Artykuł metodologiczny

Ocena wpływu czynników SASP na proliferację komórek nowotworowych za pomocą analizy porównawczej trzech różnych metodologii

DOI:

10.3791/68883

⸱

19 września 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Gazi University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to ocenia proliferacyjne efekty czynników wydzielniczych związanych ze starzeniem (SASP) pochodzących z komórek HeLa na komórki HeLa niestarzejące, wykorzystując trzy modele in vitro z monitoringiem w czasie rzeczywistym. Zalety i ograniczenia każdej metody były systematycznie porównywane, aby lepiej zrozumieć interakcje komórki w nowotworach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki nowotworowe wywołane chemioterapią wydzielają także różne czynniki, zwane fenotypem wydzielniczym związanym ze starzeniem, aby regulować swoje zewnętrzne mikrośrodowisko. Wcześniejsze badania wykazały, że te czynniki SASP wywierają szkodliwe działanie parakrynowe na otaczające komórki, w tym promujące proliferację, przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT), angiogenezę i migrację. Wiele technik kokultury in vitro jest szeroko stosowanych do zrozumienia procesów komórkowych wynikających z interakcji poprzez hodowlę tych samych i różnych typów komórek razem. Tutaj badane były potencjalne proliferacyjne efekty czynników SASP wydzielanych przez komórki HeLa starzejące się na komórki HeLa niestarzejące, stosując trzy komplementarne podejścia in vitro . Pierwsze podejście polegało na współhodowli komórek senescentycznych i niesenescentnych w celu zbadania sygnalizacji parakrynologicznej pośredniczonej przez SASP. W drugim podejściu skoncentrowano podłoża warunkowane zebrane z komórek nowotworowych na poziomie starzejącym się i następnie wykorzystano do badania wpływu podłoża warunkowanego z monitorowaniem proliferacji w czasie rzeczywistym. W trzeciej metodzie komórki starzejące i niesenescentyjne były hodowane obok siebie, aby ocenić efekty paradokryniczne SASP poprzez bezpośredni kontakt komórka-komórka. Wszystkie trzy modele eksperymentalne konsekwentnie wykazywały, że czynniki SASP znacząco zwiększają proliferację komórek nowotworowych niesenescentnych. Warto zauważyć, że koprodukcja komórek starzących zwiększyła tempo proliferacji o 64,6%, a trzykrotnie skoncentrowane podłoża warunkowane SASP zwiększyły proliferację o ponad 50% w porównaniu z grupami kontrolnymi. Obrazowanie oparte na fluorescencji wykazało wzrost liczby komórek GFP w warunkach zgodnych z GFP o 49,3%. Metody te łącznie umożliwiły ilościową i jakościową ocenę proliferacyjnych zmian wywołanych przez SASP. Analiza porównawcza tych podejść podkreśla ich zalety i ograniczenia, dostarczając cennych informacji na temat parakrynologicznych efektów komórek starzejących się na przyrost.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

U organizmów wielokomórkowych komórki komunikują się za pomocą sygnalizacji parakrynowej i juxtacrynowej, wymieniając się komunikatami ze swoim mikrośrodowiskiem, wpływając tym samym na zachowania innych osób. Ta komunikacja może odbywać się bezpośrednio, poprzez tunelujące nanorurki i połączenia szczelinowe, lub pośrednio poprzez wydzielanie rozpuszczalnych cząsteczek chemicznych, takich jak cytokiny, czynniki wzrostu i chemokiny, do macierzy zewnątrzkomórkowej. Te mechanizmy sygnalizacyjne odgrywają istotną rolę w regulacji różnych procesów fizjologicznych, w tym rozwoju tkanek i odpowiedzi komórek odpornościowych, a także są powiązane z patogenezą licznych chorób, takich jak nowotwory, HIV, nadciśnienie czy choroba Alzheimera1.

W latach 60. Leonard Hayflick odkrył, że normalne ludzkie fibroblasty mają ograniczoną zdolność do replikacji in vitro2. Ten ograniczony stan proliferacji komórek, który rozwija się w wyniku skracania telomerazy, nazywany jest starzeniem replikacyjnym. Kolejne badania wykazały, że różne formy stresu komórkowego również mogą wywoływać starzenie się komórkowe. Ustalono, że powszechne metody leczenia nowotworów, takie jak chemioterapia i radioterapia, również wywołują starzenie komórkowe zarówno w komórkach nowotworowych, jak i stromalnych, zwane starzeniem wywołanym terapią 3,4. Starzenie się komórkowe i starzenie się to procesy powiązane hierarchicznie; reprezentują one odrębne procesy biologiczne. Nagromadzenie komórek starzących w organizmie przyczynia się do starzenia się poprzez promowanie stanu zapalnego, dysfunkcji tkanek oraz rozwój chorób związanych z wiekiem. Jednak starzenie się obejmuje znacznie szerszy zakres zdarzeń i mechanizmów systemowych w porównaniu do starzeniasię 5.

Komórki starzejące charakteryzują się tym, że ich rozbudowana cytoplazma jest znacznie większa i ma spłaszczoną morfologię w porównaniu do komórek normalnych6. Te komórki starzące się mają zwiększoną aktywność lizosomalną i są pozytywne na aktywność β-galaktozydazy (SA-β-gal) związaną ze starzeniem się, enzymu lizosomalnego, który pozostaje aktywny nawet przy kwaśnym pH 6,0. Barwienie SA-β-gal jest najczęściej stosowanym biomarkerem do wykrywania komórek starzejących7. Powiększenie i nieregularna morfologia jąder są powszechnie obserwowane w komórkach przechodzących starzenie się. Ponadto komórki te charakteryzują się unikalnymi przekształceniami chromatynowych zwanymi heterochromatycznymi ogniskami związanymi ze stareniem (SAHF), które pośredniczą w nieodwracalnym zatrzymaniu cyklu komórkowego 8,9.

Chociaż starzejące się komórki nowotworowe ostatecznie utraciły zdolność do proliferacji, pozostały żywotne i metabolicznie aktywne. Wiadomo, że komórki starzejące wydzielają także różne czynniki regulujące mikrośrodowisko guza zewnętrznego, zwane fenotypem wydzielniowym związanym ze starzeniem (SASP)10,11. Czynniki SASP obejmują rozpuszczalne czynniki sygnalizacyjne (interleukiny, chemokiny i czynniki wzrostu), wydzielane proteazy oraz wydzielane nierozpuszczalne białka/składniki macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Łącznie te czynniki wywierają szkodliwe efekty parakryniologiczne, w tym sprzyjają proliferacji komórek nowotworowych, migracji, inwazji oraz indukcji przejścia z nabłonka do mezenchymu (EMT)4,12. Ponadto skutki niepożądane wywołane chemioterapią częściowo przypisuje się gromadzeniu komórek starzejących13. Dlatego badanie interakcji między komórkami starzejącymi a niestarzającymi stało się ważnym obszarem badań w kontekście terapii nowotworów. Szczególnie analiza czynników SASP, zwłaszcza ich składu i wpływu na mikrośrodowisko nowotworowe, jest uważana za obiecującą strategię identyfikacji nowych cząsteczek docelowych w terapii nowotworowej oraz odkrywania nowych leków na te cząsteczki.

Techniki kokultury in vitro od dawna są wykorzystywane do badania zrozumienia interakcji międzykomórkowych14. W tym artykule metodologicznym celem było ocenenie możliwej aktywności proliferacyjnej czynników wydzielanych z komórek starzejących się na komórkach nowotworowych niesenescentycznych za pomocą trzech różnych metod. Dodatkowo porównano wyniki uzyskane z trzech różnych metod, a każde z nich krytycznie oceniło ich zalety i wady.

Najpierw stworzono model współhodowli między komórkami HeLa a niestarzalymi komórkami HeLa, aby monitorować możliwe zmiany w proliferacji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym za pomocą systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym12. System ten składa się z dwóch płyt do oceny interakcji między komórkami. Widok e-plate, który tworzy dolną warstwę, ma powierzchnię, na której zasiewane są komórki docelowe, z mikroelektrodami umieszczonymi na dole płyty. Opór elektryczny wywołany przez adhezję komórek docelowych do tej powierzchni wyrażany jest przez mierzalny parametr Indeks Komórki (CI). Wartość CI jest proporcjonalna do liczby komórek oraz stopnia przyczepności do powierzchni15. Dodatkowo widok e-plate umożliwia morfologiczne badanie komórek pod mikroskopem kontrastu fazowego. Wkładka e-plate, która tworzy górną warstwę, to miejsce, gdzie zasiewane są komórki efektorowe. Spód tej płyty pokryty jest półprzepuszczalną membraną o wielkości poru 0,4 μm. Czynniki wydzielane z komórek efektorowych mogą przechodzić przez błonę i wpływać na komórki docelowe w widoku e-plate. Jeśli ta interakcja stymuluje proliferację komórek, obserwuje się to jako wzrost wartości CI. W ten sposób interakcje między komórkami można oceniać ilościowo.

W drugiej metodzie skoncentrowano podłoża warunkowane zebrane z komórek HeLa i dodano do komórek HeLa niesenescentnych. Potencjalny efekt proliferacyjny na te komórki monitorowano za pomocą systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym.

W trzeciej metodzie planowano współhodować komórki HeLa starzejące się bezpośrednio i komórki GFP-HeLa niesenescentne w 2D oraz monitorować możliwe zmiany proliferacyjne w komórkach nowotworowych w czasie rzeczywistym pod mikroskopem.

Celem tego eksperymentu jest stworzenie trzech modeli do badania interakcji między komórkami HeLa starzejących się a niesenescentnych HeLa oraz monitorowanie możliwych zmian w proliferacji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym. Dzięki temu wpływ czynników SASP wydzielanych przez komórki nowotworowe na pozostałe komórki nowotworowe można łatwo zbadać. W związku z tym systematycznie oceniono zalety i ograniczenia tych trzech podejść.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie procedury hodowli komórek przeprowadzano w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego II+ (BSL2+) w certyfikowanej szafce bezpieczeństwa. Doksorubicyna to niebezpieczny środek chemioterapeutyczny. Wszystkie procedury muszą być wykonywane w certyfikowanej szafce o poziomie bezpieczeństwa biologicznego II+ (BSL2+), z użyciem odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (PPE), w tym fartuchów laboratoryjnych i rękawiczek. Wszystkie odpady zawierające doksorubicynę, w tym media i utrwalacze, powinny być zbierane w wyznaczonych i wyraźnie oznakowanych pojemnikach na odpady niebezpieczne i utylizowane w ramach instytucjonalnego systemu zarządzania odpadami niebezpiecznymi.

1. Model 1: Współhodowla z użyciem systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym

  1. Hodowla komórek i indukcja starzenia (dzień 1-2)
    1. Nasiać 8 x 10 5komórek HeLa do kolby T25 zawierającej 5 mL Zmodyfikowanego Medium Orła (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionego 10% surowicą bydła płodu (FBS), penicyliną (100 U/mL) i streptomycyną (0,1 μg/mL) oraz inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5%CO2.
    2. Następnego dnia zamień podłoże komórek na 5 mL świeżego, kompletnego medium. Należy bezpośrednio poddać komórki 300 nM doksorubicyny, dodając je do ośrodka, aby wywołać starzenie komórkowe. Przechowywać kolbę T25 w inkubatorze z 5%CO2 w 37 °C przez 72 godziny.
  2. Niesenescentyjne siewnictwo komórkowe (dzień 4)
    1. Nasiać 8 x 10 5 nieprzetworzonych komórek HeLa (kontrola niesenescentyjna) w nowej kolbie T25 w 5 mL DMEM z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydła, penicylinie (100 U/mL) i streptomycyny (0,1 μg/mL) i przechowywać w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5%CO2.
  3. Potwierdzenie indukcji starzenia (dzień 5)
    1. Aby ustalić, czy 72 godziny leczenia doksorubicyną wywołało starzenie się, należy wykonać barwienie SA-β-gal6. Wykonaj ten test na osobnym zestawie komórek, które nie były używane w głównych eksperymentach. Uzyskane wyniki można znaleźć na rysunku 1A,B.
    2. Zmierz IL-6 w warunkowanych ośrodkach starzejących się komórek raka HeLa, aby ocenić ich aktywność wydzielniczą. Lecz komórki doksorubicyną przez 72 godziny, a następnie inkubuj w medium bezsurowicowym i wolnym od fenolu przez kolejne 2 dni. Normalizuj zebrane podłoże warunkowane do liczby komórek i mierz poziom IL-6.
      UWAGA: IL-6 jest charakterystyczną cytokiną SASP12. Wyniki pomiaru IL-6 przedstawiono na rysunku 1C.
  4. Konfiguracja systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym (Dzień 5)
    1. Włącz system analizy komórek w czasie rzeczywistym przed zasiewem komórek. Uruchom oprogramowanie RTCA 2.0. Kliknij przycisk Exp Notes (Rysunek 2) i wprowadź szczegóły eksperymentu.
    2. Kliknij przycisk Harmonogram i dodaj dwa kroki. Pierwszym krokiem jest tło. Drugim krokiem jest monitorowanie proliferacji komórek co 15 minut przez 72 godziny.
    3. Wybierz pierwszy krok i kliknij Play , aby zarejestrować impedancję tła, dodając 50 μL pełnego medium do każdego wgłębienia widoku e-plate.
  5. Siewowanie komórek do widoku e-plate (dzień 5)
    1. Sprawdź zarówno komórki HeLa leczone doxorubicyną (senescentyjne), jak i nieleczone (niesenescentne) pod mikroskopem kontrastowym fazowym, używając powiększenia 10x przed zasiewem komórek. Pod mikroskopem komórki starzejące mają znacznie bardziej powiększoną morfologię niż komórki normalne.
    2. Przemyj zarówno komórki HeLa senescentyjne, jak i niesenescentyjne 5 mL sterylnego, wcześniej podgrzanego PBS, a następnie aspiruj.
    3. Dodaj 1 ml podgrzanej trypsyny o stężeniu 0,05% i utrzymuj kolby w temperaturze 37 °C przez 2 minuty, aby odłączyć komórki. Zneutralizuj trypsynę 5 mL kompletnego DMEM uzupełnionego o 10% surowicę płodową bydła, penicylinę (100 U/mL) oraz streptomycynę (0,1 μg/mL).
    4. Wirówka komórek w stężeniu 500 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut, odrzuć supernatant i ponownie zawiesować osady komórkowe w 5 mL kompletnego DMEM z dodatkiem 10% surowicy bydlęcej płodu, penicyliny (100 U/mL) i streptomycyny (0,1 μg/mL).
    5. Policz żywotne komórki metodą wykluczania barwnika trypan blue za pomocą hemocytometru.
    6. Niesenescentyjne komórki HeLa zasiewaj o gęstości 5 x 103 komórek /dołek w każdej dołku jednej płytki e, zobacz pełną ilość 100 μL DMEM uzupełnioną o 10% surowicę płodową bydła, penicylinę (100 U/mL) i streptomycynę (0,1 μg/mL).
    7. Umieść widok e-plate w kolebce systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym, aby komórki mogły przyłączyć się do powierzchni płyty w inkubatorze.
    8. Wybierz Drugi Krok na przycisku harmonogramu i kliknij przycisk Play , aby rozpocząć pomiar impedancji za pomocą oprogramowania RTCA 2.0 przez 72 godziny (Rysunek 2).
  6. Siewowanie komórek do wkładki e-plate
    1. Komórki nasienne w jednej wkładce e-plate wkładają się w 60 μL kompletnego DMEM, uzupełnionego o 10% surowicę płodową bydła, penicylinę (100 U/mL) oraz streptomycynę (0,1 μg/mL).
    2. Komórki zasiewające na wkładkę e-plate w trzech różnych konfiguracjach eksperymentalnych: Grupa 1 (Kontrola negatywna): Nie zasiewane komórki (tylko nośnik)
      Grupa 2: 2 × 104 niesenescentyjne komórki HeLa
      Grupa 3: 1 × 105 komórek HeLa
    3. Wkład do e-plate utrzymuj w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5%CO2 przez 6 godzin do przymocowania.
  7. Komórki współhodowujące
    1. Kliknij Pauza po 6 godzinach siewania komórek. Delikatnie aspiruj pożywkę hodowlową z każdego dołku w widoku e-plate, aby usunąć surowicę i nieprzywierające komórki.
    2. Przepłukaj studnie 2 razy podgrzanym PBS w temperaturze 37 °C. Dodaj 140 μL bezsurowicowego DMEM do każdej studni w widoku e-plate.
    3. Weź wkładkę do e-plate i aspiruj pożywkę hodowlą. Delikatnie płucz je PBS w temperaturze 37 °C 2x i dodaj 60 μL DMEM wolnego od surowic.
    4. Umieść wkładkę e-plate w widoku e-plate i delikatnie dociskaj, aż wkładka będzie całkowicie osadzona w wwiercie.
    5. Włóż połączoną płytę do systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym i kliknij Play , aby wznowić monitorowanie wartości indeksu komórek w czasie rzeczywistym co 15 minut za pomocą oprogramowania (Rysunek 2).
    6. Wyłącz system analizy komórek w czasie rzeczywistym po zakończeniu czasu eksperymentu (Rysunek 3A).
  8. Komórki obrazujące na wkładce e-plate
    UWAGA: Ponieważ w dołku wkładu e-plate znajduje się błona, komórki zasiane tutaj nie mogą być widoczne na membranie za pomocą mikroskopii kontrastowej fazowej. Aby sprawdzić, czy komórki zachowały żywotność do końca eksperymentu oraz czy komórki starzejące zachowały integralność strukturalną, zostały one zabarwione DAPI (Rysunek 3B).
    1. Usuń wkładkę e-plate z widoku e-plate. Barw komórki w wkładce e-plate DAPI i sprawdź ich obecność pod mikroskopem fluorescencyjnym16. Jądra komórek świecących są znane jako większe niż jądra komórek normalnych. Na podstawie rozmiarów jąder komórek zabarwionych DAPI określić, która studnia została zasiana komórkami niesenescentnymi, a która komórkami senescentyjnymi.
  9. Komórki obrazujące w widoku e-plate
    1. Bezpośrednio obejrzyj widok na tablicy e-pod mikroskopem z kontrastem fazowym z użyciem powiększenia 10x (Rysunek 3B). Ponieważ cztery rzędy czujników mikroelektrod zostały usunięte ze środka każdego dołka w widoku e-plate, utworzono przestrzeń 6, aby umożliwić monitorowanie komórek mikroskopią.
  10. Analiza danych
    1. Normalizuj wartości CI w momencie połączenia, gdy widok e-plate i wkładka e-plate są łączone i wstawione do systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym.
    2. Kliknij przycisk Analiza danych, aby obliczyć tempo i ilość proliferacji, korzystając z maksymalnego indeksu komórek i danych o nachyleniu uzyskanych z systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym (Rysunek 2). Następnie analizuj dane za pomocą odpowiedniego programu statystycznego (rysunek 3C,D).

2. Model 2: Test zabiegowy z podłożem warunkowym z wykorzystaniem systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym

  1. Hodowla komórek i indukcja starzenia (dzień 1-2)
    1. Zasiać 35 x 10 4komórek HeLa do każdego dołku z 6 płytkami dołków zawierających 2,5 mL Zmodyfikowanego Medium Orła (DMEM) Dulbecco, uzupełnionego o 10% surowicę płodową bydła (FBS), penicylinę (100 U/mL) i streptomycynę (0,1 μg/mL) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze z 5%CO2.
    2. Następnego dnia zamień podłoże komórkowe na 2,5 mL świeżego, kompletnego medium. Należy bezpośrednio poddać komórkom 300 nM doksorubicyny, dodając ją do ośrodka, aby wywołać starzenie się komórkowe. Utrzymuj płytkę z 6 dołkami w inkubatorze z 5% CO2 w 37 °C przez 72 godziny.
  2. Niesenescentyjne siewnictwo komórkowe (dzień 4)
    1. Zasiewaj 35 x 10 4 nieleczonych komórek HeLa (kontrola niesenescentyjna) do każdego dołka nowej płytki 6-dołkowej w 2,5 mL DMEM wzbogaconej o 10% surowicę płodową bydła, penicylinę (100 U/mL) i streptomycynę (0,1 μg/mL) i przechowywać w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5%CO2.
  3. Przeprowadz potwierdzenie indukcji starzenia się zgodnie z krokiem 1.3.
  4. Przygotowanie warunkowanego medium z komórek HeLa starzących i niesenescentnych
    1. Sprawdź zarówno komórki leczone doksorubicyną (komórki starzejące), jak i nieleczone komórki HeLa (komórki niesenescentyjne) pod mikroskopem kontrastu fazowego. Pod mikroskopem komórki starzejące mają znacznie bardziej powiększoną morfologię niż komórki normalne.
    2. Aspiruj pożywkę hodowlową z obu dwóch płytek z 6 dołkami (komórek HeLa starzących i niestarzejących się). Przemyj komórki 2 razy podgrzanym PBS w temperaturze 37 °C, aby usunąć surowicę i zanieczyszczenia komórkowe.
    3. Do każdego dołka dodaj 2 mL bezsurowicowego DMEM z penicyliną (100 U/mL) i streptomycyną (0,1 μg/mL). Inkubuj komórki w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez 48 godzin.
  5. Zbieranie i koncentracja mediów warunkowanych (Dzień 7)
    1. Zbieraj podłoże kondycjonowane z każdej studni do rurek sterylnych w laminarnej kabinie bezpieczeństwa.
    2. Trypsynizuj komórki i licz je metodą wykluczania barwnika trypanowego niebieskiego za pomocą hemocytometru, aby normalizować podłoża warunkowane do liczby komórek.
    3. Dostosuj podłoże kondicjonowane, znormalizowane według liczby komórek, do końcowej objętości 2 mL z bezsurowicowym DMEM uzupełnionym penicyliną (100 U/mL) i streptomycyną (0,1 μg/mL) w sterylnych probówkach o pojemności 2 mL.
    4. Wiruj zebrane kondycjonowane medium w dawce 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe, a następnie wiruj w 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać klarowany supernatant.
    5. Wirówka kondycjonowanego medium za pomocą ultraodśrodkowych filtrów o pojemności 2 mL w temperaturze 4 °C przez 60 minut przy 3000 x g , aby je skoncentrować. Procedura ta koncentruje 2 mL kondicjonowane medium do 5 razy większej niż 400 μL w porównaniu z kondicjonowanym medium.
    6. Rozcieńcz uzyskane 40 μL kondicjonowanego medium świeżym, bezsurowicowym medium, aby przygotować 1x, 2x i 3x skoncentrowane media kondicjonowane w sterylnych tubach w laminarnej kabinie bezpieczeństwa.
      UWAGA: Ponieważ ośrodek pozostający na komórkach przez 48 godzin jest wyczerpany w wyniku konsumpcji komórkowej, zebrane i skoncentrowane podłoże kondycjonowane jest następnie rozcieńczane nowym medium.
  6. Siew komórek do widoku e-plate
    1. Ustaw system analizy komórek w czasie rzeczywistym, jak opisano w krokach 1.1-1.4. Przemyj niesenescentyjne komórki HeLa podgrzanym PBS, a następnie aspiruj.
    2. Dodaj 1 ml podgrzanej trypsyny o stężeniu 0,05% i utrzymuj kolby w temperaturze 37 °C przez 2 minuty, aby odłączyć komórki. Zneutralizuj trypsynę 5 mL kompletnego DMEM uzupełnionego o 10% surowicę płodową bydła, penicylinę (100 U/mL) oraz streptomycynę (0,1 μg/mL).
    3. Wirówka komórek w stężeniu 500 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut, odrzuć supernatant i ponownie zawiesować osady komórkowe w 5 mL kompletnego DMEM z dodatkiem 10% surowicy bydlęcej płodu, penicyliny (100 U/mL) i streptomycyny (0,1 μg/mL).
    4. Policz żywotne komórki metodą wykluczania barwnika trypan blue za pomocą hemocytometru.
    5. Niesenescentyjne komórki HeLa zasiewaj o gęstości 5 x 103 komórek /dołek w każdej jamce jednej e-płytki w 200 μL kompletnego DMEM uzupełnionego o 10% surowicę płodową bydła, penicylinę (100 U/mL) oraz streptomycynę (0,1 μg/mL).
    6. Umieść widok e-plate w kolebce systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym, aby komórki mogły przyłączyć się do powierzchni płyty w inkubatorze.
    7. Wybierz drugi krok na przycisku harmonogramu i kliknij przycisk Play, aby rozpocząć pomiar impedancji za pomocą oprogramowania RTCA 2.0 (Rysunek 2). Kliknij przycisk Pauza w oprogramowaniu po 6 godzinach powlekania komórek HeLa niesenescentnych (Rysunek 2).
    8. Delikatnie aspiruj pożywkę hodowlową z każdego dołku w widoku e-plate, aby usunąć surowicę i nieprzywierające komórki. Płucz studnie 2 razy z podgrzanym PBS w temperaturze 37 °C.
    9. Dodaj podgrzewane, kondycjonowane podłoże do 37 °C w odpowiednich grupach:
      Grupa 1: Świeże media
      Grupa 2: 1x niestarzejące się ośrodki warunkowane komórkami HeLa
      Grupa 3: 2x niesenescentyjne ośrodki warunkowane komórkami HeLa
      Grupa 4: 3 ośrodki warunkowane komórkami HeLa niestarzejącymi się
      Grupa 5: 1x starzejące się media warunkowane komórkami HeLa
      Grupa 6: 2x starzejące się media warunkowane komórkami HeLa
      Grupa 7: 3x starzejące się ośrodki warunkowane komórkami HeLa
    10. Wstaw widok e-plate do systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym i kliknij Play , aby wznowić monitorowanie wartości indeksu komórek w czasie rzeczywistym w odstępach 15 minut przez 48 godzin (Rysunek 2).
    11. Wyłącz system analizy komórek w czasie rzeczywistym, gdy czas eksperymentu się skończy (Rysunek 4A).
  7. Komórki obrazujące w widoku e-plate
    1. Bezpośrednio obejrzyj widok e-plate pod mikroskopem fazowo-kontrastowym przy 10-krotnym powiększeniu (Rysunek 4B). Ponieważ cztery rzędy czujników mikroelektrod zostały usunięte ze środka każdego otworu w widoku e-plate, powstała przestrzeń umożliwiająca monitorowanie komórek za pomocą mikroprocesora.
  8. Analiza danych
    1. Normalizować wartości CI w momencie, gdy skoncentrowane podłoże warunkowane było podawane komórkom HeLa niestarzejącym.
    2. Kliknij przycisk analizy danych, aby obliczyć tempo i ilość proliferacji, korzystając z maksymalnego indeksu komórki i danych o nachyleniu uzyskanych z systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym (Rysunek 2). Następnie przeanalizuj dane za pomocą odpowiedniego programu statystycznego (rysunek 4C,D).

3. Model 3: Monitorowanie interakcji między komórkami w czasie rzeczywistym

  1. Hodowla komórek i indukcja starzenia (dzień 1-2)
    1. Nasiać 8 x 10 5komórek HeLa do kolby T25 zawierającej 5 mL Zmodyfikowanego Medium Orła (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionego 10% surowicą bydła płodu (FBS), penicyliną (100 U/mL) i streptomycyną (0,1 μg/mL) oraz inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5%CO2.
    2. Następnego dnia zamień podłoże komórek na 5 mL świeżego, kompletnego medium. Należy bezpośrednio poddać komórki 300 nM doksorubicyny, dodając je do ośrodka, aby wywołać starzenie komórkowe. Przechowywać kolbę T25 w inkubatorze z 5%CO2 w 37 °C przez 72 godziny.
  2. Niesenescentyjne siewnictwo komórkowe (dzień 4)
    1. Nasiać 8 x 10 5komórek GFP-HeLa (kontrola niesenescentyjna) w nowej kolbie T25 w 5 mL DMEM uzupełnionego o 10% surowicę płodową bydła, penicylinę (100 U/mL) i streptomycynę (0,1 μg/mL) i przechowywać w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5%CO2.
    2. Nasiaj 8 x 10 5komórek HeLa (kontrola niesenescentyjna) w nowej kolbie T25 w 5 mL DMEM uzupełnionej o 10% surowicę płodową bydła, penicylinę (100 U/mL) i streptomycynę (0,1 μg/mL) i przechowywać w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5%CO2.
  3. Przeprowadz potwierdzenie indukcji starzenia zgodnie z krokiem 1.3 (dzień 5).
  4. Komórki współhodowujące
    1. Sprawdź komórki poddane doksorubicynie, nieleczone komórki GFP-HeLa oraz nieleczone komórki HeLa pod mikroskopem kontrastowym fazowym przed zasiewem komórek. Pod mikroskopem komórki starzejące mają znacznie bardziej powiększoną morfologię niż komórki normalne.
    2. Przemyj wszystkie trzy kolby T25 5 ml sterylnego, wcześniej podgrzanego PBS, a następnie zasysaj do zasysania. Dodaj 1 ml podgrzanej trypsyny o stężeniu 0,05% i utrzymuj kolby w temperaturze 37 °C przez 2 minuty, aby odłączyć komórki.
    3. Zneutralizuj trypsynę 5 mL kompletnego DMEM uzupełnionego o 10% surowicę płodową bydła, penicylinę (100 U/mL) oraz streptomycynę (0,1 μg/mL).
    4. Wirówka komórek w stężeniu 500 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut, odrzuć supernatant i ponownie zawiesować osady komórkowe w 5 mL kompletnego DMEM z dodatkiem 10% surowicy bydlęcej płodu, penicyliny (100 U/mL) i streptomycyny (0,1 μg/mL).
    5. Policz żywotne komórki metodą wykluczania barwnika trypan blue za pomocą hemocytometru. Komórki nasienne w 200 μL kompletnego DMEM uzupełnionego o 10% surowicę płodową bydła, penicylinę (100 U/ml) oraz streptomycynę (0,1 μg/mL).
    6. Komórki zasiewne na μ przesuwanie 8-dołków wysoko pod trzema różnymi ustawieniami eksperymentalnymi:
      Grupa 1: 7 x 103 ogniwa GFP-HeLa
      Grupa 2: 18 x 103 niesenescentne komórki HeLa + 7 x 103 komórki HeLa GFP-La
      Grupa 3: 18 x 103 komórki HeLa + 7 x 103 komórki HeLa GFP-La
    7. Utrzymuj μ-suwak przez 8 godzin do przymocowania w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5%CO2. Po 8 godzinach myj komórki podgrzanym PBS (37 °C) 2 razy, aby wyeliminować działanie surowicy na komórki.
    8. Do każdego dołku dodaj 200 μL bezsurowicowego DMEM zawierającego penicylinę (100 U/mL) i streptomycynę (0,1 μg/mL).
  5. Instalacja mikroskopu
    1. Włącz regulator temperatury i CO2-Controller i pozwól systemowi inkubacji na górze sceny ustabilizować się przez 30 minut.
    2. Ręcznie sprawdzam stężenie i temperaturęCO2 oraz upewniam się, że osiągnięto warunki fizjologiczne (5%CO2, 37 °C).
    3. Włącz odwrócony mikroskop fluorescencyjny i pozwól systemowi na samokalibrację. Włącz źródło światła fluorescencyjnego. Uruchomić oprogramowanie do obrazowania i analizy do kontroli parametrów obrazowania i akwizycji obrazu.
  6. Obrazowanie poklatkowe
    1. Umieść preparat na komorze inkubacyjnej na górze sceny mikroskopii fluorescencyjnej odwróconej za pomocą aparatu cyfrowego o wysokiej rozdzielczości. Otwórz oprogramowanie i wybierz tryby części X, Y, Z i T, a eksperymenty przeprowadzaj w ustawieniach akwizycji (rysunek 5A).
    2. Wybierz obiektyw 20x o wysokim kontraście do obrazowania fluorescencyjnego i fazowego (rysunek 5A). Dodaj kanały kontrastu fazowego i fluorescencji (filtr FITC), aby umożliwić obrazowanie w obu trybach (rysunek 5A).
    3. Kliknij przycisk Live , aby rozpocząć obrazowanie komórek żywych, a następnie wyostrz komórki pod kontrastem fazowym (rysunek 5A). Otwórz okno stosu z i zaznacz pozycję komórek zainteresowania (zawierających zarówno komórki HeLa starzejące/niesenescentyjne, jak i komórki HeLa GFP). Nawiguj po etapie między studniami za pomocą automatycznego kontrolera sceni, co pozwala na precyzyjne lokalizowanie wybranych obszarów do oznaczania pozycji (Rysunek 5A).
      UWAGA: W ten sposób w tym samym wgłębieniu slajdu można wybrać więcej niż jeden obszar.
    4. Przełącz kanał na kanał fluorescencyjny, aby rozpocząć obrazowanie fluorescencyjne. Ustaw odpowiednie ustawienia ekspozycji (89,506 ms), wzmocnienia (10) i intensywności (136) (rysunek 5A).
      UWAGA: Parametry te różnią się w zależności od intensywności fluorescencji komórek wyrażających białko fluorescencyjne.
    5. Wybierz interwał stosu μm, ustaw pozycję górną i dolną oraz skonfiguruj stos z w kontraście fazowym (rysunek 5A). Kliknij Stop, aby zamknąć opcję Na żywo.
    6. Ustaw czas trwania (48 h) i interwał czasowy (30 min), używając pól Czas trwania i Interwał Czasowy do obrazowania poklatkowego.
    7. Kliknij Start, aby rozpocząć obrazowanie przez 48 godzin (Rysunek 5A). Zapisz projekt po 48 godzinach (rysunek 5A).
    8. W każdym punkcie czasowym (0 h i 48 h) wybierz najlepszą klatkę ze stosu z i wyeksportuj obraz (rysunek 5A).
    9. Policz komórki GFP-dodatnie w odległości 0 i 48 h, oblicz procentowy wzrost liczby komórek GFP-dodatnich i analizuj dane za pomocą odpowiedniego programu (Rysunek 1D,E).
  7. Generowanie filmu
    1. Kliknij Pokaż galerię, aby wyświetlić wszystkie zarejestrowane obrazy uporządkowane według punktów czasowych i warstw stosu z (Rysunek 5B).
    2. Dla każdego punktu czasowego kliknij prawym przyciskiem myszy na Najlepiej skupiony obraz z odpowiadającego stosu z i wybierz Wybierz kciuki w wierszu. Zapisz wybrane klatki (rysunek 5B).
    3. Powtarzaj ten proces indywidualnie dla każdej pozycji. Aby pomóc w wyborze najbardziej ostrych obrazów, użyj funkcji Znajdź najlepsze ostre klatki. Zapisz wybrane obrazy za pomocą opcji Zapisz wybrane klatki. Zapisane obrazy są automatycznie przesyłane do sekcji Open Project.
    4. Kliknij prawym przyciskiem myszy na film i wybierz Eksportuj obraz, gdy sekwencje obrazów są w pełni załadowane.
    5. Przejdź do zakładki Film w oknie eksportu, ustaw pożądaną liczbę klatek na sekundę (klatki na sekundę), wybierz dodatkowe opcje, takie jak pasek skalowania, znacznik czasu itp., jeśli to konieczne, i zakończ eksport, wybierając miejsce docelowe za pomocą opcji Przeglądanie (Rysunek 5B, Wideo 1, Wideo 2 i Wideo 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten reprezentatywny zestaw eksperymentów badał potencjalne efekty fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się, pochodzącego z komórek nowotworowych na inne komórki nowotworowe. Dlatego po raz pierwszy potwierdzono, czy leczenie doksorubicyną przez 72 godziny może wywołać starzenie się komórek HeLa za pomocą barwienia SA-β-Gal. W komórkach senescentnych enzym lizosomalny β-galaktozydaza pozostaje aktywny nawet przy niskim pH i rozszczepia chromogeniczny substrat X-gal, tworząc niebieski wysad17<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamiczne interakcje komórek nowotworowych w mikrośrodowisku są kluczowe dla postępu guza, co wpływa na indukcję przerzutów i rozwój guza wtórnego. Zgłaszano również, że starzejące się komórki nowotworowe i stromalne regulują mikrośrodowiska nowotworowe poprzez czynniki wydzielane z komórek starzejących4. Czynniki te stymulują proliferację komórek, migrację, inwazję, różnicowanie oraz zwiększają oporność na wiele leków 4,13. Dlatego zrozu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zostało wsparte przez Jednostkę Projektu Naukowego Uniwersytetu Gazi (kod grantu: TOA-2021-7321) oraz TUBITAK (kod grantu: 122S564 i 223S969).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
&mikro;-Slajd 8 Wysokofigure-materials-1bidi80806
0,05 % trypsyna-EDTA (1x)Gibco25300-054
Jednostki filtrów odśrodkowych Amicon Ultra (Ultracel-3K)MilliporeUFC200324
CO2 inkubator (37 stopni i g; C, 5% CO2)Sanyo
CO2-Controller 2000 Pecon 
DMEMGibco41966-029
DoksorubicynyTocris2252
Tablica E INSERT 16 ACEA Biosciences/Agilent6 465 382 001
Tablica E WIDOK 16 ACEA Biosciences/Agilent300 601 140
FBSGibcoA5256701
Komórki HeLafigure-materials-2AP Institute, Ankara, TurcjaHÜ KÜ K Nr: 90061901 
Leica DMi8 mikroskop fluorescencyjny odwrócony Leica
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)Gibco70011-044
Zestaw do barwienia związany ze starzeniem i beta; -galaktozydaza (SA-β-galon);Sygnalizacja komórkowa9860 LATA
System inkubacji na górze stópPecon 
Temp-controller 2002-2 Pecon 
Trypan Blue DyeSigmaT8154
xCELLigence RTCA DP system ACEA Biosciences/Agilent

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Su, J., et al. Cell-cell communication: new insights and clinical implications. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 196(2024).
  2. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res. 25, 585-621 (1961).
  3. Ewald, J. A., Desotelle, J. A., Wilding, G., Jarrard, D. F. Therapy-induced senescence in cancer. J Natl Cancer Inst. 102 (20), 1536-1546 (2010).
  4. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent Cells in Cancer Therapy: Friends or Foes. Trends Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  5. Wang, J., et al. The Common Hallmarks and Interconnected Pathways of Aging, Circadian Rhythms, and Cancer: Implications for Therapeutic Strategies. Research (Wash D C). 8, 0612(2025).
  6. Simay, Y. D., Ozdemir, A., Ibisoglu, B., Ark, M. The connection between the cardiac glycoside-induced senescent cell morphology and Rho/Rho kinase pathway. Cytoskeleton (Hoboken). 75 (11), 461-471 (2018).
  7. Ozdemir, A., Simay Demir, Y. D., Yesilyurt, Z. E., Ark, M. Senescent cells and SASP in cancer microenvironment: New approaches in cancer therapy. Adv Protein Chem Struct Biol. 133, 115-158 (2023).
  8. Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
  9. Heckenbach, I., et al. Nuclear morphology is a deep learning biomarker of cellular senescence. Nat Aging. 2 (8), 742-755 (2022).
  10. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
  11. Kuilman, T., Peeper, D. S. Senescence-messaging secretome: SMS-ing cellular stress. Nat Rev Cancer. 9 (2), 81-94 (2009).
  12. Simay Demir, Y. D., Ozdemir, A., Sucularli, C., Benhur, E., Ark, M. The implication of ROCK 2 as a potential senotherapeutic target via the suppression of the harmful effects of the SASP: Do senescent cancer cells really engulf the other cells. Cell Signal. 84, 110007(2021).
  13. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discov. 7 (2), 165-176 (2017).
  14. Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Multifunction co-culture model for evaluating cell-cell interactions. Methods Mol Biol. 1202, 29-36 (2014).
  15. Ozdemir, A., et al. Cardiac glycoside-induced cell death and Rho/Rho kinase pathway: Implication of different regulation in cancer cell lines. Steroids. 109, 29-43 (2016).
  16. zdemir, A., Ibisoglu, B., Simay, Y. D., Polat, B., Ark, M. Ouabain induces Rho-dependent rock activation and membrane blebbing in cultured endothelial cells. Mol Biol. 49 (1), 138-143 (2015).
  17. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  18. Simay Demir, Y. D., et al. Antimigratory effect of pyrazole derivatives through the induction of STAT1 phosphorylation in A549 cancer cells. J Pharm Pharmacol. 73 (6), 808-815 (2021).
  19. Ariffin, N. S. The CellProfiler pipeline analysis of cell migration. Acta Histochem. 125 (7), 152074(2023).
  20. Li, D., et al. Decoding the crossroads of aging and cancer through single-cell analysis: Implications for precision oncology. Int J Cancer. 157 (5), 807-818 (2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Proliferacja kom rek nowotworowychkom rki senescentnesygnalizacja parakrynnaefekty jukstakrynnepo ywka warunkowanatechniki kokulturyanaliza kom rkowa w czasie rzeczywistymobrazowanie ywych kom rekkom rki HeLa

Powiązane artykuły