Przyjazna użytkownikowi i wydajna analiza R dużych zbiorów danych

Wraz ze wzrostem dostępności dużych zbiorów danych w dziedzinie nauki, ważne jest opracowanie przyjaznych użytkownikowi narzędzi, które pozwolą badaczom szybko i łatwo analizować te duże zbiory. Jednym z typów powszechnie dużych zbiorów danych jest wykorzystanie genu lucyferazy jako reportera, co umożliwiło łatwe, ciągłe i nieinwazyjne badanie ekspresji genów w żywych komórkach i organizmach. Automatyzacja w rejestrowaniu luminescencji zrewolucjonizowała pomiar luminescencji lunescencji lunescencji i doprowadziła do rozszerzenia zbioru danych, szczególnie w polu zegara okołodobowego ^1,2. Korzystając z mikropłyt z 96 dołkami oraz automatycznego czytnika płyt ze stosownikiem, tysiące próbek ekspresujących gen lucyferazy można indywidualnie badać w szeregach czasowych, czasem co godzinę przez kilka dni, w jednym eksperymencie. Takie eksperymenty o wysokiej przepustowości doprowadziły do powstania dużych zbiorów danych, których tradycyjne eksperymenty ekspresji genów z użyciem pobierania próbek ręcznych, a następnie przetwarzania RNA, nie były w stanie osiągnąć. Analiza tak dużych zbiorów danych w odpowiednim czasie jest ważna, ale może być wyzwaniem.

Chociaż istnieje wiele narzędzi do analizy danych pod kątem rytmiczności, wiele z nich analizuje testy oparte na zachowaniu zwierząt, a nie na ekspresji reporterowej luminescencji 3,4,5,6,7 (Tabela Uzupełniająca S1). Niektóre narzędzia wymagają od badaczy wcześniejszych umiejętności programowania, takich jak znajomość Pythona lub dostęp do MATLAB-a. Inne narzędzia wymagają zakupu oprogramowania, co może być kosztowne. Dostępne są darmowe, praktyczne rozwiązania online. Jednym z takich narzędzi jest BioDare2⁸, które oferuje różnorodne metody analizy danych o rytmiczności. BioDare2 to przyjazne dla użytkownika narzędzie online, które wymaga minimalnej wiedzy obliczeniowej. Użytkownicy muszą przesyłać dane wejściowe online oraz pobierać dane wyjściowe z interfejsu online do dalszego przetwarzania.

Prezentujemy tutaj przyjazne dla użytkownika skrypty R z wieloma możliwościami łatwej analizy dużych zbiorów danych. Korzystamy z darmowego, otwartoźródłowego oprogramowania RStudio⁹, interfejsu dla R i Pythona, do uruchamiania skryptów. RStudio może być używane na różnych systemach komputerowych, w tym Windows, Mac i Linux. W tym raporcie przedstawiono szczegółowe instrukcje krok po kroku, które pomogą użytkownikom korzystać ze skryptów R, szczególnie w sekcjach protokołu 1 i 2. Ta metoda wymaga minimalnego wkładu użytkownika. Początkujący, który nie posiada wcześniejszej wiedzy o R i nie ma doświadczenia programistycznego, będzie mógł wykorzystać tę metodę do analizy dużych zbiorów danych z testów lucyferazowych lub innych typów zbiorów danych z danymi z szeregów czasowych. Wszystkie dane wejściowe i wyjściowe są przechowywane na komputerze lokalnym, dzięki czemu analiza może być przeprowadzona w dowolnym miejscu bez ograniczeń dostępu do internetu, gdy wszystkie odpowiednie pakiety R zostaną po raz pierwszy pobrane. Dane wyjściowe są sortowane w dobrze zorganizowane foldery, a wyniki gotowe do przetworzenia do publikacji. Analize statystyczne są również uwzględniane jako część wyników, aby umożliwić szybką ocenę różnic między próbami. W ten sposób metoda R mogłaby stanowić łatwe i skuteczne rozwiązanie dla badaczy w analizie dużych zbiorów danych.

1. Analiza zegara okołodobowego oparta na lucyferazach

1. Eksperymentalne przygotowanie do testu lucyferazowego
   UWAGA: Test lucyferazowy to powszechna metoda stosowana do oceny aktywności zegara dobowego w czasie rzeczywistym. Luminescencja, emitowana przez reporter lucyferazowy przenoszony przez żywe organizmy transgeniczne i/lub komórki, może być rejestrowana automatycznie, co prowadzi do powstawania dużych zbiorów danych z szeregami czasowymi. Nasze laboratorium głównie wykorzystuje sadzonki Arabidopsis thaliana wyrażające gen lucyferazy jako reporter. Rysunek 1 i Rysunek 2 przedstawiają schemat przepływu typowego eksperymentalnego zestawu testu lucyferazowego z sadzonkami w formacie 96-dołkowym w naszym laboratorium, zmodyfikowany na podstawie wcześniejszego opisu².
   1. Wysterylizuj nasiona parą wybielacza wytworzoną przez dodanie 3 mL 36% (w/w) HCl do 100 mL wybielacza domowego w zlewce przez 3 godziny. Włóż zlewkę do słoika z zamkniętą pokrywką, umieszczoną w okapu chemicznym. Po sterylizacji należy nasiona nakładać na płytki o pojemności 1/2 MS zawierające 0,5% sacharozy i 0,8% agaru (pH 5,7), używając sterylnej szklanej pipety Pasteura, w szafce laminarnej przepływowej. Zbieraj odpady chemiczne do słoika z pokrywką i utylizuj je we współpracy z instytucjonalnym działem zdrowia środowiskowego.
   2. Umieść płytki w temperaturze 4 °C na 2 dni, zanim przeniesiesz je do komory do hodowli tkanek z cyklem światła 12 godzin i 12 godzin ciemnego światła (LD).
   3. Pozwól siewkom rosnąć przez 4 dni w stanie LD.
   4. Przenieś siewki na płytę z 96 dołkami; każdy dołek zawierał 180 μL podłoża do testów (1/2MS, 0,5% sacharozy, 0,4% agaru, 0,25 mM lucyferyny). Umieść płytki na 1 dzień w stanie LD, a następnie przez 1 dzień w 24 godzinach stałego światła (LL).
   5. Dodaj preparaty lub roztwór próbny do studni i rejestruj luminescencję co godzinę przez 5-7 dni w LL. Ustaw soczewkę filtra emisyjnego na 3 600 dla wzmocnienia i czas interwału pomiaru na 1 s.
      UWAGA: Czas rozpoczęcia nagrywania może być w dowolnym momencie. Jednakże, ponieważ skrypt R przyjmuje tylko liczby całkowite (liczby całkowite), interwały zapisu muszą być liczbą całkowitą. Na przykład dozwolony jest interwał 1-godzinny, ale 15-minutowy interwał nie jest dozwolony dla skryptu R.
   6. Na końcu nagrania zrób zdjęcie płyty, aby zarejestrować wzrost siewek.
   7. Zapisz surowe dane jako plik CSV do analizy R, używając funkcji zapisu jako w oprogramowaniu do analizy danych dla czytnika płyt.
2. Stopniowe wyjaśnienie analizy R danych okołodobowych opartych na lucyferazach
   UWAGA: Ta analiza R wykorzystuje skrypt R Supplemental File 1 (LUC_2025.R), opracowany do analizy danych okołodobowych, oraz plik wejściowy Supplemental File 2 (NO7.csv). Skrypt R wraz z plikiem wejściowym jest publicznie dostępny na platformie repozytorium Github (https://github.com/elvenfire29/Circadian-Luciferase-Analysis).
   1. Pobierz oprogramowanie RStudio kompatybilne z systemem^{komputerowym 9,10}.
   2. Pobierz pakiety algorytmiczne RStudio wymagane przez Plik Uzupełniający 1 (LUC_2025.R): MetaCycle¹¹: algorytm ARSER¹² z pakietu MetaCycle, ggplot2¹³, dplyr¹⁴, magrittr¹⁵, stringr¹⁶, filesstrings¹⁷, circular¹⁸, AICcmodavg¹⁹ oraz broom²⁰.
      UWAGA: Zobacz także górę skryptu R, aby zobaczyć listę pakietów.
   3. Zmień User Input I (zgodnie z konkretnym zbiorem danych na lokalnym komputerze, w tym katalogiem roboczym, nazwą pliku wejściowego, etykietami dla zabiegów oraz względnym czasem rozpoczęcia testu.
      UWAGA: Kroki 1.2.1 i 1.2.2 trzeba wykonać tylko raz; po czym konsola interfejsu RStudio jest gotowa do przyjmowania danych wejściowych od użytkownika, z modyfikacjami przy każdej nowej analizie. W sekcji User Input (Ilustracja Dodatkowa S1) znajdują się dwie części.
      1. Wybierz katalog roboczy. Wskaż, gdzie znajduje się plik wejściowy. Ten sam folder będzie miejscem przechowywania plików wyjściowych.
      2. Wybierz plik wejściowy, czyli plik CSV poprawnie sformatowany dla skryptu R (Rysunek 2B). Konkretnie, górny wiersz zawiera szeregi czasowe, a pierwsza kolumna zawiera poszczególne pozycje próbek na płycie z 96 dołkami.
         UWAGA: Przykład takiego pliku CSV można znaleźć w Pliku Uzupełniającym 2 (NO7.csv).
      3. Wskaż próbki i/lub zabiegi. Ponieważ analiza ta jest wykorzystywana do danych uzyskanych z 96 dołków w przebiegu czasu, zaprojektuj eksperymenty jako 8 replik na leczenie, co daje łącznie do 12 zabiegów na płytkę, lub jako 12 replikacji na leczenie, co daje łącznie do 8 zabiegów na płytkę. Upewnij się, że wpisujesz właściwą liczbę próbek, 8 lub 12, ponieważ liczba próbek się liczy; Jeśli liczba próbek nie wynosi 8 lub 12, kod nie uruchomi się. Jeśli jednak są rzędy pustych właści, po prostu wypisz je jako takie w przestrzeni dla nazw zabiegów, na przykład nazywając jako puste 1, puste 2...
         UWAGA: W przypadku przykładowych nazw należy unikać używania ukośników lub podobnych symboli, ponieważ mogą one powodować problemy z nazwami plików. Dodatkowo, należy unikać używania etykiety "NA" przy wyborze ANOVA w User Input II. Każde leczenie o identycznej nazwie zostanie połączone w jedną dużą grupę leczenia.
      4. Podaj względny czas rozpoczęcia testu. Dla danego dnia trwającego 24 godziny subiektywny świt to moment, gdy światło w komorze jest włączane podczas normalnego cyklu światła/ciemności. Na przykład, jeśli światło świeci się o 7 rano, rozważmy ten czas jako czas okołodobowy 0. Jeśli test lucyferazowy rozpoczyna się o 9:00, czas testu to czas okołodobowy 2; wejście 2 jako względny czas rozpoczęcia.
         UWAGA: Względny czas rozpoczęcia musi być liczbą całkowitą i nie może być ujemny. To wpłynie na odczyt fazy próbek.
   4. Zmieniaj opcje User Input II według konkretnych potrzeb.
      UWAGA: Poniższe instrukcje zawierają bardziej szczegółowe wyjaśnienie sekcji Input użytkownika oraz krok po kroku przewodnik po wprowadzaniu zmian.
      1. Uwzględnij wykresy: krzywe luminescencji, wykresy dla okresu, fazy i amplitudy dla genotypu i leczenia.
      2. Użyj testu ANOVA z Tukey HSD, aby porównać leczenie pod względem okresu, fazy i amplitudy. Wybierz kontrolę dla wyjścia testu ANOVA; określ kontrolę dla testu ANOVA lub pozostawij opcję pustą, aby użyć każdego zabiegu jako kontroli w porównaniu parowym. Alternatywnie, można wybrać numerację plików wyjściowych ANOVA dla szybszego odniesienia i organizacji.
      3. Użyj testu T, aby porównać metody leczenia pod względem okresu, fazy i amplitudy. Wybierz, czy test t powinien być porównaniem parowym; Jeśli wybrany jest parowy test T, wybieramy, czy dane są sparowane. Wybierz kontrolę do testu T; Określ kontrolę dla testu T-lub pozostawij opcję pustą, aby używać każdego zabiegu jako kontroli. Zdecyduj, czy ponumerować pliki wyjściowe t-test dla szybszego odniesienia i organizacji.
         UWAGA: Powinno się to stosować tylko do porównywania dwóch zabiegów jednocześnie, na przykład dwóch linii tego samego genotypu z dodatkiem SA lub Mock. Wartości p nie są korygowane do wielokrotnych porównań z tą samą linią.
      4. Zdecyduj, czy zaokrąglić punkty czasowe. Jeśli punkty czasowe są przesunięte tylko o minutę lub dwie, zaokrąglaj do najbliższej godziny i użyj tej analizy.
         UWAGA: Ten kod oblicza okres, fazę i amplitudę przy użyciu metody^{ARS 12}. Ta metoda wymaga spójnego szeregu czasowego w godzinach do działania.
      5. W zależności od sposobu rejestrowania studni przez czytnik płyt, zmień sposób odczytu wejścia. Wybierz standardową listę danych studni według A1, A2, A3... lub ten dla odwiertów wymienionych według A1, B1, C1...
   5. Analizę uruchom, po prostu klikając przycisk Źródło w prawym górnym rogu konsoli.
      UWAGA: Analiza trwa mniej niż 1 minutę. Wynik analizy R automatycznie pojawi się w tym samym folderze co zbiór danych wejściowych.
   6. Zobacz wyjście: Folder wyjściowy zawiera kilka dokumentów i podfolderów, które zapewniają kompleksową analizę, w tym dane statystyczne dotyczące średniego okresu, fazy i amplitudy dla replikacji każdego genotypu i/lub leczenia.
      UWAGA: Dla pliku wejściowego Plik Uzupełniający 2 (NO7.csv) lista dokumentów wyjściowych wygenerowanych przez skrypt Pliku Uzupełniającego 1 (LUC_2025.R) w sekcji protokołu 1 jest opisana w Tabeli 1 i można ją wygodnie zobaczyć ze strukturą drzewa w Rysunku Uzupełniającym S2.

2. Analiza ROS oparta na luminolu

1. Przygotowanie eksperymentalne do testu ROS
   1. Wyciąć dyski liściowe o średnicy 4 mm z czwartego do siódmego liścia 25-dniowych roślin za pomocą dziurkarki do biopsji.
   2. Unieś dyski liściowe z owłosioną stroną do góry na 100 μL sterylnej wody w płytce z 96 dołkami.
   3. Przykryj płytkę czystą folią aluminiową i umieść ją na noc w komorze wzrostu LD.
   4. Zastąp wodę na 100 μL roztworu luminolu (300 μM w buforze MOPS 10 mM o pH 7,4 oraz 1 μM flg22 lub innym elicitorem). Użyj mock solution zamiast flg22 jako kontroli.
   5. Natychmiast zacznij zapisywać luminescencję co minutę przez 40-60 minut.
2. Stopniowe wyjaśnienie analizy danych ROS metodą R
   UWAGA: Ta analiza R wykorzystuje Rstudio, skrypt R, Plik Uzupełniający 3 (ROS_2025.R) oraz pliki wejściowe Plik Uzupełniający 4 (ROS_flg22.csv) lub Plik Uzupełniający 5 (ROS_elf26.csv). Skrypt R wraz z plikiem wejściowym Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv) jest publicznie dostępny za pośrednictwem platformy repozytorium Github (https://github.com/elvenfire29/ROS-Luminol-Analysis)
   1. Pobierz pakiety RStudio: gplot2¹³, dplyr¹⁴, magrittr¹⁵, stringr¹⁶ oraz filesstrings¹⁷.
      UWAGA: Kroki 2.2.1 trzeba wykonać tylko raz. Aby pomóc użytkownikom dostosować każdą analizę do określonego zestawu danych na komputerze, utworzono sekcję "User Input", która pozwala użytkownikom wskazywać konkretne parametry eksperymentów (Ilustracja uzupełniająca S3).
   2. Zmień User Input I zgodnie z konkretnym zbiorem danych na lokalnym komputerze, w tym katalogiem roboczym, nazwą pliku wejściowego, etykietami dla zabiegów oraz względnym czasem rozpoczęcia testu.
      1. Wybierz katalog roboczy. Wskaż, gdzie znajduje się plik wejściowy. Ten sam folder będzie miejscem przechowywania plików wyjściowych.
      2. Wybierz plik wejściowy, czyli plik CSV poprawnie sformatowany dla skryptu R (Rysunek 2B). Konkretnie, górny wiersz zawiera szeregi czasowe, a pierwsza kolumna zawiera poszczególne pozycje próbek na płycie z 96 dołkami.
         UWAGA: Przykład takiego pliku CSV można znaleźć w materiałach uzupełniających, Pliku Uzupełniającym 4 (ROS_flg22.csv) lub Pliku Uzupełniającym 5 (ROS_elf26.csv).
      3. Wskaż próbki i/lub zabiegi. Ponieważ analiza ta jest wykorzystywana do danych uzyskanych z 96 dołków w przebiegu czasu, zaprojektuj eksperymenty jako 8 replik na leczenie, co daje łącznie do 12 zabiegów na płytkę, lub jako 12 replikacji na leczenie, co daje łącznie do 8 zabiegów na płytkę. Jeśli są rzędy pustych dołków, po prostu wypisz je jako takie w przestrzeni dla nazw zabiegów, na przykład nazywając jako puste 1, puste 2...
         UWAGA: Ważne jest, aby podać prawidłową liczbę próbek, 8 lub 12, ponieważ liczba próbek się liczy. Jeśli liczba próbek nie wynosi 8 lub 12, kod nie uruchomi się. W przypadku przykładowych nazw unikaj używania ukośników lub podobnych symboli, ponieważ mogą one powodować problemy z nazwami plików. Unikaj także używania etykiety "NA" podczas wyboru ANOVA w User Input II. W przeciwieństwie do skryptu Supplemental File 1 (LUC_2025.R), opracowania o tej samej nazwie nie łączą się w jedną grupę w tym skrypcie Supplemental File 3 (ROS_2025.R).
   3. Zmień opcje User Input II w zależności od indywidualnych potrzeb użytkownika.
      UWAGA: Przykładowe wkłady użytkownika można zobaczyć na Rysunku Uzupełniającym S3.
      1. Użyj testu ANOVA z Tukey HSD, aby porównać sumy luminescencji leczenia.
      2. Użyj dwustronnego testu T, aby porównać dane z dwóch zabiegów jednocześnie.
         UWAGA: Pokazane wartości p nie są korygowane pod kątem wielokrotnych porównań z tą samą linią.
      3. Zrób wykres krzywych fluorescencji i wykres słupkowy porównujący całkowitą sumę fluorescencji. Dodaj do grafów odchylenie standardowe lub średni błąd standardowy.
      4. W zależności od sposobu rejestrowania studni przez czytnik płyt, zmień sposób odczytu wejścia. Albo użyj standardowej listy danych studni według A1, A2, A3... lub ten dla odwiertów wymienionych według A1, B1, C1...
3. Analizę uruchom, klikając przycisk Źródło w prawym górnym rogu konsoli.
   UWAGA: Analiza trwa mniej niż 1 minutę. Wynik analizy R automatycznie pojawi się w tym samym folderze co zbiór danych wejściowych.
4. Zobacz wyjście: Folder wyjściowy zawiera kilka dokumentów i podfolderów, które zapewniają kompleksową analizę.
   UWAGA: W pliku wejściowym Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv) przedstawiono strukturę drzewa dokumentów wyjściowych generowanych przez skrypt Supplemental File 3 (ROS_2025.R) opisany w sekcji 2 protokołu, przedstawioną na Rysunku Uzupełniającym S4.

Studium przypadku 1. Badanie luminescencji aktywności zegara dobowego z sadzonkami Arabidopsis

Wcześniej wykazaliśmy, że gen GLYCINE-BOGATY W BIAŁKO WIĄŻĄCE RNA 7 (GRP7) jest kontrolowany przez białko zegara głównego CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1 (CCA1), a ekspresja okołodobowa GRP7 jest istotna ze względu na jego rolę w obronie roślin, wykorzystując transgeniczne rośliny Col-0 ekspresujące reporter lucyferazy pod kontrolą promotora GRP7 typu dzikiego (pGRP7wt: LUC)21. Przeanalizowaliśmy aktywność zegara okołodobowego tych roślin transgenicznych wraz z rośliną kontrolną CCA1:LUC/Col-0, używając skryptu R o nazwie LUC_2025.R (Plik uzupełniający 1 w sekcji protokołu 1).

Plik wejściowy o nazwie NO7.csv (Plik Uzupełniający 2) zawiera odczyty luminescencji dla siedmiu niezależnych linii pGRP7wt:LUC oraz sterowania CCA1:LUC/Col-0 (Plik Uzupełniający 2 (NO7.csv)). Po uruchomieniu skryptu podfolder wyjściowy o nazwie NO7 output zostanie wygenerowany w tym samym folderze co plik wejściowy NO7.csv (Supplemental File 2 (NO7.csv)). Pliki folderu wyjścia NO7 opisano w Tabeli 1 i można je wygodnie przeglądać ze strukturą drzewa w Rysunku Uzupełniającym S2. Wartości w folderze wyjściowym NO7 zostały dalej przetworzone, aby uzyskać Rysunek 3 i Rysunek 4. Rysunek 3 pokazuje, że raport CCA1:LUC wykazywał amplitudę 3 000 RLU, okres 23,5 godziny i fazę 3,5 godziny. Parametry zegara są w dużej mierze zgodne z wcześniejszymi raportami22,23. Dla linii pGRP7wt:Luc zaobserwowano inny wzorzec ekspresji. Chociaż wszystkie linie pGRP7wt:LUC wydawały się być podobne pod względem okresu i fazy, występowały różnice w wartościach amplitud tych linii, prawdopodobnie spowodowane wpływem transgenów w chromosomach na pozycję. Obserwacje te zostały dodatkowo potwierdzone, gdy parametry okresu, amplitudy i fazy zostały obliczone za pomocą skryptu R (Rysunek 4). Aby zweryfikować tę analizę, ten sam zbiór danych został ponownie przeanalizowany za pomocą BioDare2, bezpłatnej platformy online do analizy danych okołodobowych8. Wyniki analizy R były porównywalne z tymi uzyskanymi z algorytmu BioDare2 FFT-NLLS (NLLS) 8,24 (Rysunek 4).

Studium przypadku 2. Badanie luminescencji aktywności zegara okołodobowego z komórkami ssaków
Skrypt R LUC_2025.R (Plik Uzupełniający 1) został dodatkowo wykorzystany do analizy aktywności zegara okołodobowego wykazywanej przez komórki ssaków25. Linia komórkowa U2 OS wyrażająca raport zegara okołodobowego jest powszechnie używaną modelową linią komórkową do pomiaru aktywności zegara okołodobowego ssaków26,27. Ponownie przeanalizowaliśmy dane szeregów czasowych wygenerowane komórkami U2 OS ekspresującymi raport Per2d:Luc hodowany w płytce z 96 dołkami. Komórki były leczone cząsteczkami siRNA celującymi w określone geny. Rysunek 5 pokazuje, że komórki kontrolne negatywne, które nie były leczone siRNA, miały okres 23,3 h, fazę 2,8 h oraz amplitudę 184,8 RLU. Jak można się spodziewać, siRNA celujące w gen CRY2 znacząco osłabiło amplitudę i wpłynęło na okres oraz fazę raportującego. Geny PSMD4 i PSMD7 kodują białka będące częścią komponentu pokrywy proteasomu 26S do degradacji białek. Zgodnie z poprzednim raportem25, analiza R pokazuje, że obniżenie PSMD4 lub PSMD7 przez ich odpowiednie siRNA nie wpływa na parametry zegara. Dlatego ten skrypt R jest łatwo stosowany w różnych systemach eksperymentalnych do badań zegara okołodobowego.

Studium przypadku 3. Test ROS dla odpowiedzi obronnej
Oprócz dużych zbiorów danych z luminescencyjnych testów zegara okołodobowego, skrypt R może być adaptowany do analizy innych typów danych. Przedstawiamy tutaj jedno z takich zastosowań do ilościowego określenia reaktywnych związków tlenu (ROS). Rośliny wykształciły różne strategie walki z inwazją patogenów. Jedną ze strategii jest rozpoznanie nie-własnych cząsteczek od patogenu i następnie aktywacja wrodzonych odpowiedzi immunologicznych. Jedną z takich wczesnych odpowiedzi immunologicznych jest wybuch ROS, który następuje w ciągu kilku minut, gdy gospodarz napotka niebędącą cząsteczką własną. Typowy test ROS przeprowadzono na płytkach 96-dołkowe, zawierającej 12 dysków liściowych na genotyp na leczenie (sekcja protokołu 2). Tutaj użyto dwóch powszechnych cząsteczek elicitorowych, flg22, peptydu 22-aminokwasowego pochodzącego z konserwowanego obszaru białek bakteryjnychwici-28, oraz elf26, 26-aminokwasowego peptydu z czynnika elongacyjnego Tuprotein 29, które indukowały wybuch ROS. Skrypt, Supplemental File 3 (ROS_2025.R), został opracowany do analizy danych ROS. Dwa pliki CVS z ROS assays, Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv) i Supplemental File 5 (ROS_elf26.csv), które zostały przekonwertowane do formatu analizy R, można pobrać z sekcji Materiały Uzupełniające. Po analizie R, foldery wyjściowe są generowane w tym samym folderze co każdy plik wejściowy w własnym komputerze, zawierając krzywe ROS burst oraz całkowite wartości ROS podczas testu, wraz z analizami statystycznymi (Rysunek uzupełniający S4). Dane zostały dalej przetworzone, tworząc rysunek 6. Wyniki przedstawione tutaj są podobne do tych opublikowanych, które zostały przetworzone ręcznie30.

Rysunek 1: Schemat przepływowy testu lucyferazy do analizy R. Siewki wyrażające reporter lucyferazowy napędzany przez promotor zegara były sterylizowane i hodowane na podłożu o masie 1/2 MS w LD przez 4 dni. Sadzonki przenoszono na płytki z 96 dołkami zawierające 180 μL medium 1/2 MS zawierającego D-lucyferynę. Każda dobrze opanowana była po jednej sadzonce. Po 1 dniu w LD, a następnie 1 dniu w LL, luminescencja była rejestrowana za pomocą czytnika płyt. Sadzonki na płytce były zazwyczaj rejestrowane pod kątem luminescencji w LL co godzinę przez 5-7 dni. Po nagraniu sfotografowano płyty w celu oceny wzrostu siewek, a surowe dane zapisano jako plik CSV do analizy R. Skróty: LD = 12 godzin światła/12 godzin ciemności; LL = stałe światło. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Schemat przepływowy pozyskiwania danych luminescencyjnych i analizy R. (A) Opisano pięciostopniową procedurę analizy zegara okołodobowego za pomocą skryptu R. Krok 1. Organizować eksperymenty jako 8 lub 12 siewek na genotyp i/lub na zabieg; Krok 2. Rekordowa luminescencja w LL w odstępach 1 godziny przez 5-7 dni; Krok 3. Pobierz i sformatuj dane w pliku CSV; Krok 4. Analizuj dane za pomocą R; oraz Krok 5. Zobacz dane wyjściowe. Czas rozpoczęcia nagrywania może być w dowolnym momencie. Jednakże, ponieważ skrypt R przyjmuje tylko liczby całkowite (liczby całkowite), interwały zapisu muszą być liczbą całkowitą. (B) Zrzut ekranu pliku CSV poprawnie sformatowanego dla skryptu R. Oryginalny plik wejściowy, NO7.csv, można znaleźć w Pliku Uzupełniającym 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Ekspresja okołodobowa pGRP7wt:LUC u roślin transgenicznych. Pokazano ślady luminescencji pGRP7wt:LUC. Paski pod osią x wskazują subiektywny dzień (otwarte paski) i noc (szare paski). Średnio ślad luminescencji każdego genotypu wynosi 12 replik. Paski błędów nie były wyświetlane ze względu na dużą liczbę krzywych. Skrót: RLU = Względne jednostki luminescencji. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Porównanie danych wyjściowych ze skryptu R i BioDare2. Ten sam zestaw danych co na Rysunku 3 został przeanalizowany przez skrypt R oraz BioDare2 dla parametrów zegara okołodobowego, amplitudy, okresu i fazy. Dane reprezentują średnią ± SEM (n=12). Różne litery wskazują na istotną różnicę między próbkami (P < 0,05; ANOVA jednokierunkowa z post-hoc testem HSD Tukeya). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 5: Analiza aktywności zegara okołodobowego z komórkami ssaków. Dane szeregów czasowych wygenerowane przez komórki U2 OS wyrażające reportera Per2dLuc hodowanego na 96-dołkowej płycie w DD zostały opisane wcześniej na 25. do leczenia komórek użyto cząsteczek siRNA skierowanych do CRY2, PSMD4 lub PSMD7. (A) Ślady luminescencji. (b) Amplituda, okres i faza Per2d:Luc. Dane reprezentują średnią ± SEM (n = 3). Różne litery na panelu (B) wskazują istotną różnicę między próbką kontrolną z ujemną a próbką obtraktowaną siRNA (P<0,05; ANOVA jednokierunkowa z post-hoc testem HSD Tukeya). Skrót: RLU = jednostka względnej luminescencji. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 6: Analiza wybuchów ROS według R. Siewki zostały zarejestrowane pod kątem względnej luminescencji bezpośrednio po leczeniu 1 μM flg22 (po lewej) lub 1 μM elf26 (po prawej). (A) Ślady luminescencji średnio wynosiły 12 siewek na genotyp (n = 12) w czasie po ewokacji. Średnie wartości na genotyp na jedno leczenie są częścią wyciągu R. (B) Uśrednione całkowite liczby luminescencji dla każdego genotypu przy leczeniu flg22 lub elf26. Dane reprezentują średnią ± SEM (n = 12). Różne litery wskazują na istotną różnicę między próbkami (P < 0,05; ANOVA jednokierunkowa z post-hoc testem HSD Tukeya). Skrót: RLU = jednostka względnej luminescencji. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Tabela 1: Lista dokumentów wyjściowych z analizy R. To jest lista dokumentów wyjściowych generowanych przez skrypt LUC_2025.R (Plik Uzupełniający 1) oraz plik wejściowy NO7.csv (Plik Uzupełniający 2).

Ilustracja uzupełniająca S1: Zrzuty ekranu dla Input I i Input II w sekcji protokołu 1. Input użytkownika I musi zostać zmieniony, aby dostosować analizę do konkretnego zbioru danych na lokalnym komputerze. Zmiany w User Input II są opcjonalne, w zależności od ustawienia eksperymentalnego. Ważne jest, aby zauważyć, że skrypt Supplemental File 1 (LUC_2025.R) oczekuje, że wszystkie wgłębienia będą obecne w pliku, a nie tylko wybrane lub użyte. Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.

Rysunek uzupełniający S2: Struktura drzewa dla dokumentów wyjściowych. Wynik ten był generowany za pomocą skryptu LUC_2025.R (Plik Uzupełniający 1) oraz pliku wejściowego NO7.csv (Plik Uzupełniający 2). Skrypt LUC_2025.R generuje folder wyjściowy na podstawie nazwy pliku wejściowego. Więcej szczegółów dotyczących plików wyjściowych można znaleźć w Tabeli 1. Ramki symbolizują foldery z plikami. Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.

Ilustracja uzupełniająca S3: Zrzuty ekranu z User Input I i User Input II w sekcji protokołu 2. Skrypt Supplemental File 3 (ROS_2025.R) korzysta z tego samego ogólnego formatu wejściowego co skrypt Supplemental File 1 (LUC_2025.R). Input użytkownika I musi zostać zmieniony, aby dostosować analizę do konkretnego zbioru danych na lokalnym komputerze. Zmiany w User Input II są opcjonalne, w zależności od ustawienia eksperymentalnego. Ważne jest, aby zauważyć, że skrypt Supplemental File 3 (ROS_2025.R) oczekuje, że wszystkie wgłębienia będą obecne w pliku, a nie tylko wybrane lub użyte. Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.

Rysunek uzupełniający S4: Struktura drzewa dla dokumentów wyjściowych. Wyjście to zostało wygenerowane za pomocą skryptu ROS_2025.R (Supplemental File 3) oraz pliku wejściowego ROS_flg22.csv (Supplemental File 4). Skrypt ROS_2025.R generuje folder wyjściowy na podstawie nazwy pliku wejściowego. W tym folderze znajduje się plik z całkowitymi liczbami ROS oraz plik z wykresami. Są też podfoldery z PRISM i danymi graficznymi, testem ANOVA oraz testami t. Ramki symbolizują foldery z plikami. Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.

Tabela uzupełniająca S1: Lista dostępnych narzędzi bioinformatycznych do analizy danych okołodobowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: LUC_2025.R. Jest to skrypt R używany do analizy danych zegara okołodobowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: NO7.csv. Jest to plik wejściowy zawierający przykład danych zegara okołodobowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: ROS_2025.R. To jest skrypt R używany do analizy danych ROS. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: ROS_fig22.csv. Jest to plik wejściowy zawierający przykład danych ROS. ROS został wywołany leczeniem 1 μM flg22. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: ROS_elf26.csv. Jest to plik wejściowy zawierający przykład danych ROS. ROS został wywołany leczeniem 1 μM elf26. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.