Artykuł metodologiczny

Ilościowa identyfikacja pochłaniania kwasów tłuszczowych śródbłonka za pomocą analogów kwasów tłuszczowych fluorescencyjnych

DOI:

10.3791/68859

⸱

15 sierpnia 2025

 ,  , 
1Department of Biology, Union College, 2Department of Biology, University of North Carolina Chapel Hill, 3Department of Pathology & Laboratory Medicine and McAllister Heart Institute, University of North Carolina Chapel Hill

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje test in vitro do pomiaru pobierania lipidów komórkowych przez komórki śródbłonka po stymulacji fluorescencyjnymi analogami BODIPY-C12 i BODIPY-C16 nasyconych kwasów tłuszczowych długołańcuchowych i bardzo długołańcuchowych. Ta metoda jest wydajna i adaptowalna do innych typów komórek, oferując użyteczne podejście do badania metabolizmu lipidów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki śródbłonkowe (EC) odgrywają kluczową rolę w regulacji transportu kwasów tłuszczowych (FA) z krwiobiegu do tkanek metabolicznych, jednak narzędzia do wiarygodnego i skalowalnego pomiaru pobierania EC FA pozostają ograniczone. Przedstawiamy tutaj szybki, ilościowy i opłacalny test mierzący pobieranie FA w EC z wykorzystaniem analogów fluorescencyjnej FA (BODIPY-C12 i BODIPY-C16), które umożliwiają badanie dynamiki pobierania specyficznej dla długości łańcucha w formacie płytek 96-dołkowych. Protokół obejmuje pozytywne (3-hydroksyzobutyran, mleczan) i ujemne (niklosamid) kontrole i jest walidowany zarówno w liniach pierwotnych (HUVEC), jak i uwiecznionych (EA.hy926) w liniach EC. Test wykrywa pochłanianie FA zależne od czasu i dawki, a wyniki są normalizowane do liczby komórek za pomocą barwienia jądrowego Hoechst i korygowane pod kątem tła odpowiednimi kontrolami. Może być adaptowany do różnych typów komórek, metod obrazowania oraz warunków eksperymentalnych, w tym obrazowania z żywymi komórkami oraz formatów impuls-chase. W porównaniu do tradycyjnego barwienia lipidowego lub radioaktywnych znaczników znaczniących, ta metoda oferuje lepsze bezpieczeństwo, szybkość i wszechstronność, jednocześnie rejestrując dynamiczne pobieranie FA w komórkach żywych. Ten test stanowi solidną podstawę do badania regulacji transportu lipidów śródbłonka i jego wkładu w choroby metaboliczne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby składniki odżywcze przenoszone przez krew, takie jak lipidy, dostały się do tkanek metabolicznych, takich jak mięśnie szkieletowe, muszą najpierw przejść przez barierę komórek śródbłonkowych (EC), która tworzy ściany naczyń kapilarnych. Chociaż przez długi czas sądzono, że kwasy tłuszczowe (FA) po prostu dyfundują przez tę barierę, by dotrzeć do tkanek leżących, pojawiające się dowody sugerują, że EC aktywnie regulują ten proces poprzez wyspecjalizowane mechanizmy transportu, które wyewoluowały do przenoszenia hydrofobowych cząsteczek między wodnymi światami pozakomórkowymi i wewnątrzkomórkowymi1.

We krwi FA występują albo jako wolne kwasy tłuszczowe związane z albuminą (FFA), albo są pakowane w lipoproteiny bogate w trójglicerydy (TRL), takie jak chylomikrony i lipoproteiny o bardzo niskiej gęstości (VLDLs)2. Na powierzchni luminalnej EC lipoproteinowa lipaza (LPL) hydrolizuje TRL, uwalniając FFA do pobierania. W transporcie FA uczestniczy wiele białek, w tym CD36, który faktycznie pobiera FA do komórki; białka transportujące kwasy tłuszczowe (FATP) oraz syntetazy acyl-CoA (ACSL), które pośredniczą w transporcie wektorowym; białka wiążące tłuszcze (FABP), które działają jako lipofilowe chaperony, oraz niezliczone inne, niektóre z nich wciąż nie zostały odkryte i sklasyfikowane 2,3. Tkanka podłoża również wykorzystuje podobne mechanizmy do pochłaniania transportowanego tłuszczu, choć obecne izoformy często różnią się w zależności od typu komórki.

Najnowsze badania wykazały, że EC koordynują się z sąsiednimi komórkami poprzez sygnalizację parakrynoczną, modulując transport FA do tkanek docelowych. Na przykład miocyty szkieletowe wydzielają zbiór czynników parakrynowych, takich jak 3-hydroksyzobutyran (3-HIB), czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego B (VEGFB) oraz apelina, aby wspierać transport FA przez pobliskie śródbłonko 4,5,6. Co ciekawe, może być zaangażowany także układ hormonalny, jak to ma miejsce w przypadku insuliny stymulującej adipocyty do uwalniania mleczanu, co również stymuluje EC do pobieraniaFAs 7.

EC działają więc jako modulatorzy bram tłuszczu, co sugeruje, że odgrywają kluczową rolę w zaburzeniach metabolicznych lipidów, takich jak choroby sercowo-naczyniowe czy cukrzyca typu 2. Najnowsze dowody wykazały, że same ECs gromadzą krople lipidowe (LD) w odpowiedzi na przeciążenie tłuszczem, potencjalnie działając jako bufor regulujący dostarczanie kwasów tłuszczowych do tkanek leżącychpod powierzchnią 8,9. W przypadku wysokiego spożycia tłuszczów, jak w przypadku nowoczesnych diet, nadmierne gromadzenie tych LD może przyczyniać się do zaburzeń naczyń i chorób, w tym nadciśnienia10. Ogólnie rzecz biorąc, lepsze zrozumienie, jak EC przyjmują i transportują FA, może dostarczyć nam nowych terapeutycznych metod leczenia chorób przenoszonych przez lipidy.

W niniejszym badaniu opisujemy prosty, szybki i opłacalny test pomiaru pochłaniania FA przez śródbłonek za pomocą fluorescencjowych analogów FA długich łańcuchów BODIPY-C12 i BODIPY-C16. Te odczynniki są stosunkowo tanie i bezpieczne, zwłaszcza w porównaniu z radioaktywnymi lub silnie izotopowymi substancjami FA, które tradycyjnie były używane do pomiaru pobierania tłuszczu przez komórkę11,12. Warto zauważyć, że te odczynniki różnią się od niesprzężonego "wolnego" barwnika BODIPY, który pasywnie gromadzi się w hydrofobowych obszarach komórki, głównie w LDs13. Natomiast sprzężenie BODIPY z alifatycznym łańcuchem FA (np.C12 lubC16) daje cząsteczkę, która strukturalnie naśladuje rodzime długołańcuchowe FA. Ta modyfikacja pozwala na specyficzny pomiar dynamicznego pobierania kwasów tłuszczowych do komórek, zamiast odzwierciedlać wewnątrzkomórkowe magazynowanie lipidów czy tworzenie kropelek.

Kluczową zaletą tego podejścia jest jego elastyczność. Naukowcy mogą wykorzystać inne typy komórek, zmienne czasy inkubacji oraz różne analogi FA sprzężone z BODIPY do badania pobierania zależnego od długości łańcucha, a nawet naturalnie fluorescencyjnych lipidów, takich jak cis-parinaczynowy kwastłuszczowy 14. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten zapewni naukowcom łatwy sposób testowania pochłaniania FA przez komórki w różnych warunkach i utoruje drogę do odpowiedzi na podstawowe pytania dotyczące metabolizmu lipidów, biologii śródbłonka oraz chorób metabolicznych (Rysunek 1).

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie komórki śródbłonka pochodzącego od człowieka (HUVEC) użyte w tym badaniu zostały pozyskane z komercyjnie dostępnych, anonimowych źródeł zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i dostawcami dotyczącymi etycznego wykorzystania ludzkich materiałów biologicznych. Wszystkie etapy wykonuj w sterylnym środowisku pod laminarnym kapturem. Zobacz Tabelę Materiałów , aby znaleźć listę wszystkich odczynników i sprzętu.

1. Powłoka żelatynowa na płytce 96-dołkowej

  1. Przygotuj roztwór żelatyny o stężeniu 0,1%, rozcieńczając 25 mL 2% zapasu żelatynowego w 500 mL 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).
  2. Dokładnie wymieszaj i sterylizuj filtr za pomocą filtra próżniowego 0,2 μm (lub autoklawu).
  3. Dodaj 100 μL żelatyny 0,1% na dołek do czarnej, przezroczystej płyty z 96 dołkami.
  4. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut lub najlepiej przez noc.

2. Siewowanie komórek

  1. Przygotuj zawiesinę pojedynczolowej EC w kompletnym nośniku.
    1. Przygotuj kompletne podłoże, uzupełniając odpowiedni podłoże bazalne o 10% surowicy płodowej bydła i 1% penicyliny/streptomycyny (w obu przypadkach w dołku).
      UWAGA: Ośrodek bazalny różni się w zależności od konkretnego typu komórki; w tym badaniu dla komórek HUVEC i EA.hy926 zastosowano odpowiednio ośrodek wzrostu śródbłonka śródbłonkowego (EGM-2) oraz zmodyfikowane medium Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco.
  2. Pipeta włóż 100 μL zawiesiny komórkowej do każdej studni z gęstością zasiewną, która pozwala komórkom osiągnąć zbieg do następnego dnia.

3. Przygotowanie i aplikacja odczynników do obróbki

  1. Przygotuj wszystkie odczynniki w dwuwartościanowym PBS (z Ca2+ i Mg2+) i podgrzej do 37 °C.
    1. Przygotuj 3-HIB (pozytywną kontrolę) jako roztwór roboczy o pojemności 20 mM. Rozpuszcz roztwór bulwarowy w temperaturze 1 M w wodzie podwójnie destylowanej i przechowuj w 4 °C.
    2. Przygotuj laktan (pozytywna kontrola) jako roztwór roboczy o pojemności 20 mM. Rozpuszcz roztwór bulwarowy w temperaturze 1 M w wodzie podwójnie destylowanej i przechowuj w 4 °C.
    3. Przygotuj niklosamid (kontrolę negatywną) w końcowym stężeniu 1 μM. Rozpuszcz roztwór zapasowy w stężeniu 10 mM w DMSO. Zawieraj mniejsze objętości, aby uniknąć cyklu zamarzania i rozmrażania, i przechowywaj w temperaturze -20 °C.
  2. Umyj komórki raz podgrzanym dwuwartościowym PBS.
  3. Dodaj 50 μL odpowiedniego odczynnika leczniczego na dołek (3-HIB, mleczan lub niklosamid) i inkubuj w temperaturze 37°C przez 30 minut (w przypadku niklosamidu) lub 60 minut (w przypadku 3-HIB i mleczanu).

4. BODIPY-FA: złożone przygotowanie i zastosowanie BSA

  1. Przygotuj kompleksy BODIPY-FA: BSA w stężeniach końcowych 0,5 μM, 1 μM lub 2 μM w PBS, stosując molowy stosunek 2:1 FA:BSA. Dla roztworu bodipy-fa o pojemności 2 μM inkubuj z 1 μM wolnym od FA BSA w PBS. Dla 1 μM BODIPY-FA używaj 0,5 μM BSA i tak dalej. Zawsze chroń kompleksy przed światłem podczas inkubacji.
  2. Inkubuj mieszankę w temperaturze pokojowej przez 10 minut przed użyciem.
  3. Dodaj 50 μL kompleksu do oczyszczonych studni.
    UWAGA: Używaj tylko środkowych 10 kolumn, aby uniknąć efektów krawędzi. Zarezerwuj zewnętrzne kolumny jako regulatory autofluorescencji, dodając do tych studni jedynie PBS.
  4. Inkubuj płytkę w 37 °C przez 1 minutę, 5 lub 10 minut.

5. Hartowanie fluorescencji i wykrywanie sygnałów wewnątrzkomórkowych

  1. Przygotuj 1 μM BSA wolnego od FA w PBS jako bufor płukania i podgrzej do 37 °C.
  2. Usuń BODIPY-FA: BSA i dwukrotnie umyj całą płytę 50 μL podgrzanego 1 μM wolnego od FA BSA w PBS. Każde mycie wykonuj przez 1,5 minuty.
  3. Dodaj 50 μL 0,08% Trypan Blue, aby ograniczyć fluorescencję zewnątrzkomórkową.
  4. Natychmiast zmierz fluorescencję wewnątrzkomórkową za pomocą czytnika mikropłytek o następujących ustawieniach: Wzbudzenie: 488 nm, Emisja: 515 nm, Cutoff: 495 nm, Tryb: odczyt od dołu.
    UWAGA: W kroku 4 odejmij tło autofluorescencji za pomocą zewnętrznych kolumnowych dołków zawierających komórki, które nie były traktowane BODIPY-FA.

6. Barwienie jądrowe Hoechsta dla normalizacji komórek

  1. Usuń roztwór Trypan Blue i delikatnie przemyj PBS.
    UWAGA: Komórki mogą być nieco delikatne i podatne na łuszczenie się. Zachowaj ostrożność podczas mycia.
  2. Dodaj 4 μg/mL Hoechst w podłożu 10% i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Czas inkubacji Hoechst może wymagać optymalizacji. W zależności od typu komórki, może być potrzebne od 5 do 60 minut, aby osiągnąć jednolite oznakowanie jądrowe i odpowiednią intensywność sygnału. Nie dodawaj Hoechst do zewnętrznych kolumn.
  3. Umyj talerz raz PBS.
  4. Dodaj świeże PBS i zmierz fluorescencję Hoechst przy następujących ustawieniach: Wzbudzenie: 350 nm, Emisja: 461 nm, Odcięcie: 455 nm, Tryb: odczyt od dołu.
    UWAGA: Odejmij tło autofluorescencji Hoechst za pomocą zewnętrznych studni kolumnowych.
  5. Znormalizuj fluorescencję BODIPY-FA do liczby komórek, dzieląc wartości skorygowane autofluorescencją z kroku 5.3 przez odpowiadające wartości Hoechsta uzyskane w kroku 6.4. Używaj wartości koregowanych tłem zarówno dla sygnałów BODIPY, jak i Hoechst.
    UWAGA: Końcowe wartości reprezentują pobór BODIPY-FA znormalizowany do liczby komórek, skorygowany o autofluorescencję zarówno w kanałach BODIPY, jak i Hoechst.

7. Analiza statystyczna

  1. Wykonaj analizę statystyczną dla Rysunku 2 za pomocą dwukierunkowej metody ANOVA, aby ocenić wpływ czasu, koncentracji i ich interakcji. Zastosuj test post hoc Tukey'a do wielu porównań.
  2. Dla Rysunku 3 i Rysunku 4 użyj niesparowanego dwustronnego testu t Studenta przy porównywaniu dwóch warunków. W eksperymentach obejmujących trzy lub więcej warunków stosuje się jednokierunkową metodę ANOVA, a następnie test Dunnetta dla wielu porównań.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak pokazano na Rysunku 1, ten test wykorzystuje format płyty 96-dołkowy, gdzie EC są zasiewane bezpośrednio do odwiertów. FAs oznaczane przez BODIPY są sprzężone z albuminą surowicy bydłej (BSA) i stosowane zarówno w studniach eksperymentalnych, jak i kontrolnych. Przed leczeniem FA EC mogą być manipulowane za pomocą farmakologicznych zabiegów lub zaburzeń genetycznych, takich jak transfekcja siRNA czy edycja genów CRISPR. Co istotne, takie manipulacje pozwalają również na zastosowanie odpowiednich pozytywnych i ujemnych kontroli, aby zapewnić wiarygodność testu.

Po inkubacji BODIPY-C12 w stężeniu 0,5 μM, 1 μM i 2 μM przez 1 minutę, 5 minut i 10 minut zarówno w HUVEC, jak i komórkach EA.hy926, zaobserwowano wyraźny, zależny od dawki i czasu zależny od dawki i czasu (Rysunek 2). Aby uwzględnić potencjalne zmiany liczby komórek na dołek, wartości BODIPY-C12 zostały znormalizowane do barwienia jądrowego Hoechsta i zmierzone fluorescencyjnym. Autofluorescencja tła została skorygowana za pomocą studni kontrolnych bez BODIPY i bez Hoechsta.

Aby zweryfikować powtarzalność i zakres testu, znane modulatory metabolizmu kwasów tłuszczowych zostały przetestowane w ECs EA.hy926 z użyciem BODIPY-C12 (Rysunek 3). Leczenie 1-godzinne ze zwiększającym stężeniem mleczanu (0 mM, 5 mM, 20 mM) lub 3-HIB (0 mM, 5 mM, 20 mM) zwiększało pobieranie BODIPY-C12 w zależności od dawki, potwierdzając ich rolę jako pozytywnych regulatorów pobierania substancji organicznej. Z kolei wcześniej wykazano, że związek niklosamid może hamować pobieranie kwasów tłuszczowych poprzez rozdzielanie mitochondriów15. Podobne wyniki powtórzono tutaj, ponieważ 30 minut leczenia niklosamidem (1 μM) znacząco zmniejszyło sygnał BODIPY-C12 w porównaniu do kontroli pojazdu, potwierdzając jego użyteczność jako kontroli ujemnej. Chociaż dane te są normalizowane do Hoechst, aby uwzględnić różnice w liczbie komórek, żadne z tych zabiegów nie zmieniło żywotności komórek ani wartości fluorescencji Hoechst.

Aby ocenić adaptacyjność testu do różnych analogów kwasów tłuszczowych, HUVEC-om podano BODIPY-C16, który można uznać za zastępstwo dla bardzo długołańcuchowego kwasu tłuszczowego, a jego przyjmowanie zmierzono po 5-minutowych inkubacjach (Rysunek 4). Zaobserwowano, że leczenie mleczanem (0 mM, 10 mM, 20 mM) zwiększało sygnał BODIPY-C16 w zależności od dawki, podczas gdy niklosamid (1 μM) zmniejszał sygnał, odzwierciedlając wyniki obserwowane w BODIPY-C12.

Podsumowując, ten test umożliwił solidne i powtarzalne określenie wchłaniania FA zarówno w pierwotnych (HUVEC), jak i uwiecznionych (EA.hy926) EC. Ponadto wyniki te pokazują wszechstronność testu w zakresie FA o różnej długości łańcucha, a także potwierdzają ważność zarówno pozytywnych, jak i negatywnych kontroli.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat testu pobierania kwasów tłuszczowych z użyciem kwasów tłuszczowych znakowanych przez BODIPY. Komórki śródlijkowe są zasiewane do czarnej, przezroczystej płytki z 96 dołkami i inkubowane analogami kwasów tłuszczowych sprzężonych z BODIPY, aby umożliwić pobieranie w obrębie. Po inkubacji fluorescencja zewnętrzna jest tłumiona Trypanowym Blue, a sygnał wewnątrzkomórkowy mierzony jest za pomocą odczytu fluorescencyjnego mikropłytkowego czytnika z dołem. Po pomiarze fluorescencji stosuje się barwnik jądrowy Hoechsta w celu ilościowego określenia liczby komórek w celu normalizacji. Leczenie farmakologiczne lub zaburzenia genetyczne mogą być stosowane przed inkubacją BODIPY-FA. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Ilościowa analiza pobierania BODIPY-C12 w komórkach śródbłonka pierwotnego i uwiecznionego. (A) Zależny od czasu i koncentracji wzrost pobierania BODIPY-C12 w HUVEC po inkubacji trwającej 1 minę, 5 minut i 10 minut przy 0,5 μM, 1 μM i 2 μM BODIPY-C12 złożonych odpowiednio do 0,25 μM, 0,5 μM i 1 μM wolnego od FA. (B) Komórki EA.hy926 wykazywały podobne, zależne od czasu i dawki pobieranie BODIPY-C12 w identycznych warunkach. Średnia intensywność fluorescencji została znormalizowana do jąder barwionych Hoechst (liczba komórek) oraz kontrolnych grup bez BODIPY. Dane są pokazywane jako średnia ± SD. Analiza statystyczna została przeprowadzona za pomocą dwukierunkowej metody ANOVA, aby ocenić wpływ czasu, koncentracji i ich interakcji, a następnie przeprowadzono test post hoc Tukeya dla wielu porównań. Istotne główne efekty zaobserwowano dla czasu (p < 0,0001), stężenia (p < 0,0001) oraz ich interakcji (p = 0,0443). Statystycznie istotne porównania parowe zidentyfikowane przez test Tukeya są przedstawione na wykresie słupkowym następująco: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 oraz ****p < 0,0001. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Walidacja testu z użyciem pozytywnych i negatywnych kontrol w EA.hy926. (A) 1-godzinne leczenie mleczanem (0 mM, 5 mM, 20 mM) zwiększyło pobieranie BODIPY-C12 w sposób zależny od dawki. (B) 1-godzinne 3-HIB (0 mM, 5 mM, 20 mM) podobnie zwiększono pobieranie FA (HIB). (C) 30-minutowe leczenie niklosamidem (1 μM) istotnie złagodziło pobieranie BODIPY-C12 w porównaniu do kontroli pojazdu (DMSO). Średnia intensywność fluorescencji została znormalizowana do jąder barwionych Hoechst (liczba komórek) oraz kontrolnych grup bez BODIPY. Dane przedstawiono jako średnią ± SD. We wszystkich eksperymentach inkubowano 2 μM BODIPY-C12 (złożony do 1 μM BSA wolnego od kwasów tłuszczowych) przez 5 minut. Statystyki dla (A) i (B) zostały określone za pomocą jednokierunkowej ANOVA, z testem Dunnetta dla wielu porównań, a dla C za pomocą niesparowanego dwustronnego testu T Studenta. p < 0,0001. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Walidacja testu za pomocą BODIPY-C16 w HUVEC. (A) Leczenie mleczanem (0 mM, 10 mM, 20 mM przez 1 godzinę) zwiększa przyjmowanie BODIPY-C16 w zależności od dawki. (B) Leczenie niklosamidem (1 μM przez 1 godzinę) istotnie zmniejszyło sygnał BODIPY-C16 w porównaniu z kontrolą leczoną pojazdem. Średnia intensywność fluorescencji została znormalizowana do jąder barwionych Hoechst (liczba komórek) oraz kontrolnych grup bez BODIPY. Dane przedstawiono jako średnią ± SD. We wszystkich eksperymentach inkubowano 2 μM BODIPY-C16 (złożony do 1 μM BSA bez kwasów tłuszczowych) przez 5 minut. Statystyki dla (A) zostały wyznaczone za pomocą jednokierunkowej ANOVA z testem Dunnetta dla wielu porównań, a dla B za pomocą niesparowanego dwustronnego testu T Studenta. *p < 0,05, ***p < 0,001 i ****p < 0,0001. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten test oferuje szybką, ilościową i opłacalną metodę pomiaru pochłaniania FA w EC, wykorzystując format płytek 96-dołkowych oraz fluorescencyjne analogi FA długołańcuchowe. Poprzez integrację zarówno pozytywnych, jak i negatywnych kontrol oraz walidację między pierwotnymi (HUVEC) i uwiecznionymi (EA.hy926) EC, protokół ten wykazuje odporność, powtarzalność i szeroką zastosowalność.

Analizy oparte na fluorescencji odegrały kluczową rolę w odkrywaniu parakrynologicznych regulatorów transportu lipidów śródbłonka, jak wspomniano wcześniejw 4,5,7. Te przykłady pokazują, jak standaryzowany system może nadal niezawodnie wyjaśniać regulację transportu lipidów opartą na metabolitach w kontrolowanym środowisku in vitro. Opisany tutaj protokół ustala kluczowe parametry wiarygodnych pomiarów pobierania FA (FA), w tym stosowanie BODIPY-C12 i BODIPY-C16 w wielu stężeniach (0,5-2 μM) oraz z czasami inkubacji (1 min, 5 min i 10 min). Skutecznie wykrył także zwiększoną absorpcję w odpowiedzi na 3-HIB i mleczan oraz zmniejszoną absorpcję po leczeniu niklosamidem, co potwierdza zarówno jego wrażliwość, jak i zakres dynamiczny. Chociaż jest tu zoptymalizowany pod kątem EC (EC), test ten można łatwo dostosować do innych typów komórek, takich jak adipocyty, myorurki czy hepatocyty, z uwzględnieniem dostosowania do stosunków BODIPY: BSA oraz warunków leczenia. Może być również modyfikowany do obrazowania żywych komórek przy użyciu kompatybilnych płytek lub dostosowany do formatu impuls-chase w celu oceny retencji wewnątrzkomórkowej FA, metabolizmu lub wypływu.

W porównaniu z innymi podejściami, ta metoda oferuje wyraźne zalety: jest skalowalna, ilościowa i adaptowalna do różnych długości łańcuchów FA. Ponadto jest opłacalny, obejmuje tylko kilka kroków i wymaga instrumentów nie bardziej złożonych niż zwykły czytnik mikropłyt, co pozwala nowym użytkownikom, w tym studentom, szybko opanować ten protokół. Wreszcie, w przeciwieństwie do metod opartych na mikroskopii jakościowej lub barwników końcowych, takich jak Oil Red O, które odzwierciedlają skumulowaną zawartość lipidów, protokół ten rejestruje pobieranie FA w czasie rzeczywistym bez konieczności utrwalania czy lizy.

Niemniej jednak należy zauważyć kilka ograniczeń. Zastosowanie dwuwymiarowego systemu statycznej hodowli nie oddaje w pełni złożoności fizjologicznej środowiska naczyniowego. Kluczowe czynniki, takie jak naprężenie ścinające lub lipoliza podlegana LPL, a także interakcje śródbłonkowo-przymięczaszkowe, są nieobecne w tym uproszczonym modelu. Zaawansowane systemy, takie jak mikrofluidyczne lub organoidowe kokultury 3D, lepiej naśladują architekturę in vivo i sygnalizację, choć wymagają większej wiedzy technicznej i infrastruktury16,17. Na przykład mikrofluidyczne bioreaktory zapewniają środowisko, w którym EC mogą naśladować formowanie się mikronaczyń i oddziaływać z innymi typami tkanek, umożliwiając badaczom modelowanie dynamiki parakryny w bardziej fizjologicznych warunkach18. Ponadto najnowsze badania wykazały, że można opracować specjalistyczne systemy do prowadzenia obrazowania fluorescencyjnego na żywo w hodowlach hydrożelowych 3D19. Takie postępy dają pewność, że ten test może zostać pewnego dnia dostosowany do systemów hodowli komórkowych o bardziej reprezentatywnych fizjologicznie, ale konieczna będzie optymalizacja.

Podsumowując, ten test stanowi elastyczną, dostępną i powtarzalną platformę do badania komórkowego pobierania FA w różnych warunkach. Choć najlepiej nadaje się do mechanistycznych badań in vitro , wnioski uzyskane z tego systemu mogą pomóc w przyszłych badaniach z wykorzystaniem bardziej fizjologicznie istotnych modeli transportu lipidów śródbłonka.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczyli, że nie istnieje konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tanisha Choudhury została sfinansowana z letniego stypendium badawczego dla studentów licencjackich z Office for Undergraduate Research na University of North Carolina at Chapel Hill. Boa Kim był wspierany przez NHLBI (R56HL162660) i AHA (24CDA1264317). Ayon Ibrahim był wspierany przez Faculty Research Fund Union College.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3-Hydroksizobutyrat (3-HIB)Cayman Chemicals26105Kontrola dodatnia, końcowe stężenie 5 lub 20 mM
96-dołkowa, przezroczysta mikropłytka z polistyrenuSigma-AldrichCLS3603-48EAAby komórki płytkowe mogły być testowane
BODIPY FL C12 (Bodipy-FA)Thermo Fisher ScientificD3822Zielone fluorescencyjne długołańcuchowe kwasy tłuszczowe
BODIPY FL C16 (Bodipy-FA)Thermo Fisher ScientificD3821Zielone fluorescencyjne bardzo długołańcuchowe kwasy tłuszczowe
Roztwór albuminy surowicy bydlęcejSigma-AldrichA9205-50MLWykorzystywane do przygotowania kompleksu Bodipy:BSA
Dimetylsulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650Rozpuszczalnik dla akcji leków
Jednorazowe zbiorniki pipetowaniaVWR89094-680Zawiera różne roztwory do pipetowania na komórki
Dulbecco' Zmodyfikowany Eagle' s MediumCorning Life Sciences10-013-CVNośniki dla komórek EA.hy926
Komórki EA.hy926ATCCCRL-2922 Uwieczniona linia hybrydowa komórek śródbłonka
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitLonzaCC-3162Media dla HUVEC
Serum bydlęce płodu (FBS)  VWR97068-08510% suplement w EGM-2 i DMEM
Czytnik mikropłyt fluorescencyjnychRóżneNie maKażdy czytnik mikropłyt zdolny do pomiarów fluorescencji
Roztwór żelatynySigma-AldrichG1393-100mlUżywany do pokrywania płyt w stężeniu 0,1% roboczym
Rozwiązanie Hoechst 33342Nauki o życiu62249Barwienie jądrowe dla normalizacji komórek (4 &m; M)
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)LonzaC2519APierwotne komórki śródbłonka człowieka
Pipeta wielokanałowaVWR76627-768Do pipetowania na płytę 96-dołkową
Niclosamide  Millipore SigmaN3510-50GKontrola ujemna, 1 μ M  Ostateczna koncentracja
PBS, z wapniem i magnezemFisher Scientific21031CVUżywany do przygotowywania zabiegów i jako bufor płukania (z BSA)
PBS, bez wapnia i magnezuGenesee Scientific25-508Do rozcieńczania żelatyny, barwienia Hoechst i ogólnych myć
Penicylina/StreptomycynaThermo Fisher Scientific151401221% suplementu w EGM-2 i DMEM
L-mleczan soduSigma-AldrichL7022-5GKontrola dodatnia, końcowe stężenie 5 lub 20 mM
Rozwiązanie Trypan BlueSigma-AldrichT8154-20MLStosowany w 0,08% do tłumienia fluorescencji zewnątrzkomórkowej
Systemy filtrów próżniowych, membrana PES 500ml, 0,45&mikro; mGenClone25-227Aby sterylizować roztwór żelatyny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwenk, R. W., Holloway, G. P., Luiken, J. J. F. P., Bonen, A., Glatz, J. F. C. Fatty acid transport across the cell membrane: regulation by fatty acid transporters. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 82 (4-6), 149-154 (2010).
  2. He, Q., Chen, Y., Wang, Z., He, H., Yu, P. Cellular uptake, metabolism and sensing of long-chain fatty acids. Front Biosci (Landmark Ed). 28 (1), 10(2023).
  3. Mashek, D. G., Coleman, R. A. Cellular fatty acid uptake: the contribution of metabolism. Curr Opin Lipidol. 17 (3), 274-278 (2006).
  4. Jang, C., et al. A branched-chain amino acid metabolite drives vascular fatty acid transport and causes insulin resistance. Nat Med. 22 (4), 421-426 (2016).
  5. Hagberg, C. E., et al. Vascular endothelial growth factor B controls endothelial fatty acid uptake. Nature. 464 (7290), 917-921 (2010).
  6. Hwangbo, C., et al. Endothelial APLNR regulates tissue fatty acid uptake and is essential for apelin's glucose-lowering effects. Sci Transl Med. 9 (407), eaad4000(2017).
  7. Ibrahim, A., et al. Insulin-stimulated adipocytes secrete lactate to promote endothelial fatty acid uptake and transport. J Cell Sci. 135 (5), jcs258964(2022).
  8. Kuo, A., Lee, M. Y., Sessa, W. C. Lipid droplet biogenesis and function in the endothelium. Circ Res. 120 (8), 1289-1297 (2017).
  9. Ibrahim, A., Arany, Z. Does endothelium buffer fat. Circ Res. 120 (8), 1219-1221 (2017).
  10. Kim, B., et al. Endothelial lipid droplets suppress eNOS to link high-fat consumption to blood pressure elevation. J Clin Invest. 133 (24), e173160(2023).
  11. Dubikovskaya, E., Chudnovskiy, R., Karateev, G., Park, H. M., Stahl, A. Measurement of long-chain fatty acid uptake into adipocytes. Methods Enzymol. 538, 107-134 (2014).
  12. Watkins, O. C., et al. Metabolism of 13C-labeled fatty acids in term human placental explants by liquid chromatography-mass spectrometry. Endocrinology. 160 (6), 1394-1408 (2019).
  13. Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. J Biomed Biotechnol. 2011, 598358(2011).
  14. Fraser, H., et al. Fatty acid uptake in diabetic rat adipocytes. Mol Cell Biochem. 167 (1-2), 51-60 (1997).
  15. Ibrahim, A., Yucel, N., Kim, B., Arany, Z. Local mitochondrial ATP production regulates endothelial fatty acid uptake and transport. Cell Metab. 32 (2), 309-319.e7 (2020).
  16. Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Opin Biotechnol. 25, 95-102 (2014).
  17. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-21 (2022).
  18. Maiullari, F., et al. Modeling breast cancer dynamics through modulable small vessel environment bioreactor (sVEB). Biomaterials. 323, 123441(2025).
  19. Murphy, A. R., Franco, R. A., Allenby, M. C. Fabricating microfluidic co-cultures of immortalized cell lines uncovers robust design principles for the simultaneous formation of patterned, vascularized, and stem cell-derived adipose tissue. Small. , e2501834(2025).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

BODIPY Fatty AcidEndothelial CellsFatty Acid Transport96 Well Plate AssayHoechst Nuclear StainingLive Cell ImagingDose Dependent UptakeMetabolic Disease

Powiązane artykuły