Method Article

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

DOI:

10.3791/68887

⸱

September 26th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki eukariotyczne podążają za zachowanym cyklem komórkowym, który reguluje różnorodne procesy, w tym utrzymanie DNA i homeostazę organelli. Badanie procesów komórkowych zależnych od cyklu komórkowego jest często konieczne do właściwej interpretacji wyników eksperymentalnych. Dostępne są metody chemiczne i genetyczne umożliwiające synchronizację cyklu komórkowego w komórkach hodowanych w szerokim spektrum organizmów, w tym modele kręgowców, umożliwiające badanie procesów zależnych od cyklu komórkowego. Jednak wśród organizmów modelowych drożdże pączkujące pozostają potężnym narzędziem do analizy cyklu komórkowego ze względu na szczególnie solidne metody synchronizacji, krótki czas generowania oraz genetyczną podatność na przetwarzanie. Drożdże dzielą podstawowe mechanizmy cyklu komórkowego z innymi eukariontami, co umożliwiło przełomowe odkrycia w regulacji cyklu komórkowego. Protokół ten szczegółowo opisuje metody analizy cyklu komórkowego u drożdży, koncentrując się na eksperymentach G1 z zatrzymaniem i uwalnieniem oraz mitotycznym zatrzymaniem i uwalnianiem, w tym konstrukcją szczepów, przygotowaniem hodowli oraz mikroskopią. Przedstawiono metody znakowania PCR do uzyskania odpowiednich szczepów do zatrzymań cyklu komórkowego oraz mikroskopii fluorescencyjnej. Zatrzymanie G1 osiąga się przy użyciu czynnika α feromonów peptydowych, a krótkie płukania prowadzą do synchronicznego uwalniania i postępu cyklu komórkowego. Próbki pobierane są w różnych momentach po wypuszczeniu do cyklu komórkowego i utrwalane do mikroskopii. Druga metoda zatrzymuje komórki drożdży w mitozie poprzez wyczerpanie regulatora cyklu komórkowego Cdc20, aby osiągnąć populację zatrzymaną metafazą, a także opcjonalne uwolnienie do anafazy. Próbki są utrwalane i przygotowywane do obrazowania przed i po uwolnieniu, a następnie są obrazowane i analizowane. Analiza obrazów koncentruje się na katalogowaniu dynamicznej lokalizacji oraz zmian liczebności białek w cyklu komórkowym. Metody synchronizacji te są odpowiednie do różnorodnych manipulacji cyklu komórkowego, a choć ich zastosowanie w obrazowaniu stałych komórek jest tutaj podkreślone, można je dostosować do wielu innych analiz, w tym obrazowania żywych komórek oraz testów biochemicznych i molekularnych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podział komórek eukariotycznych jest silnie regulowany poprzez program zwany cyklem komórkowym. Wysoce zachowane i dynamiczne procesy zachodzące w cyklu komórkowym sprawiają, że badanie jest interesujące samo w sobie, ale mają też szerokie implikacje, które wspierają badania innych procesów biologicznych komórek – na przykład wiele organelli przechodzi dramatyczną przebudowę podczas podziału komórkowego, a obfitość i lokalizacja wielu białek są silnie regulowanew całym 1,2,3. Chociaż w układach metazoowych występują pewne dodatkowe warstwy złożoności w porównaniu do drożdży, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konstrukcja szczepów do analizy i obrazowania cyklu komórkowego

  1. Projektuj startery do C-terminalnego oznaczania interesującego genu za pomocą plazmidów Pringle Tagging (pFA6a) 24. Krótko mówiąc, projektuj startery F2 i R1, które w połączeniu z plazmidami serii pFA6a wytwarzają produkt PCR, który można bezpośrednio przekształcić w drożdże, aby wygenerować "oznaczoną" wersję interesującego genu. Użyj par primerów i plazmidów zawartych w Tabeli 1 , aby oznaczyć geny interesujące tego protokołu. Strategie projektowania plazmidów i primerów do oznaczania genów drożdży na końcu C zostały szczegółowo opisane przez Longt....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza zmian w lokalizacji białek zależnych od cyklu komórkowego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej może być łatwo przeprowadzona metodami opisanymi tutaj. Nasza grupa od dawna interesuje się dynamiczną regulacją i funkcją wrzeciona mitotycznego. W drożdżach ciała biegunów wrzeciona (oznaczone składnikiem Spc110) pełnią funkcję centrów organizujących mikrotubule, z których wychodzą włókna mikrotubul, tworząc strukturę wrzeciona mitotycznego30. Białko wiążące m.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie synchronizacji cyklu komórkowego u drożdży pączkujących umożliwia badanie kluczowych mechanizmów różnych procesów komórkowych. Zastosowanie zatrzymań-uwalniania G1 z terapią α-czynnikową umożliwia synchroniczny przebieg populacji komórek przez etapy cyklu komórkowego i, jak pokazaliśmy, może ujawnić dynamiczne wzorce lokalizacji regulatorów komórkowych, takich jak Stu236. Zatrzymywanie cyklu komórkowego można również osiągnąć za pomocą metod genetycznych poprzez wyczerpanie .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy University of Utah Cell Imaging Core za utrzymanie obiektu mikroskopu Delta Vision. Prace te były częściowo wspierane przez granty NIH F31CA2717405 (dla M.G.S.) i T32GM141848 (dla M.G.S. i T.C.S.), 5 For the Fight (dla M.P.M.), Pew Biomedical Scholars (dla M.P.M.) oraz NIH grant R35GM142749 (dla M.P.M.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
?-czynnikZakład Syntezy Rdzeniowej Uniwersytetu UtahSekwencja: WHWLQLKPGQPMY
1,5 mL Pippendorf TubeAxygenMCT-175-C
10mM mieszanka dNTPThermo ScientificR0193
Stożkowe lampy o pojemności 50 mLGreiner Bio-One227 261
5x bufor reakcji HF PhusionNew England BioLabsB0518S
Kwas octowy, lodowiecFisher ChemicalBP2401C-212
Sól hemisiarczanowa adeninySigma-AldrichA9126-100G
Agar, granulowanyApex Chemicals and Reagents20-275
AgarozyProdukty Apex Bioresearch20-102GP
Autoklaw Amsco Century Steam SterilizerSterisSV-1262
Autoklawowa woda DI
AuxinaSigma-AldrichKatalog#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
Cargille Laser LiquidLaboratoria Cargille20130
D-SorbitolSigma-AldrichS1876-500G
DAPI (40,6-Diamidino-2-fenylindol, dihydrochlorek)Sondy molekularneCat#D1306
Sól sodowa z kwasu deoksyrybonukleinowego z jąder łososiaSigma-AldrichD1626
DekstrozaFisher ChemicalD16-10
Tetraacetat disodu etylendiaminyFisher ChemicalS811-10
DMSOThermo Scientific20688
FIJI/ImageJ2 vs 2.14.0/1.54fImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
Mieszacz wirowy o stałej prędkościVWRhttps://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
Mikroskop fluorescencyjny DV UltraLeicahttps://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwESerial #: NV01063. Brak poparcia
FormaldehydFisher ChemicalKatalog#F79-500
Aparat żelowyThermo ScientificOwl EasyCast B1
GeneRuler DNA Ladder MixFermentySM0333
Koraliki szklaneFisher Scientific11312A
Szklane slajdyVWR48300-026
Platforma Innova 2300Nowy BrunszwikNB-2300
KimwipesKimtech06-666
Wirówka laboratoryjna do probówek 1,5 mLEppendorf2525
Wirówka laboratoryjna do probówek 50 mLEppendorf5804
Dwuchlorek octana lituSigma-AldrichL4158-250G
Master cycler nexus X2Eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
Mikropipety p2, p20, p200 i p1000 oraz odpowiadające im końcówkiRaininL-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
Szkło osłonowe mikroskopuFisher Scientific12541014
NocodazolCalbiochemCat#487928; CAS: 31430-18-9; Lot#B35705
Pomarańczowe GSigma-AldrichO7252
CZOPBadania HamptonHR2-591
Pepton granulowany Bioreagenty FisheraBP9725-5
Polimeraza DNA Phusion HFNew England BioLabsM0530L
Pipet-XRaininPX-100R
Fosforan potasu, dibazowyThermo Scientific424195000
Fosforan potasu, monozasadowyThermo Scientific424200025
Źródło zasilaniaBio-Rad23786
Rozpocznij Acquire Ultra 1.2.2softWoRx CytivaUzyskaj z DV Ultra
Baza TrisBioreagenty FisheraBP152-10
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1
Rotator rurVWR10136-084
kąpiel wodnaVWRWBE10A11B
Woda, Ultra CzystaProdukty Apex Bioresearch18-194
Ekstrakt drożdżowy granulowanyBioreagenty FisheraBP9727-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carlton, J. G., Jones, H., Eggert, U. S. Membrane and organelle dynamics during cell division. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (3), 151-166 (2020).
  2. Cai, Y., et al. Experimental and computational framework for a dynamic protein atlas of human cell division. Nat....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle AnalysisBudding YeastCell Cycle SynchronizationG1 Arrest ReleaseMitotic Arrest ReleaseChromosome SegregationFluorescence MicroscopyProtein LocalizationImageJ AnalysisSpindle Pole

Related Articles