Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie chemiczne o bardzo wysokiej zawartości informacji z szerokopasmową koherentną mikroskopią Ramana antystokesa i dwufotonową mikroskopią fluorescencji

1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68845

⸱

7 października 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology, 3School of Electrical and Computer Engineering, Georgia Institute of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W artykule przedstawiono multimodalną platformę obrazowania łączącą szerokopasmowe koherentne rozpraszanie anty-Stokesa Ramana (BCARS), fluorescencję wzbudzenia dwufotonowego (TPEF) i mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej (2p-FLIM), umożliwiając bioobrazowanie chemiczne o bardzo wysokiej zawartości informacji.

Streszczenie

Ramanowska spektroskopia odcisków palców i obrazowanie czasu życia fluorescencji to nowe narzędzia do badania profili metabolicznych próbek biologicznych. Podczas gdy spektroskopia odcisków palców Ramana wykrywa wewnętrzne drgania molekularne, które odzwierciedlają skład molekularny i środowisko chemiczne próbki, obrazowanie czasu życia fluorescencji mierzy zmiany w czasie życia w stanie wzbudzonym fluoroforów, które są wrażliwe na swoje mikrośrodowisko. W tym miejscu prezentujemy multimodalną platformę obrazowania łączącą szerokopasmowe koherentne rozpraszanie Ramana Stokesa (BCARS) i mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej (2p-FLIM), która może pozyskiwać biologicznie istotne widma odcisków palców Ramana i sygnały czasu życia fluorescencji in vivo i jednocześnie. Ogromna ilość informacji chemicznych uzyskanych z przestrzennie współzarejestrowanych obrazów BCAR i 2p-FLIM pozwala nam scharakteryzować subtelne różnice między przedziałami subkomórkowymi i zweryfikować potencjalne fałszywie dodatnie wyniki generowane przez samo obrazowanie fluorescencyjne. Wykazano to, porównując bezpośrednio sygnały BCARS, 2p-FLIM i fluorescencji wzbudzenia dwufotonowego (TPEF) jednocześnie uzyskane z tych samych barwionych barwnikiem organelli w żywych, nienaruszonych C. elegans wyrażających marker białka zielonej fluorescencji (GFP). W tej pracy przedstawiamy schemat konfiguracji BCARS / 2p-FLIM / TPEF, etapy akwizycji obrazu, przetwarzanie danych i reprezentatywne wyniki pokazujące, że metoda obrazowania międzymodalnego umożliwia rygorystyczną charakterystykę i wykrywanie in vivo w rozdzielczości subkomórkowej. Protokół ten zapewnia ramy dla jednoczesnego obrazowania czasu życia substancji chemicznych i fluorescencji w celu poprawy dokładności interpretacji biologicznej w złożonych systemach żywych.

Wprowadzenie

Jednym z wyzwań w badaniach biologicznych jest dokładne wykrycie biologicznych materiałów budulcowych w ich rodzimych stanach oraz w nienaruszonej architekturze komórek i tkanek. Spektroskopia Ramana wykazuje bezprecedensowy potencjał w wykrywaniu wewnętrznych metabolitów i związków chemicznych w próbkach biologicznych, a ostatnio została uznana za nowe narzędzie do profilowania metabolicznego próbek biologicznych1. Analizując piki różnych grup metabolicznych pokazane w widmach odcisków palców Ramana, coraz więcej dowodów wskazuje, że cechy odcisków palców mogą być wykorzystywane do wykrywania wczesnych stadiów chorób, takich jak rak 2,3,4, zaburzenia serca 5,6 i choroby neurodegeneracyjne 7,8 i są szczególnie przydatne w rozwiązywaniu podstawowych problemów biologicznych 9,10 w tym obrazowanie struktur wewnątrzkomórkowych bez zaburzeń znakowania11, różnicowanie różnych stanów komórek12,13 i klasyfikacja typów komórek 14,15,16. Większość informacji chemicznych (> 90%) zakodowanych w widmach Ramana znajduje się w obszarze odcisków palców (od 500 do 1800 cm-1), co czyni ten obszar zdecydowanie najbardziej przydatnym do rozróżniania składu chemicznego w próbkach biologicznych17. Jednak słaby sygnał Ramana w tym zakresie częstotliwości sprawia, że zastosowania spektroskopii odcisków palców Ramana w badaniach biologicznych są trudne, szczególnie w przypadku żywych, nienaruszonych próbek biologicznych1.

Metody koherentnego obrazowania ramanowskiego (CRI) znacznie skracają czas akwizycji sygnałów Ramana, ale większość z nich uzyskuje stosunkowo wąskie segmenty spektralne i jest zoptymalizowana pod kątem silnych sygnałów rozciągnięcia CH w zakresie 2800 - 3100 cm-1. Wąskopasmowe CARS i wymuszone rozpraszanie Ramana (SRS) (Rysunek 1A,B) wykorzystują dwa impulsy pikosekundowe, zwykle do uzyskania wąskiej części silnego sygnału CH 18,19,20,21,22,23. Podejścia multipleksowe CRI, takie jak multipleksy CARS (rysunek 1C), wykorzystują kombinację impulsów pikosekundowych i ~100 fs, aby uzyskać umiarkowany zakres widmowy (zwykle ≤ 400 cm-1), zwykle w obszarze CH 24,25,26,27,28,29,30. Uzyskanie całego biologicznego spektrum Ramana (od 600 do 3200 cm-1) na piksel przy użyciu tych metod obrazowania jest zwykle zaporowe, ponieważ większość sygnałów odcisków palców jest 10-100 razy słabsza niż sygnały rozciągnięciaCH31. W przeciwieństwie do większości podejść CRI, szerokopasmowe koherentne rozpraszanie przeciw Ramanowi Stokesa (BCARS) jest zoptymalizowane pod kątem jednostrzałowej akwizycji szerokopasmowej, która obejmuje obszary odcisku palca i rozciągnięcia CH: 31,32,33. BCARS wykorzystuje interakcje wewnątrzimpulsowe impulsu ~10 fs do skutecznego wzbudzania drgań o niskiej częstotliwości (odcisk palca) (rysunek 1D) i wykorzystuje ten sam mechanizm, co multipleksowe CARS, połączenie impulsu fs z impulsem ps w celu wygenerowania spójności wibracyjnej w obszarze rozciągliwym CH (rysunek 1C)32,33. Co więcej, sygnały BCARS są wewnętrznie skalibrowane ze względu na ich interakcję z nierezonansowym tłem (NRB), co skutkuje ilościowym i niezmiennym dla instrumentów pełnym widmem Ramana na impuls laserowy na każdy piksel31, z możliwością szybkiego pozyskiwania danych o wysokiej zawartości informacji z komórek, nienaruszonych tkanek i żywych organizmów biologicznych 32,34,35,36,37,Rozdział 38,39.

Pozyskane surowe widma BCARS zawierają silne tzw. "nierezonansowe tło" (NRB). NRB to wkład elektronicznej odpowiedzi na impulsy laserowe, który nie jest specyficzny chemicznie. NRB koherentnie interferuje z sygnałem rezonansowym wibracyjnie, działając jako wzmacniacz heterodynowy32. NRB zniekształca również leżące u podstaw widmo Ramana (ryc. 2A), ale widmo Ramana można odzyskać, o ile uzyskane zostaną znaczące ciągłe odcinki widma. Obecnie nie jest dostępna metoda post-processingu, która pozwoliłaby oddzielić rezonansowy sygnał CARS od nierezonansowego przy użyciu wąskopasmowego podejścia CARS. Pobieranie sygnału Ramana z szerokopasmowego sygnału CARS można osiągnąć, wykorzystując relację Kramersa-Kroniga w dziedzinie czasu (lub transformację Hilberta)33,40 (rysunek 2B), maksymalną entropię41,42 lub uczenie maszynowe 43,44,45,46,47,48 Podejścia. Należy zauważyć, że pierwsze dwie metody analitycznie pobierają fazę (rezonansowy sygnał Ramana) z surowych widm BCARS, natomiast podejścia oparte na uczeniu maszynowym mogą być w dużym stopniu zależne od oprzyrządowania i modeli treningowych.

Podczas gdy mikroskopia BCARS pozwala na bezznacznikową charakterystykę profilowania metabolicznego próbek biologicznych, ten sam laser superkontinuum (950 - 1200 nm dla konfiguracji BCARS przedstawionej w tej pracy) używany do generowania sygnału BCARS może również wzbudzać szeroką gamę barwników, takich jak barwniki na bazie rodaminy, Bodipy, Alexa na bazie fluoru i cyjaniny oraz różne białka fluorescencyjne, w tym GFP i mCherry49, Lokal mieszkalny 50. W porównaniu ze wzbudzeniem pojedynczych fotonów przy użyciu widzialnych laserów fal ciągłych (CW), wielofotonowa mikroskopia fluorescencyjna, taka jak mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej (2p-FLIM) i mikroskopia fluorescencyjna wzbudzenia dwufotonowego (TPEF), wykorzystująca światło bliskiej podczerwieni (NIR) oferuje większą głębokość penetracji próbki, wewnętrzną zdolność do cięcia 3D, obrazy o wysokim kontraście i dobrą rozdzielczość porównywalną z najnowocześniejszą mikroskopią konfokalną, co czyni ją atrakcyjnym narzędziem do biologii Badania 51,52. Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) przy użyciu skorelowanego w czasie zliczania pojedynczych fotonów (TCSPC) wykrywa sygnały rozpadu fluorescencji wielokrotnie wzbudzane przez modulowane w czasie źródło laserowe53,54. Widmo fluorescencji danego fluoroforu może się zmieniać wraz z czynnikami środowiskowymi, takimi jak polarność rozpuszczalnika, ale zmiany te są zwykle subtelne. Z drugiej strony, czas życia fluorescencji często różni się w zależności od dwóch lub więcej czynników ze zmianami środowiskowymi, takimi jak wartości pH55, lepkość56, polarność57 i stężenie związków jonowych58,59, interakcje wiążące, obecność wygaszaczy lub zmiany strukturalne53,54. Ta unikalna właściwość czasu życia fluorescencji zapewnia dodatkowy kontrast sygnału w obrazowaniu fluorescencyjnym i z powodzeniem rozwiązała problemy interferencji autofluorescencji w obrazowaniu komórek i tkanek60, rozmieszaniu wielu fluoroforów przy użyciu spektralnie rozdzielczego podejścia FLIM61, diagnozowaniu raka i monitorowaniu leczenia62, bezznacznikowym wykrywaniu heterogeniczności komórkowej63 i zmianach metabolicznych64.Lokal mieszkalny 65.

W tej pracy wprowadzamy multimodalną platformę obrazowania łączącą BCARS, 2p-FLIM i TPEF. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, po raz pierwszy prezentowana jest platforma obrazowania umożliwiająca jednoczesne obrazowanie BCARS i 2p-FLIM/TPEF. Demonstrujemy możliwości obrazowania in vivo tego instrumentu przy użyciu szeroko stosowanego, genetycznie podatnego organizmu modelowego, Caenorhabditis elegans (C. elegans). Pokazujemy, że widma BCARS, rozpady 2p-FLIM czerwieni nilowej (ważnego barwnika lipidowego) i dwufotonowe sygnały fluorescencyjne GFP zgłoszonego markera lipidowego (DHS-3::GFP) mogą być jednocześnie pozyskiwane in vivo od robaków barwionych czerwienią Nilu. Praktyczny przewodnik dotyczący przedstawionego tutaj podejścia do obrazowania obejmuje: (i) próbka powinna być optycznie przezroczysta i mieć zwykle mniejszą grubość niż 100 μm; (ii) warunki barwienia mogą się różnić w zależności od barwników i próbek. W przedstawionych tutaj wynikach barwienia czerwienią Nilu C. elegans stężenie czerwieni nilowej jest na poziomie ~μM, a czas barwienia może wynosić od kilku godzin do nocy66; (iii) wymagane jest ciemne środowisko próbki, aby uniknąć wycieku światła widzialnego do detektorów 2p-FLIM/TPEF. Te warunki obrazowania są identyczne z warunkami obrazowania większości nieliniowej mikroskopii optycznej i fluorescencyjnej. Ponadto zademonstrowany tutaj nasz system może być dalej stosowany do wykrywania innych barwników i reporterów fluorescencyjnych oprócz czerwieni Nilowej i GFP poprzez wprowadzenie dodatkowego lasera Ti:Sapphire fs, który obejmuje zakres 700 -950 nm dla wzbudzenia fluorescencji dwufotonowej. Tak więc, podczas gdy reprezentatywne wyniki opisane w tym protokole to obrazowanie in vivo barwionych barwnikiem C. elegans wykazujących ekspresję GFP, platforma bioobrazowania chemicznego o bardzo wysokiej zawartości informacji ma zastosowania, które są szerokie i dalekosiężne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Z . Przygotowanie próbki elegans i barwienie czerwienią Nilu

UWAGA: C. elegans był intensywnie stosowany w wielu technikach obrazowania ze względu na jego przezroczystość całego ciała. Narządy wewnętrzne i tkanki można łatwo zobrazować w nienaruszonym zwierzęciu bez sekcji. Ponadto zgoda etyczna nie jest wymagana w przypadku badań z udziałem C. elegans, ponieważ nie są one uważane za kręgowce i nie podlegają tym samym regulacjom etycznym, co zwierzęta wyższe, takie jak gryzonie. W tej sekcji opisano synchronizację robaków C. elegans i przygotowanie próbek barwionych czerwienią nilową do obrazowania fluorescencyjnego. Zsynchronizowane jednodniowe dorosłe robaki uzyskuje się za pomocą dwupokoleniowego protokołu składania jaj i barwi przy użyciu świeżo przygotowanych płytek Nile Red-OP50.

  1. Szczepy C. elegans (np. N2, LIU1 ldrIs1 [dhs-3p::d hs-3::GFP + unc-76(+)]) należy utrzymywać na standardowych płytkach pożywki do wzrostu nicieni (NGM) wysianych bakteriami OP50 w temperaturze 20 °C.
  2. Synchronizacja robaków
    1. Zbierz 10-20 grawitacyjnych dorosłych robaków na świeżo przygotowaną płytkę NGM z nasionami OP50.
    2. Inkubować płytkę w temperaturze 20 °C przez 1-3 godziny, aby umożliwić złożenie jaj.
    3. Usuń wszystkie dorosłe robaki, pozostawiając na talerzu tylko świeżo złożone jaja.
    4. Inkubować płytkę w temperaturze 20 °C, aż robaki osiągną jednodniowe stadium dorosłe.
    5. Powtórz powyższe kroki dla dodatkowej generacji, aby poprawić precyzję synchronizacji.
  3. Przygotować roztwór podstawowy czerwieni nilowej
    1. Rozpuścić 15,92 mg czerwieni nilowej w 10 ml DMSO do końcowego stężenia 5 mM.
    2. W razie potrzeby sonikuj przez 10-30 minut, aby wspomóc rozpuszczanie.
  4. Przygotuj płytki barwiące Nile Red-OP50.
    1. Dokładnie wymieszaj zawiesinę bakteryjną OP50 z wywarem czerwieni nilowej, aby uzyskać końcowe stężenie czerwieni nilowej wynoszące 5 μM na płytkę NGM. Na przykład, wymieszaj 10 μl wywaru Nile Red z 20 μl zawiesiny bakteryjnej OP50, a następnie natychmiast nałóż całą mieszaninę na niezasianą 6 cm (o objętości ~10 ml) płytkę agarową NGM, aby uzyskać końcowe stężenie czerwieni Nilu wynoszące 5 μM na płytkę NGM.
    2. Rozprowadź masę równomiernie na nieobsianych talerzach NGM o średnicy 6 cm.
    3. Przechowuj płytki w ciemności w temperaturze pokojowej przez noc, aby umożliwić rozwój bakterii i wchłanianie barwnika.
  5. Robaki zsynchronizowane z plamami
    1. Przenieś 30-50 zsynchronizowanych, jednodniowych dorosłych robaków na każdą przygotowaną płytkę Nile Red-OP50.
    2. Inkubować robaki w ciemności w temperaturze 20 °C przez 1-2 godziny przed obrazowaniem.
  6. Unieruchomienie robaków do obrazowania
    1. Nanieś kroplę 100 mM azydku sodu na 2% wacik agarozowy na szkiełku mikroskopowym (około 10-15 μl na 20 robaków)
    2. Przenieś poplamione robaki do kropli środka znieczulającego (azydek sodu) i przykryj robaki szkiełkiem nakrywkowym przed mikroskopią.
      UWAGA: Wybierając 10-20 grawitych dorosłych osobników na świeżo przygotowaną płytkę NGM OP50 w pierwszym etapie synchronizacji składania jaj, wybieraj tylko dorosłe osobniki, ale nie zabłąkane jaja lub larwy. Ma to na celu upewnienie się, że wszystkie pozostałe jaja na talerzach zostaną wyprodukowane przez zebrane robaki w ciągu 1-3 godzin składania jaj. Ponadto azydek sodu jest klasyfikowany jako materiał niebezpieczny, chociaż wymaga bardzo małej ilości do znieczulenia nicieniami. Użytkowanie i utylizacja odpadów azydku sodu muszą być zgodne z wytycznymi instytucjonalnego działu bezpieczeństwa i higieny pracy.

2. Generowanie wiązki sondy

UWAGA: Ten protokół opisuje generowanie wiązki pikosekundowej (ps) sondy za pomocą domowego optycznego oscylatora parametrycznego (OPO), a następnie generowanie drugiej harmonicznej (SHG) z domowym systemem pętli sprzężenia zwrotnego sygnału w celu ustabilizowania mocy wyjściowej wiązki sondy.

  1. Włącz laser pompujący OPO 1030 nm (rysunek 3A lub laser z pompą OPO o długości zbliżonej 1 ps, ~ 3 W pokazany na rysunku 4) i odczekaj co najmniej 2 godziny na równowagę termiczną. Stabilna moc wyjściowa ma kluczowe znaczenie dla działania OPO.
  2. Skieruj wyjście do wnęki OPO
    1. Wybierz odpowiedni okres polowania na krysztale OPO PPLN (rysunek 3A), aby dopasować docelową długość fali sygnału.
    2. Skieruj wiązkę do pierwszego zakrzywionego zwierciadła (CM) (rysunek 3A), tworzącego część wnęki liniowej.
    3. Upewnij się, że wiązka przechodzi przez okresowo naklejany kryształ niobianu litu (PPLN) OPO (rysunek 3A), aby ułatwić optyczną parametryczną konwersję w dół (rysunek 3B).
    4. Upewnij się, że wiązka odbija się od drugiego zakrzywionego lustra (CM), a następnie od zwierciadła końcowego (EM) (Rysunek 3A), tworząc pętlę wnęki.
    5. Skonfiguruj łącznik wyjściowy (OC) (Rysunek 3A), aby wyodrębnić wygenerowaną wiązkę sygnałową z wnęki.
  3. Dostosuj temperaturę kryształu OPO PPLN za pomocą regulatora temperatury (TC) (Rysunek 3A), aby wybrać długość fali sygnału. Typowa długość fali sygnału wynosi 1530 nm, co odpowiada mocy wyjściowej około 0,8 W przy pompowaniu 3 W przy 1064 nm.
  4. Zoptymalizuj wyrównanie OPO
    1. Dostosuj położenie i nachylenie dwóch CM i EM, aby zmaksymalizować moc wyjściową i jakość wiązki.
    2. Dostosuj długość wnęki, aby przesunąć widmo sygnału do żądanej częstotliwości.
  5. Przeprowadź wiązkę sygnałową OPO przez zestaw optyki kolimacyjnej i skupiającej i skieruj ją do etapu SHG.
    1. Wybierz odpowiedni okres nabiegunowy na krysztale SHG PPLN (rysunek 3A), aby dopasować docelową długość fali sygnału.
    2. Precyzyjnie kontroluj temperaturę kryształu za pomocą regulatora temperatury, aby zmaksymalizować wydajność SHG.
    3. Skieruj wiązkę do kryształu SHG PPLN w celu wygenerowania drugiej harmonicznej, przekształcając sygnał OPO o długości fali 1530 nm na 765 nm (ilustracja 3C). Typowa sprawność konwersji SHG wynosi około 30% w optymalnych warunkach wyrównania.
    4. Umieść filtr krótkoprzepustowy 1300 nm (SPF na rysunku 3A, specyfikacje w tabeli materiałów) za SHG PPLN, aby usunąć resztkowe światło podstawowe 1530 nm.
    5. Kolimować otrzymaną wiązkę o długości fali 765 nm za pomocą odpowiedniej soczewki (jak L na rysunku 3A).
  6. Implementacja stabilizacji mocy
    1. Użyj okna klinowego (WW), aby pobrać próbkę wiązki SHG i skierować ją do fotodiody (PD).
    2. Upewnij się, że pętla sprzężenia zwrotnego porównuje sygnał fotodiody (PD na rysunku 3A) z wartością odniesienia i uruchamia silnik pikomotor na zwierciadle końcowym (EM) w celu dostosowania długości wnęki OPO w czasie rzeczywistym, stabilizując w ten sposób moc wyjściową SHG.
      UWAGA: Aby określić wartość referencyjną, najpierw zeskanuj pozycję EM za pomocą silnika pikomotorowego, rejestrując moc wyjściową SHG. Zidentyfikuj szczytową intensywność w tym profilu, a następnie ustaw wartość odniesienia na 90% wartości szczytowej. Taki wybór zapewnia wyraźny kierunek korekcji sprzężenia zwrotnego, umożliwiając systemowi kompensację zarówno rosnących, jak i malejących trendów mocy oraz skutecznie stabilizuje moc wyjściową w czasie.

3. Generowanie superkontinuum (SC) dla BCARS

UWAGA: Uproszczony schemat systemu multimodalnego opartego na BCARS przedstawiono na rysunku 4. Protokół ten opisuje generowanie wiązki SC.

  1. Dostosuj pre-chirp (Group Delay Dispersion, GDD) do wyjścia impulsu femtosekundowego (fs) (1030 nm, 150 fs, ~1 W), aby uzyskać wystarczająco szerokie pasmo SC pokrywające sygnały obszaru odcisku palca (pasmo SC ≥ 1800 cm−1). Osiąga się to, regulując separację pary krat (patrz rysunek 4), co pozwala na precyzyjną kontrolę dyspersji.
    UWAGA: Zastosowanie wstępnie skompensowanego GDD ma kluczowe znaczenie dla generowania pożądanego impulsu i optymalizacji generowania SC. Wymagana wartość GDD może się różnić w zależności od specyfiki zastosowanego systemu laserowego.
  2. Dołącz teleskop wiązki składający się z dwóch soczewek o tych samych ogniskowych, aby dostosować rozbieżność wiązki pompy.
    UWAGA: Gdy wiązka pokonuje ponad metry przed wejściem do rozszerzającego się włókna, niezbędna staje się precyzyjna kontrola rozbieżności wiązki. Utrzymanie skolimowanej wiązki na tym dystansie ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia wydajnego generowania SC.
  3. Ustaw automatyczne wyrównywanie (Rysunek 4) za pomocą kinematycznych mocowań lusterek wyposażonych w siłowniki piezoelektryczne do sterowania wiązką. Połącz je z klinami optycznymi i detektorem położenia (PSD), aby aktywnie monitorować i korygować wyrównanie wiązki.
  4. Ustaw komponenty w taki sposób, aby odległość od klina do pierwszego lustra była równa odległości od klina do pierwszego pliku PSD. Ta symetryczna konfiguracja zapewnia stabilność kierowania wiązki w poszerzające się światłowód.
    UWAGA: Aktywne wyrównanie jest niezbędne do maksymalizacji wydajności poszerzania widma i zminimalizowania ryzyka uszkodzenia wejścia światłowodu.
  5. Użyj płytki półfalowej (HWP) i rozdzielacza wiązki polaryzacyjnej (PBS), aby kontrolować moc lasera przed sprzężeniem ze światłowodem. Obróć HWP, aby wyregulować kąt polaryzacji względem PBS, dostrajając w ten sposób przesyłaną moc. Chociaż elementy te nie są pokazane na rysunku 4, mają one kluczowe znaczenie dla bezpiecznego wyrównania i kontroli mocy.
  6. Podłącz około 1 W mocy lasera do 10-centymetrowego światłowodu fotonicznego (PCF) z utrzymaniem polaryzacji w dużym obszarze (LMA-PM-5) za pomocą sprzęgacza światłowodowego. Procedura sprzęgania jest następująca:
    1. Po pierwsze, zmniejsz moc lasera do ~20-50 mW podczas początkowego ustawiania, aby uniknąć uszkodzenia światłowodu.
    2. Skieruj skolimowaną wiązkę do światłowodu, upewniając się, że trochę światła wyłania się z drugiej strony. Zoptymalizuj ścieżkę wiązki, dostosowując jej położenie, aby zmaksymalizować moc wyjściową.
    3. Włóż soczewkę asferyczną (Rysunek 4), ponownie dostrój wiązkę, aby zmaksymalizować moc wyjściową.
    4. Dostosuj pozycję Z soczewki asferycznej, aby zapewnić precyzyjną ostrość na fasetce włókna.
    5. Powtarzaj iteracyjnie regulacje wyrównania i ostrości, aby zmaksymalizować wydajność sprzęgania.
    6. Zwiększ moc lasera do 1 W na czas pracy.
  7. Skolimować wynikowy szerokopasmowy sygnał wyjściowy superkontinuum (SC) z PCF za pomocą pozaosiowego zwierciadła parabolicznego (OAP) o ogniskowej f = 15 mm, jak pokazano na rysunku 4.
    UWAGA: Optyka refleksyjna, taka jak lustro OAP, jest preferowana w przypadku wiązek szerokopasmowych, aby zminimalizować aberrację chromatyczną wprowadzaną przez elementy refrakcyjne.
  8. Sprowadź wyjście skolimowanego szerokopasmowego superkontinuum (SC) do kompresora pryzmatycznego (Rysunek 4) składającego się z pary pryzmatów Schotta Flinta (SF10).
    1. Skieruj wiązkę SC na wierzchołek pierwszego pryzmatu, aby zainicjować dyspersję widmową.
    2. Ustaw drugi pryzmat tak, aby rozproszona wiązka wchodziła przez jego wierzchołek.
    3. Zamontuj oba pryzmaty na systemie szynowym, aby umożliwić zgrubną regulację separacji pryzmatów. Przełóż drugi pryzmat wzdłuż szyny, aby dostosować długość ścieżki optycznej i ogólną kompresję. Odstęp dla tego systemu wynosi 44 cm.
    4. Zamontuj pierwszy pryzmat na precyzyjnym stoliku do translacji liniowej. Dostosuj głębokość wsunięcia pierwszego pryzmatu, aby precyzyjnie dostroić kompensację dyspersji.
    5. Iteracyjnie dostosuj zarówno separację pryzmatu, jak i długość wstawienia drugiego pryzmatu, aby uzyskać optymalną kompresję czasową impulsu SC. Określ optymalną kompresję czasową, dopasowując obserwowany eksperymentalnie zdegenerowany sygnał mieszania czterofalowego (DFWM) do symulowanych wyników, które uwzględniają dyspersję grupową opóźnioną (GDD) i dyspersję trzeciego rzędu (TOD). Podejście to polega na przeprowadzeniu symulacji procesu generowania superkontinuum, z uwzględnieniem efektów GDD i TOD, co stanowi odniesienie dla oczekiwanych charakterystyk czasowych i spektralnych optymalnie skompresowanych impulsów SC. Następnie iteracyjnie dostosuj parametry sprężarki pryzmatycznej, aby skompensować GDD i TOD obecne w systemie, aż eksperymentalny sygnał DFWM będzie zgodny z przewidywaniami symulacji. Typowy wynik profilu spektralnego SC przedstawiono na rysunku 5.
      UWAGA: Właściwa kompensacja dyspersji zwiększa spójność widmową SC. Przy optymalnym ustawieniu wyjście SC ma moc około 150 mW, środkową długość fali około 1060 nm i rozciąga się w zakresie widmowym od 950 do 1200 nm (co odpowiada 1800 cm−1). Wartości te mogą się nieznacznie różnić w zależności od wyrównania i wydajności sprzężenia światłowodów.
  9. Połącz wiązki sondy i superkontinuum za pomocą zwierciadła dichroicznego (patrz DM na rysunku 4). Wyrównaj je z parą otworów, aby upewnić się, że obie belki są współliniowe. Skoncentruj połączone wiązki na fotodiodzie wysokiej częstotliwości (szerokość pasma 1 GHz). Aby uzyskać optymalną jakość sygnału, obie wiązki muszą nakładać się na siebie zarówno w domenie przestrzennej, jak i czasowej. Proces przebiega następująco:
    1. Skieruj wyjście z fotodiody do oscyloskopu wysokiej częstotliwości (szerokość pasma 500 MHz). Użyj spustu laserowego jako zegara referencyjnego.
    2. Zablokuj wiązkę sondy i zmierz impulsy SC. Zapisz różnice czasowe między impulsami SC a odniesieniem lasera.
    3. Zablokuj wiązkę SC i zmierz impulsy sondy. Wyreguluj mechaniczną linię opóźniającą (jak pokazano na rysunku 4) tak, aby impulsy sondy nakładały się na impulsy SC w czasie. Upewnij się, że obie wiązki osiągają jednocześnie maksimum.
    4. Wyjmij fotodiodę i pozwól, aby wiązka dotarła do mikroskopu.
      UWAGA: Powyższe kroki opisują zgrubną korektę nakładania się belek. Dalsza optymalizacja w celu dokładniejszego wyrównania została omówiona w krokach od 6.1 do 6.9.

4. Konfiguracja detekcji fluorescencji dla 2p-FLIM i TPEF oraz wprowadzenie dodatkowego lasera Ti:Sapphire fs

  1. Włącz laser Ti:Sapphire i pozwól mu osiągnąć równowagę termiczną. Odczekaj około 2 godzin, aby zapewnić stabilną moc wyjściową i skierowanie wiązki.
    UWAGA: W tym badaniu obrazowanie TPEF i FLIM przeprowadzono przy użyciu źródła SC, które zapewnia szerokie pokrycie spektralne i wystarczającą moc dla fluoroforów, takich jak GFP i czerwień nilowa. Laser Ti:Sapphire jest zawarty w systemie jako opcjonalne źródło wzbudzenia dla fluoroforów z dwufotonowymi pikami absorpcji poniżej 950 nm, które mogą nie być efektywnie wzbudzane przez SC.
  2. Aktywuj mechanizm blokujący tryb w laserze Ti:Sapphire. Potwierdź blokowanie trybu stabilnego za pomocą wbudowanego monitora.
  3. Wstępnie ćwierkaj impulsy Ti:Sapphire w celu optymalnej kompresji czasowej na próbce za pomocą kompresora pryzmatu. Ułóż pryzmaty w konfiguracji podobnej do opisanej w kroku 3.8 i dostosuj długość wsunięcia drugiego pryzmatu, aby precyzyjnie dostroić czas trwania impulsu.
    UWAGA: Właściwa kompresja czasowa zapewnia szczytową intensywność i efektywne wzbudzenie dwufotonowe w płaszczyźnie próbki.
  4. (Opcjonalnie) Połącz wiązkę Ti:Sapphire ze światłowodem jednomodowym utrzymującym polaryzację, jeśli laser znajduje się na oddzielnym stole optycznym. Wyreguluj wejściową optykę sprzęgającą i monitoruj wyjście światłowodu, aby zminimalizować straty sprzężenia.
  5. Połącz wiązkę Ti:Sapphire z superkontinuum (SC) i wiązkami sondy za pomocą zwierciadła dichroicznego (patrz punkt łączenia w PBS pokazany na rysunku 3). Ostrożnie wyrównaj wiązki, aby zapewnić przestrzenne zachodzenie na dichroik i współpropagację w kierunku mikroskopu.
  6. Skieruj połączone wiązki do mikroskopu i dostosuj ich przestrzenne nakładanie się. Użyj próbki fluorescencyjnej (np. szkiełka z fluorescencyjnymi kulkami polistyrenowymi 1 μm), aby sprawdzić wyrównanie wiązki Ti:Sapphire względem ścieżki wzbudzenia BCARS. Dostosuj lustra wyrównujące Ti:Sapphire, aby upewnić się, że emisja fluorescencji jest kolokowana z punktem ogniskowym BCARS w tym samym polu obrazowania. Potwierdź kolokalizację, wizualizując nakładanie się obrazów BCARS i TPEF, które są pozyskiwane jednocześnie, gdzie przesunięcie przestrzenne powinno być mniejsze niż jeden piksel.
    UWAGA: Uzyskanie przestrzennego nakładania się sygnałów fluorescencyjnych i BCARS ma zasadnicze znaczenie dla multimodalnej rejestracji obrazów.
  7. Włóż zwierciadło dichroiczne przed wejściem mikroskopu, aby odbić fluorescencję rozpraszaną wstecznie w kierunku ścieżki wykrywania. Wybierz dichroik o odpowiedniej długości fali granicznej, aby skutecznie oddzielić fluorescencję od wiązek wzbudzenia.
  8. Umieść drugie zwierciadło dichroiczne za ścieżką emisji, aby podzielić sygnał fluorescencyjny na dwie gałęzie detekcji:
    1. Przesyłaj fale o długości fali ≥ 550 nm do detektora FLIM.
    2. Odbijaj fale o długości ≤ 550 nm w kierunku lampy fotopowielacza (PMT) w celu wykrywania analogowej fluorescencji wzbudzonej dwufotonem (TPEF).
      UWAGA: Zainstaluj filtry pasmowoprzepustowe w każdej gałęzi detekcji, aby zablokować szczątkowe światło wzbudzenia i wyizolować określone pasma emisji.
  9. Podłącz wyjście PMT do przedwzmacniacza i wprowadź wzmocniony sygnał analogowy do urządzenia do akwizycji danych (DAQ). Udostępnij globalny wyzwalacz synchronizacji z programowalnej macierzy bramek (FPGA) z DAQ, aby zapewnić wyrównanie czasowe między modalnościami obrazowania (ilustracja 7).
  10. Podłącz wyjście detektora FLIM do skorelowanego czasowo modułu zliczania pojedynczych fotonów (TCSPC).
    1. Podłącz sygnał detektora FLIM do wejścia start modułu TCSPC.
    2. Podłącz wyjście synchronizacji lasera Ti:Sapphire (lub BCARS SC) do wejścia referencyjnego modułu TCSPC.
    3. Podłącz globalny wyzwalacz kamery (generowany przez FPGA) do wejścia synchronizacji klatek modułu TCSPC, aby zsynchronizować się z akwizycją obrazu skanowanego liniowo.

5. Konfiguracja ścieżki detekcji BCARS

UWAGA: W tym protokole opisano konfigurację obniżonej ścieżki detekcji dla obrazowania hiperspektralnego ze skanowaniem liniowym. Lustro galvo 1D skanuje wiązkę wzbudzenia wzdłuż osi y z czasem przebywania 2-4 ms na piksel w celu wystarczającej integracji sygnału. Po każdym skanowaniu linii stolik na próbkę przesuwa się o jeden krok wzdłuż osi x. Deskanowanie przy użyciu zsynchronizowanego wtórnego lustra galvo jest niezbędne do utrzymania spójnej rejestracji przestrzennej sygnału widmowego w kamerze podczas szybkiego skanowania wiązką, eliminując przesłuchy sygnału między sąsiednimi pikselami i zachowując wierność przestrzenno-spektralną39.

  1. Wprowadzić superkontinuum (SC) i wiązki sondy do jednowymiarowego (1D) skanera galvo (jak pokazano na rysunku 4 i więcej szczegółów w odnośniku39). Ustaw sprzężone lustro galvo z tylną aperturą obiektywu skupiającego, aby umożliwić dokładne skanowanie wiązki w całym polu view.
  2. Rozszerz każdą wiązkę za pomocą ekspandera wiązki odblaskowej (jak pokazano na rysunku 4), aby dopasować ją do tylnej apertury obiektywu wzbudzenia. Zapewnia to optymalne ogniskowanie i maksymalną rozdzielczość przestrzenną na płaszczyźnie próbki.
    UWAGA: Użyj optyki refleksyjnej, aby zminimalizować aberrację chromatyczną i utrzymać szerokopasmową zawartość widmową wiązki SC.
  3. Umieść cel wyrównania na tylnej płaszczyźnie apertury obiektywu wzbudzenia. Wyreguluj wiązki SC i sondy tak, aby obie przechodziły przez środek celu, zapewniając współosiowość wzdłuż osi optycznej.
    UWAGA: Precyzyjne nakładanie przestrzenne maksymalizuje siłę sygnału BCARS i zapewnia maksymalną rozdzielczość przestrzenną w punkcie ogniskowym.
  4. Skoncentruj wiązki na próbce za pomocą obiektywu wzbudzenia o wysokim stopniu NA (np. 1,2 NA, obiektyw zanurzony w wodzie 60x) zamontowanego na odwróconym mikroskopie.
  5. Przygotuj próbkę wyrównującą, umieszczając kroplę wody między dwoma szkiełkami nakrywkowymi, aby utworzyć szczelne szkiełko mikroskopowe. Umieść przygotowane szkiełko na stoliku mikroskopu i wyreguluj ostrość, aby uzyskać próbkę w polu widzenia.
  6. Zbierz wygenerowany sygnał anty-Stokesa podczas transmisji za pomocą celu zbierania umieszczonego naprzeciwko ścieżki wzbudzenia.
  7. Zaimplementuj system deskanowania 4f (jak pokazano na rysunku 4), aby zachować przestrzenne mapowanie sygnału anty-Stokesa na stałych rzędach detektora.
    1. Przenieś tylną płaszczyznę ogniskową (BFP) obiektywu zbierającego na oś lustra galvo do deskanowania za pomocą układu optycznego 4f. Składa się on z dwóch precyzyjnych soczewek tubusu (patrz Tabela materiałów), rozmieszczonych w taki sposób, że:
      1. Pierwszy obiektyw umieszcza się o jedną ogniskową (200 mm) za BFP obiektywu kolekcji.
      2. Drugi obiektyw umieszcza się na jedną ogniskową przed lustrem galvo.
    2. Zsynchronizuj galvo deskanowania z galvo skanowania za pomocą generatora przebiegów sterowanego przez FPGA.
    3. Zintegruj 7-bitowy potencjometr cyfrowy z systemem sterowania FPGA, aby umożliwić regulację amplitudy galvo deskanowania.
      UWAGA: Lustro galvo do deskanowania kompensuje ugięcia kątowe wprowadzane przez główne zwierciadło skanujące. Poprzez dynamiczną regulację kąta w synchronizacji, przeciwdziała ruchowi wiązki, zapewniając, że sygnał anty-Stokesa pozostaje wyrównany wzdłuż osi optycznej prowadzącej do spektrometru. Ta stabilizacja jest niezbędna do utrzymania rejestracji przestrzennej na detektorze i zapobiegania bocznemu przemieszczaniu się obrazu spektralnego podczas skanowania.
  8. Skonfiguruj system FPGA (patrz tabela materiałów), aby zsynchronizować skanowanie galvo i wyzwalanie kamery.
    1. Generuj wyjścia analogowe dla galvos skanowania i deskanowania.
    2. Zaakceptuj wyzwalacz etapu wejściowego, aby oznaczyć początek każdego skanowania linii.
    3. Sygnały wyzwalające przechwytywanie klatek wyjściowych do naukowej kamery komplementarnej metal-tlenek-półprzewodnik (sCMOS) w każdej pozycji skanowania.
    4. Niezależna kontrola amplitudy deskanowania w celu dostosowania do różnych celów zbierania.
      UWAGA: Typowy ciąg impulsów FPGA zawiera skanujący sygnał sterowania galvo, deskanujący sygnał sterowania galvo, wejście wyzwalające Stage i zegar pikselowy do synchronizacji taktowania klatek.
  9. Przepuść skolimowany sygnał anty-Stokesa przez dwa filtry krótkoprzepustowe, aby zablokować resztkową pompę i światło wzbudzenia SC.
  10. Skoncentruj przefiltrowany sygnał anty-Stokesa przez szczelinę wejściową spektrometru i na detektorze sCMOS. Dostosuj kąty zarówno skanowania, jak i deskanowania galvo, aby upewnić się, że wiązka jest skanowana równolegle do długiej osi szczeliny, wyrównując optyczną płaszczyznę obrazu ze szczeliną. To precyzyjne wyrównanie maksymalizuje rozdzielczość spektralną i minimalizuje przesłuchy boczne sygnału w rzędach detektorów.
  11. Skonfiguruj spektrometr tak, aby rozpraszał widmo anty-Stokesa w pionie wzdłuż rzędów kamer. Wybierz odpowiednią siatkę (np. 300 linii/mm, przypaloną przy 700 nm), aby uzyskać optymalne pokrycie spektralne.

6. Optymalizacja sygnału i kalibracja rozdzielczości spektralnej

  1. Uruchom domowe oprogramowanie do akwizycji i rozpocznij monitorowanie sygnału w czasie rzeczywistym z kamery sCMOS. Oprogramowanie do akwizycji jest zbudowane w Pythonie 3.8+ (Windows 10) z zależnościami, w tym sterownikami Hamamatsu DCAM-API i Measurement Computing Universal Library, wyprowadzającymi dane w formacie HDF5. Oprogramowanie jest dostępne na uzasadnione żądanie autora korespondencyjnego.
  2. Przygotować próbkę do kalibracji spektralnej, umieszczając kroplę benzonitrylu między dwoma szkiełkami nakrywkowymi, aby utworzyć szczelne szkiełko. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i ustaw na nim ostrość za pomocą obiektywu wzbudzenia.
  3. Zlokalizuj sygnał BCARS w kamerze sCMOS. Dostosuj pozycję Z obiektywu zbierającego, aby zmaksymalizować intensywność sygnału anty-Stokesa.
  4. Dostosuj boczne położenie obiektywu zbierającego, aby upewnić się, że światło anty-Stokesa jest prawidłowo skupione przez szczelinę wejściową spektrometru. To wyrównanie zapewnia optymalne sprzężenie ze spektrometrem i lepszą wierność spektralną.
  5. Zoptymalizuj przestrzenne nakładanie się superkontinuum (SC) i wiązek sondy na płaszczyźnie próbki. Użyj luster w ścieżce wiązki sondy, aby precyzyjnie dostosować jej położenie boczne i kąt padania.
  6. Przesuń optyczną linię opóźnienia na ścieżce wiązki sondy, aby zapewnić czasowe nakładanie się impulsów SC. Monitoruj intensywność sygnału i dostosuj, aż sygnał anty-Stokesa zostanie zmaksymalizowany, potwierdzając prawidłową synchronizację czasową.
  7. Zidentyfikuj silny, ostry pik Ramana w benzonitrylu (np. 1002 cm-1) na obrazie sCMOS.
  8. Zapisz długość fali sondy i odpowiadającą jej pozycję pikseli w kamerze. Użyj linii Rayleigha (0 cm-1 na długości fali sondy) i znanych szczytów Ramana benzonitrylu na 1002 cm-1 i 3073 cm-1 , aby ustalić liniowe mapowanie pikseli na liczby falowe w detektorze sCMOS. Linia Rayleigha zapewnia odniesienie do zerowej liczby falowej, podczas gdy piki benzonitrylu określają przyrost liczby falowej na piksel.
    UWAGA: Ponieważ analiza wymaga tylko względnych informacji o liczbie falowej (mapowanie między położeniem piksela a przesunięciem Ramana), bezwzględna kalibracja długości fali przy użyciu lamp emisyjnych nie jest konieczna.
  9. Wprowadź mapowanie liczby falowej piksela do oprogramowania do akwizycji. Kalibracja ta powinna pozostać ważna, chyba że zostaną wprowadzone zmiany w ścieżce optycznej, ustawieniu siatki w spektrometrze lub wyrównaniu.

7. Akwizycja sygnału

  1. Załadować próbkę C. elegans przygotowaną w krokach od 1.1 do 1.6 na stolik mikroskopu. Zlokalizuj obszar zainteresowania i ustaw na nim ostrość za pomocą celu wzbudzenia.
  2. Zidentyfikuj obszar na szkiełku, w którym brakuje aktywnego sygnału Ramana (tło wodne lub szkiełko nakrywkowe), które posłuży jako odniesienie do tła nierezonansowego (NRB).
  3. Zlokalizuj sygnał BCARS na detektorze sCMOS. Dostosuj pozycję Z obiektywu zbierającego, aby zmaksymalizować intensywność sygnału anty-Stokesa.
  4. Dostosuj boczne położenie obiektywu zbierającego, aby upewnić się, że światło anty-Stokesa jest prawidłowo ustawione przez szczelinę wejściową spektrometru.
  5. Rozpocznij zsynchronizowane skanowanie i deskanowanie luster galvo za pomocą FPGA. Dostosuj amplitudę galvo deskanującego za pomocą potencjometru cyfrowego, aż odchylenie kątowe od skanowania pierwotnego zostanie w pełni skompensowane. Sygnał anty-Stokesa powinien pozostać zamknięty w ~12 rzędach na kamerze w całym zakresie skanowania.
  6. Definiowanie czasowej sekwencji akwizycji
    1. Uzyskaj sygnał korelacji krzyżowej między impulsami SC a sondą, opóźniając impuls sondy. Aby to uzyskać, należy wykreślić zintegrowany trójkolorowy sygnał BCARS w funkcji opóźnienia czasowego impulsu sondy. Najsilniejszy sygnał pojawi się w czasie 0, gdy impulsy SC i sondy czasowo się na siebie nakładają.
      UWAGA: Ponieważ systemy detekcji FLIM i TPEF mają ten sam spust co BCARS, ich sygnały są jednocześnie odbierane w tym punkcie czasowym.
    2. Zapis z późniejszym opóźnieniem wiązki sondy (np. 1-2 ps) dla BCARS i późniejszym opóźnieniem wiązki SC dla nierezonansowego tła (widma NRB na rysunku 6A). Gdy do impulsu wąskopasmowego (sondy) zostanie zastosowane opóźnienie czasowe, NRB w trójkolorowym sygnale CARS może być skutecznie stłumiony, a tym samym można poprawić stosunek sygnału do szumu67.
    3. Uzyskaj ciemny obraz bez czasowego nakładania się między SC a sondą, aby uchwycić szum detektora linii bazowej (ciemne odniesienie).
    4. Zapisz wszystkie BCARS, NRB i ciemne obrazy, w tym metadane, w jednym pliku h5.
  7. Protokół przetwarzania sygnału BCARS
    1. Otwórz oprogramowanie CRIkit268.
    2. Załaduj wszystkie niezbędne zestawy danych za pomocą narzędzia Open HDF, jak pokazano na rysunku 6B: Załaduj dane hiperspektralne BCARS, odniesienie NRB i ciemne odniesienie. Wybierz obszar częstotliwości w paśmie generowania sygnału BCARS za pomocą narzędzia Freq Window (od 400 cm-1 do ≥ 3200 cm-1 dla systemu BCARS pokazanego tutaj).
    3. Wykonaj kroki przetwarzania wstępnego:
      1. Użyj narzędzia Anscombe (jak pokazano na rysunku 6B), aby ustabilizować wariancję zestawów danych BCARS i NRB.
      2. Użyj narzędzia De-noise , aby przeprowadzić dekompozycję wartości osobliwych (SVD): Zachowaj główne komponenty na podstawie kontroli wizualnej. Zachowaj składniki wykazujące rozkłady przestrzenne zgodne z morfologią próbki i odrzuć składniki zdominowane przez szum nieustrukturyzowany lub przypominający plamki. Ten etap odszumiania poprawia stosunek sygnału do szumu (SNR), szczególnie w przypadku cech spektralnych o niskiej intensywności.
      3. Użyj narzędzia Odwrócony Anscombe , aby przywrócić dane do ich pierwotnej domeny.
        UWAGA: Te kroki można pominąć, jeśli wykonujesz przetwarzanie w czasie rzeczywistym podczas pozyskiwania.
    4. Pobieranie widm podobnych do widm Ramana za pomocą transformaty Kramersa-Kroniga (KK):
      1. Otwórz narzędzie KK (jak pokazano na rysunku 6B).
      2. Włącz Norm do NRB , aby zapewnić odpowiednią normalizację odniesienia spektralnego.
      3. Ustaw parametry, w tym odchylenie NRB, współczynnik dopełnienia i uśrednianie pikseli krawędzi.
      4. Wykonaj transformację KK, aby uzyskać odzyskane widma Ramana.
    5. Wykonywanie korekcji błędów po KK
      1. Korygowanie błędów fazowych za pomocą wygładzania Savitzky'ego-Golaya: Otwórz narzędzie do korekcji błędów fazy (Rysunek 6B). Dostosuj rozmiar okna wygładzania i kolejność wielomianów. Sprawdź oryginalne i poprawione widma za pomocą panelu podglądu .
      2. Korygowanie błędów skali: Otwórz narzędzie do korekcji błędów skali (Rysunek 6B). Normalizuj widma, aby skorygować skalowanie intensywności względnej w zestawie danych. Zapewnij spójność w wymiarach przestrzennych i spektralnych.
    6. Kalibracja osi widmowej (opcjonalnie, jeśli jest niewspółosiowa): Otwórz narzędzie do kalibracji (Rysunek 6B). Porównaj zmierzone liczby falowe ze znanymi pikami odniesienia. Zastosuj skorygowane nachylenie/punkt przecięcia, aby ponownie wyrównać oś widma.
    7. Definiowanie i wyodrębnianie danych z obszarów zainteresowania (ROI)
      1. Skorzystaj z widma ROI. lub Pt Spect. (Rysunek 6B) do oznaczania przestrzennych obszarów zainteresowania lub punktów zainteresowania na obrazie BCARS.
      2. Wizualizuj i porównuj zawartość spektralną różnych ROI.
      3. Eksport pobranych widm w celu dalszej analizy ilościowej lub chemometrycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 5 przedstawia zmierzone widma sondy wąskopasmowej oraz impulsów szerokopasmowego superkontinuum (SC) wykorzystywanych do wzbudzenia BCARS. Impuls sondy, generowany przez generowanie drugiej harmonicznej sygnału ~1530 nm z domowego optycznego oscylatora parametrycznego (OPO, rysunek 3), jest wyśrodkowany na 764,2 nm z pełną szerokością w połowie maksimum (FWHM) 0,2 nm, zapewniając rozdzielczość spektralną na poziomie ~6,8 cm-1 w wyniko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Praca ta szczegółowo demonstruje architekturę BCARS i platformy obrazowania 2p-FLIM/TPEF. Podczas gdy w naszej obecnej konfiguracji używany jest laser o podwójnej mocy 1030 nm, większość laserów światłowodowych fs 1030 nm o dużej mocy może być używana jako główne źródło lasera do budowy mikroskopu BCARS. Dzięki starannemu doborowi długości i okresu kryształów OPO/SHG PPLN, możliwe jest wygenerowanie impulsu sondy o wartości kilku ps za pomocą pompy sub-ps OPO 1030 nm. Chociaż wykazano tutaj stosunkowo wysoką częstotliwoś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia i nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

W-W.C. potwierdza wsparcie ze strony NIH (R21AG086974). M.T.C. dziękuje za wsparcie ze strony Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych (DOE BERDE-SC0022121).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
KameraHamamatsuORCA-FuzjasCMOS, 2304 razy; 2304 pikseli
Cel zbierania danych  Olympus  LUMPLFLN60XW  Zanurzenie w wodzie, 1.0 BRAK danych
DAQ (Język DAQ)  Pilny  MCC USB-1208HS  Karta akwizycji danych
Linia opóźniająca  Newport  Zobacz materiał DL225  Mechaniczne opóźnienie impulsu sondy
Dichroicznych  Semrock  FF925-DI01  połączenie sondy i SC
Dichroicznych  Semrock  FF705-Di01  Wykrywanie fluorescencji w trybie epi
Dichroicznych  Tholabs powiedział:  DMLP550R  separacja sygnału FLIM i sygnału TPEF
Cel wzbudzenia  Olympus  UPLSAPO60XWIR  Zanurzenie w wodzie, 1.2 NA
Filtr  Semrock  Zobacz materiał FF01-1326/SP-25  Odrzuć podstawowy laser po SHG
Filtr  Semrock  FF01-758/SP  Odrzuć podstawowy laser przed kamerą BCARS
Filtr  Tholabs powiedział:  FESH0650  Odrzuć laser podstawowy przed modalnością fluorescencji
FLIM PMT  PicoQuant (Czujnik PicoQuant)  Hybrydowy PMA  Detektor pojedynczych fotonów FLIM
Układ FPGA  Czerwona Pitaja  STEMlab 125-14  Synchronizacja i wyzwalanie skanowania
Galvo powiedział:  Tholabs powiedział:  Zobacz materiał GVS101  Do skanowania i deskanowania
Krata  Spójne  ŚwiatłoSmyth 1040nm  1000 Groves/mm, wstępne ćwierkanie dla SC
Płyta półfalowa  Tholabs powiedział:  AHWP05M-980  Kontrola polaryzacji
Kostka K  Tholabs powiedział:  Zobacz materiał KPA101 Sterownik PSD do automatycznego wyrównywania
Laser  Instrumenty perspektywiczne  FSX-Podwójny  Laser femtosekundowy z podwójnym wyjściem
Laser  Spójne  Mira-900 powiedział:  Laser femtosekundowy do wzbudzenia fluorescencji
PBS  Tholabs powiedział:  PBS255 powiedział:  Kombinacja wiązki dla SC i sondy
PCF  Tholabs powiedział:  LMA-PM-5  10 cm fotoniczne włókno krystaliczne do generacji SC
PD  Tholabs powiedział:  PDA100A2  Pętla sprzężenia zwrotnego OPO
Mocowanie lustra piezoelektrycznego  Tholabs powiedział:  POLARIS-K1S2P  Regulator piezoelektryczny do automatycznego wyrównywania
Przedwzmacniacz  EdmundOptyka  59-179  Przedwzmacniacz TPEF
Pryzmat  Optyka Lambda Research  EQP-30SF10  Kompresja SC
Dyrektywa PSD  Tholabs powiedział:  PDQ80A (biblioteka PDQ80A)  Detektor czułości położenia dla automatycznego wyrównywania
Spektrometr  Instrumenty Teledyne Princeton  Samolot izopłaski 160  Krata 300 g/mm, wyśrodkowana przy 700 nm
Scena  ASI  Przekaźnik MS-2000  Zmotoryzowany stolik 3-osiowy
TCSPC powiedział:  PicoQuant (Czujnik PicoQuant)  MultiHarfa 150  Urządzenie do liczenia fotonów dla FLIM
TPEF PMT  Hamamatsu  H9305-03  Detektor TPEF
Soczewka tubusu  Tholabs powiedział:  TL200-2P2  Używany w systemie deskanowania

Bibliografia

  1. Cutshaw, G., et al. The emerging role of Raman spectroscopy as an omics approach for metabolic profiling and biomarker detection toward precision medicine. Chem Rev. 123 (13), 8297-8346 (2023).
  2. Kong, K., Kendall, C., Stone, N., Notingher, I. Raman spectroscopy for medical diagnostics - from in vitro biofluid assays to in vivo cancer detection. Adv Drug Deliv Rev. 89, 121-134 (2015).
  3. Abramczyk, H., et al. Aberrant protein phosphorylation in cancer by using Raman biomarkers. Cancers (Basel). 11 (12), 2017(2019).
  4. Contorno, S., Darienzo, R. E., Tannenbaum, R. Evaluation of aromatic amino acids as potential biomarkers in breast cancer by Raman spectroscopy analysis. Sci Rep. 11 (1), 1698(2021).
  5. John, R. V., et al. Micro-Raman spectroscopy study of blood samples from myocardial infarction patients. Lasers Med Sci. 37 (9), 3451-3460 (2022).
  6. You, A. Y. F., et al. Raman spectroscopy imaging reveals interplay between atherosclerosis and medial calcification in the human aorta. Sci Adv. 3 (12), e1701156(2017).
  7. Carlomagno, C. Human salivary Raman fingerprint as biomarker for the diagnosis of amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 10 (1), 10175(2020).
  8. Morasso, C. F., et al. Raman spectroscopy reveals biochemical differences in plasma derived extracellular vesicles from sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Nanomedicine. 29, 102249(2020).
  9. Pezzotti, G. Raman spectroscopy in cell biology and microbiology. J Raman Spectrosc. 52 (12), 2348-2443 (2021).
  10. Dodo, K., Fujita, K., Sodeoka, M. Raman spectroscopy for chemical biology research. J Am Chem Soc. 144 (43), 19651-19667 (2022).
  11. Hamada, K., et al. Raman microscopy for dynamic molecular imaging of living cells. J Biomed Opt. 13 (4), 044027(2008).
  12. Ichimura, T., et al. Non-label immune cell state prediction using Raman spectroscopy. Sci Rep. 6 (1), 37562(2016).
  13. Germond, A., Panina, Y., Shiga, M., Niioka, H., Watanabe, T. M. Following embryonic stem cells, their differentiated progeny, and cell-state changes during IPS reprogramming by Raman spectroscopy. Anal Chem. 92 (22), 14915-14923 (2020).
  14. Zahn, J., Germond, A., Lundgren, A. Y., Cicerone, M. T. Discriminating cell line specific features of antibiotic-resistant strains of Escherichia coli from Raman spectra via machine learning analysis. J Biophotonics. 15 (7), e202100274(2022).
  15. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  16. Nitta, N., et al. Raman image-activated cell sorting. Nat Commun. 11 (1), 3452(2020).
  17. Shipp, D. W., Sinjab, F., Notingher, I. Raman spectroscopy: techniques and applications in the life sciences. Adv Opt Photon. 9 (2), 315-428 (2017).
  18. Kong, C., et al. High-contrast, fast chemical imaging by coherent Raman scattering using a self-synchronized two-colour fibre laser. Light Sci Appl. 9 (1), 25(2020).
  19. Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. C. Lipid metabolism and lipid signals in aging and longevity. Dev Cell. 56 (10), 1394-1407 (2021).
  20. Fueser, H., Pilger, C., Kong, C., Huser, T., Traunspurger, W. Polystyrene microbeads influence lipid storage distribution in C. elegans as revealed by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Environ Pollut. , 294-118662 (2022).
  21. Lee, J., et al. Label-free multiphoton imaging of microbes in root, mineral, and soil matrices with time-gated coherent Raman and fluorescence lifetime imaging. Environ Sci Technol. 56 (3), 1994-2008 (2022).
  22. Sheng, M., et al. Single source CARS-based multimodal microscopy system for biological tissue imaging. Biomed Opt Express. 15 (1), 131-141 (2024).
  23. Zeng, Q., et al. Label-free Raman imaging for screening of anti-inflammatory function food. Food Chem X. 22, 101297(2024).
  24. Zhang, J., et al. High-throughput single-cell sorting by stimulated Raman-activated cell ejection. Sci Adv. 10 (50), eadn6373(2024).
  25. Yang, L., Iyer, R. R., Sorrells, J. E., Renteria, C. A., Boppart, S. A. Temporally optimized and spectrally shaped hyperspectral coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Opt Express. 32 (7), 11474-11490 (2024).
  26. Pegoraro, A. F., Stolow, A. Chirp modulation stimulated Raman scattering microscopy. Opt Express. 32 (18), 31297-31310 (2024).
  27. Zhang, Y., et al. Rapid coherent Raman hyperspectral imaging based on delay-spectral focusing dual-comb method and deep learning algorithm. Opt Lett. 48 (3), 550-553 (2023).
  28. Sorrells, J. E., et al. Programmable hyperspectral coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Opt Lett. 49 (9), 2513-2516 (2024).
  29. De la Cadena, A. Multiplex chemical imaging based on broadband stimulated Raman scattering microscopy. J Vis Exp. (185), e63709(2022).
  30. Zhang, S., He, Y., Yue, S. Coherent Raman scattering imaging of lipid metabolism in cancer. J Innov Opt Health Sci. 16 (3), 2230015(2023).
  31. Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nat Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
  32. Camp, C. H. High-speed coherent Raman fingerprint imaging of biological tissues. Nat Photonics. 8 (8), 627-634 (2014).
  33. Camp, C. H., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Quantitative comparable coherent anti-Stokes Raman scattering spectroscopy: correcting errors in phase retrieval. J Raman Spectrosc. 47 (4), 408-415 (2015).
  34. Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nat Chem Biol. 16 (10), 1087-1095 (2020).
  35. Poorna, R., Chen, W. W., Qiu, P., Cicerone, M. T. Toward gene-correlated spatially resolved metabolomics with fingerprint coherent Raman imaging. J Phys Chem B. 127 (25), 5576-5587 (2023).
  36. Vernuccio, F., et al. Full-spectrum CARS microscopy of cells and tissues with ultrashort white-light continuum pulses. J Phys Chem B. 127 (21), 4733-4745 (2023).
  37. Murakami, Y., et al. Molecular fingerprinting of mouse brain using ultrabroadband coherent anti-stokes Raman scattering microspectroscopy empowered by multivariate curve resolution-alternating least squares. Chem Biomed Imaging. 2 (10), 689-697 (2024).
  38. Muddiman, R., Harkin, S., Butler, M., Hennelly, B. Broadband CARS hyperspectral classification of single immune cells. J Biophotonics. 18 (3), e202400382(2025).
  39. Dixon, J. Z., Chen, W. W., Xu, H., Audier, X., Cicerone, M. T. Broadband coherent anti-stokes Raman scattering microscopy for rapid, label-free biological imaging. Rev Sci Instrum. 96 (4), 043706(2025).
  40. Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Opt Lett. 34 (9), 1363-1365 (2009).
  41. Rinia, H. A., Bonn, M., Müller, M., Vartiainen, E. M. Quantitative CARS spectroscopy using the maximum entropy method: The main lipid phase transition. Chemphyschem. 8 (2), 279-287 (2007).
  42. Cicerone, M. T., Aamer, K. A., Lee, Y. J., Vartiainen, E. Maximum entropy and time-domain Kramers-Kronig phase retrieval approaches are functionally equivalent for CARS microspectroscopy. J Raman Spectrosc. 43 (5), 637-643 (2012).
  43. Houhou, R., et al. Deep learning as phase retrieval tool for CARS spectra. Opt Express. 28 (14), 21002-21024 (2020).
  44. Wang, Z., et al. Vector: Very deep convolutional autoencoders for non-resonant background removal in broadband coherent anti-stokes Raman scattering. J Raman Spectrosc. 53 (6), 1081-1093 (2022).
  45. Camp, C. H. Raman signal extraction from CARS spectra using a learned-matrix representation of the discrete Hilbert transform. Opt Express. 30 (15), 26057-26071 (2022).
  46. Junjuri, R., Saghi, A., Lensu, L., Vartiainen, E. M. Evaluating different deep learning models for efficient extraction of Raman signals from CARS spectra. Phys Chem Chem Phys. 25, 16340-16353 (2023).
  47. Vernuccio, F., et al. Non-resonant background removal in broadband CARS microscopy using deep-learning algorithms. Sci Rep. 14 (1), 23903(2024).
  48. Yao, B., et al. Recent progress in deep learning for improving coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Laser Photonics Rev. 18 (11), 2400562(2024).
  49. Bestvater, F., et al. Two-photon fluorescence absorption and emission spectra of dyes relevant for cell imaging. J Microsc. 208 (2), 108-115 (2002).
  50. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
  51. Zhu, H., Fan, J., Du, J., Peng, X. Fluorescent probes for sensing and imaging within specific cellular organelles. Acc Chem Res. 49 (10), 2115-2126 (2016).
  52. Wu, L., Liu, J., Li, P., Tang, B., James, T. D. Two-photon small-molecule fluorescence-based agents for sensing, imaging, and therapy within biological systems. Chem Soc Rev. 50, 702-734 (2021).
  53. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chem Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
  54. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).
  55. Lin, H. J., Herman, P., Lakowicz, J. R. Fluorescence lifetime-resolved pH imaging of living cells. Cytometry A. 52 (2), 77-89 (2003).
  56. Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. Molecular rotor measures viscosity of live cells via fluorescence lifetime imaging. J Am Chem Soc. 130 (21), 6672-6673 (2008).
  57. Wang, B., et al. Bipolar and fixable probe targeting mitochondria to trace local depolarization via two-photon fluorescence lifetime imaging. Analyst. 140, 5488-5494 (2015).
  58. Despa, S., Vecer, J., Steels, P., Ameloot, M. Fluorescence lifetime microscopy of the Na+ indicator sodium green in HeLa cells. Anal Biochem. 281 (2), 159-175 (2000).
  59. Wilms, C. D., Eilers, J. Photophysical properties of Ca2+-indicator dyes suitable for two-photon fluorescence-lifetime recordings. J Microsc. 225 (3), 209-213 (2007).
  60. König, K. Review: Clinical in vivo multiphoton FLIM tomography. Methods Appl Fluoresc. 8 (3), 034002(2020).
  61. Scipioni, L., Rossetta, A., Tedeschi, G., Gratton, E. Phasor s-FLIM: a new paradigm for fast and robust spectral fluorescence lifetime imaging. Nat Methods. 18 (5), 542-550 (2021).
  62. Ouyang, Y., Liu, J., Wang, Z. M., Liu, Z., Wu, M. FLIM as a promising tool for cancer diagnosis and treatment monitoring. Nano Micro Lett. 13 (1), 133(2021).
  63. Shirshin, E. A., et al. Label-free sensing of cells with fluorescence lifetime imaging: The quest for metabolic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (9), e2118241119(2022).
  64. Liu, Z. Mapping metabolic changes by noninvasive, multiparametric, high-resolution imaging using endogenous contrast. Sci Adv. 4 (3), eaap9302(2018).
  65. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  66. Chen, W. W., et al. Identifying lipid particle sub-types in live Caenorhabditis elegans with two-photon fluorescence lifetime imaging. Front Chem. 11, 1161775(2023).
  67. Littleton, B., Shah, P., Kavanagh, T., Richards, D. Three-color coherent anti-stokes Raman scattering with optical nonresonant background removal. J Raman Spectrosc. 50 (9), 1303-1310 (2019).
  68. Crikit2 software for BCARS data processing. , https://github.com/ccampjr/crikit2 (2025).
  69. Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol Cell Proteomics. 11 (8), 317-328 (2012).
  70. Hulsey-Vincent, H. J., Cameron, E. A., Dahlberg, C. L., Galati, D. F. Spectral scanning and fluorescence lifetime imaging microscopy enable separation and characterization of C. elegans autofluorescence in the cuticle and gut. Biol Open. 13 (12), bio060613(2024).
  71. Gottlieb, D., Asadipour, B., Kostina, P., Ung, T. P. L., Stringari, C. FLUTE: A Python GUI for interactive phasor analysis of FLIM data. Biol Imaging. 3, e21(2023).
  72. Weber, G. Resolution of the fluorescence lifetimes in a heterogeneous system by phase and modulation measurements. J Phys Chem. 85 (8), 949-953 (1981).
  73. Ranjit, S., Malacrida, L., Jameson, D. M., Gratton, E. Fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging data using the phasor approach. Nat Protoc. 13 (9), 1979-2004 (2018).
  74. Smolen, J. A., Wooley, K. L. Fluorescence lifetime image microscopy prediction with convolutional neural networks for cell detection and classification in tissues. PNAS Nexus. 1 (5), pgac235(2022).
  75. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nat Biomed Eng. 5 (1), 77-88 (2021).
  76. Vu, T., et al. Spatial transcriptomics using combinatorial fluorescence spectral and lifetime encoding, imaging and analysis. Nat Commun. 13 (1), 169(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie czasu ycia fluorescencjispektroskopia ramanowska z analiz sygnaturmikroskopia dwufotonowaprofilowanie metabolicznerozdzielczo subkom rkowaobrazowanie in vivoC eleganszielone bia ko fluorescencyjne
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.