Artykuł metodologiczny

Rozwarstwienie tkanek twarzoczaszki danio pręgowanego po zabarwieniu błękitem alcyjskim

DOI:

10.3791/68900

⸱

12 września 2025

 , 
1Tata Institute of Fundamental Research

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół przedstawia prostą i łatwą do wykonania procedurę barwienia i preparowania chrząstek twarzoczaszki u 5-dniowej larwy danio pręgowanego. Może być używany do badania anatomii, kształtu i wielkości tych struktur w różnych warunkach rozwojowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany, ze względu na swoją przezroczystość optyczną, jest doskonałym modelem kręgowców do badania mechanizmów, za pomocą których chrząstki twarzoczaszki tworzą się w zarodku. Chrząstki twarzoczaszki można ogólnie podzielić na dwie grupy, neuroczaszkę i trzewiowoczaszkę, które z kolei można podzielić na liczne grupy chrząstek niezbędnych do podtrzymania mózgu i stanowiących między innymi aparat żywieniowy i oddechowy. Protokół ten najpierw opisuje prostą i ustaloną procedurę barwienia u danio pręgowanego w celu wizualizacji tych grup chrząstek, a następnie metodologię preparowania i oddzielania neuro i trzewności. Z tych sekcji można łatwo uzyskać proste wskaźniki kształtu i wielkości, a w tym protokole wykazano to dla podniebienia, które jest częścią przedniej neurokraniu, tkanki często dotkniętej większością zaburzeń twarzoczaszki u ludzi. Protokół można powielić w prosty sposób nawet w warunkach ograniczonych zasobów, zapewniając w ten sposób cenne narzędzie edukacyjne dla studentów studiów licencjackich, aby zapoznać się z morfologią twarzoczaszki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chrząstka twarzoczaszki u kręgowców wyłania się z multipotencjalnej populacji komórek zwanej komórkami grzebienia nerwowego czaszki1. Komórki te są najpierw określane na grzbietowych brzegach płytki nerwowej we wczesnych zarodkach, które następnie migrują na duże odległości, aby dotrzeć do obszaru twarzoczaszki i łuków gardłowych przed różnicowaniem 2,3. Mechanizmy sygnalizacyjne, które napędzają tę migrację i różnicowanie, są w dużej mierze zachowane wśród kręgowców 4,5. Mimo to organizacja, rozmiar i kształt poszczególnych elementów chrząstki są różne u różnych gatunków, co prowadzi do różnych morfologii twarzoczaszki6. W szczególności danio pręgowany stał się potężnym systemem modelowym do badania morfogenezy twarzoczaszki, biorąc pod uwagę przezroczystą naturę zarodków aż do stadium larwalnego. Stosując proste procedury barwienia do oznaczania chrząstki, scharakteryzowano morfologię wielu struktur twarzoczaszki u danio pręgowanego w różnych perturbacjach szlaków sygnałowych 7,8,9, a także gdy zarodki lub larwy są narażone na powszechne zanieczyszczenia obecne w środowisku10. Opisane tutaj barwienie błękitem alcyjskim do oznaczania chrząstki polega na użyciu warunków niekwaśnych standaryzowanych przez Walkera i Kimmela11, które zostały następnie wykorzystane przez wiele laboratoriów danio pręgowanego pracujących nad rozwojem twarzoczaszki 5,12,13,14,15,16,17,18,19 , w tym opis użytkowania w środowisku licealnym20. Barwienie bezkwasowe zachowuje struktury kostne w stanie nienaruszonym, co pozwala na barwienie chrząstki i kości razem za pomocą odpowiednio błękitu Alcian i czerwieni alizarynowej. Brakuje jednak szczegółowego protokołu barwienia, a także przeprowadzania precyzyjnego preparowania chrząstek twarzoczaszki, zwłaszcza w celu pomocy w podejmowaniu takich badań w warunkach ograniczonych zasobów.

Mimo że struktura szkieletu twarzy u dorosłego danio pręgowanego jest dość złożona, składa się z 43 kości pochodzących z chrząstki21, chrząstka twarzoczaszki u larwy w 5 dni po zapłodnieniu (dpf), która właśnie nabyła zdolność żerowania, jest stosunkowo prosta i można ją szeroko podzielić na neurokranium grzbietowe i brzuszne trzewnoczaszkowe4. Struktury te wspierają mózg, przyczyniają się do pracy aparatu żywieniowego i dają początek chrząstkom podtrzymującym tkanki skrzelowe. Opisany tutaj protokół pozwoli na barwienie chrząstek danio pręgowanego błękitem Alciana, a następnie szczegółową procedurę preparowania neuro i trzewiowoczaszki na odrębne struktury, co ostatecznie umożliwi dokładną charakterystykę kształtu i wielkości różnych chrząstek w tych strukturach. Na przykład mierzymy wymiary przedniego odcinka podniebienia (podniebienie) zwanego płytką sitową, która jest częścią neuroczaszki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury utrzymania danio pręgowanego i procedury eksperymentalne zastosowane w tym badaniu zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyki zwierząt, vide odniesienie TIFR/IAEC/2023-1.

1. Przygotowanie odczynnika

  1. Nośniki E3:
    1. Przygotuj 50x bulion 1 mieszając 3,25 g dwuzasadowego fosforanu sodu (0,458 mM Na2HPO4), 0,29 g diwodorofosforanu potasu (0,042 mM KH2PO4), 11,93 g chlorku sodu (4,084 mM NaCl) i 0,48 g chlorku potasu (0,128 mM KCl) w 1 l wody destylowanej.
    2. Przygotuj 50x stock 2 mieszając 2,43 g chlorku wapnia (0,33 mM CaCl2) i 4,07 g siarczanu magnezu (0,33 mMMgSO4) w 1 l wody destylowanej.
    3. Aby przygotować 500 ml pożywki 1x E3, do 480 ml wody destylowanej, dodaj po 10 ml z podstawowych 1 i 2 (pH = 7,4).
      UWAGA: Podczas przygotowywania tych roztworów należy nosić rękawice.
  2. 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami):
    1. Podgrzej 100 ml 1x PBS w temperaturze 68 °C. Dodać 4 g PFA i inkubować roztwór w temperaturze 68 °C z okresowym mieszaniem, aż do całkowitego rozpuszczenia PFA.
      UWAGA: Podczas przygotowywania tego odczynnika należy nosić rękawice i maskę, najlepiej pod wyciągiem, ponieważ PFA jest wysoce toksyczny.
  3. 0,05% roztwór MS-222 (powszechnie znany jako trikaina):
    1. Przygotuj 4% wywaru z tricainy w E3 i przechowuj w temperaturze 4 °C. Aby przygotować 10 ml bulionu tricaine, dodaj 0,40 g MS-222 do 7 ml E3. Delikatnie wstrząsnąć probówką z roztworem, aby wymieszać i uzupełnić objętość do 10 ml. Aby przygotować 50 ml 0,05% roztworu tricainy, dodaj 625 μl 4% bulionu do 49,375 ml E3.
      UWAGA: Podczas przygotowywania tego odczynnika należy nosić rękawiczki i maskę.
  4. 0,4% roztwór podstawowy błękitu alcyjskiego w 70% etanolu
    1. Aby przygotować 2 ml roztworu podstawowego, rozpuścić 8 mg błękitu alcian w 1 ml 50% etanolu. Podgrzewać roztwór w temperaturze 37 °C przez 15-20 minut z okresowym mieszaniem w celu rozpuszczenia. Gdy plama się rozpuści, uzupełnić roztwór do 70% etanolu, dodając 900 μl 100% etanolu i 100 μl wody destylowanej.
      UWAGA: Roztwór podstawowy można przechowywać w temperaturze pokojowej do 2 tygodni.
  5. Roztwór barwie - 0,02% błękitu alckiego, 200 mM chlorku magnezu (MgCl2) i 70% etanolu
    1. Aby przygotować 5 ml roztworu niebieskiej plamy Alcian, dodaj 1 ml 1 M MgCl2, 3,5 ml 100% etanolu i 250 μl 0,4% bulionu błękitu alkijskiego (8 mg błękitu alcyjskiego w 2 ml 70% etanolu) do 250 μl wody i dobrze wymieszaj.
      UWAGA: Przygotuj świeży roztwór do barwienia, aby uzyskać najlepsze rezultaty barwienia.
  6. Roztwór wybielacza:
    1. Wymieszać równe objętości 3% nadtlenku wodoru (H2O2) i 2% wodorotlenku potasu (KOH). Aby przygotować 2 ml roztworu wybielacza, wymieszaj 1 ml 3% nadtlenku wodoru i 1 ml 2% wodorotlenku potasu.
      UWAGA: Przygotuj ten roztwór na świeżo przed rozpoczęciem tego kroku. PonieważH2O2jest wrażliwy na światło, należy go w miarę możliwości chronić przed wystawieniem na działanie światła. Nosić rękawice podczas obchodzenia się zH2,O2 i KOH.
  7. Roztwór I: 20% glicerolu + 0,25% KOH
    UWAGA: Ponieważ glicerol jest bardzo lepki, należy ostrożnie pipetować. Podczas przygotowywania tych roztworów należy nosić rękawiczki.
    1. Aby przygotować 5 ml roztworu I, dodaj 2 ml 50% glicerolu i 625 μl 2% KOH do 2,375 ml wody i dobrze wymieszaj.
  8. Roztwór II: 50% glicerolu + 0,25% KOH
    1. Aby przygotować 5 ml roztworu II, dodaj 3,570 ml 70% glicerolu i 625 μl 2% KOH do 805 μl wody i dobrze wymieszaj.
  9. Roztwór do przechowywania: 50% glicerol + 0,1% KOH
    1. Aby przygotować 5 ml roztworu do przechowywania, dodaj 3,570 ml 70% glicerolu i 250 μl 2% KOH do 1,180 ml wody i dobrze wymieszaj.
  10. 3% agarozy
    1. Rozpuść 3 g agarozy w 100 ml wody destylowanej. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej, aż roztwór stanie się klarowny.
  11. 0,1% PBST (0,1% Animacja 20 w 1x PBS)
    1. Aby przygotować 1 l 1x PBS, dodaj 8 g NaCl, 0,20 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 i 0,24 g KH2PO4 w 1,000 ml wody destylowanej. Wymieszać roztwór i dostosować pH do 7,4. Aby uzyskać 500 ml 0,1% PBST, dodaj 5 ml 10% Tween 20 do 495 ml 1x PBS.
  12. 0,50 μg/ml roztworu DAPI
    1. Przygotuj 10 mg / ml bulionu DAPI w 1x PBS. Aby przygotować 10 ml 0,50 μg/ml roztworu DAPI, dodaj 0,50 μl bulionu do 10 ml 1x PBS i energicznie wstrząśnij, aby upewnić się, że DAPI całkowicie się rozpuści.
      UWAGA: Podczas przygotowywania tych roztworów należy nosić rękawice. Chroń DAPI przed światłem, ponieważ jest wrażliwy na światło. Zapas DAPI może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez ponad rok.

2. Pobieranie zarodków

  1. Ustaw pary samców i samic danio pręgowanego w zbiornikach hodowlanych wieczorem przed potrzebnymi zarodkami, przy czym samce i samice ryb są oddzielone barierami.
  2. Usuń bariery następnego ranka i zbierz zarodki w ciągu 15-20 minut po usunięciu barier.
    UWAGA: Czas usunięcia bariery jest pomocny w inscenizacji zarodków i larw danio pręgowanego.
  3. Hodować zarodki w temperaturze 28,5 °C, aż osiągną 5 dpf.
    UWAGA: Pamiętaj, aby wymieniać nośnik E3 na nową partię podgrzanego E3 w temperaturze 28.5 °C raz na 2 dni.

3. Barwienie niebieskim alkijskim

UWAGA: Podczas wykonywania tego eksperymentu noś rękawiczki

  1. Znieczulij 20-25 5-dniowych larw danio pręgowanego za pomocą 0,05% trikainy w probówce do mikrowirówki (MCT) o pojemności 2 ml.
  2. Po tym, jak larwy przestaną się poruszać, co zwykle trwa ~ 4-5 minut, usuń środek znieczulający i umieść je w 1,5 ml 4% PFA w temperaturze pokojowej (RT) na bujaku przy 60 obr./min przez 2 godziny.
  3. Usunąć jak najwięcej utrwalacza za pomocą pipety i dodać 1,5 ml 50% etanolu do próbki. Inkubuj przez 10 minut, kołysząc się z prędkością 60 obr./min przy RT.
  4. Usuń jak najwięcej etanolu za pomocą pipety i dodaj 1,5 ml roztworu niebieskiej plamy Alcian.
  5. Utrwalone larwy należy inkubować w roztworze barwienia przez 18-20 godzin na bujaczku przy 60 obr./min przy temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Inkubacja przez krótszy lub dłuższy czas może prowadzić do tego, że niektóre obszary chrząstki są odpowiednio niedobarwione lub nadmiernie przebarwione. W tym przypadku 18-20 godzin barwienia wydawało się działać najlepiej dla wyraźnej wizualizacji neuro i trzewiowoczaszki 5-dniowej larwy.
  6. Usuń roztwór plamy, dodaj 1,5 ml wody destylowanej i inkubuj przez 1-2 minuty na bujaczku w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Barwienie można zatrzymać na tym etapie, aby uwidocznić granice komórek w wypreparowanych chrząstkach. Jednak wadą zatrzymania protokołu barwienia na tym etapie bez wykonania kolejnych kroków oczyszczania jest to, że granice neuro i trzewiowoczaszki nadal pozostaną lekko rozmyte, a precyzyjne wykonanie sekcji staje się trudniejsze.
  7. Dodać 1 ml roztworu wybielacza do próbki i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej na otwartym powietrzu, bez przykrycia płytki lub studzienek.
    UWAGA: Nie zakrywaj MCT na tym etapie, ponieważ reakcja między nadtlenkiem wodoru a wodorotlenkiem potasu wytwarza gazowy tlen, który może spowodować pęknięcie pokrywy po zamknięciu.
  8. Usuń roztwór wybielacza i wykonaj następujące kroki oczyszczania tkanek.
    1. Dodać 1,5 ml roztworu I do próbki i trzymać na kołysce z prędkością 60 obr./min przez 40 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Usunąć roztwór I i dodać 1,5 ml roztworu II do próbki i trzymać na kołysce z prędkością 60 obr./min przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Etapy oczyszczania pomagają usunąć nadmiar plamy, poprawiając przejrzystość optyczną próbek, a tym samym pomagając w efektywnym przeprowadzaniu sekcji. Z próbkami należy obchodzić się ostrożnie podczas zmiany roztworów, ponieważ wszelkie uszkodzenia mogą wpłynąć na przyszłą analizę ich morfologii.
  9. Usunąć roztwór II i dodać 1,5-2 ml roztworu do przechowywania. Ze względu na obecność glicerolu wybarwione próbki stopniowo opadają na dno w ciągu 10 minut.
    UWAGA: Barwione próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez ponad rok.

4. Rozwarstwienie szkieletu twarzoczaszki

  1. Rozpuść 3% roztwór agarozy w kuchence mikrofalowej, aż roztwór stanie się klarowny.
    UWAGA: Nie przegrzewać, ponieważ roztwór może wypłynąć z kolby. Podczas wykonywania tego kroku dokładnie sprawdź rozwiązanie.
  2. Pokryj szalkę Petriego o średnicy 90 mm 3% agarozą, wlewając stopioną agarozę do momentu, aż jedna trzecia głębokości szalki Petriego zostanie pokryta i pozwól jej zastygnąć. Na tej szalce Petriego zostaną przeprowadzone sekcje.
    UWAGA: Szalki Petriego z powłoką agarozową można przygotować z tygodniowym wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze 4 °C. Powłoka agarozowa zapewnia bardziej miękkie podłoże, na którym można przeprowadzić sekcje bez uszkadzania kleszczy.
  3. Oczyść kleszcze, które mają być używane, 70% etanolem i wytrzyj je czystym kawałkiem standardowej bibułki laboratoryjnej.
  4. Za pomocą pipety Pasteura przenieś 3-4 barwione larwy wraz z 0,5 ml roztworu do przechowywania na pokrytą agarozą szalkę Petriego.
    UWAGA: Rozwiązanie do przechowywania zapewnia większą przejrzystość optyczną podczas wykonywania sekcji w porównaniu do wykonywania tego samego w E3.
  5. Ustaw poplamioną larwę na jej bocznej stronie (ryc. 1A) i ostrożnie zeskrob żółtko z ciała larwy za pomocą kleszczy
    UWAGA: Rycina 1B przedstawia zarodek, z którego usunięto żółtko. Dobrą praktyką jest przeniesienie zeskrobanego z żółtka zarodka na nową szalkę Petriego przed przystąpieniem do dalszych etapów sekcji, tak aby unosząca się wokół lepka masa żółtka nie przeszkadzała w rozbiorze.
  6. Po usunięciu żółtka chwyć larwę za ogon jednym kleszczem, a drugą użyj do ostrożnego usunięcia oczu.
    UWAGA: Rycina 1C przedstawia zarodek z usuniętym żółtkiem i oczami. Oczy należy usuwać z zachowaniem ostrożności, ponieważ ich bliskość do szkieletu twarzoczaszki może przeszkadzać w ich rozwarstwieniu.
  7. Za pomocą kleszczy ostrożnie pociągnij i uszczypnij mózg i inne tkanki grzbietowe do neurokraniumu. Przytrzymaj larwę nieruchomo jedną parą kleszczy i użyj drugiej pary kleszczy, aby wykonać nacięcie pośrodku (ryc. 1C, czerwona strzałka), a następnie ściskać tkanki (ryc. 1D).
    UWAGA: Podczas wykonywania tego kroku należy zachować ostrożność przy usuwaniu tkanek bliżej najbardziej wysuniętych do przodu obszarów neuroczaszki, ponieważ chrząstka może odpaść wraz z nimi.
  8. Oddziel głowę larwy od reszty ciała. Obszar głowy po tym etapie zawiera przede wszystkim neurokranium i trzewiowoczaszkę połączone ze sobą w dwóch punktach - na przednim i tylnym końcu - wraz z kilkoma małymi niebarwionymi tkankami przyczepionymi do tych struktur twarzoczaszki (ryc. 1E).
    UWAGA: Trudno jest całkowicie usunąć niezabarwione tkanki bezpośrednio przyczepione do neurokranium i trzewiowoczaszki. Nawet jeśli niektóre szczątkowe tkanki będą obecne, ich obecność nie wpłynie na żadną dalszą analizę kształtu lub rozmiaru, ponieważ są one niebarwione.
  9. Ostrożnie przeciąć dwa połączenia między neuroczaszką a trzewiowoczaszką, aby je rozdzielić (ryc. 1F, czerwone przerywane linie). Na rycinie 2 przedstawiono obrazy neuroczaszki i trzewiowoczaszki, zarówno w nienaruszonych, jak i wypreparowanych zarodkach.
  10. Na czystym szkiełku podstawowym dodaj kroplę lub dwie 100% glicerolu. Za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś wypreparowaną neuroczaszkę lub trzewiowoczaszkę na ten szkiełko. Użyj kleszczyków, aby delikatnie umieścić szkiełko nakrywkowe na tych tkankach, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki, i uszczelnij szkiełko nakrywkowe na wszystkich szkiełkach lakierem do paznokci.
    UWAGA: Szkiełka te można przechowywać w temperaturze 4 °C przez ponad rok bez utraty plamy.

5. Kwantyfikacja wymiarów płytki sitowej

  1. Uzyskaj obrazy podniebienia za pomocą kamery dołączonej do mikroskopu stereoskopowego (ryc. 2D). W przypadku braku kamery klasy naukowej podłącz standardowy smartfon do mikroskopu stereoskopowego, aby uzyskać obrazy.
  2. W celu określenia ilościowego załaduj obraz podniebienia do FIJI22, a następnie użyj narzędzia linii, aby zmierzyć szerokość i wysokość płytki sitowej w mikronach (patrz rysunek 3A-C) i określić wymiary za pomocą rozdzielczości pikseli kamery.
  3. Narysuj kontur wokół płytki sitowej i kliknij Analizuj | Ustawianie pomiarów | obszar, aby uzyskać obszar płytki sitowej (ryc. 3D,E).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szkielet twarzoczaszki danio pręgowanego jest w pełni chrzęstny po 5 dniach od zapłodnienia (dpf), a zatem może być barwiony przy użyciu błękitu alcyjskiego, który jest podstawowym barwnikiem zdolnym do wiązania się z glikozaminoglikanami obecnymi obficie w chrząstkach23. Powoduje to, że chrząstka jest zabarwiona na niebiesko (ryc. 1), dzięki czemu można ją odróżnić od innych tkanek obecnych w larwie za pomocą standardowego mikroskopu stereoskopowego dostępnego w więk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wady rozwojowe twarzoczaszki stanowią większość wszystkich wad wrodzonych u ludzi, często prowadząc do śmiertelności niemowląt. Jednak etiologia leżąca u podstaw większości anomalii twarzoczaszki pozostaje do wyjaśnienia25. Struktury twarzoczaszki są złożone u każdego kręgowca, a z perspektywy studiów licencjackich pierwszym wymogiem jest zatem posiadanie narzędzia edukacyjnego, które zapewnia studentom ogólny przegląd odrębnych struktur w okolicy twarzoczaszki. Jednak dostęp do zarodka ssaków w t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Kalidasowi Kohale'owi i jego zespołowi za utrzymanie obiektu rybackiego. SRN przyjmuje do wiadomości wsparcie finansowe ze strony Departamentu Energii Atomowej (DAE), rządu Indii (nr identyfikacyjny projektu. RTI4003, DAE OM nr 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 z dnia 11.02.2020 r.), program Max Planck Society Partner Group (M.PG. A MOZG0010) oraz grant na badania nad start-upami Rady ds. Badań Naukowych i Inżynieryjnych (SRG/2023/001716). Dziękujemy dr Shweta Verma z laboratorium za wnikliwe komentarze. Dziękujemy Swetha Nagarajan i Upal Chatterjee za pomoc w wykonaniu rycin do rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarozyNauki biologiczne Lonza50004Do powlekania szalek Petriego
Niebieski alcki 8G Sigma-AldrichSamolot A3157Do barwienia chrząstek
Chlorek wapnia dwuwodnySigma-Aldrich12022Do wykonywania
KameraOlympusZobacz materiał DP28Do pozyskiwania obrazów
DAPI (interfejs DAPI)Roche Nauki Przyrodnicze10236276001Do znakowania jąder
EtanolHoneywell32221Rozpuszczalnik do barwienia błękitu alcyjskiego
FIDŻIWersja: ImageJ 1.54f
KleszczeDumontDumontDo wykonywania sekcji
GlicerolMP biomedycyna193996Do wykonywania mycia i montażu próbek 
Nadtlenek wodoruMP biomedycyna194057Do sporządzania roztworu wybielacza
Chlorek magnezu sześciowodnySARD Nauki biologiczneSBRC0217Do wykonywania
Siarczan magnezu siedmiowodnySigma-AldrichZobacz materiał M2773Do wykonywania
MS-222 (Trikaina)Sigma-AldrichCiągnik hamulcowy A5040Do znieczulania larw
Chlorek potasuSigma-AldrichZobacz materiał P9541 powiedział:Do wykonywania
Wodorotlenek potasuSigma-Aldrich484016Do wykonywania
Fosforan potasu jednozasadowySigma-AldrichZobacz materiał P0662Do wykonywania
Chlorek soduSigma-AldrichS3014 powiedział:Do wykonywania
Fosforan sodu dwuzasadowySigma-Aldrich71640Do wykonywania
StereoskopOlympusSZX61Do wykonywania sekcji
Tween-20 (Kanał Telewizyjny)HIMEDIAZobacz materiał TC287Detergent stosowany do komórek przepuszczalnych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Establishing neural crest identity: a gene regulatory recipe. Development. 142 (2), 242-257 (2015).
  2. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Dev Dyn. 249 (1), 88-111 (2020).
  3. Hammond, N. L., Dixon, M. J. Revisiting the embryogenesis of lip and palate development. Oral Dis. 28 (5), 1306-1326 (2022).
  4. Mork, L., Crump, G. Zebrafish craniofacial development: a window into early patterning. Craniofacial development. Yang, C. , Academic Press. 235-269 (2015).
  5. Swartz, M. E., SheehanRooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
  6. Selleri, L., Rijli, F. M. Shaping faces: genetic and epigenetic control of craniofacial morphogenesis. Nat Rev Genet. 24 (9), 610-626 (2023).
  7. Beaty, T. H., et al. Evidence for geneenvironment interaction in a genome wide study of nonsyndromic cleft palate. Genet Epidemiol. 35 (6), 469-478 (2011).
  8. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat Rev Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
  9. Reynolds, K., Kumari, P., Sepulveda Rincon, L., Gu, R., Ji, Y., Kumar, S., Zhou, C. J. Wnt signaling in orofacial clefts: crosstalk, pathogenesis and models. Dis Model Mech. 12 (2), dmm037051(2019).
  10. Raterman, S. T., Metz, J. R., Wagener, F. A. D. T. G., Von den Hoff, J. W. Zebrafish models of craniofacial malformations: interactions of environmental factors. Front Cell Dev Biol. 8, 600926(2020).
  11. Walker, M., Kimmel, C. A twocolor acidfree cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
  12. Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat Genet. 40 (3), 290-298 (2008).
  13. Melvin, V. S., Feng, W., HernandezLagunas, L., Artinger, K. B., Williams, T. A morpholinobased screen to identify novel genes involved in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 242 (7), 817-831 (2013).
  14. Spoorendonk, K. M., Hammond, C. L., Huitema, L. F. A., Vanoevelen, J., SchulteMerker, S. Zebrafish as a unique model system in bone research: the power of genetics and in vivo imaging. J Appl Ichthyol. 26, 219-224 (2010).
  15. Farmer, D. T., et al. A comprehensive series of Irx cluster mutants reveals diverse roles in facial cartilage development. Development. 148 (16), dev197244(2021).
  16. Rochard, L., Monica, S. D., Ling, I. T. C., Kong, Y., Roberson, S., Harland, R., Halpern, M., Liao, E. C. Roles of Wnt pathway genes wls, wnt9a, wnt5b, frzb and gpc4 in regulating convergentextension during palate morphogenesis. Development. 143 (14), 2541-2547 (2016).
  17. Liu, S., Narumi, R., Ikeda, N., Morita, O., Tasaki, J. Chemicalinduced craniofacial anomalies caused by disruption of neural crest cell development in a zebrafish model. Dev Dyn. 249 (7), 794-815 (2020).
  18. Zinck, N., FranzOdendaal, T. A. Accurate wholemount bone and cartilage staining requires acidfree conditions. Anat Rec. 304 (5), 958-960 (2021).
  19. Stenzel, A., et al. Distinct and redundant roles for zebrafish her genes during mineralization and craniofacial patterning. Front Endocrinol. 13, 1033843(2022).
  20. Tomasiewicz, H. G., Hesselbach, R., Carvan, M. J., Goldberg, B., Berg, C. A., Petering, D. H. Zebrafish as a model system for environmental health studies in the grad classroom. Zebrafish. 11 (4), 384-395 (2014).
  21. Cubbage, C. C., Mabee, P. M. Development of the cranium and paired fins in the zebrafish Danio rerio (Ostariophysi, Cyprinidae). J Morphol. 229 (2), 121-160 (1996).
  22. Schindelin, J. Fiji: an opensource platform for biologicalimage analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Tuckett, F., MorrissKay, G. Alcian Blue staining of glycosaminoglycans in embryonic material: effect of different fixatives. Histochem J. 20 (3), 174-182 (1988).
  24. Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140 (1), 76-81 (2013).
  25. Goodwin, A. F., et al. From bench to bedside and back: improving diagnosis and treatment of craniofacial malformations utilizing animal models. Craniofacial development. Yang, C. , Academic Press. 459-492 (2015).
  26. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196(2012).
  27. Ding, J., et al. Using alizarin Red staining to detect chemically induced bone loss in zebrafish larvae. J Vis Exp. (178), e63251(2021).
  28. Klingenberg, C. P., Barluenga, M., Meyer, A. Shape analysis of symmetric structures: quantifying variation among individuals and asymmetry. Evolution. 56 (10), 1909-1920 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Disekccja kraniofacialna ryb dop awnic Zebrafishbarwienie b kitem Alcianemchrz stka kraniofacialnadyssekcja neurokraniumdyssekcja wiscerokraniump ytka sitowamorfogeneza podniebieniamikroskopia arkusza wiat autlenianie tkanekanaliza obrazu

Powiązane artykuły