę wyników klinicznych immunoterapii GC.

Lektynopodobny transkrypt 1 (LLT1) jest białkiem związanym z lektyną typu C, z CD161, składnikiem rodziny receptorów komórek NK (natural killer), który służy jako zidentyfikowany partner wiążący. Gen CLEC2D, który jest odpowiedzialny za jego syntezę, daje początek pięciu odrębnym izoformom poprzez alternatywne zdarzenia splicingu, które omijają niektóre eksony. Wariant 1, znany jako LLT1, został zatwierdzony jako jedyny wariant obecny na błonie komórkowej16,17. Ekspresję LLT1 obserwuje się głównie w różnych typach komórek odpornościowych, takich jak limfocyty B, komórki NK, komórki dendrytyczne (DC), specyficzne populacje komórek T (w tym aktywowane i regulatorowe limfocyty T), monocyty i makrofagi, a także obserwuje się ją w niektórych komórkach nowotworowych i podczas epizodów zapalnych18. Wstępne wyniki wskazują, że LLT1 jest regulowany w górę w komórkach DC i B po stymulacji receptora Toll-podobnego (TLR). Wykazano, że zaangażowanie LLT1 w CD161 hamuje cytotoksyczność za pośrednictwem komórek NK, co sugeruje jej udział w modulowaniu odpowiedzi immunologicznej18. W komórkach B ekspresja LLT1 jest zwiększona przez infekcję wirusową lub stymulację zapalną. Działając jako komórki prezentujące antygen (APC), interakcja LLT1-CD161 wywiera podwójne działanie immunomodulujące poprzez tłumienie funkcji komórek NK przy jednoczesnej stymulacji proliferacji komórek T lub produkcji IFN-γ19.

Wiadomo, że LLT1 jest obecny w wielu komórkach rakowych, w tym w potrójnie ujemnym raku piersi, glejaku i chłoniaku nieziarniczym z komórek B. Białko to angażuje się w receptor CD161 znajdujący się na komórkach NK, skutecznie blokując ich zdolność do niszczenia komórek rakowych, pomagając w ten sposób w unikaniu odpowiedzi immunologicznej 20,21,22. Godną uwagi obserwacją w raku płaskonabłonkowym jamy ustnej i gardła HPV-ujemnym jest zmienna ekspresja LLT1, która zgodnie z badaniami immunohistochemicznymi wskazuje na pozytywne znaczenie prognostyczne w przypadku wysokiej ekspresji w trzeciorzędowych strukturach limfatycznych (TLS), podczas gdy jej obecność na komórkach nowotworowych wiąże się z gorszym wynikiem23. Ponadto, w kontekście niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC), LLT1 nie jest wykrywany w samych komórkach nowotworowych, ale znajduje się w mikrośrodowisku guza (TME), a jego poziom ekspresji mRNA wiąże się z lepszym rokowaniem24.

Jak wykazano przez Mathewson i in. w badaniach nad glejakiem, blokowanie CD161 zwiększa zabijanie komórek glejaka za pośrednictwem limfocytów T in vitro i poprawia ich funkcję przeciwnowotworową in vivo, podkreślając potencjał terapeutyczny CD161 jako celu immunologicznego punktu kontrolnego25. Biorąc pod uwagę, że LLT1 jest kanonicznym ligandem CD16118, jego rola jako celu immunoterapeutycznego wymaga poważnego rozważenia. Analogicznie do krytycznej interakcji między PD-1 i PD-L1 w immunoterapii, badanie biologicznych funkcji LLT1 w raku żołądka i jego korelacji z wynikami immunoterapii ma istotną wartość kliniczną.

Badanie to zapewnia kompleksową analizę wzorców ekspresji LLT1 w mikrośrodowisku guza raka żołądka, integrując zarówno badania na poziomie mRNA, jak i białka. Systematycznie ocenia potencjał LLT1 jako biomarkera prognostycznego w zaawansowanym raku żołądka i ocenia jego wartość predykcyjną dla skuteczności immunoterapii. Te spostrzeżenia przyczyniają się do głębszego zrozumienia jego klinicznego potencjału translacyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania z udziałem ludzi zostały ocenione i zatwierdzone przez Komisję Etyczną Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Soochow (Zatwierdzenie nr 2019026). Komisja ds. oceny etycznej Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Soochow zatwierdziła lub przyznała zwolnienie z oceny etycznej tego wykorzystania danych. Dodatkowo uzyskano świadomą zgodę od wszystkich uczestników.

Analiza danych bioinformatycznych
Po dokładnym badaniu analizy ekspresji raka w bazach danych TCGA i Tumor IMmune Estimation Resource (TIMER), zbadano zachowanie LLT1 w różnych typach raka, ze szczególnym uwzględnieniem raka żołądka. Baza danych TISIDB została wykorzystana do zbadania korelacji między poziomami ekspresji LLT1 a różnymi podtypami molekularnymi raka żołądka. Korelacja między charakterystyką kliniczną pacjentów a ekspresją LLT1 była dalej analizowana za pomocą danych TCGA za pomocą programowania R. Analizy GO i KEGG wykorzystano do zbadania funkcjonalnej roli LLT1 w kancerogenezie żołądka. Algorytm ESTIMATE (Estimation of STromal and Immune cells in MAlignant Tumor tissues using Expression data) został dodatkowo wykorzystany do ilościowego określenia poziomów naciekania komórek immunologicznych i zrębowych w tkankach nowotworowych zgodnie ze wzorcami ekspresji LLT1. Przeprowadzono dalszą analizę z wykorzystaniem algorytmu CIBERSORT w celu oceny korelacji między poziomami ekspresji LLT1 a specyficznymi wzorcami infiltracji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza. Przeprowadzono kompleksową analizę bioinformatyczną przy użyciu zestawów danych TCGA i programowania statystycznego R (v4.4.1) w celu zbadania potencjalnych korelacji między profilami ekspresji LLT1 a biomarkerami immunoregulacyjnymi. Na koniec wykorzystano bazę danych TCIA (The Cancer Immunome Atlas) do zbadania, czy ekspresja LLT1 może przewidywać odpowiedź na terapię blokującą immunologiczne punkty kontrolne PD-1/PD-L1.

Próbki GAC i budowa mikromacierzy tkankowych (TMA)
Wygenerowano dwa zestawy danych z mikromacierzy tkankowych w następujący sposób:

W pierwszym zestawie retrospektywnie przeanalizowano próbki od 268 pacjentów z GAC, którzy przeszli operację w 2011 roku. Patolodzy wybrali bloki parafiny, zidentyfikowali obszary rdzenia guza i skonstruowali je w mikromacierze tkankowe. Każdemu pojedynczemu miejscu próbki przypisano odrębny identyfikator w celu skrupulatnego monitorowania powiązanych parametrów klinicznych, takich jak płeć, wiek, wymiary nowotworu, stopień zróżnicowania nowotworu, faza progresji raka, głębokość inwazji, zajęcie limfy i obecność odległego rozprzestrzeniania się. Czas trwania przeżycia całkowitego (OS) zdefiniowano jako odstęp czasu od rozpoczęcia leczenia do wystąpienia śmiertelności lub daty granicznej grudnia 2017 r. Należy podkreślić, że kompleksowe dane dotyczące systemu operacyjnego były dostępne tylko dla podzbioru 198 uczestników.

Druga grupa obejmowała 115 nieleczonych wcześniej pacjentów z zaawansowanym GC, którzy przeszli chirurgiczną/endoskopową resekcję w Pierwszym Szpitalu Stowarzyszonym Uniwersytetu Soochow w latach 2016-2023. Patolodzy ocenili bloki parafiny i skonstruowali mikromacierze tkankowe ze ścisłym śledzeniem postępu choroby. Warto zauważyć, że wszystkie próbki zostały pobrane przed jakimkolwiek leczeniem przedoperacyjnym, a leczenie pooperacyjne składało się głównie z przeciwciał monoklonalnych PD-1 w połączeniu z chemioterapią.

Wszystkie wycinki z resekcji chirurgicznej pobrano z antrum żołądka. Wszystkie próbki utrwalono w obojętnej buforowanej formalinie i zatopiono w parafinie. Na podstawie oceny skrawków wybarwionych H&E dwóch starszych patologów niezależnie zidentyfikowało najbardziej reprezentatywne regiony tkanek z próbek zanurzonych w parafinie. Mikromacierze tkankowe (TMA) zostały zbudowane przy użyciu zautomatyzowanej macierzy tkankowej, z rdzeniami tkanek precyzyjnie umieszczonymi w blokach TMA zgodnie z predefiniowanymi modułami. Finalnie gotowe bloki TMA zostały przecięte na kawałki o grubości 4 μm przez doświadczonego histotechnologa.

Immunohistochemia (IHC) i immunofluorescencja multipleksowa (mIHC)
Testy immunohistochemiczne i immunofluorescencyjne multipleksowe przeprowadzono na skonstruowanej mikromacierzy tkankowej. Barwienie IHC przeprowadzono zgodnie z wcześniej ustaloną metodologią26. Pierwszy zestaw skrawków parafiny mikromatrycy przeniesiono na szkiełka podstawowe i wypalono w temperaturze 72°C przez 1 godzinę. Po odparafinowaniu skrawków ksylenem i ponownym uwodnieniu w kolejno zwiększających się rozcieńczeniach etanolu, aktywność endogennej peroksydazy została zablokowana przez zastosowanie roztworu blokującego peroksydazę na 30 minut. Pobieranie antygenu przeprowadzono przez gotowanie szkiełek w temperaturze 110 °C w roztworze do pobierania antygenu cytrynianowego (pH 6,0) przez 3 minuty. Po zablokowaniu 5% buforem blokującym BSA, skrawki inkubowano z mysim anty-ludzkim monoklonalnym CLEC2D, mysim anty-ludzkim monoklonalnym CD3 (gotowym do użycia), mysim anty-ludzkim monoklonalnym CD4 (gotowym do użycia), króliczym anty-ludzkim monoklonalnym CD8 (gotowym do użycia), mysim anty-ludzkim monoklonalnym CD11c (1:50) mysim anty-ludzkim monoklonalnym CD19 (gotowym do użycia), mysim anty-ludzkim monoklonalnym CD31 (gotowym do użycia), mysi anty-ludzki monoklonalny CD56 (gotowy do użycia), mysi anty-ludzki monoklonalny CD68 (gotowy do użycia), królik anty-ludzki monoklonalny Foxp3 (1:50), mysi anty-ludzki monoklonalny IL-17 (1:50), mysi anty-ludzki monoklonalny IFN-γ (1:50), mysi anty-ludzki monoklonalny Ki67 (1:50), mysi anty-ludzki monoklonalny PD-L1 (gotowy do użycia) w temperaturze 4 °C przez noc27,28. Szkiełka zostały następnie umyte i inkubowane z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi peroksydazą chrzanową (anty-mysz i królik) w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po inkubacji próbki zostały umyte, a do immunodetekcji wykorzystano system detekcji EnVision. Pod mikroskopem, gdy na chipie zaczynają pojawiać się brązowe obszary, wymagana jest uważna obserwacja. Reakcję chromogenną należy zatrzymać, gdy brązowe obszary przestaną się powiększać. Szkiełka zostały wybarwione hematoksyliną Mayera i zamontowane za pomocą neutralnego kleju. W kontroli ujemnej zamiast przeciwciała pierwszorzędowego zastosowano mysią lub króliczą IgG. Kontrolą pozytywną była ludzka tkanka migdałków. Drugi zestaw skrawków mikromacierzy służy do immunohistochemii multipleksowej (mIHC). Wykorzystując wyżej wymienione warunki pobierania i blokowania antygenu, panel przeciwciał jest optymalizowany spektralnie w następujący sposób: PD-L1 (480 nm), CD161 (520 nm), LLT1 (570 nm), PD-1 (620 nm), CD8 (690 nm) i PAN-CK (780 nm). Przeciwciała pierwszorzędowe inkubowano w tych samych warunkach, co w pierwotnym protokole29 (z wyjątkiem PANCK i CD161, które zostały nowo wprowadzone), w zalecanym rozcieńczeniu 1:100, a następnie nastąpiło barwienie fluorescencyjne ze wzmocnieniem sygnału tyramidowego (TSA). Po każdej rundzie barwienia fluorescencyjnego przeprowadza się usuwanie przeciwciał, a następnie wielokrotne pobieranie antygenu, blokowanie endogennej peroksydazy i blokowanie nieswoistego celu przed inkubacją następnego przeciwciała pierwotnego. Podczas wykonywania immunohistochemii multipleksowej kluczowe są trzy punkty: należy przeprowadzić eksperymenty wstępne dla każdego barwnika fluorescencyjnego, silnie wyrażone przeciwciała powinny być sparowane ze słabymi sygnałami fluorescencyjnymi, podczas gdy słabo wyrażone przeciwciała powinny być sparowane z silnymi sygnałami fluorescencyjnymi, a po wybarwieniu każdego markera fluorescencyjnego wyniki barwienia należy obserwować pod mikroskopem w warunkach ochrony przed światłem. Po wybarwieniu6-tym barwnikiem fluorescencyjnym, do znakowania jąder komórkowych nakłada się barwienie przeciwstawne DAPI, a następnie montuje się szkiełka. Na koniec wszystkie mikromacierze tkankowe zostały zeskanowane za pomocą cyfrowego skanera patologicznego i przeanalizowane za pomocą oprogramowania do cyfrowej analizy obrazów patologicznych opartego na sztucznej inteligencji.

Ocena barwienia IHC/mIHC
Wyniki barwienia zostały zinterpretowane przez dwóch ekspertów patologów w sposób podwójnie ślepej próby. Zmierzyli głębokość barwienia za pomocą obiektywu o dużej mocy (200-krotne powiększenie) lub pasującego ustawienia fluorescencyjnego (200x), przypisując punkty w zakresie od 0 (brak barwienia) do 3 (intensywne barwienie). Frakcje komórek LLT1-dodatnich w próbkach raka żołądka podzielono na cztery stratyfikacje: 0 (<5%), 1 (5-25%), 2 (26-50%) i 3 (>50%). Wynik immunoreaktywności (IRS) uzyskano na podstawie iloczynu głębokości barwienia i proporcji komórek LLT1-dodatnich. Próbki, które uzyskały zero punktów, były uważane za negatywne, podczas gdy wyniki 1-4 wskazywały na słabą ekspresję, 5-7 na umiarkowaną i 8-9 na silną ekspresję; te same kryteria zastosowano do oceny ekspresji innych markerów, takich jak Ki67 i CD3. W oparciu o metodologię oceny i grupowania, próbki oznaczono jako mające silną (IRS8-9), umiarkowaną (IRS5-7), słabą (IRS1-4) lub bez ekspresji (IRS0). Pacjenci z najniższymi wynikami (IRS≤4) zostali przypisani do grupy o niskiej ekspresji, a ci z wyższymi wynikami (IRS≥5) zostali przypisani do grupy o wysokiej ekspresji.

Jednak w przypadku markera PD-L1 przyjęto inne podejście przy użyciu CPS. Wynik ten został określony na podstawie stosunku komórek PD-L1-dodatnich (w tym komórek nowotworowych, immunologicznych i zrębowych) do całkowitej liczby żywotnych komórek nowotworowych przeskalowanych 100-krotnie. Osoby z CPS przekraczającym pięć zostały umieszczone w kohorcie o wysokiej ekspresji, podczas gdy osoby z CPS wynoszącym pięć lub mniej zostały zgrupowane w kohorcie o niskiej ekspresji.

Grupowanie odpowiedzi na immunoterapię
Zgodnie z kryteriami oceny odpowiedzi w guzach litych w wersji 1.1 (RECIST 1.1), ocena docelowych zmian u pacjentów dzieli się na cztery odrębne kategorie: (a) Odpowiedź całkowita (CR): wszystkie zmiany docelowe całkowicie zniknęły, a krótka oś wszystkich patologicznych węzłów chłonnych (zarówno docelowych, jak i niedocelowych) musi mieć mniej niż 10 mm; b) Odpowiedź częściowa (PR): łączna średnica wszystkich możliwych do zmierzenia docelowych zmian chorobowych zmniejszyła się o co najmniej 30% w stosunku do pomiarów wyjściowych; c) postępująca choroba (PD): kategoria ta ma zastosowanie, gdy łączna średnica docelowych zmian chorobowych zwiększyła się o co najmniej 20 % w porównaniu z najmniejszą wartością zarejestrowaną podczas badania (przy użyciu linii podstawowej jako punktu odniesienia, jeśli reprezentuje ona najmniejszą wartość), przy czym bezwzględny wzrost wynosi nie mniej niż 5 mm; dodatkowo pojawienie się nowych zmian jest również klasyfikowane jako choroba postępująca (PD); (d) Stabilna choroba (SD): skumulowana średnica docelowych zmian chorobowych nie spełnia kryteriów redukcji PR ani kryteriów wzrostu PD w całym badaniu. Zastosowano dwie techniki stratyfikacji. Pierwsza metoda polegała na segregacji pacjentów na podstawie ich statusu odpowiedzi, przy czym pacjenci z PD (n=53) i SD (n=46) stanowili grupę nieodpowiadającą (n=99), podczas gdy pacjenci z PR (n=15) i CR (n=1) tworzyli grupę odpowiadającą (n=16). Drugie podejście polegało na kategoryzacji pacjentów według progresji choroby, przy czym pacjenci z CR, PR i SD zostali sklasyfikowani jako kohorta skuteczna w immunoterapii (n = 62), a pacjenci z PD jako kohorta nieskuteczna w immunoterapii (n = 53).

Analiza statystyczna
Oceny empiryczne przeprowadzono przy użyciu platformy obliczeniowej R (wersja 4.4.1) i pakietu oprogramowania SPSS Statistical (wersja 27.0). Rozbieżności między badanymi kohortami badano poprzez zastosowanie analizy tabeli kontyngencji chi-kwadrat. Technika korelacji nieparametrycznej Spearmana została wykorzystana do zbadania siły i kierunku powiązań między zmiennymi. Różnice w czasie przeżycia analizowano za pomocą konstrukcji estymatorów Kaplana-Meiera uzupełnionych testami logarytmicznymi dla istotności. Następnie wykorzystano modele regresji proporcjonalnego hazardu Coxa w celu zidentyfikowania czynników potencjalnie wpływających na wyniki przeżycia pacjentów. Istotność statystyczna została wstępnie zdefiniowana jako dwustronny próg wartości p wynoszący <0,05. Aby zapewnić wiarygodność wyników, przeprowadzono kompleksowe analizy wrażliwości w celu oceny potencjalnych zmiennych zakłócających, a następnie odpowiednio dostosowano modele wielowymiarowe. Ponadto przedstawiono wyraźne interpretacje współczynników ryzyka, aby ułatwić zrozumienie kliniczne, kładąc nacisk na praktyczne implikacje zidentyfikowanych czynników ryzyka dla rokowania pacjentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Związek między ekspresją mRNA CLEC2D a podklasyfikacją raka żołądka/parametrami klinicznymi
Wstępne kompleksowe badanie raka z wykorzystaniem zestawu danych TCGA, ułatwione przez bazę danych TIMER, wykazało znaczny wzrost poziomów transkryptów CLEC2D w różnych tkankach nowotworowych, jak pokazano na rysunku 1A. Obserwacja ta sugeruje, że CLEC2D może służyć jako ogólny czynnik onkogenny zaangażowany w patogenezę...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nasze badanie wykazało wyższą ekspresję mRNA CLEC2D w tkankach nowotworowych niż w normalnych tkankach. Wyniki immunohistochemiczne raka żołądka wykazały, że wysoka ekspresja białka LLT1 w tkankach nowotworowych wiązała się z lepszym rokowaniem i dodatnio korelowała z infiltracją komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza. Analiza tkanek pobranych od pacjentów z rakiem żołądka otrzymujących immunoterapię wykazała, że wysoka ekspresja LLT1 przewiduje lepszą odpowiedź immunologiczną. Nasze badania dotyczyły ek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają potencjalnego konfliktu interesów.

Podziękowania

Podziękowania są również kierowane do bazy danych TCGA za zapewnienie wsparcia w zakresie danych. Badanie to było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr 81974375) oraz Granty Planu Rozwoju Nauki i Technologii Suzhou (SKY2022129). Badanie jest zgodne z wytycznymi ARRIVE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5% bufor blokujący BSABeijing Solarbio Nauka & Technology Co., Ltd., ChinyZobacz materiał SW3015
anty-CD11c ZSGB-BIO, Chiny5D11 powiedział:
Anty-CD161Abcam, Cambridge, Wielka Brytaniaab302564 powiedział:
anty-CD19   ZSGB-BIO, ChinyEPl69 powiedział:
anty-CD3 ZSGB-BIO, ChinyLNl0 powiedział:
anty-CD31ZSGB-BIO, Chiny  UMAB30 powiedział:
anty-CD4ZSGB-BIO, ChinyUMAB64 powiedział:
anty-CD56 ZSGB-BIO, ChinyUMAB83 powiedział:
anty-CD68 ZSGB-BIO, ChinyZobacz materiał KP1
Anty-CD8ZSGB-BIO, ChinyEP334 powiedział:
Powłoka anty-CLEC2DAbcam, Cambridge, Wielka Brytaniaab197341 powiedział:
anty-Foxp3 powiedział:R& D Systems, Stany Zjednoczone1054C
anty-IFN-γ  Biotechnologia Santa CruzSC-74108
anty-IL-17R& D Systems, Stany Zjednoczone  MAB317 
anty-Ki67 ZSGB-BIO, Chiny8H5
Anty-pan Cytokeratyna Abcam, Cambridge, Wielka Brytaniaab7753 powiedział:
Anty-PD-1Abcam, Cambridge, Wielka Brytaniaab137132 powiedział:
Anty-PD-L1DAKO, DaniaZobacz materiał 22C3
Zautomatyzowany sprzęt do macierzy tkankowejEstigen OU, Tartu, EstoniaBeecher ATA 27Przyrząd ten jest używany przede wszystkim do budowy mikromacierzy tkankowych.
Roztwór do odzyskiwania antygenu cytrynianowegoAladdin Biochemical Technology Co., Ltd, ChinyC752119
Zestaw chromogenów DAB AiFang Biological, ChinyAFIHC004
Cyfrowy skaner patomorfologicznyNingbo Jiangfeng Bio-Information Technology Co., Ltd, ChinyKF-FL-020Przyrząd ten jest używany przede wszystkim do skanowania chipów immunohistochemicznych i multipleksowych układów immunohistochemicznych.
Pryzmat GraphPad 10Oprogramowanie GraphPad, Stany ZjednoczoneWersja 10.0.3To oprogramowanie służy do wykreślania krzywych Kaplana-Meiera (z analizą statystyczną log-rank), wizualizacji danych naukowych i przygotowywania figur.
PBSAladdin Biochemical Technology Co., Ltd, ChinyP743267
Roztwór blokujący peroksydazęAiFang Biological, ChinyAFIHC012
Przeciwciało wtórne przeciwko myszom/królikowi sprzężone z polimerem HRPAiFang Biological, ChinyAFIHC001
Sześciokolorowy, siedmiomarkerowy multipleksowy zestaw do barwienia immunofluorescencyjnegoAiFang Biological, ChinyAFIHC037Ten zestaw odczynników jest przeznaczony do immunohistochemii multipleksowej (mIHC)
SPSSIBM Corporation, Stany ZjednoczoneIBM SPSS Statistics 27Oprogramowanie zostało wykorzystane do analizy statystycznej danych.
Projekt RPodstawowy zespół języka RWersja 4.4.1Wszystkie pakiety języka R, powiązany kod i oryginalne pliki zostały przekazane do publicznej bazy danych.
Oprogramowanie VISIOPHARMVisiopharm, Dania2025.02.2.18022 x64To oprogramowanie jest przeznaczone przede wszystkim do ilościowej analizy obrazów patologicznych.

Bibliografia

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  2. Suzuki, H., et al. Long-term survival after endoscopic resection for gastric cancer: Real-world evidence from a multicenter prospective cohort. Clin Gastroenterol Hepatol. 21 (2), 307-318.e2 (2023).
  3. Ma, S., et al. Clinical application and detection techniques of liquid biopsy in gastric cancer. Mol Cancer. 22 (1), 7(2023).
  4. Ugai, T., et al. Is early-onset cancer an emerging global epidemic? Current evidence and future implications. Nat Rev Clin Oncol. 19 (10), 656-673 (2022).
  5. Wagner, A. D., et al. Chemotherapy for advanced gastric cancer. Cochrane Database Syst Rev. 8 (8), Cd004064(2017).
  6. Chao, J., et al. Assessment of pembrolizumab therapy for the treatment of microsatellite instability-high gastric or gastroesophageal junction cancer among patients in the keynote-059, keynote-061, and keynote-062 clinical trials. JAMA Oncol. 7 (6), 895-902 (2021).
  7. Lee, K. W., et al. Association of tumor mutational burden with efficacy of pembrolizumab±chemotherapy as first-line therapy for gastric cancer in the phase III Keynote-062 study. Clin Cancer Res. 28 (16), 3489-3498 (2022).
  8. Wainberg, Z. A., et al. Efficacy of pembrolizumab monotherapy for advanced gastric/gastroesophageal junction cancer with programmed death ligand 1 combined positive score ≥10. Clin Cancer Res. 27 (7), 1923-1931 (2021).
  9. Zhao, J. J., et al. Low programmed death-ligand 1-expressing subgroup outcomes of first-line immune checkpoint inhibitors in gastric or esophageal adenocarcinoma. J Clin Oncol. 40 (4), 392-402 (2022).
  10. Zhu, Q., Zhang, R., Zhao, Z., Xie, T., Sui, X. Harnessing phytochemicals: Innovative strategies to enhance cancer immunotherapy. Drug Resist Updat. 79, 101206(2025).
  11. Khosravi, G. R., et al. Immunologic tumor microenvironment modulators for turning cold tumors hot. Cancer Commun (Lond). 44 (5), 521-553 (2024).
  12. Gibney, G. T., Weiner, L. M., Atkins, M. B. Predictive biomarkers for checkpoint inhibitor-based immunotherapy. Lancet Oncol. 17 (12), e542-e551 (2016).
  13. Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy. Cell. 168 (4), 707-723 (2017).
  14. Naidoo, J., et al. Toxicities of the anti-PD-1 and anti-PD-L1 immune checkpoint antibodies. Ann Oncol. 27 (7), 1362(2016).
  15. Yang, M., Lin, W., Huang, J., Mannucci, A., Luo, H. Novel immunotherapeutic approaches in gastric cancer. Precis Clin Med. 7 (4), pbae020(2024).
  16. Germain, C., et al. Characterization of alternatively spliced transcript variants of clec2d gene. J Biol Chem. 285 (46), 36207-36215 (2010).
  17. Boles, K. S., Barten, R., Kumaresan, P. R., Trowsdale, J., Mathew, P. A. Cloning of a new lectin-like receptor expressed on human NK cells. Immunogenetics. 50 (1-2), 1-7 (1999).
  18. Rosen, D. B., et al. Cutting edge: Lectin-like transcript-1 is a ligand for the inhibitory human nkr-p1a receptor. J Immunol. 175 (12), 7796-7799 (2005).
  19. Germain, C., et al. Induction of lectin-like transcript 1 (llt1) protein cell surface expression by pathogens and interferon-γ contributes to modulate immune responses. J Biol Chem. 286 (44), 37964-37975 (2011).
  20. Marrufo, A. M., et al. Blocking llt1 (clec2d, ocil)-nkrp1a (cd161) interaction enhances natural killer cell-mediated lysis of triple-negative breast cancer cells. Am J Cancer Res. 8 (6), 1050-1063 (2018).
  21. Germain, C., et al. Lectin-like transcript 1 is a marker of germinal center-derived B-cell non-Hodgkin's lymphomas, dampening natural killer cell functions. Oncoimmunology. 4 (8), e1026503(2015).
  22. Roth, P., et al. Malignant glioma cells counteract antitumor immune responses through expression of lectin-like transcript-1. Cancer Res. 67 (8), 3540-3544 (2007).
  23. Sanchez-Canteli, M., et al. Lectin-like transcript 1 (llt1) checkpoint: A novel independent prognostic factor in hpv-negative oropharyngeal squamous cell carcinoma. Biomedicines. 8 (12), 535(2020).
  24. Braud, V. M., et al. Expression of llt1 and its receptor CD161 in lung cancer is associated with better clinical outcome. Oncoimmunology. 7 (5), e1423184(2018).
  25. Mathewson, N. D., et al. Inhibitory CD161 receptor identified in glioma-infiltrating T cells by single-cell analysis. Cell. 184 (5), 1281-1298.e26 (2021).
  26. Guo, L., et al. Association of increased B7 protein expression by infiltrating immune cells with progression of gastric carcinogenesis. Medicine (Baltimore). 98 (8), e14663(2019).
  27. Quan, Q., et al. Expression and clinical significance of PD-L1 and infiltrated immune cells in the gastric adenocarcinoma microenvironment. Medicine (Baltimore). 102 (48), e36323(2023).
  28. Varaden, D., Moodley, J., Onyangunga, O. A., Naicker, T. Morphometric image analysis of placental c-type lectin domain family 2, member d (clec2d) immuno-expression in hiv associated pre-eclampsia. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol X. 3, 100039(2019).
  29. Chen, S., et al. B7-h3 and CD47 co-expression in gastric cancer is a predictor of poor prognosis and potential targets for future dual-targeting immunotherapy. J Cancer Res Clin Oncol. 149 (18), 16609-16621 (2023).
  30. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma. Nature. 513 (7517), 202-209 (2014).
  31. Cristescu, R., et al. Molecular analysis of gastric cancer identifies subtypes associated with distinct clinical outcomes. Nat Med. 21 (5), 449-456 (2015).
  32. Thorsson, V., et al. The immune landscape of cancer. Immunity. 48 (4), 812-830.e14 (2018).
  33. Tumeh, P. C., et al. Pd-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
  34. Lopez De Rodas, M., et al. Biological and clinical significance of tumour-infiltrating lymphocytes in the era of immunotherapy: A multidimensional approach. Nat Rev Clin Oncol. , (2025).
  35. Myojin, Y., et al. Multiomics analysis of immune correlatives in hepatocellular carcinoma patients treated with tremelimumab plus durvalumab. Gut. , (2025).
  36. Marvel, D., Gabrilovich, D. I. Myeloid-derived suppressor cells in the tumor microenvironment: Expect the unexpected. J Clin Invest. 125 (9), 3356-3364 (2015).
  37. Sautès-Fridman, C., Petitprez, F., Calderaro, J., Fridman, W. H. Tertiary lymphoid structures in the era of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 19 (6), 307-325 (2019).
  38. Ye, Z., et al. Gastric cancer-derived exosomal let-7 g-5p mediated by serpine1 promotes macrophage m2 polarization and gastric cancer progression. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 2(2025).
  39. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  40. Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
  41. Xiong, S., Dong, L., Cheng, L. Neutrophils in cancer carcinogenesis and metastasis. J Hematol Oncol. 14 (1), 173(2021).
  42. Mantovani, A., Locati, M. Tumor-associated macrophages as a paradigm of macrophage plasticity, diversity, and polarization: Lessons and open questions. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (7), 1478-1483 (2013).
  43. Niu, X., et al. Autophagy in cancer development, immune evasion, and drug resistance. Drug Resist Updat. 78, 101170(2025).
  44. Ikeda, H., et al. Immune evasion through mitochondrial transfer in the tumour microenvironment. Nature. 638 (8049), 225-236 (2025).
  45. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat Rev Immunol. 9 (3), 162-174 (2009).
  46. Pan, Y., et al. The protective and pathogenic role of Th17 cell plasticity and function in the tumor microenvironment. Front Immunol. 14, 1192303(2023).
  47. Smyth, M. J., et al. Perforin-mediated cytotoxicity is critical for surveillance of spontaneous lymphoma. J Exp Med. 192 (5), 755-760 (2000).
  48. Galon, J., et al. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science. 313 (5795), 1960-1964 (2006).
  49. Galon, J., Bruni, D. Approaches to treat immune hot, altered, and cold tumours with combination immunotherapies. Nat Rev Drug Discov. 18 (3), 197-218 (2019).
  50. Chen, D. S., Mellman, I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekspresja LLT1punkt kontrolny odpowiedzi immunologicznejmikro rodowisko guzanaciekanie kom rek odporno ciowychekspresja PD L1limfocyty T CD8immunohistochemiawielokrotna immunofluorescencja

Powiązane artykuły