Prezentacja modyfikacji fosforylacji za pomocą elektroforezy żelowej SDS-PAGE ze znacznikiem Phos-PAGE i testu kinazy in vitro

Podsumowanie

Ten protokół opisuje procedury wykrywania zmian w modyfikacjach fosforylacji docelowych białek za pomocą elektroforezy żelowej Phos-tag w próbkach klinicznych i testach kinaz in vitro.

Streszczenie

Fosforylacja to klasyczna modyfikacja potranslacyjna, która reguluje funkcję białka. Białka zazwyczaj zawierają wiele potencjalnych miejsc fosforylacji, które mogą być modyfikowane przez różne kinazy w różnych lokalizacjach. Badanie zmian fosforylacji białek docelowych w chorobie często wymaga przeciwciał swoistych dla fosfony. Jednak opcje komercyjne mogą być ograniczone do jednej witryny lub całkowicie niedostępne. W tym miejscu opisano metodę wykrywania zmian w modyfikacjach fosforylacji białek docelowych w próbkach klinicznych za pomocą elektroforezy żelowej Phos-tag oraz identyfikacji szczegółowych miejsc fosforylacji za pomocą testów kinaz in vitro. Fosforylowane białka związane ze znacznikiem Phos wykazują wolniejsze tempo migracji w elektroforezie żelowej SDS-PAGE, umożliwiając półilościową analizę zmian fosforylacji w tkankach chorobowych w oparciu o średnią intensywność pikseli wolno migrujących prążków. Łącząc Phos-tag SDS-PAGE z immunoblottingiem przy użyciu przeciwciał swoistych dla wielu białek kandydujących, naukowcy mogą skutecznie zidentyfikować białka docelowe ze zmianami fosforylacji. Po przeprowadzeniu badań przesiewowych kinaz kandydujących, przeprowadza się testy kinaz in vitro z białkiem docelowym, a uzyskane produkty fosforylowane są poddawane spektrometrii mas w celu precyzyjnej identyfikacji miejsca. Metoda ta nie wymaga specyficznych przeciwciał białkowych fosforylowanych, co pozwala na badania przesiewowe próbek tkanek na dużą skalę w celu zidentyfikowania zmienionych stanów fosforylacji w chorobie. Co więcej, zidentyfikowane miejsca fosforylacji można wykorzystać do opracowania specyficznych przeciwciał do analizy ilościowej i lokalizacyjnej w tkankach chorobowych, zapewniając głębszy wgląd w ich role funkcjonalne.

Wprowadzenie

Fosforylacja jest kluczową modyfikacją potranslacyjną modulującą lokalizację subkomórkową, aktywność kinazy i aktywność transkrypcyjną białek. W ludzkim genomie znaleziono ponad 500 genów kinazy białkowej, które biorą udział w transdukcji sygnału, ekspresji genów i interakcji białko-białko¹. Fosforylacja i defosforylacja są kontrolowane przez różne kinazy, które są szybko odwracalne w celu regulacji adhezji komórek, proliferacji komórek i różnicowania komórek². Jednak nieprawidłowe modyfikacje fosforylacji białek są odpowiedzialne za wiele chorób u ludzi, w tym nowotworzenie nowotworów, zaburzenia autoimmunologiczne, neurodegenerację i subpłodność^3,4,5.

Profilowanie fosfoproteomiczne próbek klinicznych daje wiele kandydatów na różnie fosforylowane białka⁶. Aby ujawnić kluczowe modyfikacje fosforylacji w chorobach człowieka, niezbędna jest łatwa i skuteczna metoda wykrywania stanu fosforylacji określonych białek docelowych. Fosforylacja w różnych miejscach może prowadzić do wyraźnych zmian funkcjonalnych w białku. W związku z tym stosowanie przeciwciał specyficznych dla fosforylacji ukierunkowanych na określone miejsca aminokwasów jest niewątpliwie najlepszą metodą wykrywania zmian w fosforylacji białek. Jednak dobrze scharakteryzowane przeciwciała specyficzne dla fosfon są nieobecne w przypadku wielu białek. Ponadto potrzebne jest bardziej odpowiednie podejście do identyfikacji nowych potencjalnych miejsc fosforylacji. Fosforylacja w określonych resztach aminokwasowych często zmienia szybkość migracji białka w elektroforezie żelowej, a wolniej migrujące pasma mogą odzwierciedlać zmiany w statusie fosforylacji⁷. Jednak te zmiany mobilności są zwykle subtelne, co utrudnia ich rozróżnienie. Phos-tag to zsyntetyzowany związek chemiczny zaprojektowany z domeny katalitycznej fosfatazy alkalicznej jako model, który może wychwytywać fosforylowane reszty Ser / Thr / Tyr i His / Asp / Lys. W związku z tym koniugacja znacznika fos skutecznie wzmacnia różnice w szybkości migracji między białkami fosforylowanymi i niefosforylowanymi, jednocześnie rozróżniając różnice w liczbie miejsc fosforylacji⁸.

Ta oparta na znacznikach Phos metodologia wykrywania zmian fosforylacji białka docelowego w próbkach tkanek oferuje wyraźne zalety w porównaniu z konwencjonalnymi podejściami. Co najważniejsze, eliminuje to konieczność stosowania przeciwciał swoistych dla fosfonu, zamiast tego wykorzystując do wykrywania standardowe przeciwciała specyficzne dla białka klasy WB. Ufosforylowane i nieufosforylowane formy białek docelowych są rozpoznawane jako odrębne prążki podczas Phos-tag SDS-PAGE, umożliwiając półilościową ocenę zmian poziomu fosforylacji w stanach chorobowych poprzez porównawczą analizę intensywności pasma. Przebieg pracy w tym protokole obejmuje: (1) separację próbek białek metodą SDS-PAGE za pomocą znacznika Phos, (2) badania przesiewowe immunoblot pod kątem fosforylowanych celów, (3) testy kinaz in vitro z kinazami kandydującymi zweryfikowanymi przez przeciwciała phospho-Ser/Thr. Późniejsza analiza spektrometrii mas (przeprowadzona przez zewnętrzną platformę usługową) identyfikuje miejsca fosforylacji, aby umożliwić rozwój przeciwciał specyficznych dla danego miejsca; Szczegółowa metodyka nie jest zawarta w obecnym protokole. Warto zauważyć, że podejście to zostało z powodzeniem zastosowane do wykrywania zmian fosforylacji Nur77 w próbkach klinicznych, identyfikując kinazę Mst1 jako regulator fosforylacji Nur77 i opracowując specyficzne dla miejsca przeciwciało fosfologiczne do klinicznego wykrywania fosforylacji w treoninie 366 z klasy Nur77⁹. Dlatego podejście to okazuje się szczególnie cenne we wstępnych fazach badań, gdy bada się wiele białek kandydujących, ponieważ umożliwia badania przesiewowe na dużą skalę zmian stanu fosforylacji w wielu celach przy użyciu komercyjnie dostępnych przeciwciał.

Protokół

Instytucjonalne Komisje Rewizyjne w Szpitalu Nanjing Drum Tower zatwierdziły badania na ludziach (2013-408081-01). Obecny protokół jest ustalany przy użyciu tkanki endometrium jako reprezentatywnego modelu. Przy odpowiedniej optymalizacji metodologia ta może zostać rozszerzona na inne próbki kliniczne, w tym między innymi tkanki nowotworowe do ekstrakcji białek i późniejszych analiz. Biopsję endometrium wykonuje się w środkowej fazie wydzielniczej od kobiet płodnych (grupa kontrolna) oraz kobiet z nawracającymi niepowodzeniami implantacji zarodków poddawanychzapłodnieniu in vitro-transferowi zarodków (grupa chorobowa). Wszyscy pacjenci wyrazili świadomą zgodę przed procedurą pobierania próbek. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie próbek

1. Otrzymane świeże próbki tkanek należy dwukrotnie przepłukać wstępnie schłodzonym PBS w celu usunięcia komórek krwi i oddzielić około 100 mg tkanki do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
2. Umieść tkankę w okrągłodennej probówce mielącej o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml buforu do lizy białek tkankowych (150,0 mmol/L NaCl, 1,0% NP-40, 50,0 mmol/L Tris pH 8,0, 0,5% deoksycholanu sodu, koktajl inhibitorów proteazy i koktajl inhibitorów fosfatazy 2 i 3).
3. Ustaw prędkość szybkoobrotowego dyspergatora tkanek na poziom 5 (z 6 poziomów) i miel tkankę przez 10 s, a następnie 30 s inkubacji na lodzie. Powtórz ten proces 5 razy, aby uzyskać homogenat tkankowy.
4. Homogenat poddać lizie przez powolne obracanie na wytrząsarce w temperaturze 4 °C przez 30 minut, następnie odwirować w temperaturze 4 °C i 13 000 × g przez 10 minut i zebrać supernatant.
5. Określić stężenie białka za pomocą metody BCA.
6. Weź w sumie 300 μg białka, dostosuj do równej objętości i wymieszaj z 4× buforem próbki białka Laemmli. denaturację mieszaniny poprzez ogrzewanie jej w temperaturze 95 °C przez 8 minut, schłodzenie do temperatury pokojowej, a następnie załadowanie do dalszej analizy.
   UWAGA: Przed etapem 2 zaleca się konwencjonalne analizy Western blot w celu wykrycia białka będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu całkowitych przeciwciał w celu oceny poziomów ekspresji.

2. Przygotowanie żelu Phos-tag SDS-PAGE

1. Przygotować 100 ml 30% w/v roztworu mieszanego akrylamidu/N, N'-metyleno-bisakryloamidu, dodając 29,0 g akrylamidu i 1,0 g N,N'-metyleno-bisakryloamidu.
   UWAGA: Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.
2. Przygotuj 1,5 mol/l roztwór Tris-HCl (pH 8,8), 0,5 mol/l roztwór Tris-HCl (pH 6,8), 10% w/v roztwór SDS i 10% w/v roztwór nadsiarczanu amonu, jak stosuje się w konwencjonalnym SDS-PAGE.
3. Przygotować 5,0 mmol/L roztworu Phos-tag i 10 mmol/L MnCl₂ Roztwór specyficzny dla żelu Phos-tag SDS-PAGE.
4. Przygotować rozdzielczy roztwór żelowy, w przypadku przygotowania 10 ml roztworu z 6 w/v% żelu poliakryloamidowego z 50 μM roztworem znacznika Phos i 100 μM MnCl₂, mieszając 2 ml 30% (m/v) mieszaniny akrylamidu/bis-akrylamidu, 2,5 ml roztworu Tris/HCl o stężeniu 1,5 mol/l (pH 8,8), 0,1 ml roztworu znacznika fosu 5,0 mmol/l, 0,1 ml roztworu 10 mmol/l MnCl₂, 0,1 ml 10% (w/v) roztworu SDS, 10 μl TEMED i 5,14 ml wody destylowanej.
5. Delikatnie zmieszać przygotowany roztwór żelu rozdzielczego, aby zapewnić jednorodność, a następnie umieścić probówkę z roztworem żelu w eksykatorze próżniowym i stosować podciśnienie (0,1 MPa) przez 2 minuty, aż nie pozostaną widoczne pęcherzyki.
6. Dodać 50 μl 10% nadsiarczanu amonu i delikatnie, ale dokładnie wymieszać.
7. Natychmiast odpipetować roztwór do zmontowanej kasety z żelem, aż znajdzie się ~1 cm poniżej górnej krawędzi krótkiej płytki. Unikaj wprowadzania bąbelków.
8. Ostrożnie nałóż 0,5 ml wody destylowanej na wierzch żelu, aby wykluczyć powietrze i zapewnić płaską powierzchnię. Pozostaw do polimeryzacji w temperaturze pokojowej na 20-30 minut.
9. W tym samym czasie należy przygotować standardowy, buforowany roztwór żelu Tris-HCl (4,5% w/v żelu poliakrylamidowego), mieszając 0,6 ml 30% (m/v) mieszanego roztworu akrylamidu/bis-akryloamidu, 1 ml 0,5 mol/l roztworu Tris-HCl (pH 6,8), 40 μl 10% (w/v) roztworu SDS, 4 μl TEMED i 2,33 ml wody destylowanej. Delikatnie odwiruj i odgazuj.
10. Upewnij się, że żel całkowicie zastygł (przechyl kasetę z żelem, aby obserwować przechylanie się górnej warstwy cieczy, jednocześnie potwierdzając nieruchomość granicy faz pośrednich). Ostrożnie wylej nakładkę wodną, a następnie całkowicie odcedź.
11. Dodać 20 μl 10% nadsiarczanu amonu do przygotowanego roztworu żelu do układania w stosy, delikatnie wymieszać i natychmiast odpipetować na wierzch żelu rozdzielczego.
12. Ostrożnie umieść 10- lub 15-dołkowy grzebień w roztworze żelu do układania w stosy, unikając pęcherzyków. Pozostawić żel do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    UWAGA: Żel należy zawsze przygotowywać tuż przed użyciem. Zoptymalizuj stężenia znakowane fosem i akrylamidem dla każdego interesującego Cię białka.

3. Elektroforeza SDS-PAGE z tagiem Phos

1. Zmontuj sprzęt do elektroforezy i napełnij komory elektrod konwencjonalnym buforem biegowym Tris/Glycine/SDS.
2. Załadować 30 μg próbki białka do każdej studzienki za pomocą mikropipety.
3. Przeprowadzić elektroforezę w warunkach stałego prądu (30 mA/żel), aż błękit bromofenolowy dotrze do dna żelu rozdzielczego.
4. Namocz żele w bezmetanolowym buforze transferowym SDS-PAGE z 5 mM EDTA przez 10 minut dwa razy, aby usunąć kationy dwuwartościowe.
5. Przenieś białka na membranę PVDF pod napięciem 90 V przez 90 minut za pomocą systemów Blotting Wet/Tank Blotting.

4. Immunoblotting i analiza

1. Zatkać błonę 5% roztworem odtłuszczonego mleka lub białka bydlęcego w proszku (rozcieńczonego w roztworze 1×tris-boran-sodu tween-20, TBST) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
2. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko białku docelowemu w odpowiednim stosunku i inkubować z błoną w temperaturze 4 °C przez noc.
3. Umyj membranę 3 razy TBST, 10 minut na pranie, w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
4. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
5. Umyj membranę 3 razy TBST, 10 minut na pranie, w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
6. Inkubować ze wzmocnionym substratem chemiluminescencyjnym w ciemności przez 1 minutę, a następnie poddać ekspozycji.
7. Uchwyć obrazy za pomocą zautomatyzowanego systemu dokumentacji żelu i określ ilościowo pasma docelowe (wolno migrujące fosforylowane białko docelowe i szybko migrujące niefosforylowane białko docelowe) dla intensywności skali szarości za pomocą oprogramowania ImageJ.
   UWAGA: Western blot żeli Phos-Tag nie może być używany do przypisywania masy cząsteczkowej.
8. Oblicz stosunek wolno migrujących fosforylowanych prążków do szybko migrujących prążków nieufosforylowanych dla każdej próbki i przeanalizuj statystyczną różnicę procentu fosforylacji między grupami.

5. Immunoprecypitacja białka docelowego

1. Skonstruuj plazmidy ekspresyjne kodujące znakowane FLAG (lub alternatywne znaczniki epitopów, w tym między innymi HA, GFP, GST lub His) mutanty fosfo typu dzikiego lub specyficzne dla miejsca docelowego białka.
2. Transfect HEK293 komórki z plazmidami ekspresyjnymi przy użyciu Lipofectamine 3000 zgodnie z protokołem producenta.
3. Lizować komórki w 1 ml buforu do lizy białek tkankowych, jak opisano w kroku 1, aby wyekstrahować supernatant białkowy.
4. Inkubować supernatant z 20 μl żelu o powinowactwie Anti-FLAG M2 przez noc w temperaturze 4 °C z rotacją.
5. Odwirować (1000 × g, 3 min), zebrać kulki agarozy i przemyć 10 objętościami kolumny TBS w celu usunięcia niespecyficznie związanych białek.
6. Rozpuścić peptyd FLAG w TBS do końcowego stężenia 100 μg/ml.
7. Eluować związane białko fuzyjne FLAG z żelu o powinowactwie do przeciwciał FLAG M2 przez kompetencyjną elucję z pięcioma jednokolumnowymi objętościami roztworu peptydu FLAG (użyć 100 μl roztworu na 20 μl kulek agarozy) przez 5-10 minut z delikatnym mieszaniem.
8. Odwirować (1000 × g, 3 min) i zebrać supernatant.
   UWAGA: Jeśli kinaza jest znana, przejdź do kroku 6; w przeciwnym razie najpierw zidentyfikuj potencjalne kinazy za pomocą dwuhybrydowego badania przesiewowego drożdży lub przewidywania bioinformatycznego (np. przy użyciu PhosphositePlus lub Group-based Prediction System), zanim przejdziesz do kroku 6.

6. Test kinazy in vitro do identyfikacji fosforylowanych aminokwasów

1. Przygotować bufor kinazy (30 μL na reakcję): 40 mM HEPES pH7,6, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 2,5 mM β-glicerofosforanu, 200 μM ATP, 100 ng aktywnej kinazy, immunoprecypitowane białko fuzyjne FLAG.
2. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 30 minut w termomikserze, delikatnie mieszając.
3. Zatrzymać reakcje, dodając 10 μl 4× buforu Laemmli, i poddać denaturacji w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
4. Wykonaj konwencjonalną elektroforezę SDS-PAGE przy użyciu immunoprecypitowanego białka fuzyjnego FLAG reagującego z aktywną kinazą lub bez niej.
5. Sonda z przeciwciałem Anti-phospho-Thr i przeciwciałem Anti-phospho-Ser w celu identyfikacji fosforylowanych aminokwasów. Sonda z przeciwciałem Anti-Flag jako kontrolą (patrz tabela materiałów).
6. Zakończ immunoblotting i analizę zgodnie z opisem w kroku 4.

Wyniki

Wstępne profilowanie fosfoproteomiczne próbek ludzkich z grupy kontrolnej i grupy chorobowej zidentyfikowało Nur77 jako kandydata na białko inaczej fosforylowane. Aby ocenić skuteczność znacznika Phos SDS-PAGE w wykrywaniu fosforylacji białka Nur77, przeprowadzono eksperyment SDS-PAGE ze znacznikiem Mn²⁺-Phos. Po całkowitej ekstrakcji białka z próbek tkanek 30 μg białka załadowano i oddzielono za pomocą elektroforezy żelowej Mn²⁺-Phos-tag, a następnie przeniesiono na membranę PVDF. Immunoblotting pr...

Dyskusja

Oparte na znacznikach Phos-tag podejście do wykrywania zmian fosforylacji białek docelowych w tkankach klinicznych oferuje znaczące korzyści w badaniach nad fosforylacją białek. Fosforylowane białka wykazują zmniejszoną ruchliwość elektroforetyczną ze względu na wiązanie znacznika Phos, co umożliwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe stanu fosforylacji białek kandydujących bez konieczności stosowania przeciwciał specyficznych dla fosfonu. Jest to szczególnie cenne dla wstępnego profilowania na dużą skalę wielu białek ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10% roztwór SDS	Sangon Biotech	B548118
10x Tris/Glycine/SDS	BIO-RAD
4 razy;   Bufor do próbek białka Laemmli	BIO-RAD	1610747
Akrylamid	Sangon Biotech A601032
Nadsiarczan amonu	Sangon Biotech	A100486
Anti-FLAG M2 Affinity	Millipore	A2220
Zestaw do zwiększonej chemiluminescencji	ThermoFisher	32106
Przeciwciało	FLAG CST	14793
FLAGA  Peptyd	Millipore	F3290
Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP	Technologia Bioworld	BS13278
Lipofectamina 3000	ThermoFisher	L3000015
Mini komórka trans-blot	BIO-RAD	1703930
Mini-PROTEAN Tetra Pionowe ogniwo do elektroforezy	BIO-RAD	1658005
Przeciwciało	Mst1CST	3682
N, N'-metyleno-bisakryloamid	Sangon Biotech	A600025
N,N,N',N'--Tetramethyloethelenodiamine(TEMED)	Przeciwciało Sangon Biotech	A610508
Nur77	CST	3960
Koktajl inhibitorów fosfatazy 2	Sigma	P5726	Do hamowania fosfataz białkowych tyrozyny, kwasów i fosfatazy alkaliczne
Koktajl inhibitorów fosfatazy 3	Sigma	P0044	Do hamowania fosfatazy białkowej 2A, fosfataz alkalicznych, fosfataz białkowych 1 i 2A
Przeciwciało fosfo-serynowe	Sigma	P5747
Przeciwciało fosfo-treoninowe	Sigma	P6623
Phos-tag Akrylamid	Wako	304-93526	Do przygotowania Phos-tag SDS PAGE żel
Pierce BCA Zestaw do oznaczania białek	Thermo	23227
Koktajl inhibitorów proteazy	Sigma	S8830	EDTA-Free, tabletka, do hamowania błony PVDF seryny, cysteiny, asparaginy i metaloproteazy
	Roche	3010040001
ThermoMixer	Eppendorf	2231001127
Dyspergator tkanek	IKA	T 10	Aby uzyskać homogenat tkankowy
Bufor Tris-HCl (0,5 m, pH 6,8)	B546020		Sangon Biotech
1,5 m, pH 8,8)	Sangon Biotech	B546019
ThermoFisher		5311-0250	Do odgazowania roztworu żelu
β-Merkaptoetanol	Sigma	M3148