Obrazowanie żywych komórek segregacji chromosomów podczas mejozy oocytów myszy

Podsumowanie

W tym miejscu podsumowujemy techniki obrazowania żywych komórek do badania segregacji chromosomów w oocytach myszy, używając H2B-RFP do chromatyny i SiR-tubuliny do wizualizacji wrzeciona. Szczegółowo opisujemy przygotowanie próbek, mikroiniekcję, hodowlę, konfigurację obrazowania i analizę, oferując praktyczny przewodnik po uzyskaniu wysokiej rozdzielczości i minimalnie fototoksycznego obrazowania dynamiki chromosomów mejotycznych.

Streszczenie

Dokładna segregacja chromosomów podczas mejozy oocytów jest niezbędna do zapewnienia prawidłowego rozwoju zarodka i zapobiegania zaburzeniom związanym z aneuploidią. Obrazowanie żywych komórek w połączeniu z technikami znakowania fluorescencyjnego stało się potężnym podejściem do badania dynamiki chromosomów mejotycznych z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. W tym protokole podsumowujemy kluczowe metodologie wizualizacji segregacji chromosomów w żywych oocytach myszy, koncentrując się na wykorzystaniu histonu H2B-RFP do znakowania chromatyny i SiR-tubuliny do śledzenia wrzeciona. Opisujemy procedury przygotowania próbki, mikroiniekcji mRNA, hodowli oocytów, konfiguracji komory obrazowania żywych komórek i ustawień mikroskopii konfokalnej, wszystkie zoptymalizowane w celu uzyskania obrazowania w wysokiej rozdzielczości przy jednoczesnej minimalizacji fototoksyczności. Ponadto zwracamy uwagę na krytyczne kwestie eksperymentalne, takie jak fototoksyczność, przetwarzanie obrazu i analiza ilościowa zdarzeń mejotycznych. Zapewniając kompleksową ocenę obecnych metodologii, protokół ten służy jako praktyczny przewodnik dla badaczy chcących zbadać dynamikę chromosomów w żywych oocytach oraz poprawić dokładność i odtwarzalność badań mejotycznych.

Wprowadzenie

Dokładna wizualizacja dynamiki chromosomów i wrzecion podczas mejozy oocytów ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów rządzących dojrzewaniem gamet żeńskich i ryzykiem aneuploidii 1,2,3,4,5. Oocyty ssaków przechodzą wysoce skoordynowaną serię zdarzeń mejotycznych, w tym rozpad pęcherzyków rozrodczych (GVBD), kondensację chromosomów, składanie wrzeciona i asymetryczny podział⁶. Chociaż obrazowanie ze stałym punktem czasowym dostarczyło cennych migawek tych procesów, brakuje m....

Protokół

Wszystkie eksperymenty muszą być przeprowadzane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez lokalną Komisję Etyki ds. Zwierząt. Procedury eksperymentalne powinny być ściśle zgodne z zasadami 3R - Wymiana, Redukcja i Udoskonalenie. Myszy muszą być trzymane w akredytowanym obiekcie dla zwierząt w znormalizowanych warunkach środowiskowych (22 °C, 60% wilgotności) ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody.

1. Pobieranie i przygotowanie komórek jajowych

UWAGA: Cały sprzęt i odczynniki muszą być sterylne. Całą operację z oocytami należy wykonać za pomocą pipety doustnej pod mikroskopem stereoskopowym (pa....

Wyniki

Jak pokazano na rysunku 4A,B, protokół ten umożliwia wysokiej jakości obrazowanie żywych komórek chromosomów (H2B-RFP) i mikrotubul wrzecionowatych (SiR-tubulina) w oocytach, dostarczając w ten sposób kompleksowych informacji czasoprzestrzennych przez cały okres dojrzewania mejotycznego.

Kanał H2B-RFP na rysunku 4A ujawnia wszystkie aspekty ruchu chromosomów od początkowego dopasowania po GVBD (ry.......

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół przedstawia solidną metodę mikroiniekcji i obrazowania żywych komórek jajowych myszy, umożliwiając wizualizację dynamiki chromosomów podczas mejozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną. Kluczowe znaczenie dla powodzenia tego podejścia ma skrupulatne obchodzenie się z oocytami na każdym etapie procedury, od pobrania i mikroiniekcji po obrazowanie. Oocyty są bardzo wrażliwe na wahania środowiskowe, a odchylenia temperatury, pH lub osmolarności mogą zagrozić ich integralności fizjolog.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawki 1 ml	Terumo (Ziemia)	SS+01T Tuberkulina	Strzykawki do precyzyjnych iniekcji PMSG.
Żel agarozowy	Invitrogen	16500500	Służy do elektroforezy żelowej DNA i RNA w celu oddzielenia kwasów nukleinowych według wielkości, w celu dostosowania sekwencji H2B-RFP
Palnik alkoholowy	LabTek	LW15557-01	Służy do sterylizacji i przygotowania świetlików do ust.
Pożywka do hodowli bakteryjnych (bulion LB)	Sigma-Aldrich	L3022	Standardowe podłoże stosowane do hodowli E. coli i innych kultur bakteryjnych.
Szalki do hodowli komórkowych (35 & razy; 10 mm i 60 & razy; 15 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430165, CLS430166	Służy do hodowli oocytów; Dostępne w różnych rozmiarach.
Wirówka (stołowa)	Eppendorf powiedział:	5424R	Kompaktowa wirówka do małych objętości próbek, powszechnie stosowana w laboratoriach badawczych.
Probówki wirówkowe (15 ml i 50 ml)	Corning	352096, 352070	Większe probówki do wirowania, powszechnie stosowane do przetwarzania komórek i białek.
Chloroform	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C2432	Rozpuszczalnik powszechnie stosowany w protokołach biologii molekularnej, zwłaszcza w ekstrakcji DNA/RNA.
Inkubator CO2	Sanyo	(model: MCO-18AIC)	Inkubator przeznaczony do utrzymywania kontrolowanej atmosfery CO2 do hodowli oocytów.
Jednorazowe ultracienkie igły (27 G i razy 1/2")	Hanke Sass Wilk	4710004012	Cienkie igły do pobierania komórek jajowych
DNaza I (wolna od RNaz)	Thermo Fisher Naukowy	EN0521	Enzym stosowany do usuwania zanieczyszczającego DNA z preparatów RNA.
Suchy blok grzewczy	Instrumenty grantowe	(model: QBD4)	Blok używany do podgrzewania próbek lub reakcji w precyzyjnych temperaturach bez konieczności użycia wody.
Etanol (klasa biologii molekularnej)	Sigma-Aldrich	E7023 powiedział:	Stosowany do wytrącania DNA i RNA, a także w procedurach sterylizacji.
Cienkie nożyczki preparacyjne	Instrumenty naukowe i chirurgiczne Met-App	2235	Służy do precyzyjnej sekcji oocytów myszy
Cienkie kleszcze	Instrumenty naukowe i chirurgiczne Met-App	2127	Służy do precyzyjnej sekcji oocytów myszy
System elektroforezy żelowej	Bio-Rad	1645050	System do wykonywania elektroforezy kwasów nukleinowych lub białek w żelach.
Siarczan gentamycyny	Sigma-Aldrich	G1264 powiedział:	Antybiotyk stosowany w celu zapobiegania skażeniu bakteryjnemu w hodowlach komórkowych.
Szklane pipety Pasteura (230 mm)	Firma VWR	6121702	Pipety szklane do pipet do jamy ustnej oocytów
Biblioteka IBMX	Sigma-Aldrich	I5879 powiedział:	Inhibitor fosfodiesterazy stosowany w zapobieganiu GVBD
Mikroskop odwrócony	Nikon		Mikroskop przeznaczony do obserwacji żywych komórek lub organizmów znajdujących się pod szalką hodowlaną.
Lekki olej mineralny odpowiedni do hodowli zarodków myszy	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M5310	Służy do przykrywania oocytów w hodowli w celu zapobieżenia parowaniu i utrzymania temperatury.
Chlorek litu	Sigma-Aldrich	L9650	Stosowany w metodach wytrącania RNA.
System obrazowania żywych komórek	Księga Leica	LAS X	System obrazowania przeznaczony do obserwacji żywych komórek w czasie rzeczywistym przy użyciu zaawansowanych technik mikroskopowych.
Pożywka M16 (do hodowli in vitro)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M7292	Pożywka przeznaczona do hodowli oocytów i zarodków myszy oraz innych zastosowań in vitro.
Probówki do mikrowirówek (0,6 ml i 1,6 ml)	Neptun	3735.X, 3745.X	Probówki o małej objętości do wirowania, często stosowane w protokołach biologii molekularnej i biochemii.
Probówki do mikrowirówek (bez RNaz)	Eppendorf / Neptun	022431081 (Eppendorf)	Probówki wolne od RNaz do RNA działają w celu zapobiegania degradacji RNA.
Igły do mikroiniekcji	Instrumenty Sutter	Ściągacz do pipet P-30	Igły do precyzyjnej mikroiniekcji do komórek jajowych
System mikroiniekcji	Aparatura Harvarda	FemtoJet, PicoPump	Systemy służące do wstrzykiwania cRNA do oocytów myszy z dużą precyzją.
Zestaw do miniprzygotowania	Qiagen powiedział:	27106 (Zestaw do miniprzygotowania QIAprep Spin)	Zestaw do izolowania plazmidowego DNA z kultur bakteryjnych do zastosowań w biologii molekularnej.
Zespół rurki aspiratora doustnego	Sigma-Aldrich	Nr kat. A5177	do aspiracji oocytów
Farba granulkowa	Merck Millipore	69049-3	Produkt do wizualizacji tworzenia się granulek podczas wirowania.
Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy	Thermo Fisher Naukowy	15593031	Roztwór stosowany w ekstrakcji H2B-RFP do separacji faz.
Kodowanie plazmidowe H2B-RFP	Addgene powiedział:	Plazmid #20972	Plazmid stosowany do znakowania chromosomów białkiem czerwonej fluorescencji (RFP)
PMSG (Międzynarodowa Organizacja Zarządzania T	Prospec	HOR-272 powiedział:	Do superowalacji myszy
Proteinaza K	Thermo Fisher Naukowy	EO0491 powiedział:	Enzym używany do trawienia białek, powszechnie stosowany w procedurach ekstrakcji DNA/RNA.
Enzym restrykcyjny NotI	Laboratoria biologiczne Nowej Anglii (NEB)	Czynnik R3189S	Enzym restrykcyjny stosowany w klonowaniu DNA i zastosowaniach biologii molekularnej, do linearyzacji plazmidu H2B-RFP.
Inhibitor RNazy (opcjonalnie)	Laboratoria biologiczne Nowej Anglii (NEB)	Zobacz materiał M0314S	Enzym stosowany w celu zapobiegania degradacji RNA podczas eksperymentów związanych z RNA.
Rękawice bez RNaz	VWR / Fisher Scientific	Różni się w zależności od rozmiaru	Rękawice poddane obróbce zapobiegającej zanieczyszczeniu RNazą, stosowane w protokołach manipulacji RNA.
Końcówki do pipet bez RNaz	Axygen / Thermo Fisher	T-300-R-S	Końcówki do pipet zaprojektowane tak, aby były wolne od zanieczyszczeń RNazą, do zastosowań związanych z RNA.
Woda wolna od RNaz	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał AM9932	Woda oczyszczona w celu usunięcia enzymów RNazy, niezbędnych do pracy RNA, aby uniknąć degradacji.
SDS (10%)	Sigma-Aldrich	L3771	Dodecylosiarczan sodu stosowany do denaturacji białek w elektroforezie i innych eksperymentach.
SiR-tubulina	Spirochrom	Zobacz materiał SC002	Barwnik fluorescencyjny, który wiąże się specyficznie z tubuliną w celu obrazowania żywych komórek wrzeciona
Octan sodu (3 M)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S7899 powiedział:	Stosowany jako bufor i do wytrącania DNA w procedurach biologii molekularnej.
Spektrofotometr	Thermo Fisher (NanoKropla)	ND-JEDEN-W	Przyrząd służący do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych, białek i innych substancji poprzez pomiar absorbancji.
Mikroskop stereoskopowy	Mikrosystemy Leica	M165C	Mikroskop przeznaczony do obserwacji preparatów w trzech wymiarach przy małych powiększeniach, przydatny do sekcji.
Filtr strzykawkowy (0,22-&mikro; m)	Merck	SLGP033RS	Służy do sterylnej filtracji cieczy, szczególnie w zastosowaniach mikrobiologicznych i biologii molekularnej.
Montaż strzykawek i igły	Terumo (Ziemia)	SS+01T Strzykawki tuberkulinowe	służy do precyzyjnego dostarczania PMSG.
Zestaw mMACHINE mMESSAGE T7	Thermo Fisher Naukowy	AM1344 powiedział:	Zestaw do transkrypcji RNA in vitro z promotora T7 do otrzymywania cRNA H2B-RFP.
Łaźnia wodna / blok grzewczy	Instrumenty dotacji	Kontroler QBD4	Służy do utrzymywania precyzyjnych temperatur w eksperymentach wymagających ciepła.