Artykuł metodologiczny

Ujawnienie elektromechanicznej kontroli homeostazy tkanek za pomocą dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego

DOI:

10.3791/68894

⸱

19 września 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Westlake University, 2Mechanobiology Institute, National University of Singapore, 3Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 4Research Center for Industries of the Future, Westlake University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy protokół wytwarzania unikalnego dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego do badania elektromechanicznej regulacji homeostazy tkanek nabłonkowych. Urządzenie aplikuje statyczne fizjologiczne prądy elektryczne prostopadłe do płaszczyzny tkanki, wpływając na adhezję, proliferację i wytłaczanie komórki. Obrazowanie żywych komórek i pomiary naprężeń mechanicznych ujawniają mechanizmy tych procesów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na zachowanie i los komórki mają wpływ prądy elektryczne lub pola, które są endogenne lub stosowane zewnętrznie. Statyczne sygnały elektryczne mogą być stosowane w niestandardowych urządzeniach mikroprzepływowych w celu naśladowania środowiska elektrycznego w powolnych procesach fizjologicznych, takich jak rozwój, gojenie się ran i homeostaza. Ważną klasą badań elektryczności komórkowej jest kontrola migracji komórek za pomocą statycznych prądów galwanicznych w płaszczyźnie w prostych kanałach mikroprzepływowych naśladujących prądy uzwojone, o gęstości prądu ~0,1-1000 A/m2. Jednak ze względu na niekompatybilną geometrię urządzenia te nie są odpowiednie do badania efektów elektrycznych w homeostazie tkanek, w której komórki przyjmują polaryzację apiko-podstawową i transnabłonkową różnicę potencjałów (TEPD). W tym miejscu szczegółowo opisujemy unikalne urządzenie oparte na mikroprzepływach, które stosuje fizjologiczne prądy jonowe prostopadłe do płaszczyzny zbiegających się warstw komórek nabłonka, aby zakłócić TEPD i zbadać elektryczną regulację stanów równowagi tkanek. Zestaw jest wykonany z dwuwarstwowego polimeru utwardzanego promieniami UV osadzonego w miękkim podłożu z żelu poliakrylamidowego pokrytego wybranym białkiem o macierzy zewnątrzkomórkowej. To urządzenie mikroprzepływowe zapewnia prawidłową geometrię i przepuszczalne podłoże, aby indukować stosunkowo równomierny prąd jonowy w warstwach komórek w skali centymetrowej. Konfiguracja jest kompatybilna z konfokalnym obrazowaniem żywych komórek i mikroskopią sił trakcyjnych w celu wywnioskowania naprężeń mechanicznych wywołanych prądami transnabłonkowymi. Uderzające jest to, że proliferacja, ekstruzja i migracja komórek są kolektywnie wpływane w zlewającym się nabłonku w zależności od kierunku prądu jonowego, indukując nowy stan tkanki charakteryzujący się różną siłą interakcji komórka-komórka, zdarzeniami komórkowymi (śmierć i proliferacja) oraz strukturami tkankowymi. Elektrycznie kontrolowane zachowanie komórki można rozumieć jako elektrycznie wywołane naprężenie mechaniczne i odpowiedź komórki. To nowatorskie urządzenie mikroprzepływowe i protokół zapewniają narzędzie i dokumentację niezbędną społecznościom mechanobiologii i bioinżynierii do badania efektów elektrycznych w homeostazie tkanek i opracowywania nowych zastosowań inżynierii tkankowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnały bioelektryczne są ważnymi czynnikami biofizycznymi przyczyniającymi się do zarządzania zachowaniem komórek. Najbardziej znanym przykładem jest potencjał czynnościowy neuronów i komórek serca, które przesyłają sygnały elektryczne na duże odległości (do metra) i przy wysokich częstotliwościach (do setek Hz)1. Impulsy elektryczne stosowane za pomocą elektrod mogą być wykorzystywane do stymulowania wyzwalania potencjału czynnościowego i są przydatne w badaniach i zastosowaniach medycznych2. Endogenne sygnały bioelektryczne w powolnych procesach fizjologicznych, takich jak rozwój, gojenie się ran i homeostaza 3,4,5,6,7,8 zostały również zmierzone 9,10 w okresie od kilku godzin do dni. Ważnym przykładem są zlewające się warstwy nabłonka, które aktywnie utrzymują różnicę potencjału przeznabłonkowego (TEPD) w zakresie od kilku do kilkudziesięciu miliwoltów 4,11. Cięcie lub zranienie w tych zlewających się warstwach generuje prąd zwarciowy, napędzany przez aktywność elektryczną tkanki12,13. Prądy uzwojone do dziesiątek μA/cm2 i pola elektryczne do setek mV/mm zostały zgłoszone przy użyciu różnych technik. Badania sugerują, że te sygnały elektryczne wytwarzają kierunkową wskazówkę dla komórek do migracji w kierunku ran lub miejsc infekcji, co jest ważne dla procesu gojenia 3,6,14. Ogólnie rzecz biorąc, zarówno statyczne (lub wolno zmieniające się), jak i szybko zmieniające się sygnały elektryczne są ważne i wywołują różne reakcje komórek lub tkanek.

W sferze wolno zmieniających się sygnałów, jednym z ważnych zjawisk jest napędzany elektrycznie proces migracji określany jako "galwanotaksja". Kontrolowane prądy galwaniczne w płaszczyźnie mogą być stosowane w urządzeniach mikroprzepływowych z prostymi kanałami naśladującymi prądy uzwojone, podczas gdy migracja komórek jest badana jako funkcja gęstości prądu15,16. Stwierdzono, że pola elektryczne o natężeniu 0,1-1000 V/m (odpowiadająca im gęstość prądu 0,1-1000 A/m2) napędzają migrację komórek w wielu typach komórek w tym ustawieniu in vitro 17, podczas gdy szlaki sygnałowe kanoniczne do chemotaksji (migracja komórek kierowana gradientami chemicznymi), takie jak PI3K, są zaangażowane w galwanotaksję 7,18. "Podstawowe" urządzenia mikroprzepływowe do badania galwanotaksji mogą być wytwarzane przy użyciu standardowych technik miękkiej litografii i mikrofabrykacji19. Urządzenia te zazwyczaj składają się z jednokanałowego podłoża polidimetylosiloksanowego (PDMS) połączonego ze szkiełkiem podstawowym (rozmiar przekroju kanału: setki mikrometrów, długość: centymetry). Elektrody używane do dostarczania prądu statycznego są instalowane z dala od obszaru ogniwa i połączone z mostkami solnymi lub bez nich. Połączenie mostka solnego można wykonać poprzez wydrążenie otworów w podłożu PDMS, łączników mikroprzepływowych i rurki wypełnione agarem. Prosty szkiełko (zwykle o grubości 170 μm) pod kanałem obsługuje również obrazowanie żywych komórek w wysokiej rozdzielczości podczas eksperymentów z galwanotaksją, co jest kluczową cechą dla badania procesu.

Rola endogennych sygnałów elektrycznych w utrzymaniu homeostazy tkanek jest znacznie mniej zrozumiała niż w gojeniu się ran. Jednym z ważnych powodów jest brak odpowiednich narzędzi do badania tych efektów w nienaruszonych tkankach. Urządzenie mikroprzepływowe do galwanotaksji nie nadaje się do tego celu ze względu na swoją geometrię, która obsługuje tylko prądy elektryczne w płaszczyźnie. W kontekście homeostazy nabłonka potrzebne jest nowe urządzenie do kontrolowania i zakłócania TEPD lub prądów poza płaszczyzną przez zlewającą się warstwę nabłonka. Aby osiągnąć cel, jakim jest zastosowanie względnie jednolitej gęstości prądu jonów w monowarstwie, zaprojektowaliśmy i wyprodukowaliśmy urządzenie mikroprzepływowe z innowacjami w geometrii urządzenia, wykorzystaniu materiałów i możliwościach pomiarów biomechanicznych in situ 4. Ta ostatnia zdolność jest ważna, ponieważ efekty elektryczne mogą wpływać na zachowanie komórek poprzez sprzężenie ze szlakami biomechanicznymi i mechanobiologicznymi, które można badać za pomocą tej funkcji.

To nowe urządzenie wykazuje wiele innowacyjnych funkcji. Został zaprojektowany z dwiema warstwami zamiast pojedynczego kanału, który można znaleźć w urządzeniach galwanotaksyjnych (innowacja w geometrii), przy jednoczesnym zachowaniu połączenia z komorami elektrod podobnymi do tego w tych ostatnich. Pierwsza warstwa mikroprzepływowa ma kanały kierujące prądy jonowe do (lub od) obszaru tkanki, podczas gdy druga warstwa ma otwór, który kieruje ten prąd prostopadle przez nabłonek znajdujący się na szczycie tej drugiej warstwy mikroprzepływowej (ryc. 1A, B). Techniki mikrowytwarzania są stosowane do wytwarzania wystarczająco cienkich warstw, tak aby możliwe było obrazowanie konfokalne o wysokiej rozdzielczości pomimo układania warstw mikroprzepływowych, które zwiększają grubość próbki. W przypadku innych ważnych innowacji, syntetyczny hydrożel poliakryloamidowy (PA) jest wbudowany w środek urządzenia, co odgrywa kluczową rolę (rysunek 1A,B). Właściwości fizykochemiczne tego żelu, takie jak dostępna chemia do powlekania białek macierzy zewnątrzkomórkowej, przepuszczalność jonów, a także znana elastyczność, są odpowiednio niezbędne do przyłączania i wzrostu komórek, stosowania prądów poza płaszczyzną i pomiaru naprężeń mechanicznych20 podczas stymulacji elektrycznej. Struktury barierowe są włączone do warstwy 1 obszaru tkanki w celu uwięzienia roztworu prekursora żelu PA, tak jak to miało miejsce w poprzednich urządzeniach mikroprzepływowych21 (Figura 1A, B). Wreszcie, ponieważ polimeryzacja żelu PA jest hamowana tlenem na powierzchniach PDMS przepuszczalnych dla tlenu, do produkcji urządzeń stosuje się inny materiał22, który może umożliwić polimeryzację i ścisłe wiązanie żelu PA. Wszystkie innowacyjne funkcje są kluczowe, aby nowe urządzenie działało.

Ogólnie rzecz biorąc, dogłębne badanie statycznych lub wolno zmieniających się sygnałów bioelektrycznych w homeostazie nienaruszonych tkanek jest możliwe dzięki temu nowemu urządzeniu, którego protokół zostanie szczegółowo opisany poniżej. Protokół i wyniki, o których mowa tutaj, koncentrują się na linii komórek nabłonkowych Madin Darby Canine Kidney II (MDCK II), w tym na zdarzeniach komórkowych (proliferacja, śmierć i wytłaczanie oraz migracja) oraz zmianach strukturalnych w tkankach, które są indukowane przez prąd elektryczny. Badania te są również pouczające dla badaczy, którzy są zainteresowani zastosowaniem tej techniki do badania elektrycznej regulacji transportu nabłonkowego i indukcji zdarzeń komórkowych oraz zmian losu komórek w warstwach komórkowych i bardziej złożonych systemach, takich jak komórki pierwotne i organoidy 2D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Protokół ten zawiera kroki do skonstruowania układu, który stosuje statyczne prądy elektryczne i zaburza TEPD zlewającego się nabłonka oraz do badania jego skutków za pomocą obrazowania żywych komórek i technik mechanobiologii (ryc. 1). Zestaw składa się z urządzeń wykonanych z chipów mikroprzepływowych połączonych z wkładkami, wkładkami i uchwytami, w których mieści się wiele urządzeń do multipleksowanych eksperymentów na mikroskopie, pary komór elektrod połączonych z miernikiem źródłowym i urządzeniami oraz pokrywy komory żywej komórki do utrzymania odpowiednich warunków żywej komórki (rysunek 1C). Zasady projektowania i rysunki plików CAD kasety i innych ważnych elementów zestawu można znaleźć w pliku uzupełniającym 1. Kroki obejmują: 1) miękką litografię PDMS; 2) Produkcja chipów i montaż urządzeń; 3) Zakończenie instalacji; oraz 4) Wzrost jednowarstwowy i eksperymenty z żywymi komórkami. Szczegółowe informacje dotyczące odczynników i materiałów użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Miękka litografia PDMS

UWAGA: W tej sekcji szczegółowo opisano wytwarzanie elastomerów PDMS z wafli SU-8 (rysunek 2A, B) do formowania utwardzanych promieniami UV warstw kleju chipa mikroprzepływowego.

  1. Miękka litografia PDMS
    1. Wytwarzanie oddzielnej płytki na bazie SU-8 dla każdej warstwy mikroprzepływowej, warstwy 1 i 2, przy użyciu technik fotolitograficznych (plik uzupełniający 2 i plik uzupełniający 3).
      UWAGA: Produkcja wafli może potrwać miesiąc, jeśli prośba zostanie wysłana do zakładu mikrofabrykacji/pomieszczenia czystego. Można również zastosować technikę wytrawiania krzemu do produkcji wafli.
    2. Silanizuj wafel krzemowy, aby umożliwić rozformowanie PDMS19.
      1. Wyczyść wafel za pomocą pistoletu do przedmuchiwania azotem pod ciśnieniem. Aktywuj powierzchnię płytki, stosując krótki proces plazmy tlenowej (30 s, 30 W przy przepływie gazu 20 sccm O2 przy ciśnieniu reaktora 1-3 mbar)23.
      2. Odpipetować 200 μl tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo-1-trichlorosilanu w czystej plastikowej nasadce (średnica 60 mm, wysokość 15 mm). Umieść nakrętkę obok płytki w eksykatorze próżniowym (tylko do silanizacji). Włącz pompę próżniową i odczekaj 1-2 godziny, podczas gdy odparowany silan osadza się jako monowarstwa na płytce krzemowej.
        UWAGA: Silan jest i toksyczny. Nosić rękawice i okulary ochronne oraz pracować pod wyciągiem, aby zapewnić bezpieczną pracę.
        UWAGA: Nowo silanizowany wafel można użyć do wytworzenia 10-20 sztuk form PDMS. Czas podciśnienia zależy od stanu pompy próżniowej. Nadmierna silanizacja powoduje nierówną grubość i powoduje mętny wygląd, czego należy unikać. Przechowuj wafel w komorach o kontrolowanej wilgotności, gdy nie jest używany. Struktury PDMS wykonane z nowych płytek można sprawdzić za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM).
    3. Na szalce Petriego (średnica 150 mm, wysokość 25 mm) dokładnie wymieszać wystarczającą ilość żywicy PDMS i środka sieciującego (w:w = 10:1 i 70-80 g) przez kilka minut. Upewnij się, że w mieszance równomiernie tworzą się małe pęcherzyki, co potwierdza dobrą mieszankę. Przenieść mieszaninę do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i wirować przy 550 x g przez 3 minuty, aby dokładnie usunąć pęcherzyki powietrza.
      UWAGA: Płyn PDMS jest lepki i trudny do czyszczenia; Zachowaj ostrożność podczas nalewania. Wyczyść izopropanolem, jeśli powierzchnie stołu są zanieczyszczone rozlaną mieszaniną PDMS.
    4. Delikatnie wylej mieszaninę PDMS na wafel w plastikowym lub szklanym naczyniu (średnica 150 mm, wysokość 25 mm) z płaskim dnem, a następnie dociśnij wafel, aby usunąć PDMS z dna płytki. Mieszanina odgazowująca za pomocą pompy próżniowej.
      UWAGA: Ważne jest przedmuchiwanie ciekłego PDMS z dna płytki; gruba warstwa PDMS na dole utrudnia wyjęcie wafla z plastikowego naczynia, zwiększając prawdopodobieństwo rozbicia się wafla. Alternatywnie można przeciąć PDMS wzdłuż krawędzi płytki i utrzymać wafel na szalce Petriego. Upewnij się, że grubość PDMS wynosi około 1,5 mm dla warstwy 1, aby zapewnić elastyczność formy w późniejszych etapach produkcji. Upewnij się, że grubość PDMS wynosi około 2,5 mm dla warstwy 2, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo ugięcia na późniejszych etapach produkcji. Grubość PDMS jest mierzona za pomocą linijki po wycięciu form PDMS w potrzebne kształty.
    5. Utwardź PDMS w piekarniku w temperaturze 80 °C przez 2 godziny i upewnij się, że podczas tego procesu naczynie jest ustawione jak najbardziej poziomo. Pozwól foremce PDMS i wafli ostygnąć do temperatury pokojowej. Ostrożnie wyjmij formę PDMS w całości z wafla za pomocą ostrego ostrza chirurgicznego i wyściełanej pęsety.
      UWAGA: Uważaj, aby nie zarysować powierzchni wafla. Sprawdź, czy po odklejeniu PDMS na powierzchni płytki tworzą się resztki PDMS. Sygnalizuje to, że powierzchnia płytki powinna zostać ponownie silanizowana.
    6. Pokrój formę PDMS na bloki, które zawierają interesujące Cię cechy i przechowuj te bloki na czystych szalkach Petriego (średnica 150 mm, wysokość 25 mm) lub w komorze próżniowej, gdy nie są używane. Manipuluj formą PDMS bez dotykania podstawowych funkcji.

2. Produkcja chipów i montaż urządzeń

UWAGA: Użyj polimeru o niskiej lepkości, utwardzanego promieniami UV (maksymalny zakres absorpcji UV 350-380 nm) do wytworzenia chipa mikroprzepływowego poprzez formowanie PDMS. Klej utwardzany promieniami UV umożliwia integrację hydrożelu poliakryloamidowego (PA) jako przezroczystego, przepuszczalnego jonowo i elastycznego podłoża komórkowego. Właściwości żelu PA wspierają go jako czujnik naprężeń mechanicznych tkanek, który umożliwia obrazowanie żywych komórek i stymulację prądem statycznym. Chip zostanie w końcu przymocowany do wkładu, w którym znajduje się pożywka hodowlana i łączy się z komorami elektrodowymi.

  1. Przygotowanie szklanego podłoża szkiełka nakrywkowego
    1. Naciąć wymaganą ilość prostokątnych szkiełek nakrywkowych (170 μm) za pomocą frezu diamentowego do rozmiaru 37 × 24 mm2, aby dopasować je do wymiarów wkładu (plik uzupełniający 4).
      UWAGA: Szkiełko nakrywkowe ma grubość 170 μm zgodną z obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości, ale jest delikatne i wymaga ostrożnego obchodzenia się. Nosić rękawice i okulary ochronne. Jeśli pojawią się jakiekolwiek widoczne pęknięcia, należy natychmiast usunąć prostokątne szkiełka nakrywkowe, ponieważ odpryski z tych prostokątnych szklanych szkiełek nakrywkowych mogą stwarzać ryzyko przeciekania. Alternatywnie można zamówić szkiełka nakrywkowe o odpowiednim rozmiarze u producentów szkiełek nakrywkowych. Unikaj dotykania powierzchni prostokątnych szklanych szkiełek nakrywkowych gołymi rękami i pozostawiania plam, które mogą pogorszyć jakość obrazowania.
    2. Umieść prostokątne szkiełka nakrywkowe na czystej szalce Petriego bez nakładania się na siebie i przenieś je do komory plazmowej. Wywołaj stan próżni, ale na końcu wpuść trochę powietrza. Aktywuj powierzchnie prostokątnych szklanych szkiełek nakrywkowych za pomocą plazmy powietrznej (30 s do 5 min, 29,6 W, w zależności od stanu urządzenia)
      UWAGA: W kolejnym kroku (krok 2.1.3) należy używać tylko stron całkowicie wystawionych na działanie plazmy (tj. górnych powierzchni). Wykonaj krok 2.1.3 w ciągu 30 minut po ekspozycji na osocze. Na tym etapie komora powinna wyglądać jak różowo-fioletowa, jeśli została wygenerowana plazma powietrzna. Jeśli ostatnie etapy wiązania zakończą się pomyślnie, dla wygody skróć czas trwania plazmy.
    3. Przygotować 10 ml roztworu do obróbki powierzchniowej sporządzonego z 0,3% kwasu octowego i 0,5% metakrylanu 3-(trimetoksysililo)propylu rozpuszczonego w 100% etanolu. Prostokątne szkiełka nakrywkowe należy traktować tym roztworem na szalce Petriego (średnica 150 mm, wysokość 25 mm) przez 5 minut na wytrząsarce, aby umożliwić dobre wiązanie z warstwami mikroprzepływowymi na bazie kleju utwardzanymi promieniami UV. Upewnij się, że prostokątne szklane szkiełka nakrywkowe są całkowicie zanurzone w roztworze i obie strony są poddane obróbce.
      UWAGA: Roztwór do obróbki powierzchni jest. Trzymaj go w dygestorium.
    4. Szkiełka nakrywkowe ze szkła prostokątnego należy trzykrotnie spłukać 100% etanolem, nie dopuszczając do ich wyschnięcia podczas procesu. Suche prostokątne szkiełka nakrywkowe jeden po drugim z gazowym azotem i pistoletem do przedmuchiwania. Upewnij się, że szybkość wydmuchiwania jest wystarczająca, aby czysto usunąć kropelki płynu z powierzchni podstawy szkiełka nakrywkowego, zapobiegając powstawaniu plam z cieczy. Szkiełka nakrywkowe ze szkła prostokątnego przechowywać na czystej szalce Petriego (średnica 150 mm, wysokość 25 mm).
      UWAGA: Użyj pistoletu do przedmuchiwania, aby skierować przepływ powietrza równolegle do podstawy szkiełek nakrywkowych i unikaj używania nadmiernej szybkości nadmuchu, aby zapobiec rozbiciu okularów.
  2. Produkcja warstwy 1 (rysunek 2C)
    1. Umieść i spłaszcz czystą formę PDMS warstwy 1, stroną zadrukowaną do góry, na czystej plastikowej nasadce naczynia (średnica 60 mm, wysokość 15 mm). Odpipetować 500 μl płynnego kleju utwardzanego promieniami UV na formę powoli, ostrożnie zwilżając wszystkie wystające struktury za pomocą szpatułki. Usuń pęcherzyki powietrza w wyniku procesu zwilżania.
      UWAGA: Czyste formy PDMS można przygotować za pomocą taśmy do usuwania kurzu lub resztek kleju utwardzanego promieniami UV lub czyszcząc etanolem. Dla dodatkowych środków ostrożności przechowuj formy PDMS w komorach próżniowych, gdy nie są używane.
    2. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do formy PDMS. Nie dopuścić do tego, aby nadmiar kleju utwardzanego promieniami UV zwilżył górną stronę szkiełka nakrywkowego, ponieważ resztki kleju utwardzanego promieniami UV mogą uniemożliwić uzyskanie czystego i płaskiego szkiełka nakrywkowego. Usuń nadmiar kleju utwardzanego promieniami UV za pomocą wycieraczek laboratoryjnych.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że cechy formy PDMS przeniesione na warstwę kleju utwardzanego promieniami UV będą wyrównane z wkładem, z którym zostanie połączona. W tym celu należy oznaczyć szkiełko nakrywkowe rozpuszczalnym markerem w miejscu, w którym będą znajdować się środki dołków na wkłady (trzy z nich). Użyj tych oznaczeń, aby wyrównać szkiełko nakrywkowe z cechami formy PDMS podczas dociskania prostokątnego szklanego szkiełka nakrywkowego.
    3. Częściowo utwardź konstrukcję pod równomiernie oświetlonym światłem UV (363-370 nm, 224 mW/cm2) przez 10 s. Zetrzyj ślady 75% etanolem później. Trzymaj strukturę mocno na płaskiej powierzchni i powoli oderwij od niej formę PDMS warstwy 1.
      UWAGA: Częściowe utwardzenie umożliwia wytworzenie wystarczająco solidnej warstwy kleju utwardzanej promieniami UV, co pozwala na złuszczanie się formy PDMS na tym etapie. Ułatwia to również wiązanie z częściowo utwardzoną warstwą 2 w kolejnych krokach w celu wytworzenia dwuwarstwowej struktury kleju utwardzanej promieniami UV. Forma PDMS warstwy 1, która została przygotowana o grubości 1,5 mm (krok 1.2.4), zapewnia wystarczającą elastyczność PDMS, która zmniejsza prawdopodobieństwo pęknięcia cienkiego szkiełka nakrywkowego podczas procesu obierania. Forma PDMS może być ponownie użyta do dziesięciu do dwudziestu razy, po czym na powierzchni PDMS może pojawić się biaława warstwa resztek kleju utwardzanych promieniami UV, zmniejszając grubość struktury. W takim przypadku użyj nowych form PDMS.
  3. Produkcja warstwy 2 (rysunek 2D)
    1. Umieść czystą formę PDMS warstwy 2, stroną zadrukowaną do dołu, na płaskiej płycie PDMS (grubość płyty > 2.5 mm, aby zapewnić wysoką sztywność). Delikatnie dotknij funkcji od góry za pomocą pęsety. Obserwuj interfejs pod kątem przyciemnienia lub kontrastu optycznego pod funkcjami - wskazuje to na prawidłowy kontakt.
      UWAGA: Filary nośne otaczające główne elementy (dwa okrągłe otwory i szczelina) mają kluczowe znaczenie dla zapobiegania zwisaniu powierzchni formy PDMS.
    2. Wypełnij przestrzeń między formą PDMS a płytą płynnym klejem utwardzanym promieniami UV poprzez efekt kapilarny. Częściowo utwardzamy konstrukcję w świetle UV (363-370 nm, 224 mW/cm2) przez 10 s.
    3. Delikatnie oderwij kompozytową warstwę kleju utwardzaną promieniami UV i formę PDMS z płyty PDMS za pomocą miękko wyściełanej pęsety. W razie potrzeby przytnij nadmiar krawędzi warstwy kleju utwardzanego promieniami UV ostrymi nożyczkami.
  4. Klejenie warstw 1 i 2 (rysunek 2E)
    1. Umieść warstwę 1 przymocowaną do prostokątnego szklanego szkiełka nakrywkowego na płaskiej powierzchni. Dopasuj warstwę 2 (nadal przymocowaną do formy PDMS) z warstwą 1 i mocno dociśnij obie warstwy, upewniając się, że "cienie" pojawiają się pod elementami.
    2. Utwardź strukturę w świetle UV (363-370 nm, 224 mW/cm²) przez 10 s, aby związać warstwy 1 i 2, które tworzą dwuwarstwową strukturę chipa mikroprzepływowego. Delikatnie oderwij formę PDMS od chipa.
      UWAGA: Aby zapewnić pomyślne oderwanie pleśni PDMS od chipa, użyj pęsety, aby oddzielić każdy filar nośny PDMS od warstwy 2 kleju utwardzanego promieniami UV w kroku 2.4.1. Działanie to pomaga zmniejszyć ogólną przyczepność między formą PDMS a warstwą 2, co jest ważne w przypadku peelingu.
  5. Integracja żelu poliakrylamidowego (rysunek 2F)
    UWAGA: Przed tą sekcją przygotuj tyle chipów, ile jest potrzebnych do eksperymentu multipleksowego.
    1. Przygotować roztwór prekursora żelu PA, delikatnie mieszając składniki z poniższej tabeli, odpowiadając sztywności żelu PA wybranej24 (patrz tabela 1). Należy uważać, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza podczas pipetowania, ponieważ tlen hamuje żelowanie.
      UWAGA: TEMED i APS są toksyczne. Pracuj pod wyciągiem i noś rękawice.
      UWAGA: Konieczne jest ostrożne pipetowanie i obchodzenie się z nimi, ponieważ w grę wchodzą małe objętości płynów (1 μl TEMED na 1 ml roztworu prekursora żelu PA). Sztywność żelu może wpływać na zachowanie komórek, jak wykazano w wielu badaniach mechanobiologicznych. Wybierz sztywność najbardziej odpowiednią dla swoich eksperymentów. Koraliki fluorescencyjne służą jako markery odniesienia dla deformacji żelu i wnioskowania o naprężeniach mechanicznych. Odwirować roztwór kulek przed pipetowaniem roztworu do roztworu prekursora żelu PA. Zaleca się, aby nie mieszać TEMED o małej objętości jako ostatni, ponieważ roztwory prekursorów żelu PA zaczynają żelować po dodaniu obu inicjatorów, a małe objętości są trudne do dokładnego wymieszania w tym krótkim czasie.
    2. Natychmiast odpipetować 10 μl roztworu prekursora żelu PA w środku obszaru tkanki i na górze szczeliny warstwy 2 (ryc. 1B, 2F). Delikatnie dociśnij okrągłym szklanym szkiełkiem nakrywkowym (średnica 10 mm), aby utworzyć płaski żel. Obserwuj, jak roztwór PA przepływa do warstwy 1 przez szczelinę i zatrzymuje się przy rzędzie filarów bariery.
      UWAGA: Objętość 10 μl roztworu prekursora żelu PA wytwarza żel o grubości 100 μm powyżej warstwy 2. Zmień tę objętość w zależności od wymaganej grubości żelu. Odpipetuj roztwór na chipie tak szybko, jak to możliwe, ponieważ roztwór PA zaczyna polimeryzować po dodaniu inicjatorów. Dociśnij roztwór z odpowiednią siłą, aby zapobiec przelaniu się roztworu przez filary bariery i zablokowaniu kanału. Wyrzuć chip, jeśli kanały są zablokowane. W przypadku miękkich żeli o sztywności 5 kPa lub mniejszej należy użyć szklanego środka hydrofobowego do obróbki okrągłych szklanych szkiełek nakrywkowych, aby nadać im hydrofobowość. W szczególności zanurz szkiełka nakrywkowe w szklanym środku hydrofobowym na 5 minut, spłucz 3 razy 100% etanolem i osusz gazowym azotem. Ułatwia to późniejsze odklejanie szkiełka nakrywkowego od spolimeryzowanego żelu bez niszczenia żelu.
    3. Chip mikroprzepływowy należy natychmiast utwardzić w świetle UV (363-370 nm, 224 mW/cm2) przez 5 minut. Odczekać co najmniej ~1 godzinę, aż żel PA całkowicie zastygnie.
      UWAGA: Spowoduje to całkowite utwardzenie chipa, jednocześnie umożliwiając spolimeryzowanemu żelowi PA związanie się ze strukturą. Kroki 2.5.1, 2.5.2 i 2.5.3 należy wykonać w krótkich odstępach czasu.
    4. Dokładnie inkubować chip w HEPES (0,1 M, pH 7,4) przez co najmniej 1 godzinę lub dłużej, aby zwilżyć żel i poluzować przyczepność między szkiełkiem nakrywkowym a żelem. Delikatnie zdejmij szkło nakrywkowe za pomocą ostrej pęsety.
      UWAGA: W przypadku bardziej miękkich żeli o sztywności 5 kPa lub niższej, należy wydłużyć okres inkubacji do 10 godzin na wytrząsarce, aby zapewnić czyste usunięcie szkła nakrywkowego z żelu bez naruszania struktury żelu. Czasami między prostokątną podstawą szkiełka nakrywkowego a utwardzaną promieniami UV warstwą 1 na bazie kleju mogą tworzyć się wzory strukturalne o wielkości kilkudziesięciu i setek mikrometrów. Wzorce te mogą zakłócać obrazowanie w jasnym polu, ale mają minimalny wpływ na obrazowanie fluorescencyjne. Można to poprawić poprzez plazmową aktywację prostokątnych szkiełek nakrywkowych, jak w kroku 2.1.2.
  6. Klejenie wiórów i wkładów (Rysunek 2F)
    1. Umieść oczyszczony wkład poliwęglanowy klasy medycznej (plik uzupełniający 4) na płaskiej powierzchni, dnem do góry. Osusz żel na chipie chusteczkami laboratoryjnymi z boku. Wyrównaj chip stroną zadrukowaną do dołu z wkładem.
      UWAGA: Podczas testowania nowych konstrukcji kartridży można skorzystać z metod obróbki skrawaniem lub druku 3D. Po ustaleniu projektu można użyć formowania wtryskowego do produkcji dużych ilości wkładu.
    2. Pipetę utwardzany promieniami UV klej do szczelin między chipem a wkładem, który zostanie wypełniony przez efekt kapilarny. Utwardzać światłem UV (363-370 nm, 224 mW/cm2) przez 5 min.
      UWAGA: Uważaj, aby klej utwardzany promieniami UV nie przelał się do kanałów lub na drugą stronę podstawy szkiełka nakrywkowego.
  7. Usuwanie niespolimeryzowanego roztworu PA
    1. Za pomocą korka PDMS i strzykawki pobrać około 5 ml HEPES (0,1 M, pH 7,4) przez kanały usuwania odpadów, aby wypłukać niespolimeryzowany roztwór prekursora żelu PA, który jest toksyczny dla komórek.
    2. Inkubować żel w urządzeniu z 2 ml HEPES (0,1 M, pH 7,4) na urządzenie i umieścić go na wytrząsarce na 1-2 dni, aby zapewnić całkowite usunięcie niespolimeryzowanego roztworu prekursora żelu PA.

3. Zakończenie konfiguracji

UWAGA: Po wykonaniu urządzeń zakończ konfigurację (Rysunek 1C), pokrywając żel PA białkiem ECM do wysiewu komórek, łącząc urządzenia z komorą elektrod w celu stymulacji elektrycznej i umieszczając urządzenia we wkładkach, uchwytach i pokrywie komory żywych komórek do multipleksowanych eksperymentów obrazowania żywych komórek.

  1. Przygotowanie wysterylizowanych składników
    1. Wszystkie elementy zestawu inne niż urządzenie (Tabela Materiałów) powinny być sonikowane w następującej kolejności: najpierw w wodzie z mydłem przez 30 minut, następnie w wodzie MQ przez 30 minut, a na końcu w 75% etanolu przez 30 minut. Następnie wysuszyć je w piecu w temperaturze 60 °C i poddać działaniu światła UV o długości fali 200-280 nm w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 30 minut, aby uzyskać sterylizację.
  2. Funkcjonalizacja żelu PA białkiem ECM
    1. Wysterylizuj urządzenia światłem UV (200-280 nm) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Przygotuj wymaganą ilość 50 μg/ml roztworu roboczego Kolagenu I w 1x DPBS na lodzie.
      UWAGA: Utrzymuj zapas kolagenu I na lodzie, aby zapobiec żelowaniu. Do pełnego zanurzenia żelu potrzeba 100-150 μl roztworu roboczego Kolagenu I. Delikatnie pipetuj roztwory Kolagenu I, aby uniknąć tworzenia się błonnika.
    3. Przygotować wymaganą ilość roztworu roboczego Sulfo-SANPAH (SS) na lodzie. Każda obróbka żelem wymaga około 80 μl roztworu roboczego SS, gdzie 2 μl roztworu podstawowego SS (rozpuszczonego w bezwodnym DMSO) rozcieńcza się w 80 μl zimnego HEPE (z 4 °C lodówki, 0,1 M, pH 7,4).
      UWAGA: SS jest wrażliwy na wilgoć; Unikaj kondensacji wilgoci na produkcie, dostosowując fiolki do temperatury pokojowej przed otwarciem. Użyj SS bez ważenia, aby uzyskać najlepszą wydajność, i przygotuj zapasy w bezwodnym DMSO. Użyj go tak szybko, jak to możliwe. Zimny bufor HEPES służy do zmniejszenia szybkości hydrolizy SS w ramach przygotowań do roztworu roboczego SS. Każdy żel wymaga dwóch zabiegów roztworem roboczym SS, aby zapewnić dobrą funkcjonalizację powierzchni żelu PA.
    4. Wysuszyć żel w urządzeniu, wklepując chusteczki laboratoryjne na krawędziach żelu. Odpipetować 80 μl roztworu roboczego SS na żel, upewniając się, że powierzchnia żelu jest całkowicie zanurzona w roztworze SS. Traktuj żel promieniowaniem UV (363-370 nm, 24,5 mW/cm2) przez 5 minut, aby aktywować SS. Spłucz 3 razy zimnym filtrem HEPES (0,1 M, pH 7,4).
      UWAGA: Ostrożnie pipetuj SS w środku dołka wkładu, aby zapobiec przyciąganiu SS do ściany.
    5. Powtórz krok 3.2.4, ale na końcu spłucz trzy razy zimnym 1x DPBS.
      UWAGA: Kroki od 3.2.3 do 3.2.5 należy wykonać w krótkich odstępach czasu, aby zapobiec hydrolizie SS. Na tym etapie spłukany żel powinien mieć ciemniejszy odcień czerwieni, jeśli aktywacja powierzchniowa przez SS zakończy się sukcesem.
    6. Odpipetuj 100 μl roztworu kolagenu I na żel PA, upewniając się, że żel jest całkowicie zanurzony. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie trzykrotnie spłukać nieprzyłączony kolagen 1x DPBS. Przed użyciem zanurz żel w 1x DPBS.
      UWAGA: Próbka pokryta kolagenem I może być przechowywana w lodówce w temperaturze 4 °C przez kilka dni.
  3. Podłączenie urządzeń do komór elektrodowych
    1. Przymocuj urządzenia do wkładek za pomocą (Rysunek 1C, typ: M3 X 10 mm). Następnie przymocuj do uchwytu przeznaczonego do montażu na stoliku mikroskopu (typ: M3 X 5 mm) do czterech zespołów wkładki urządzenia.
      UWAGA: Jeśli nie zostanie użyta maksymalna liczba zespołów wkładek do urządzenia, zaleca się wypełnienie wszystkich pozostałych gniazd uchwytów pustymi urządzeniami w celu uszczelnienia przestrzeni, tak aby można było zachować dobre warunki żywej komórki do późniejszych eksperymentów obrazowych. Puste urządzenia można po prostu wykonać, przyklejając wkłady do gołych prostokątnych szkiełek nakrywkowych.
    2. Napełnij urządzenia pożywką hodowlaną (DMEM++, 2 ml w każdej z głównych studzienek). Następnie przeciągnij 2 ml pożywki przez kanały usuwania odpadów, aby wypłukać i wymienić 1x DPBS.
    3. Przygotuj dwie probówki o pojemności 50 ml z nakrętkami, które mają otwory przelotowe, które będą pełnić funkcję komór elektrodowych. Wykonaj otwory o odpowiednim rozmiarze i ilości, aby bezpiecznie dopasować elektrody platynowe i rurki Tygon, łączące komory elektrod z urządzeniami. Napełnij każdą komorę elektrody 45 ml pożywki hodowlanej.
      UWAGA: Otwory na czepkach można łatwo wykonać za pomocą ostrych ostrzy chirurgicznych.
    4. Przygotuj połączenie między komorami elektrod a urządzeniami: Podłącz dwa złącza rurkowe do każdego urządzenia. Umieść zacisk rurki na każdej rurce Tygon (Rysunek 1C). Przeciągnij pożywkę hodowlaną przez rurki za pomocą strzykawki i mocno je przypnij. Podłącz jeden koniec rurki wypełnionej medium do komory elektrody, a drugi do urządzenia.
      UWAGA: Zmniejsz prawdopodobieństwo pojawienia się pęcherzyków w rurkach, używając wstępnie podgrzanego medium i/lub odgazowując medium w komorze próżniowej. Zapobiegaj tworzeniu się pęcherzyków powietrza na styku rurki Tygon i złącza rurki, ściśnij końce przewodów, aby wybrzuszyć powierzchnię medium przed zanurzeniem w medium w rurce lub wykonaj fizyczne przymocowanie do łączników przewodów.
    5. Dostosuj względne wysokości między powierzchniami pożywki hodowlanej w urządzeniach i komorach elektrod za pomocą podnośnika laboratoryjnego. Zwolnij zaciski rurek i pozwól, aby wszystkie średnie powierzchnie wyrównały się do tej samej wysokości.
      UWAGA: Pamiętaj, aby zamocować zaciski rurki za każdym razem, gdy cały zestaw jest przenoszony, aby uniknąć przelania płynów.
    6. Przeprowadź kontrolę jakości, mierząc rezystancję każdego urządzenia osobno za pomocą miernika źródła elektrycznego.
      UWAGA: Upewnij się, że zwalniasz tylko zacisk rurki urządzenia, dla którego mierzona jest rezystancja, jednocześnie utrzymując zaciski innych urządzeń połączonych równolegle bezpiecznie zamocowane.

4. Wzrost jednowarstwowy i eksperymenty z żywymi komórkami

UWAGA: Aby utworzyć odpowiednią zlewającą się monowarstwę i uzyskać równomiernie rozłożoną gęstość prądu elektrycznego, która zależy od zbiegu i oporu elektrycznego monowarstwy. Następnie należy zapewnić odpowiednie warunki dla żywych komórek pod mikroskopem w celu długoterminowego obrazowania i eksperymentów ze stymulacją elektryczną.

  1. Wzrost jednowarstwowy
    1. Odłączyć komórki MDCK za pomocą trypsyny od kolb T25. Odwirować i policzyć objętość podłoża potrzebną do uzyskania 0,1 miliona komórek. Zawiesić tę liczbę komórek i dobrze je wymieszać w pożywce o pojemności 2 ml w probówkach wirówkowych.
    2. Odpipetować całą pożywkę zawierającą komórki do studzienki na obszar tkanki. Pozwól komórkom osiadać przez 15 minut, a następnie powoli przenieś cały zestaw do inkubatora do hodowli tkankowej.
      UWAGA: Dla każdego urządzenia gęstość wysiewu wynosząca 0,1 miliona komórek odpowiada 0,06 miliona komórek na centymetr kwadratowy (6 × 104 komórek/cm2). Ta gęstość wysiewu jest wystarczająco rzadka, a komórki rosną przez 2 dni, zanim osiągną stan zlewania. Proces ten zapewnia odpowiednio spolaryzowaną i jednorodną monowarstwę, bez konieczności spłukiwania nadmiaru nieprzyłączonych komórek, które mogą zaburzyć tkankę. Etap sedymentacji jest ważny, aby pozostawić go w spokoju, aby nastąpiło równomierne wysiewanie komórek.
    3. Pozwól komórkom rosnąć w inkubatorze (37 °C, 5% CO2, 90% wilgotności) przez 72 godziny, aby osiągnąć gęstość komórek > ~ 50 komórek/100 μm2. Sprawdzaj codziennie pod mikroskopem laboratoryjnym z kontrastem fazowym, aby monitorować proces wzrostu.
      UWAGA: Przy takiej liczbie wysianych komórek, komórki MDCK osiągną 70%-80% konfluencji po 24 godzinach, pełną konfluencję po 48 godzinach, a dalszy wzrost gęstości komórek i dojrzewanie tkanek do 72 godzin. Po 24 godzinach średnia długość komórki wynosi około 10-20 μm. Po 48 godzinach połączenia komórka-komórka i ciało komórki mają wyraźny kontrast w obrazowaniu z kontrastem fazowym. Kontrast ten drastycznie zmniejsza się po 72 godzinach.
  2. Obrazowanie żywych komórek
    1. Wybierz mikroskop epifluorescencyjny lub konfokalny w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Gdy komórki ulegają ekspresji lub są barwione markerami fluorescencyjnymi, wybierz konfokalne do trójwymiarowej obserwacji kształtu komórki i deformacji podłoża żelowego. Do obserwacji dwuwymiarowej wybierz kontrast fazowy i epifluorescencję, które powodują mniejszą fototoksyczność. Włącz system żywych komórek na 1 godzinę przed dostarczeniem zestawu do mikroskopu, pozwalając inkubatorowi mikroskopowemu ustabilizować się do 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 90%.
      UWAGA: Sterownik systemu live-cell pokazuje warunki w inkubatorze stage-top i emituje ostrzeżenie, gdy warunki są nieoptymalne. Ze względu na to, że pokrywa inkubatora typu stage top różni się od komercyjnej ze względu na konieczność umieszczenia rurek urządzenia wystających na zewnątrz, system wymaga ponownej kalibracji, aby zapewnić dobre warunki dla żywej komórki dla długotrwałych eksperymentów (od kilku dni do tygodnia). Kalibrację można przeprowadzić w oparciu o instrukcję obsługi, a pozycje czujników muszą być utrzymywane tak samo w eksperymentach, jak w warunkach kalibracji. Sprawdź szybkość parowania pożywki w inkubatorze ze stopniem i warunki pH za pomocą pożywki z czerwienią fenolową.
    2. Zamontuj zestaw na mikroskopie, tak aby komory elektrod znajdowały się po bokach. Upewnij się, że stolik elektroniczny mikroskopu ma wystarczająco dużo miejsca, aby się poruszać i nie uderzać w komory elektrod. Upewnij się, że wysokości powierzchni medium są zrównoważone i znajdują się na tej samej wysokości między wysokościami w urządzeniach a komorami elektrod.
      UWAGA: Powierzchnia medium w studzienkach urządzenia, w której znajduje się obszar tkanki (ryc. 1C), ma znaczący wpływ na obrazowanie w jasnym polu i kontrast fazowy. Łąkotka spowoduje niepożądane ogniskowanie światła. Upewnij się, że powierzchnia pożywki jest płaska na brzegu studni, ale należy pamiętać, że parowanie medium w komorze żywych komórek doprowadzi po pewnym czasie do zniekształcenia tej płaskiej powierzchni. Aby przezwyciężyć ten problem, jednym z rozwiązań jest umieszczenie płaskiego szklanego szkiełka nakrywkowego w kontakcie z powierzchnią medium, aby spłaszczyć tę powierzchnię. Szkiełko nakrywkowe powinno mieć mniejszą powierzchnię niż studnia, aby nie utrudniało wymiany gazowej, co jest ważne dla wzrostu komórek. Inną opcją jest nałożenie na podłoże oleju mineralnego klasy do hodowli komórkowych.
    3. Skonfiguruj oprogramowanie.
      1. Wybierz soczewki obiektywowe 10x lub 20x do obrazowania całych tkanek za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego oraz soczewki obiektywowe 30x (WD 0,8 mm, NA 1,05) do obrazowania konfokalnego o wyższej rozdzielczości.
      2. W przypadku obrazowania całej tkanki wybierz wiele pozycji, aby pokryć prostokątny obszar w obszarze tkanki (ryc. 1A, np. 5 rzędów na 5 kolumn, środkowy rząd zakrywający szczelinę, a pozostałe na zewnątrz szczeliny). Wybierz kanały fluorescencyjne i jasne pole zgodnie z liniami komórkowymi użytymi w części wynikowej (kanał 488 dla fluorescencji zielonej i kanał 561 dla fluorescencji czerwonej). Wybierz 1-godzinny przedział czasowy, aby zmniejszyć fototoksyczność w tym długoterminowym eksperymencie obrazowania na okres do kilku dni.
        UWAGA: Inne soczewki obiektywowe, takie jak 4x, można wybrać, jeśli potrzebny jest większy widok całej tkanki.
  3. Stymulacja elektryczna
    1. Sprawdź liczbę urządzeń, względną rezystancję urządzenia i docelowy prąd elektryczny każdego urządzenia. Zdecyduj o całkowitym prądzie elektrycznym, który ma być pozyskiwany przez kilka godzin do tygodnia w całej konfiguracji.
    2. Źródło sygnału elektrycznego w trybie cęgowym prądu. W przypadku 3 urządzeń o tej samej rezystancji kanału, z jedną grupą kontrolną (brak prądu elektrycznego, zamocowany zacisk rurowy), jednym stanem prądu wierzchołkowego do podstawowego (AtB) i jednym stanem prądu podstawowego-wierzchołkowego (BtA) (rysunek 1D), należy dostarczyć łączny prąd 20 μA za pomocą miernika źródła. Prowadzi to do tego, że dla każdego urządzenia dostarczane jest 10 μA o szacowanej gęstości prądu ~10 μA/cm2 , która jest fizjologicznie istotna (więcej szczegółów w dyskusji).
      UWAGA: Całkowite napięcie wynosi około kilkudziesięciu miliwoltów, w zależności od długości rurki Tygon. Taki prąd elektryczny może być dostarczany w sposób ciągły przez kilka dni do tygodnia. Czerwony wskaźnik fenolowy zmieni kolor w komorach elektrod (bardziej kwaśny w komorze z elektrodą dodatnią), ale nie w inkubatorze stage-top, który jest dobrze skalibrowany. Komórki pozostaną zdrowe tak długo, jak długo warunki żywych komórek będą dobrze utrzymane. Naukowcy mogą zmieniać pożywkę w inkubatorze stage top raz na drugi dzień, a pożywkę w komorach elektrod raz na kilka dni. Zamocuj zaciski rurek podczas przełączania komór elektrod, aby uniknąć przelania medium. Jak wspomniano w kroku 3.1.1, pamiętaj, aby mieć puste urządzenie, które pokryje miejsce na uchwyt. Dzięki temu komora żywej komórki jest w odpowiednim stanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie przedstawione tutaj wyniki są adaptacją poprzedniej publikacji4; Więcej informacji można znaleźć w tej publikacji.

Protokół ten umożliwia zastosowanie zewnętrznego prądu jonowego lub pola elektrycznego prostopadłego do płaszczyzny komórek lub tkanek. Ta stymulacja elektryczna zaburza endogenną przeznabłonkową różnicę potencjałów elektrycznych (TEPD) i pozwala badać rolę TEPD w regulowaniu zachowania tkanek. Zgodnie z protokołem, komórki MDCK typu dzikiego i ge...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten zawiera szczegółowe kroki i logikę projektowania w celu wytworzenia nowatorskiego urządzenia mikroprzepływowego do przeprowadzania eksperymentów z perturbacją przeznabłonkowego potencjału elektrycznego oraz do badania efektów bioelektrycznych za pomocą metod obrazowania żywych komórek i mechanobiologii. Znaczenie tej metody jest oczywiste w porównaniu z innymi powiązanymi metodami. Na przykład jedna z powiązanych metod wykorzystuje prosty układ mikroprzepływowy o konstrukcji jednokanałowej, który stosuje sta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Upewnij się, że wszyscy autorzy ujawnili wszelkie konflikty interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

XJ, PX, FF i TBS dziękują za pomocne rozmowy z dr Xumei Gao, Xinru Yu i innymi członkami grupy z Laboratorium Biofizyki Tkankowej. Dziękujemy Customized Technology Service Facility (CTSF) na Uniwersytecie Westlake za pomoc w przygotowaniu naszego rysunku schematycznego. Prace te były wspierane przez Westlake Education Foundation, Westlake Laboratory of Life Sciences and Biomedicine oraz Research Center for Industries of the Future (RCIF) na Uniwersytecie Westlake.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x DPBSGibco (firma Gibco)14190144
Metakrylan 3-(trimetoksysililo)propylu, TPMSigma2530850Po otwarciu przechowywać pod azotem.
Probówka Falcon 50 mlCorning430829Przebij 4 otwory w nasadce probówki falcon o pojemności 50 ml, aby elektroda i rurka mogły przejść przez nasadkę i zanurzyć je w medium. Do zestawu urządzenia mikroprzepływowego potrzebne są co najmniej 2 nasadki.
Kwas octowySinopharm powiedział:10000208
Roztwór akrylamidu, 40%Sigma79061Toksyczny
PompaLaboratorium OKOOKO-APElement inkubatora mikroskopowego stage-top
Nadsiarczan amonu, APSAladdinA112447
Nabój--Wkład jest wykonany na zamówienie, a projekt odnosi się do materiału dodatkowego. Surowiec to PC Makrolon 2858 Medical Grade, a tutaj można znaleźć więcej szczegółów: https://solutions.covestro.com/zh/products/makrolon/2858_000000000000508397?SelectedCountry=US
Klipy--Robert Clip, do rurek  o średnicy zewnętrznej 4,5 mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=18717491819&pisk=gAsj0ailDjcjqv-tCE2rVYReT5-1h8rFWA9OKOnqBnKv6A1RBjpxDchRepvBWczD0Ft1wQS2gt-v6c1NQi5NBGJOfnjPucR4ih6OThNUTkrFntYBXWPETzI4tHpikchwH3nJbds8Mz2dntxMXYlT8aBmCOO1qfp968tJCdc9XKnte89wBdK9MFh-ypdJXhdvkYpJBpn9HCnYF3pDKKhv6qK-edJXXCC9X86JZdt96bH_3dwJgtw2FbzzkyxCHQitXiEMlB_i7ci1TKLfXtd5zaSWhEOpWac1uiCPBiSDrzgJjT7C1NCLaqRARp1W8ZNIc61DB6tV4jeJXFQP8E_7McOP0dTpXUMtXTtPPFsWvkhWEaBVWifjCcpc0M86tUwtjF-RYeQdGA2henpOsejatmAAB9jh8HZjtK_Rd3syxDRBL50sFem6FBy7FV0GhSGPYc782SYvEK__F8GxLEpkFBy7FV0MkLvf18wSMv5..&spm=a21xtw.29978518.0.0&skuId=3344063585144
Kolagen ICorning354236
Woda DI Milli-QMili-Q-
Pożywka hodowlana Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM (wysoka glukoza)Gibco (firma Gibco)11965092DMEM++ to DMEM z dodatkowymi 10%  FBS (Sigma-Aldrich) oraz 100  jednostek/ml Penicylina-Streptomycyna (Gibco).
Obudowa klatkaLaboratorium OKOSilnik H201Element inkubatora mikroskopowego stage-top
Mikroskop odwrócony epi-fluorescencjiOlympusZobacz materiał IX83
Absolutny etanolSinopharm powiedział:10009218
Surowica bydlęca płoduSigmaF8318 powiedział:
Koraliki fluorescencyjne, 0,1 μ L, czerwony (580/605)ThermoZobacz materiał F8801 powiedział:
Komora gazowaLaboratorium OKOH201-PRIOR-SP200/400/600Element inkubatora mikroskopowego stage-top
Ręczny mieszalnik gazuLaboratorium OKOMIKSER 2GFElement inkubatora mikroskopowego stage-top
Geneticin (Genetyka)Gibco (firma Gibco)10131027GFP– aktyna i H1– GFP MDCK utrzymywano przy użyciu pożywek z dodatkiem 0,5 i cienkich mg/ml genetycyny (Gibco) w celu podtrzymania ekspresji genów
HEPESYSigma736459
IzopropanolSinopharm powiedział:80109218
Chusteczki KimwipesKimberly-Clark ProfesjonalistkaLH-70155Wycieraczka laboratoryjna
Dłuższa śruba--Niklowana śruba maszynowa z okrągłym, M3 x 10 mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n
Złącze mikroprzepływowe--Złączka prosta z polipropylenu, 1/16"-10-32UNF. https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=16&detail_redpacket_pop=true&id=555839592609<k2=1752310108435i7ldxj7ekdgu9qhnphlmj&ns=1&priceTId=2150470617523101021033708e1a4b&query=10-32unf%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E7%9B%B4%E9%80%9A%E6%8E%A5%E5%A4%B4%20%E5%A1%91%E6%96%99%E5%A4%96%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E6%8E%A5%E5%A4%B4&skuId=3600497427939&spm=a21n57.1.hoverItem.1&utparam=%7B%22aplus_abtest%22%3A%2245243a364caf5527e8392ded0656451a%22%7D&xxc=taobaoSearch
Uchwyt na płytki wielodołkoweLaboratorium OKOH201-MW-UCHWYT-NZ500Element inkubatora mikroskopowego stage-top
N',N'-metylenobisakrylamid, 2%Sigma110269Toksyczny
NOA 73 (wersja angielska)Produkty Norland17-345Klej utwardzany promieniami UV
Penicylina-Streptomycyna, PS (10 000 U/ml)Gibco (firma Gibco)15140122
szalka Petriego (150 mm i ostra 25 mm)Corning430599Odporność na co najmniej 80 stopni; C przez 2 h
Narzędzie Pico PlasmaDiener Electronic GmbH + Co. KGPlazma PicoDo obróbki plazmą O2
Czyścik plazmowyPlazma HarrickaPDC-002 (wersja CDC-002)Do obróbki plazmą powietrzną
Naczynie plastikowe (średnica 60 mm, wysokość 15 mm)Gniazdo705001
Elektrody platynoweTianjin Aida HengshengPt005 powiedział:Średnica 0,5 mm, długość 37 mm 
Rain-X Oryginalny Szklany WodoodpornyProdukty chemiczne ITW800002242
Szkiełko nakrywkowe prostokątneLotnisko Marienfeld0107222  1,5 godziny, 24 i ostre; 50 mm2, 170 &MU; m grubości
Szkiełko nakrywkowe okrągłe szklaneLotnisko Marienfeld0111500  1,5H, okrągły o średnicy 10 mm
Krótsza śruba--Niklowana śruba maszynowa z okrągłym, M3 x 4 mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n
Sulfo-SANPAH, bez masyThermoNumer telefonu A35395Roztwór podstawowy SS: 20 mg/ml w bezwodnym DMSO, 2 μ L dla każdego; Roztwór roboczy SS: 0,5 mg/ml SS w HEPES (0,1 M, pH 7,4).
SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow CorningH052KCM147Produktem końcowym jest polidimetylosiloksan, PDMS. Ten zestaw zawiera podstawową żywicę PDMS i środek sieciujący. 
Jednostka temperaturyLaboratorium OKOH201-T-UNIT-BLElement inkubatora mikroskopowego stage-top
Tetrametyloetylenodiamina, TEMEDSigma110189Toksyczny
Wyświetlacz z ekranem dotykowymLaboratorium OKOOKO-TOUCHElement inkubatora mikroskopowego stage-top
Tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo-1-trichlorosilanSigma78560459
Trypsyna-EDTA (0,25%)Certyfikat Gibco25200072
Rurki TygonTygonAJK00002Średnica zewnętrzna (OD) = 3,2 mm, Średnica wewnętrzna (ID) = 1,6 mm
UltradźwiękowaWsparcieKD-300DE
Maszyna do utwardzania UV LEDGHUVGHS-MFLGŹródło światła UV-LED, zakres emisji: 363– 370 nm, maksymalna gęstość mocy: 230 mW/cm2
Moduł nawilżający bez wibracjiLaboratorium OKOHM-VFElement inkubatora mikroskopowego stage-top
Widok VisiviewVisitron Systems GmbH-Obrazowanie bardziej miękkich wyrobów
Warstwa wafla1Narodowy Uniwersytet Singapuru, zakład mikrofabrykacji Instytutu Mechanobiologii-Wafel jest wykonywany na zamówienie, a projekt nawiązuje do materiału dodatkowego.
Warstwa wafla2Narodowy Uniwersytet Singapuru, zakład mikrofabrykacji Instytutu Mechanobiologii-Wafel jest wykonywany na zamówienie, a projekt nawiązuje do materiału dodatkowego.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alberts, B., et al. Molecular biology of the cell. , 4th ed, Garland Science. New York. (2002).
  2. Cogan, S. F. Neural stimulation and recording electrodes. Annu Rev Biomed Eng. 10 (1), 275-309 (2008).
  3. Zhao, M., et al. Electrical signals control wound healing through PI3K-γ and PTEN. Nature. 442 (7101), 457-460 (2006).
  4. Saw, T. B., et al. Transepithelial potential difference governs wound healing by electromechanics. Nat Phys. 18 (9), 1122-1128 (2022).
  5. Ferreira, F., Moreira, S., Zhao, M., Barriga, E. H. Stretch-induced collective cell migration in vivo. Nat Mater. 24, 452-470 (2025).
  6. Kennard, A. S., Theriot, J. A. Osmolarity-independent electrical response to injury in zebrafish epidermis. Elife. 9, 62386(2020).
  7. Allen, G. M., Mogilner, A., Theriot, J. A. Electrophoresis of keratocyte galvanotaxis. Curr Biol. 23 (7), 560-568 (2013).
  8. Levin, M., Thorlin, T., Robinson, K. R., Nogi, T., Mercola, M. Early step in left-right patterning. Cell. 111 (1), 77-89 (2002).
  9. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of surface electrical currents with a vibrating probe. Nat Protoc. 2 (3), 661-669 (2007).
  10. Metcalf, M. M., Shi, R., Borgens, R. B. Endogenous ionic currents in embryos. J Exp Zool. 268 (4), 307-322 (1994).
  11. Barratt, L., Rector, F., Kokko, J., Seldin, D. Factors governing the Journal of Clinical Investigation. J Clin Invest. 53 (2), 454-464 (1974).
  12. Zhao, M., et al. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Semin Cell Dev Biol. 20 (6), 674-682 (2009).
  13. Barker, A., Jaffe, L., Vanable, J. Jr The glabrous epidermis in integrative and comparative physiology. Am J Physiol Integr Comp Physiol. 242 (3), R358-R366 (1982).
  14. Sun, Y., et al. Infection-generated electric field in gut epithelium guides migration of macrophages. PLoS Biol. 17 (4), e3000044(2019).
  15. Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. A galvanotaxis assay in a microfluidic culture device. J Vis Exp. (68), e4193(2012).
  16. Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and in vivo. Nat Protoc. 2 (6), 1479-1489 (2007).
  17. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions of cell signaling. J Cell Sci. 122 (23), 4267-4276 (2009).
  18. Meng, X., et al. PI3K-mediated electrotaxis of embryonic and adult fibroblasts exposed to physiological electric fields. Exp Neurol. 227 (1), 210-217 (2011).
  19. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
  20. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  21. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  22. Stoecklin, C., et al. A new approach to design artificial 3D microenvironmental and rheological cues. Adv Biosyst. 2 (7), 1700237(2018).
  23. Khoo, B. L., et al. Expansion of patient-derived circulating tumor cells in a microfluidic culture device. Nat Protoc. 13 (1), 34-58 (2018).
  24. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Methods Cell Biol. 47, 11-16 (2010).
  25. Choudhury, M. I., et al. Kidney epithelial cells are active mechanosensors that drive physiological fluid pumps. Nat Commun. 13 (1), 2317(2022).
  26. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  27. Roy, B., et al. Fibroblast rejuvenation by mechanical reprogramming in the National Academy of Sciences. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (19), 10131-10141 (2020).
  28. Tao, J., et al. Mechanical compression creates a quiescent muscle stem cell niche. Commun Biol. 6 (1), 43(2023).
  29. Iberite, F., Gruppioni, E., Ricotti, L. Skeletal muscle differentiation: Perspectives and challenges. NPJ Regen Med. 7 (1), 23(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Stymulacja polem elektrycznympotencja transepithelialnyproliferacja kom rekekstruzja kom rekel poliakrylamidowymikroskopia konfokalnamikroskopia si trakcyjnych

Powiązane artykuły