Obrazowanie żywych komórek segregacji chromosomów podczas mejozy oocytów myszy

Podsumowanie

W tym miejscu podsumowujemy techniki obrazowania żywych komórek do badania segregacji chromosomów w oocytach myszy, używając H2B-RFP do chromatyny i SiR-tubuliny do wizualizacji wrzeciona. Szczegółowo opisujemy przygotowanie próbek, mikroiniekcję, hodowlę, konfigurację obrazowania i analizę, oferując praktyczny przewodnik po uzyskaniu wysokiej rozdzielczości i minimalnie fototoksycznego obrazowania dynamiki chromosomów mejotycznych.

Streszczenie

Dokładna segregacja chromosomów podczas mejozy oocytów jest niezbędna do zapewnienia prawidłowego rozwoju zarodka i zapobiegania zaburzeniom związanym z aneuploidią. Obrazowanie żywych komórek w połączeniu z technikami znakowania fluorescencyjnego stało się potężnym podejściem do badania dynamiki chromosomów mejotycznych z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. W tym protokole podsumowujemy kluczowe metodologie wizualizacji segregacji chromosomów w żywych oocytach myszy, koncentrując się na wykorzystaniu histonu H2B-RFP do znakowania chromatyny i SiR-tubuliny do śledzenia wrzeciona. Opisujemy procedury przygotowania próbki, mikroiniekcji mRNA, hodowli oocytów, konfiguracji komory obrazowania żywych komórek i ustawień mikroskopii konfokalnej, wszystkie zoptymalizowane w celu uzyskania obrazowania w wysokiej rozdzielczości przy jednoczesnej minimalizacji fototoksyczności. Ponadto zwracamy uwagę na krytyczne kwestie eksperymentalne, takie jak fototoksyczność, przetwarzanie obrazu i analiza ilościowa zdarzeń mejotycznych. Zapewniając kompleksową ocenę obecnych metodologii, protokół ten służy jako praktyczny przewodnik dla badaczy chcących zbadać dynamikę chromosomów w żywych oocytach oraz poprawić dokładność i odtwarzalność badań mejotycznych.

Wprowadzenie

Dokładna wizualizacja dynamiki chromosomów i wrzecion podczas mejozy oocytów ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów rządzących dojrzewaniem gamet żeńskich i ryzykiem aneuploidii 1,2,3,4,5. Oocyty ssaków przechodzą wysoce skoordynowaną serię zdarzeń mejotycznych, w tym rozpad pęcherzyków rozrodczych (GVBD), kondensację chromosomów, składanie wrzeciona i asymetryczny podział⁶. Chociaż obrazowanie ze stałym punktem czasowym dostarczyło cennych migawek tych procesów, brakuje mu rozdzielczości czasowej i nie jest w stanie uchwycić przejściowych lub gwałtownych zdarzeń, które występują między interwałami próbkowania. Z kolei obrazowanie żywych komórek znakowanych fluorescencyjnie chromosomów i mikrotubul oferuje skuteczne podejście do monitorowania tych dynamicznych procesów w czasie rzeczywistym ^2,3,7. Pozwala to na bezpośrednią obserwację czasu, czasu trwania i sekwencji zdarzeń mejotycznych w poszczególnych oocytach oraz umożliwia identyfikację zdarzeń przejściowych, które w przeciwnym razie mogłyby zostać pominięte w ustalonych próbkach. Jednak utrzymanie żywotności i integralności fizjologicznej oocytów podczas mikroiniekcji i obrazowania wymaga skrupulatnego obchodzenia się z nimi i zoptymalizowanych warunków⁸.

Protokół ten opisuje kompleksowy przebieg procesu mikrowstrzykiwania oocytów mysich pęcherzyków rozrodczych (GV) z cRNA H2B-RFP, umożliwiając fluorescencyjne znakowanie chromatyny, a następnie poklatkowe obrazowanie konfokalne chromosomów i zachowanie wrzeciona podczas mejozy⁴. Metoda łączy kluczowe etapy, w tym torowanie hormonalne, izolację oocytów, mikroiniekcję w kontrolowanych warunkach temperatury oraz obrazowanie na żywo przy użyciu mikroskopii konfokalnej z kontrolą środowiska ^4,9. Ogólnym celem tego artykułu jest przedstawienie solidnego i powtarzalnego przepływu pracy do wizualizacji w czasie rzeczywistym dynamiki chromosomów i wrzeciona w żywych oocytach myszy, zapewniając platformę do badania molekularnych i komórkowych mechanizmów leżących u podstaw regulacji mejotycznej i ryzyka aneuploidii.

Chociaż protokół ten zapewnia wysoką rozdzielczość czasową i przestrzenną, opiera się na egzogennej ekspresji reporterowej, która może nie w pełni replikować endogennej dynamiki białek i może potencjalnie zakłócać natywne procesy mejotyczne w przypadku nadekspresji. Badacze powinni wziąć pod uwagę te ograniczenia i w miarę możliwości weryfikować wyniki przy użyciu uzupełniających się podejść.

Protokół ten ma na celu wsparcie badań nad mechanizmami mejotycznymi, błędami segregacji chromosomów oraz wpływem zaburzeń genetycznych lub środowiskowych na jakość oocytów. Stanowi solidną platformę zarówno dla badań podstawowych, jak i zastosowań translacyjnych w biologii rozrodu.

Protokół

Wszystkie eksperymenty muszą być przeprowadzane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez lokalną Komisję Etyki ds. Zwierząt. Procedury eksperymentalne powinny być ściśle zgodne z zasadami 3R - Wymiana, Redukcja i Udoskonalenie. Myszy muszą być trzymane w akredytowanym obiekcie dla zwierząt w znormalizowanych warunkach środowiskowych (22 °C, 60% wilgotności) ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody.

1. Pobieranie i przygotowanie komórek jajowych

UWAGA: Cały sprzęt i odczynniki muszą być sterylne. Całą operację z oocytami należy wykonać za pomocą pipety doustnej pod mikroskopem stereoskopowym (patrz Tabela materiałów). Przykryj wszystkie kropelki pożywki hodowlanej olejem mineralnym (rysunek 1A-E).

1. Stymulacja hormonalna
   1. Wstrzyknąć 3-4 tygodniowym samicom myszy dootrzewnowo 5 jednostek międzynarodowych (j.m.) gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG; patrz tabela materiałów) 46-48 godzin przed pobraniem oocytów.
      UWAGA: B6CBAF1 myszy (potomstwo F1 C57BL/6J × CBA/CaCrl) są preferowane ze względu na lepszą wydajność oocytów i korzystne cechy dojrzewania.
2. Przygotowanie pożywek hodowlanych
   1. Przefiltrować media M2 i M16 (patrz tabela materiałów) za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm. Uzupełnić IBMX do końcowego stężenia 100 μM przez rozcieńczenie z 100 mM podstawy.
   2. Przygotuj 5-6 kropelek M2-IBMX (~30 μL każda) i 3 kropelki M16-IBMX w plastikowych szalkach do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm. Zalej wszystkie kropelki olejem mineralnym. Umieść szalki M2-IBMX na gorącym bloku o temperaturze 37 °C (Rysunek 1A), a szalki M16-IBMX w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ na co najmniej 30 minut przed izolacją oocytów (Figura 1C).
   3. Przygotuj dodatkowe naczynie zawierające 800-1 000 μL M2-IBMX (bez oleju) do wycięcia jajników. Umieścić na płycie grzewczej o temperaturze 37 °C zamontowanej nad mikroskopem stereoskopowym (rysunek 1B).
3. Izolacja oocytów
   1. Ofiaruj myszy przez zwichnięcie szyjki macicy. Przetrzyj dolną część brzucha 70% etanolem, a następnie wykonaj małe poziome nacięcie w skórze i otrzewnej, aby dostać się do jamy otrzewnej. Przedłuż nacięcie, rozsuwając krawędzie nacięcia palcami.
   2. Za pomocą kleszczy odsuń jelito od drogi, aby odsłonić jajniki w górnej części brzucha, znajdujące się na górnym biegunie nerek. Za pomocą cienkich kleszczy i mikronożyczek ostrożnie wytnij jajniki, unikając uszkodzenia tkanki. Natychmiast przenieś jajniki do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 100-200 μl wstępnie podgrzanej pożywki M2-IBMX.
   3. Przenieś jajniki do 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki M2-IBMX i przejdź do podgrzewanego etapu mikroskopu preparacyjnego (ryc. 1B). Ostrożnie usuń tkankę tłuszczową i resztki jajowodów.
      UWAGA: Z jajnikami należy obchodzić się delikatnie, aby zapobiec uszkodzeniu pęcherzyków jajnikowych lub oocytów. Utrzymuj jajniki w ciepłym podłożu podczas przenoszenia z pomieszczenia dla zwierząt do laboratorium.
   4. Uwolnij kompleksy wzgórko-oocyty (COC) poprzez nakłucie pęcherzyków za pomocą igły 27 G (ryc. 1A-B). Zbierz COC i przenieś do kropelek M2-IBMX o objętości 25-30 μl (ryc. 1D).
   5. Dysocjacja komórek wzgórka przez wielokrotne pipetowanie za pomocą szklanej pipety Pasteura o wąskim otworze (ryc. 1E).
      UWAGA: Podczas gdy pipetowanie doustne jest powszechnie stosowane do obsługi oocytów, pipety mechaniczne lub mikromanipulatory stanowią alternatywę, szczególnie w miejscach, w których pipetowanie doustne jest ograniczone lub niewykonalne. Te alternatywy zostały z powodzeniem zastosowane w podobnych protokołach^10,11.
   6. Zidentyfikuj i wybierz w pełni rozwinięte oocyty w stadium GV na podstawie większej średnicy i centralnie umieszczonej GV za pomocą mikroskopu stereoskopowego przy powiększeniu 20x-40x. Przenieść do świeżych 30 μl kropelek M2-IBMX na gorącym bloku o temperaturze 37 °C, chronionym przed światłem.
      UWAGA: Utrzymuj oocyty w temperaturze 37 °C podczas wszystkich zabiegów, aby zachować integralność fizjologiczną. Wstępnie podgrzej wszystkie podłoża i użyj stopni o kontrolowanej temperaturze do wszystkich czynności związanych z mikroskopem i mikroiniekcji.
   7. Przed mikrowstrzyknięciem należy pozostawić oocyty do regeneracji przez 20 minut w temperaturze 37 °C podgrzanej scenie.

2. Otrzymywanie cRNA H2B-RFP

UWAGA: Wszystkie kroki wykonuj w rękawiczkach w czystym środowisku wolnym od RNaz. Używaj wyłącznie wody i odczynników wolnych od RNaz i najlepiej pracuj w obecności inhibitorów RNazy.

1. Zweryfikuj sekwencjonowanie plazmidu H2B-RFP (patrz tabela materiałów) za pomocą sekwencjonowania Sangera przy użyciu starterów flankujących wkładkę. Amplifikuj plazmid, przekształcając kompetentne E. coli (np. DH5α), wybierając pojedynczą kolonię i hodując ją w bulionie LB z odpowiednimi antybiotykami. Oczyść plazmid za pomocą standardowego zestawu przygotowawczego midi lub maxi. Aby zapoznać się ze szczegółowymi procedurami, zobacz Green i Sambrook¹².
2. Oczyść plazmidowe DNA za pomocą komercyjnego zestawu miniprep zgodnie z instrukcjami producenta. Określić ilościowo stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.
3. Linearyzuj 2-4 μg plazmidowego DNA za wstawką za pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnego, który tnie raz w szkielecie wektora (NotI użyto dla H2B-RFP). Przygotować reakcję trawienia przy użyciu odpowiedniego stężenia buforu i enzymu, jak opisano w tabeli 1 , i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny. Potwierdź całkowitą linearyzację za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Wiele prążków wskazuje na niepełne trawienie. Jeśli używasz zestawu komercyjnego, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Wybierz enzym restrykcyjny, który precyzyjnie tnie za wkładką i w optymalnych warunkach trawienia. Sprawdź linearyzację, uruchamiając małą porcję na żelu agarozowym.
4. Usunąć zanieczyszczenie RNazą, inkubując reakcję trawienia z 1 μl proteinazy K (10 μg/ml), 5,3 μl 10% SDS i 50 μl wody wolnej od nukleaz w temperaturze 50 °C przez 1 godzinę.
   UWAGA: Ten krok jest niezbędny do wyeliminowania zanieczyszczeń RNazą i białkami. Używaj tylko odczynników wolnych od RNaz i utrzymuj czyste warunki pracy.
5. Ekstrahować strawione DNA za pomocą fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego (25:24:1), a następnie ekstrahować chloroformem.
   UWAGA: Aby zminimalizować toksyczność i usprawnić postępowanie z próbkami, zamiast ekstrakcji fenolem/chloroformem można również zastosować komercyjne metody oczyszczania oparte na kolumnach lub kulkach (np. membrany krzemionkowe lub systemy kulek magnetycznych).
6. Wytrącić DNA, dodając 3 M octan sodu i 100% etanolu. Inkubować w temperaturze -80 °C przez co najmniej 2 godziny.
7. Osadzać DNA przez odwirowanie w temperaturze 12 000-14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Umyć osad 70% etanolem, ponownie odwirować z tą samą prędkością przez 5 minut w temperaturze 4 °C, krótko wysuszyć na powietrzu (2-5 min) i ponownie zawiesić w 6 μl wody wolnej od RNaz.
   UWAGA: Po wytrąceniu etanolu i odwirowaniu na dnie probówki powinien uformować się widoczny półprzezroczysty lub biały osadek. Jeśli nie widać osadu, powtórzyć wirowanie z większą prędkością lub ponownie ocenić stężenie DNA.
8. Przeprowadzić transkrypcję in vitro przy użyciu zestawu T7 mMESSAGE mMACHINE (patrz Tabela 2), zgodnie z protokołem producenta.
9. Inkubować reakcję transkrypcji w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny. Przedłużyć inkubację, jeśli długość transkryptu przekracza 5 kb.
10. Usunąć matrycę DNA przez traktowanie DNazą przy użyciu 1 j. DNazy I na 10 μl objętości reakcyjnej, inkubowanej w temperaturze 37 °C przez 15 min.
11. Oczyść zsyntetyzowane cRNA za pomocą wytrącania chlorku litu¹³. Po wytrąceniu i odwirowaniu na dnie probówki powinien uformować się widoczny półprzezroczysty lub biały osadek. Umyj osad RNA 70% etanolem.
12. Zawiesić końcowe osady cRNA w 20 μl wody wolnej od RNaz. Zmierz stężenie RNA i potwierdź obecność i długość ogona poli(A), wykonując RT-PCR, a następnie sekwencjonowanie produktu PCR. Podwielokrotność cRNA podzielić na objętości 1 μl i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Przygotowanie i mikroiniekcja oocytów

UWAGA: Przez cały czas trwania zabiegu utrzymuj oocyty w temperaturze 37 °C przy użyciu wstępnie podgrzanych pożywek i mikroskopu o kontrolowanej temperaturze, aby zachować jakość oocytów.

1. Preparat
   1. Rozmrozić podwielokrotności cRNA H2B-RFP na lodzie, krótko odwirować i rozcieńczyć do pożądanego stężenia (np. 250 ng/μL).
      UWAGA: Optymalne stężenie cRNA może się różnić w zależności od konstruktu, systemu ekspresji i celów eksperymentalnych. Zalecamy miareczkowanie stężenia cRNA (np. w zakresie 50-300 ng/μL) w celu zminimalizowania artefaktów nadekspresji przy jednoczesnym zapewnieniu wystarczającego sygnału. Użytkownicy powinni również monitorować progresję mejotyczną (np. GVBD, tworzenie wrzeciona i wytłaczanie ciała biegunowego) jako funkcjonalny odczyt zdrowia i żywotności oocytów po ekspresji konstruktu. Doniesiono, że stężenia cRNA w iniekcjach zwykle wahają się od 0,2 do 1 μg/μL, przy czym optymalne wyniki często osiąga się przy 0,5 μg/μL 2,3,4,5,7,8,9.
   2. Przygotować igły do mikroiniekcji z kapilar ze szkła borokrzemianowego (OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm, długość = 100 mm) za pomocą ściągacza do pipet (Rysunek 2A).
      UWAGA: Używamy pionowego ściągacza do pipet (patrz Tabela materiałów; Rysunek 2A). Zoptymalizuj parametry ciągnięcia empirycznie. Końcówka igły powinna być wystarczająco cienka, aby zminimalizować uszkodzenie oocytów, ale wystarczająco szeroka, aby uniknąć zatkania i umożliwić płynne dostarczanie cRNA.
   3. Załaduj 0,5-1,5 μl roztworu cRNA do końcówki igły za pomocą końcówek mikroładowarek wolnych od RNaz. Przed wstrzyknięciem należy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
2. Ustawienie naczynia do mikroiniekcji
   1. Przygotuj naczynie do mikroiniekcji ze 100 μl pożywki M2-IBMX i całkowicie pokryj olejem mineralnym, aby zapobiec parowaniu i zmianom osmolarności.
3. Mikroiniekcja komórek jajowych
   1. Zamontuj pipety przytrzymujące i iniekcyjne na układzie mikromanipulatora (Rysunek 2B,C).
   2. Umieść naczynie do mikroiniekcji na stoliku mikroskopu. Za pomocą pipety doustnej przenieś oocyty do kropli M2-IBMX.
   3. Pipety do przytrzymywania i wstrzykiwań ustawić w tej samej płaszczyźnie poziomej co oocyty.
   4. Chwyć jedną komórkę jajową za pomocą delikatnego odsysania pipetą trzymającą (ryc. 2B i C).
   5. Wbić igłę do wstrzykiwań przez osłonkę przejrzystą i oolemmę, kierując się w stronę cytoplazmy i omijając jądro.
   6. Dostarczyć cRNA H2B-RFP za pomocą krótkiego impulsu o ujemnej pojemności przez elektrometr wewnątrzkomórkowy (ryc. 2B-E). Utrzymuj objętość wstrzyknięcia około 5% objętości oocytów. Udane wstrzyknięcie jest zwykle widoczne jako małe, ale wyraźne rozproszenie cytoplazmy. Dostosuj ciśnienie wtrysku i czas wtrysku, aby uniknąć uszkodzenia membrany.
   7. Wyjmij igłę szybko i płynnie pod tym samym kątem, aby zminimalizować rozdarcie membrany.
   8. Uwolnij oocyt z pipety podtrzymującej i umieść go w oddzielnym obszarze naczynia, aby odróżnić oocyty wstrzyknięte od niewstrzykniętych (ryc. 2F). W przypadku tej konfiguracji zorganizuj przepływ pracy, trzymając niewstrzyknięte oocyty na górze naczynia i przesuwając wstrzyknięte na dół.
   9. Powtórz kroki 3.3.4-3.3.8 dla wszystkich pozostałych oocytów. Wskaźniki przeżycia po wstrzyknięciu różnią się w zależności od techniki i właściwości mRNA. Spodziewaj się 60%-80% żywotności.
4. Postępowanie po wstrzyknięciu
   1. Przenieś wstrzyknięte oocyty do świeżej kropli pożywki M16-IBMX w czystym naczyniu hodowlanym.
   2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-4 godziny, aby umożliwić ekspresję H2B-RFP. Dostosuj czas inkubacji w oparciu o stężenie cRNA, rozmiar transkryptu i wydajność ekspresji.

4. Obrazowanie poklatkowe chromosomów znakowanych H2B-RFP podczas mejozy

1. Przygotowanie sprzętu i mediów
   1. Przed użyciem rozgrzej inkubator do mikroskopu konfokalnego i komorę środowiskową do temperatury 37 °C przez ≥ 30 minut (Rysunek 3A). Włącz sterownik gazu i zainicjuj przepływ gazu, aby utrzymać komorę na poziomie 5% CO₂ i otoczenia O₂ . Upewnij się, że komora jest nawilżona, aby wspierać zdrowie oocytów podczas rozszerzonego obrazowania żywych komórek.
   2. Przygotuj krople hodowlane: Umieść 5-6 kropli po 50 μl pożywki M16 uzupełnionej SiR-tubuliną (stężenie końcowe 100 nM) na szalce Petriego o średnicy 35 mm. Nakładka z olejem mineralnym. W osobnym naczyniu do obrazowania ze szklanym dnem umieść trzy krople M16 + SiR-Tubulin o pojemności 5 μl i nałóż na olej mineralny. Podgrzej obie potrawy w temperaturze 37 °C przez ≥ 30 minut przed użyciem.
2. Transfer i mycie komórek jajowych
   1. Mycie oocytów: Przenieś wstrzyknięte oocyty sekwencyjnie przez 50 μl kropli M16 + SiR-Tubulin, aby zmyć resztki IBMX (zalecane 5 prań). Wykonuj delikatne mycie, aby uniknąć uszkodzenia oocytów.
      UWAGA: Resztki IBMX mogą hamować wznowienie mejozy, dlatego dokładne mycie ma kluczowe znaczenie.
   2. Końcowy transfer: Po przepłukaniu przenieś 15-20 oocytów do 5 μl kropli M16 + SiR-tubuliny w podgrzanym naczyniu do obrazowania ze szklanym dnem.
3. Konfiguracja mikroskopu
   1. Montaż czaszy obrazowania: Umieść czaszę ze szklanym dnem na stoliku mikroskopu konfokalnego (Rysunek 3A). Pozwól oocytom osiąść przez ~10 minut.
   2. Pozycjonowanie etapu: Korzystając z obrazowania w jasnym polu, wyśrodkuj oocyty w polu widzenia. Zapisywanie pozycji za pomocą oprogramowania mikroskopowego.
      UWAGA: W tym badaniu użyliśmy mikroskopu konfokalnego Leica TCS SP8 z soczewką obiektywową HC PL APO 20x/1.0 NA. Jednak w zależności od dostępności można stosować inne systemy konfokalne i soczewki obiektywowe o podobnych specyfikacjach.
   3. Konfiguracja pompy wodnej do celów zanurzenia w wodzie: Jeśli używasz soczewki obiektywu do zanurzenia w wodzie, uruchom system pompy wodnej tak, aby dostarczał wodę z przerwami w odstępach 5-10 minut. Ten okresowy przepływ utrzymuje słup wody między soczewką a naczynią obrazową ze szklanym dnem, zapobiegając wysychaniu i zapewniając stabilne warunki obrazowania podczas długotrwałych eksperymentów. W przypadku soczewek olejowych ta konfiguracja przepływu wody nie jest wymagana.
4. Ustawienia obrazowania
   1. Przełącz na tryb skanowania laserowego. Ustaw natężenia lasera w następujący sposób: 561 nm przy 0,5% (~100 μW na obiektywie) dla H2B-RFP (chromosomy); 633 nm przy 3% (~300 μW przy obiektywie) dla SiR-tubuliny (mikrotubule wrzeciona; Rysunek 3B,E).
      UWAGA: Postępuj zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa lasera. Zminimalizuj ekspozycję na laser, aby chronić żywotność próbki.
5. Akwizycja Z-stack
   1. Uzyskaj stosy Z o rozpiętości 30-50 μm z krokiem 2-4 μm (Rysunek 3B, C).
   2. Rejestruj obrazy w odstępach 5-10 minut, korzystając z prędkości skanowania 600 Hz (Rysunek 3B,D). Całkowity czas trwania obrazowania może wynosić od 12 do 16 godzin, w zależności od monitorowanego etapu mejotycznego, i jest ograniczony przez fototoksyczność i tolerancję oocytów do rozszerzonej hodowli in vitro.
6. Sekwencyjna akwizycja obrazu
   1. Na systemach mikroskopowych wykonaj skanowanie sekwencyjne za pomocą dwóch detektorów HyD: H2B-RFP: Wzbudzenie przy 561 nm; emisja zebrana przy 580–630 nm; wzbudzenie SiR-tubuliny przy długości fali 633 nm; emisji zebranej przy długości fali 650–700 nm (rysunek 3E).
7. Inicjowanie obrazowania poklatkowego
   1. Przed rozpoczęciem długoterminowej akwizycji poklatkowej sprawdź jakość sygnału, wykonując zdjęcie testowe. Sygnały fluorescencyjne powinny być równomiernie rozłożone: H2B-RFP powinien wyraźnie oznaczać chromatynę, a tubulina SiR powinna podkreślać struktury mikrotubul bez nadmiernego tła. Potwierdź stabilność autofokusa i minimalne fotowybielanie w krótkich wstępnych seriach obrazowania.
   2. Rozpocznij obrazowanie poklatkowe, klikając przycisk Start.
      UWAGA: GVBD, oznaczający wejście fazy M, zwykle występuje 60-90 minut po wypłukaniu IBMX (rysunek 4A). W tej konfiguracji oocyty C57BL / 6 wytłaczają pierwsze ciało polarne około 8-9 godzin po GVBD (ryc. 4A). Czas może się różnić w zależności od szczepu myszy i warunków hodowli.

5. Przetwarzanie po obrazowaniu

1. Otwórz plik obrazowania w oprogramowaniu do analizy obrazu, wybierając opcję Plik > Otwórz i wybierając plik .lif z sesji obrazowania.
2. Generuj projekcje Z dla kanałów H2B RFP i SiR-Tubulin, wybierając opcję Przetwarzanie > Generuj projekcję. Ustaw typ projekcji na Projekcja o maksymalnej intensywności. Wybierz zarówno kanały RFP, jak i SiR Tubulin, a następnie kliknij przycisk Uruchom.
   UWAGA Nie należy wykonywać projekcji Z dla kanału DIC, ponieważ może to spowodować rozmycie obrazu. Zamiast tego zidentyfikuj i wybierz pojedynczą płaszczyznę DIC, która jest najbardziej wyostrzona. Użyj tego skoncentrowanego obrazu DIC w połączeniu z projekcjami o maksymalnej intensywności kanałów H2B-RFP i SiR-Tubulin, aby uzyskać optymalną wizualizację.
3. Wyodrębnij pojedynczą płaszczyznę ogniskowej jasnego pola. Wróć do Narzędzi procesu i wybierz opcję Edytuj > Przytnij. Wybierz kanał Brightfield, użyj suwaka Z, aby znaleźć optymalną płaszczyznę ogniskowej, a następnie kliknij przycisk Apply (Zastosuj).
4. Scal obrazy projekcji i obrazu w jasnym polu, otwierając Narzędzia procesu, wybierając opcję Scal > Dodaj kanały. Dodaj projekcję RFP, projekcję SiR-Tubulin i pojedynczy obraz w jasnym polu. Kliknij prawym przyciskiem myszy scalony zestaw , a następnie kliknij polecenie Zastosuj.
5. Wyeksportuj ostateczny scalony obraz, wybierając Plik > Eksportuj > obrazu. Wybierz format TIFF , aby uzyskać wysokiej jakości, nieskompresowane wydruki.
   UWAGA: Eksport w formacie TIFF jest zalecany do dalszej analizy i przygotowania rysunku.

Wyniki

Jak pokazano na rysunku 4A,B, protokół ten umożliwia wysokiej jakości obrazowanie żywych komórek chromosomów (H2B-RFP) i mikrotubul wrzecionowatych (SiR-tubulina) w oocytach, dostarczając w ten sposób kompleksowych informacji czasoprzestrzennych przez cały okres dojrzewania mejotycznego.

Kanał H2B-RFP na rysunku 4A ujawnia wszystkie aspekty ruchu chromosomów od początkowego dopasowania po GVBD (ry...

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół przedstawia solidną metodę mikroiniekcji i obrazowania żywych komórek jajowych myszy, umożliwiając wizualizację dynamiki chromosomów podczas mejozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną. Kluczowe znaczenie dla powodzenia tego podejścia ma skrupulatne obchodzenie się z oocytami na każdym etapie procedury, od pobrania i mikroiniekcji po obrazowanie. Oocyty są bardzo wrażliwe na wahania środowiskowe, a odchylenia temperatury, pH lub osmolarności mogą zagrozić ich integralności fizjolog...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawki 1 ml	Terumo (Ziemia)	SS+01T Tuberkulina	Strzykawki do precyzyjnych iniekcji PMSG.
Żel agarozowy	Invitrogen	16500500	Służy do elektroforezy żelowej DNA i RNA w celu oddzielenia kwasów nukleinowych według wielkości, w celu dostosowania sekwencji H2B-RFP
Palnik alkoholowy	LabTek	LW15557-01	Służy do sterylizacji i przygotowania świetlików do ust.
Pożywka do hodowli bakteryjnych (bulion LB)	Sigma-Aldrich	L3022	Standardowe podłoże stosowane do hodowli E. coli i innych kultur bakteryjnych.
Szalki do hodowli komórkowych (35 & razy; 10 mm i 60 & razy; 15 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430165, CLS430166	Służy do hodowli oocytów; Dostępne w różnych rozmiarach.
Wirówka (stołowa)	Eppendorf powiedział:	5424R	Kompaktowa wirówka do małych objętości próbek, powszechnie stosowana w laboratoriach badawczych.
Probówki wirówkowe (15 ml i 50 ml)	Corning	352096, 352070	Większe probówki do wirowania, powszechnie stosowane do przetwarzania komórek i białek.
Chloroform	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C2432	Rozpuszczalnik powszechnie stosowany w protokołach biologii molekularnej, zwłaszcza w ekstrakcji DNA/RNA.
Inkubator CO2	Sanyo	(model: MCO-18AIC)	Inkubator przeznaczony do utrzymywania kontrolowanej atmosfery CO2 do hodowli oocytów.
Jednorazowe ultracienkie igły (27 G i razy 1/2")	Hanke Sass Wilk	4710004012	Cienkie igły do pobierania komórek jajowych
DNaza I (wolna od RNaz)	Thermo Fisher Naukowy	EN0521	Enzym stosowany do usuwania zanieczyszczającego DNA z preparatów RNA.
Suchy blok grzewczy	Instrumenty grantowe	(model: QBD4)	Blok używany do podgrzewania próbek lub reakcji w precyzyjnych temperaturach bez konieczności użycia wody.
Etanol (klasa biologii molekularnej)	Sigma-Aldrich	E7023 powiedział:	Stosowany do wytrącania DNA i RNA, a także w procedurach sterylizacji.
Cienkie nożyczki preparacyjne	Instrumenty naukowe i chirurgiczne Met-App	2235	Służy do precyzyjnej sekcji oocytów myszy
Cienkie kleszcze	Instrumenty naukowe i chirurgiczne Met-App	2127	Służy do precyzyjnej sekcji oocytów myszy
System elektroforezy żelowej	Bio-Rad	1645050	System do wykonywania elektroforezy kwasów nukleinowych lub białek w żelach.
Siarczan gentamycyny	Sigma-Aldrich	G1264 powiedział:	Antybiotyk stosowany w celu zapobiegania skażeniu bakteryjnemu w hodowlach komórkowych.
Szklane pipety Pasteura (230 mm)	Firma VWR	6121702	Pipety szklane do pipet do jamy ustnej oocytów
Biblioteka IBMX	Sigma-Aldrich	I5879 powiedział:	Inhibitor fosfodiesterazy stosowany w zapobieganiu GVBD
Mikroskop odwrócony	Nikon		Mikroskop przeznaczony do obserwacji żywych komórek lub organizmów znajdujących się pod szalką hodowlaną.
Lekki olej mineralny odpowiedni do hodowli zarodków myszy	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M5310	Służy do przykrywania oocytów w hodowli w celu zapobieżenia parowaniu i utrzymania temperatury.
Chlorek litu	Sigma-Aldrich	L9650	Stosowany w metodach wytrącania RNA.
System obrazowania żywych komórek	Księga Leica	LAS X	System obrazowania przeznaczony do obserwacji żywych komórek w czasie rzeczywistym przy użyciu zaawansowanych technik mikroskopowych.
Pożywka M16 (do hodowli in vitro)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M7292	Pożywka przeznaczona do hodowli oocytów i zarodków myszy oraz innych zastosowań in vitro.
Probówki do mikrowirówek (0,6 ml i 1,6 ml)	Neptun	3735.X, 3745.X	Probówki o małej objętości do wirowania, często stosowane w protokołach biologii molekularnej i biochemii.
Probówki do mikrowirówek (bez RNaz)	Eppendorf / Neptun	022431081 (Eppendorf)	Probówki wolne od RNaz do RNA działają w celu zapobiegania degradacji RNA.
Igły do mikroiniekcji	Instrumenty Sutter	Ściągacz do pipet P-30	Igły do precyzyjnej mikroiniekcji do komórek jajowych
System mikroiniekcji	Aparatura Harvarda	FemtoJet, PicoPump	Systemy służące do wstrzykiwania cRNA do oocytów myszy z dużą precyzją.
Zestaw do miniprzygotowania	Qiagen powiedział:	27106 (Zestaw do miniprzygotowania QIAprep Spin)	Zestaw do izolowania plazmidowego DNA z kultur bakteryjnych do zastosowań w biologii molekularnej.
Zespół rurki aspiratora doustnego	Sigma-Aldrich	Nr kat. A5177	do aspiracji oocytów
Farba granulkowa	Merck Millipore	69049-3	Produkt do wizualizacji tworzenia się granulek podczas wirowania.
Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy	Thermo Fisher Naukowy	15593031	Roztwór stosowany w ekstrakcji H2B-RFP do separacji faz.
Kodowanie plazmidowe H2B-RFP	Addgene powiedział:	Plazmid #20972	Plazmid stosowany do znakowania chromosomów białkiem czerwonej fluorescencji (RFP)
PMSG (Międzynarodowa Organizacja Zarządzania T	Prospec	HOR-272 powiedział:	Do superowalacji myszy
Proteinaza K	Thermo Fisher Naukowy	EO0491 powiedział:	Enzym używany do trawienia białek, powszechnie stosowany w procedurach ekstrakcji DNA/RNA.
Enzym restrykcyjny NotI	Laboratoria biologiczne Nowej Anglii (NEB)	Czynnik R3189S	Enzym restrykcyjny stosowany w klonowaniu DNA i zastosowaniach biologii molekularnej, do linearyzacji plazmidu H2B-RFP.
Inhibitor RNazy (opcjonalnie)	Laboratoria biologiczne Nowej Anglii (NEB)	Zobacz materiał M0314S	Enzym stosowany w celu zapobiegania degradacji RNA podczas eksperymentów związanych z RNA.
Rękawice bez RNaz	VWR / Fisher Scientific	Różni się w zależności od rozmiaru	Rękawice poddane obróbce zapobiegającej zanieczyszczeniu RNazą, stosowane w protokołach manipulacji RNA.
Końcówki do pipet bez RNaz	Axygen / Thermo Fisher	T-300-R-S	Końcówki do pipet zaprojektowane tak, aby były wolne od zanieczyszczeń RNazą, do zastosowań związanych z RNA.
Woda wolna od RNaz	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał AM9932	Woda oczyszczona w celu usunięcia enzymów RNazy, niezbędnych do pracy RNA, aby uniknąć degradacji.
SDS (10%)	Sigma-Aldrich	L3771	Dodecylosiarczan sodu stosowany do denaturacji białek w elektroforezie i innych eksperymentach.
SiR-tubulina	Spirochrom	Zobacz materiał SC002	Barwnik fluorescencyjny, który wiąże się specyficznie z tubuliną w celu obrazowania żywych komórek wrzeciona
Octan sodu (3 M)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S7899 powiedział:	Stosowany jako bufor i do wytrącania DNA w procedurach biologii molekularnej.
Spektrofotometr	Thermo Fisher (NanoKropla)	ND-JEDEN-W	Przyrząd służący do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych, białek i innych substancji poprzez pomiar absorbancji.
Mikroskop stereoskopowy	Mikrosystemy Leica	M165C	Mikroskop przeznaczony do obserwacji preparatów w trzech wymiarach przy małych powiększeniach, przydatny do sekcji.
Filtr strzykawkowy (0,22-&mikro; m)	Merck	SLGP033RS	Służy do sterylnej filtracji cieczy, szczególnie w zastosowaniach mikrobiologicznych i biologii molekularnej.
Montaż strzykawek i igły	Terumo (Ziemia)	SS+01T Strzykawki tuberkulinowe	służy do precyzyjnego dostarczania PMSG.
Zestaw mMACHINE mMESSAGE T7	Thermo Fisher Naukowy	AM1344 powiedział:	Zestaw do transkrypcji RNA in vitro z promotora T7 do otrzymywania cRNA H2B-RFP.
Łaźnia wodna / blok grzewczy	Instrumenty dotacji	Kontroler QBD4	Służy do utrzymywania precyzyjnych temperatur w eksperymentach wymagających ciepła.