Wzmacniający wpływ stymulacji mechanicznej na funkcję chondrogenną komórek macierzystych poduszeczki tłuszczowej

Summary

Badanie to koncentruje się na opracowaniu technologii multimodalnej łączącej cykliczną mechaniczną stymulację rozciąganiem (10% odkształcenie, 1 Hz) z terapią komórkami macierzystymi pochodzącymi z podrzepkowej poduszeczki tłuszczowej (IPFP-SCs), badając ich synergiczny wpływ na promowanie chondrogennego różnicowania IPFP-SC oraz ustanawiając bardziej wydajną strategię regeneracyjną dla inżynierii tkanki chrzęstnej.

Abstract

Podrzepkowa poduszeczka tłuszczowa (IPFP), wyspecjalizowana struktura włóknisto-tłuszczowa w przednim przedziale stawu kolanowego, charakteryzuje się unikalną mikroarchitekturą z przeplatającymi się wiązkami kolagenu i zrazikami tłuszczowymi, które wspólnie określają jej lepkosprężyste właściwości biomechaniczne. Pojawiające się dowody podkreślają charakterystyczny profil transkrypcyjny IPFP-SC, a w szczególności ich związek z mediatorami degradacji chrząstki podczas progresji choroby zwyrodnieniowej stawów. Ostatnie badania pokazują, że dynamiczna kompresja i ciśnienie hydrostatyczne skutecznie zwiększają różnicowanie chondrogenne mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących zarówno ze szpiku kostnego, jak i IPFP, jednocześnie hamując odkładanie się zwapnień. W badaniu tym wykorzystano system rozciągania komórek do symulacji cyklicznego środowiska naprężeń mechanicznych stawu kolanowego, wykazując, że dynamiczna stymulacja rozciągania (10% odkształcenie, 1 Hz) znacznie zwiększa zdolność różnicowania chondrogennego IPFP-SC. Poprawa ta przejawiała się zwiększoną ekspresją markerów chondrogennych, w tym SOX9 i COMP, co potwierdza, że specyficzne dla stawów mikrośrodowisko mechaniczne odgrywa kluczową rolę regulacyjną w końcowym różnicowaniu mezenchymalnych komórek macierzystych. Wyniki te dostarczają kluczowych dowodów eksperymentalnych dotyczących strategii regeneracji tkanki chrzęstnej, podkreślając znaczenie modulacji biomechanicznej w terapiach regeneracyjnych dla naprawy chrząstki.

Introduction

Regeneracja i naprawa tkanki chrzęstnej stanowią główne wyzwanie w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów, ponieważ konwencjonalne terapie komórkowe często nie są w stanie zrekonstruować funkcjonalnych matryc chrząstki z powodu nieodpowiedniej regulacji mikrośrodowiska. W ostatnich latach strategie multimodalne łączące fizyczną stymulację mechaniczną z terapią komórkową stały się jednym z obszarów badawczych¹, mających na celu zwiększenie potencjału różnicowania chondrogennego komórek macierzystych poprzez symulację mikrośrodowisk biomechanicznych in vivo . Badanie to koncentruje się na opracowaniu multimodalnej technologii łączącej cykliczną mechaniczną stymulację rozciąganiem (10% odkształcenie, 1 Hz) z terapią IPFP-SCs, badając ich synergiczny wpływ na promowanie chondrogennego różnicowania IPFP-SC oraz ustanawiając bardziej wydajną strategię regeneracyjną dla inżynierii tkanki chrzęstnej.

Głównym celem tego badania jest zwiększenie zdolności chondrogennej IPFP-SC poprzez dynamiczną stymulację rozciągania. Wcześniejsze badania wykazały, że sygnały mechaniczne mogą napędzać chondrogenne różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) poprzez regulację reorganizacji cytoszkieletu, aktywację kanałów jonowych (np. Piezo1) i dalsze szlaki sygnałowe (np. oś YAP-SOX9)². Istniejąca literatura dostarcza krytycznych informacji na temat synergicznych efektów stymulacji multimodalnej. Buckley i Kelly i in. potwierdzili, że okresowe ciśnienie hydrostatyczne stabilizuje fenotypy chondrogenne poprzez zwiększenie odkładania się sGAG i kolagenu typu II³. Guo i wsp. stwierdzili, że hodowla dynamiczna w połączeniu z odpowiednią stymulacją mechaniczną ułatwia efektywną ekspansję komórek progenitorowych, umożliwiając wytwarzanie klinicznie istotnych chondrocytów stawowych do naprawy ubytków chrząstki. Jednak samo naprężenie ścinające spowodowało gorsze zróżnicowanie chondrogenne hMSC w porównaniu z warunkami statycznymi, podczas gdy dodatkowe obciążenie kompresyjne regulowało w górę markery chondrogenne, takie jak Sox9, aggrekan i kolagen typu II⁴. Warto zauważyć, że samo naprężenie ścinające nie indukuje znaczącej ekspresji genów specyficznych dla chrząstki⁵. Zhang i wsp. wykazali ponadto, że połączenie stymulacji mechanicznej z czynnikami egzogennymi (np. SOX-9) znacznie poprawia efektywność różnicowania⁶. Badania pokazują, że kompresja dynamiczna indukuje różnicowanie chondrogenne, podczas gdy hamowanie szlaku ERK1/2 znosi tę odpowiedź. I odwrotnie, hamowanie ERK1/2 pod wpływem dynamicznej kompresji zwiększa różnicowanie osteogenne, charakteryzujące się zwiększoną ekspresją fosfatazy alkalicznej (ALP), kolagenu typu I (COLI) i osteokalcyny (OCN)⁷. Opierając się na tych odkryciach, w badaniu przyjęto stymulację rozciągania jako podstawową interwencję, badając jej synergiczną rolę z endogennymi szlakami sygnałowymi w IPFP-SC (np. aktywacja kalcyneuryny za pośrednictwem Piezo1)². Podejście to jest bardziej zgodne z multimodalnym środowiskiem mechanicznym ruchu stawów. Ponadto ostatnie badania podkreślające czasoprzestrzenną specyfikę stymulacji mechanicznej⁸ wpływają na projekt protokołu stopniowego ładowania w tym badaniu.

W porównaniu z konwencjonalną hodowlą statyczną, technologia ta wprowadza innowacje w dwóch kluczowych aspektach. Po pierwsze, wdrażany jest protokół opóźnionej stymulacji, aby uniknąć wczesnego hamującego wpływu obciążenia mechanicznego na różnicowanie. Na przykład Luo i in. wykazali, że kompresja dynamiczna zastosowana 21 dni po enkapsulacji komórki znacznie zwiększa chondrogenezę w BMSC⁹, co jest zasadą zintegrowaną z obecnym protokołem ładowania. Po drugie, precyzyjny system stymulacji mechanicznej umożliwia dokładną kontrolę parametrów naprężeń rozciągających (intensywność, częstotliwość i czas trwania), odtwarzając fizjologicznie istotne warunki biomechaniczne. Precyzyjna kontrola parametrów ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych wyników, ponieważ nadmierne obciążenie mechaniczne może wywołać uszkodzenie komórek¹⁰, podczas gdy nadmiernie uproszczone środowiska mechaniczne mogą przynieść efekt przeciwny do zamierzonego¹¹. Zainspirowane zaawansowanymi systemami sprzęgania multimechanicznego⁵ opracowane urządzenie zapewnia stabilną i powtarzalną stymulację, przy zachowaniu wysokiej skalowalności do zastosowań translacyjnych. Co więcej, wykorzystanie unikalnych zalet IPFP-SC, w tym ich homologii rozwojowej z chrząstką stawową i wysokiego potencjału chondrogennego3, zwiększa kliniczną wykonalność technologii.

Badanie to naprzód mechanistyczną wiedzę na temat chondrogenezy IPFP-SC i wspiera rozwój klinicznych strategii naprawy chrząstki. Integrując multimodalną stymulację mechaniczną z terapią komórkową, technologia ta rozwiązuje problemy tradycyjnych metod i dostarcza informacji na temat pooperacyjnych protokołów rehabilitacji biomechanicznej. Podsumowując, dzięki innowacyjnej integracji stymulacji rozciągania i terapii IPFP-SCs, badanie to ma na celu opracowanie skutecznej i kontrolowanej strategii regeneracji chrząstki. Jego konstrukcja w dużym stopniu opiera się na wcześniejszych badaniach mechanobiologicznych, otwierając jednocześnie nowe możliwości klinicznego przełożenia technologii inżynierii tkankowej.

Protocol

Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Szpitala Ludowego Regionu Autonomicznego Mongolii Wewnętrznej (SC-07/01KT2024008). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Rozmrażanie i rozszerzanie IPFP-SC

1. Rozmrozić IPFP-SC.
   1. Szybko rozmrozić kriokonserwowane IPFP-SC (P2-P5) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
   2. Przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej wstępnie podgrzaną kompletną pożywkę wzrostową (α-DMEM + 10% FBS + 1% penicyliny/streptomycyny).
   3. Wirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżej pożywce wzrostowej.
2. Rozwiń komórki.
   1. Zasiać komórki w dwóch 10-centymetrowych szalkach hodowlanych o gęstości 5,000-8,000 komórek/cm². Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
   2. Wymieniaj pożywkę co 2-3 dni, aż komórki osiągną 80-90% konfluencji.
   3. Pasażuj komórki za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA i utrzymuj w hodowli przez kolejne etapy.

2. Komórki wysiewające do różnicowania chondrogennego

1. Przygotować zawiesinę komórkową.
   1. Trawić komórki 0,25% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C przez 5 minut, gdy osiągną 80%-90% konfluencji.
   2. Dodaj kompletną pożywkę w stosunku 1:1, aby zakończyć trawienie.
   3. Wirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżej pożywce wzrostowej.
2. Zasiej komórki.
   1. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
   2. Rozcieńczyć zawieszone komórki do gęstości 4 × 10⁵ komórek na komorę specjalistycznego naczynia hodowlanego.
   3. Umieść komory w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ na 12-16 godzin, aby umożliwić pełne przyłączenie komórek.

3. Wstępna kultura chondropeczna

1. Zainicjuj wstępne różnicowanie.
   1. Usuń pożywkę wzrostową z komór.
   2. Przepłukać komórki dwukrotnie 1× DPBS (wstępnie podgrzanym do 37 °C) w celu usunięcia resztek surowicy i zanieczyszczeń.
   3. Umyj komórki dwukrotnie wstępnie zmieszaną pożywką do indukcji chondrogenicznej (bez czynników wzrostu).
   4. Zastąp medium myjące kompletnym chondrogeniowym medium indukcyjnym.
   5. Utrzymywać kultury w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 3 dni.
2. Monitoruj morfologię komórki.
   1. Potwierdź przyleganie komórek i wczesną agregację za pomocą mikroskopii.

4. Cykliczna stymulacja mechaniczna przy rozciąganiu (dzień 7)

1. Przygotuj urządzenie do stymulacji mechanicznej.
   1. Wysterylizuj urządzenie i komory hodowlane 75% etanolem, a następnie naświetl je promieniowaniem UV.
   2. Skalibruj jednoosiowy system rozciągania komórek, aby zapewnić 10% odkształcenia z częstotliwością 1 Hz.
2. Zainicjuj stymulację.
   1. Stosować cykliczne naprężenie rozciągające (10% odkształcenie, 1 Hz) przez 1 godzinę dziennie przez 7 kolejnych dni.
   2. Utrzymywać warunki środowiskowe na poziomie 37 °C z 5% CO₂ przez cały okres stymulacji.
   3. Pożywkę do indukcji chondrogennej należy wymieniać co 72 godziny.
3. Konfiguracja sterowania
   1. Obejmują równoległe statyczne komory kontrolne bez stymulacji mechanicznej w identycznych warunkach hodowli.

5. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Przygotowanie i cięcie próbki
   1. Przetnij mechanicznie stymulowaną błonę komórkową sterylnymi nożyczkami chirurgicznymi lub skalpelem, aby dopasować ją do wielkości i kształtu naczynia konfokalnego.
   2. Upewnij się, że przycięta próbka całkowicie zakrywa obszar obrazowania naczynia.
2. Napraw komórki.
   1. Umyj komórki dwukrotnie PBS.
   2. Utrwalić 4% paraformaldehydem (PFA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
   3. Traktuj 0,1% Triton X-100 w PBS przez 10 minut w RT.
   4. Umyć dwukrotnie PBS.
   5. Blokuj z 2% BSA w PBS przez 30 minut w RT.
3. Bejca do markerów.
   1. Inkubować próbkę przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w roztworze blokującym: anty-SOX9 (1:200) i anty-COMP (1:200).
   2. Przemyć próbkę 3 razy za pomocą PBS.
   3. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe sprzężone fluorescencyjnie w PBS w stosunku 1:1000.
   4. Dodać 100 μl rozcieńczonego roztworu przeciwciał drugorzędowych, aby pokryć próbkę.
   5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na wytrząsarce orbitalnej chronionej przed światłem.
   6. Przemyć próbkę 3 razy za pomocą PBS.
4. Akwizycja obrazu
   1. Wizualizacja próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
   2. Rób zdjęcia przy stałych ustawieniach ekspozycji.

6. Ilościowa analiza PCR (qPCR)

1. Ekstrakcja RNA
   1. Lizować komórki w odczynniku TRIzol.
   2. Wyizolować całkowite RNA zgodnie z protokołem producenta.
   3. Zmierz stężenie i czystość RNA za pomocą spektrofotometru.
2. Syntetyzuj cDNA.
   1. Odwrotna transkrypcja 1 μg RNA do cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA o dużej pojemności.
3. Wykonaj qPCR.
   1. Przygotuj reakcje qPCR przy użyciu SYBR Green Master Mix i specyficznych starterów dla markerów chondrogennych (SOX9, COMP) i genów porządkowych.
   2. Uruchom testy w trzech egzemplarzach w systemie PCR w czasie rzeczywistym. Uwzględnij kontrolki bez szablonu.

7. Powtarzalność

1. Sterylności
   1. Wykonaj wszystkie czynności pod okapem z przepływem laminarnym, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
2. Spójność parametrów
   1. Codziennie sprawdzaj ustawienia stymulacji mechanicznej (napięcie, częstotliwość i czas trwania).
3. Replikuje
   1. Uwzględnij co najmniej trzy kontrpróby biologiczne dla każdego warunku.
4. Normalizacja danych
   1. Normalizacja danych qPCR do genów porządkowych i kontroli statycznych.

Results

Reprezentatywne wyniki tego badania pokazują, że cykliczna mechaniczna stymulacja rozciągająca zwiększa chondrogenne różnicowanie IPFP-SC pod wpływem indukcji chondrogennej. W szczególności IPFP-SC poddane 7-dniowemu obciążeniu rozciągającemu wykazywały znaczną regulację w górę markerów chondrogennych na obu poziomach transkrypcji, o czym świadczy zwiększona ekspresja SOX9 i produkcja COMP w porównaniu ze statycznymi grupami kontrolnymi. Te skoordynowane reakcje molekularne i strukturalne potwierdzają, ...

Discussion

Przedstawiony protokół integruje cykliczną mechaniczną stymulację rozciąganiem (10% odkształcenia, 1 Hz) z IPFP-SC w celu zwiększenia różnicowania chondrogennego, rozwiązując krytyczne wyzwania związane z regeneracją chrząstki. Kluczowe etapy obejmują precyzyjną ekspansję komórek, etapową chondrogenną hodowlę wstępną (3 dni), opóźnioną stymulację mechaniczną (rozpoczętą w 3 dniu przez 7 dni) oraz analizę po stymulacji za pomocą immunofluorescencji (SOX9, COMP) i qPCR. Mechaniczna stymulacja protokołu, o...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehydu	Ostrze biologiczne	BL539A
Antyfluorescencyjny roztwór blokujący gaszenie (zawierający DAPI)	Beyotime	Zobacz materiał P0131
Rozwiązanie blokujące	Beyotime	Zobacz materiał P0260
Komora do hodowli komórkowych	TECHNOLOGIA LOTNICZA	AZ2020062530
Zbiornik komórkowy	KOMÓRKA & SIŁA
Przeciwciało pierwszorzędowe Col II	Księga Abcam	AB34712
Zestaw E.Z.N.A. HP Total RNA	OMEGA	Przekaźnik R6812-00S
Pierwszorzędowe przeciwciało F-aktyny	Technologia białkowa	PF00001
Surowica bydlęca płodu	Komórka Maks.	Zobacz materiał SA101.02
Koza do Rb IgG	Księga Abcam	AB50077
Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox Plus)	JASZCZUR	Numer katalogowy 11202ES50
Zestaw do indukcji chondrogennej ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych	Fuyuanbio powiedział:	FY200008
Biomikroskop odwrócony Leica DMi8	LEICA	DMi8 powiedział:
Przyrząd LightCycler 96	Roche	16056
MEM-α	Gibco (firma Gibco)	C12571500BT
PBS	Serwis bio	Zobacz materiał G4202
Penicylina-Streptomycyna-Amfoterycyna B	NCM Biotechnologia	Zobacz materiał C100C8
Przeciwciało pierwszorzędowe Piezo1	Technologia białkowa	15939-1-AP
Zestaw odczynników PrimeScript RT (Perfect Real Time)	Takara	Zobacz materiał RR037A
Przeciwciało pierwszorzędowe SOX9	Księga Abcam	AB185230
Silnik TritonX-100	SZYLD	SG6193 powiedział:
96-dołkowy termocykler Veriti Dx	Rybak termiczny	EN61326