W badaniu tym przeanalizowano okołodobowe zmiany w uwalnianiu czynnika wzrostu z fibryny bogatopłytkowej (PRF) i zbadano korelacje z poziomem kortyzolu, w celu optymalizacji czasu procedur regeneracyjnych opartych na PRF.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Ocena okołodobowej zmienności czynników wzrostu fibryny bogatopłytkowej: badanie pilotażowe
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Fibryna bogatopłytkowa (PRF) ma szerokie zastosowanie kliniczne w stomatologii, szczególnie w regeneracji tkanek miękkich i twardych, gojeniu zębodołów poekstrakcyjnych, leczeniu wad przyzębia, augmentacji zatok szczękowych i zabiegach śluzówkowo-dziąsłowych. PRF jest biomateriałem bogatym w czynniki wzrostu pochodzenia płytkowego, wytwarzanym za pomocą jednoetapowego protokołu wirowania. Badanie to miało na celu ocenę, czy czynniki wzrostu pochodzące z PRF wykazują zmienność okołodobową między godzinami porannymi i wieczornymi. Wzięło w nim udział dwudziestu zdrowych ochotników, z których każdy dostarczył sześć próbek krwi żylnej, trzy o godzinie 08:00 i trzy o godzinie 20:00. Z każdego punktu czasowego używano jednej probówki do pełnej morfologii krwi, jednej do analizy kortyzolu w surowicy i jednej do przygotowania PRF (odwirowywano przy 708 x gprzez 12 minut). Czynniki wzrostu (IGF-1, PDGF, FGFR, VEGF, TGFβ-1) w PRF mierzono po 24 i 72 godzinach za pomocą testu ELISA. Ich poziomy porównano między punktami czasowymi i skorelowano z poziomem kortyzolu w surowicy. Poziomy FGFR były istotnie wyższe po 72 godzinach niż po 24 godzinach w próbkach wieczornych. Nie stwierdzono jednak istotnych różnic w przypadku IGF-1, PDGF, VEGF lub TGFβ-1 między ranem a wieczorem. Poziomy kortyzolu były ujemnie skorelowane z PDGF po 72 godzinach w próbkach porannych i z IGF-1 po 72 godzinach w próbkach wieczornych; Nie zaobserwowano jednak innych istotnych korelacji. Wyniki te sugerują, że czas pobrania krwi nie wpływa znacząco na zawartość czynnika wzrostu PRF, co wskazuje na elastyczność w protokołach klinicznych dotyczących czasu pobierania próbek.
Wprowadzenie
Fibryna bogatopłytkowa (PRF) to koncentrat płytkowy drugiej generacji, powszechnie stosowany w stomatologii regeneracyjnej ze względu na swoje autologiczne pochodzenie, łatwość przygotowania i zawartość biologicznie czynną1. Utworzony przez odwirowanie krwi pełnej bez antykoagulantów, PRF zapewnia macierz fibrynową bogatą w płytki krwi i leukocyty, które wydzielają czynniki wzrostu, takie jak płytkowy czynnik wzrostu (PDGF), transformujący czynnik wzrostu-beta 1 (TGF-β1), insulinopodobny czynnik wzrostu-1 (IGF-1), czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF) i receptor czynnika wzrostu fibroblastów (FGFr). Te biomolekuły odgrywają kluczową rolę w proliferacji komórek, angiogenezie, przebudowie macierzy zewnątrzkomórkowej i regeneracji tkanek2. W porównaniu z osoczem bogatopłytkowym (PRP), które wymaga antykoagulantów i aktywacji egzogennej, PRF jest wytwarzany w jednoetapowym, wolnym od antykoagulantów procesie, w wyniku którego powstaje fizjologiczne rusztowanie fibrynowe z uwięzionymi leukocytami i płytkami krwi. Architektura ta umożliwia wolniejsze, bardziej trwałe uwalnianie czynników wzrostu i cytokin, potencjalnie zwiększając stabilność rany i wczesną naprawę tkanek, jednocześnie zmniejszając złożoność obsługi i koszty 1,2. Co więcej, brak antykoagulantów i aktywatorów minimalizuje zmienność związaną z manipulacją i może lepiej zachować natywne zachowanie płytek krwi, oferując praktyczne korzyści do stosowania w gabinecie i standaryzacji u wszystkich operatorów2.
Pomimo powszechnego zastosowania klinicznego, dynamika czasowa bioaktywnych składników PRF pozostaje słabo poznana. Rytm okołodobowy, nieodłączny 24-godzinny cykl biologiczny, wpływa na różne układy fizjologiczne, w tym na funkcje odpornościowe, wydzielanie hormonów i parametry hematologiczne 3,4. Kortyzol, główny hormon okołodobowy, osiąga szczyt wczesnym rankiem i stopniowo spada w ciągu dnia5. Co ważne, badania wykazały, że aktywność płytek krwi, zdolność agregacji i liczba mogą być również modulowane przez mechanizmy okołodobowe, co ma wpływ na krzepnięcie i gojenie się ran6.
Ponieważ PRF pochodzi bezpośrednio z krwi obwodowej, okołodobowy czas pobierania krwi może potencjalnie wpływać na stan aktywacji płytek krwi i późniejsze uwalnianie czynników wzrostu podczas polimeryzacji fibryny. Chociaż dobowe różnice w liczbie płytek krwi i czynnikach wzrostu w osoczu bogatopłytkowym były wcześniej analizowane przez Aoto i wsp.7, nie ma badań systematycznie sprawdzających, czy PRF przygotowany o różnych porach dnia wykazuje mierzalne różnice w składzie czynnika wzrostu. Dlatego to badanie pilotażowe ma na celu zbadanie okołodobowej zmienności czynników wzrostu pochodzących z PRF poprzez porównanie próbek pobranych rano i wieczorem od zdrowych osób. Ponadto oceniliśmy poziom kortyzolu w surowicy w każdym punkcie czasowym i zbadaliśmy ich korelacje z uwalnianiem czynnika wzrostu PRF. Zrozumienie takiej zmienności czasowej może pomóc w optymalizacji protokołów klinicznych i przyczynić się do standaryzacji zabiegów regeneracyjnych opartych na PRF. Hipoteza zerowa tego badania polegała na tym, że okołodobowy czas pobierania krwi nie wpływa znacząco na stężenie czynników wzrostu uwalnianych z fibryny bogatopłytkowej (PRF); jednak w oparciu o znaną dobową regulację aktywności płytek krwi i wydzielania hormonów, początkowo postawiono hipotezę, że czas pobierania krwi (rano vs. wieczorem) może zmieniać zawartość czynnika wzrostu PRF. Z klinicznego punktu widzenia wyjaśnienie, czy zawartość czynnika wzrostu PRF jest wrażliwa na zmienność okołodobową, jest ważne dla standaryzacji protokołów regeneracyjnych. Jeśli uwalnianie czynnika wzrostu pozostaje w dużej mierze stabilne w ciągu dnia, klinicyści mogą być pewni, że czas nakłucia żyły może nie mieć znaczącego wpływu na wyniki leczenia, co pozwala na elastyczność w planowaniu zabiegów. I odwrotnie, jeśli pojawią się subtelne różnice w wybranych czynnikach, takich jak te zaangażowane w angiogenezę lub naprawę tkanek, czas pobierania krwi może być zoptymalizowany w przypadkach, gdy pożądany jest maksymalny potencjał regeneracyjny, na przykład w upośledzonych warunkach gojenia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Badanie przeprowadzono w Zakładzie Periodontologii Wydziału Stomatologii Uniwersytetu Çukurova w Adanie w Turcji z udziałem 20 zdrowych ochotników. Przed włączeniem do badania wszyscy uczestnicy zostali poinformowani o celu, metodologii i procedurach badania oraz uzyskano pisemną świadomą zgodę. Aprobata etyczna została przyznana przez Komisję Etyki Badań Klinicznych Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Çukurova (Zatwierdzenie nr: 125/55, Data: 16.09.2022). Wszystkie procedury, w tym podstawowe wytyczne dotyczące bezpieczeństwa biologicznego dotyczące obchodzenia się z ludzką krwią oraz instrukcje usuwania odpadów z materiałów niebezpiecznych biologicznie i odczynników chemicznych, zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi NIH-CDC8. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Wybór uczestników
Uczestnikami badania były osoby zdrowe w wieku od 18 do 25 lat, bez stwierdzonej choroby ogólnoustrojowej, które wykazały się odpowiednią współpracą podczas zabiegów. Z badania wykluczono osoby, które miały jakiekolwiek schorzenia ogólnoustrojowe, były w ciąży lub karmiły piersią lub stosowały jakiekolwiek leki lub środki hormonalne, które mogłyby wpływać na parametry hematologiczne lub hormonalne.
2. Pobieranie krwi i przydział do grup
Od każdego uczestnika pobrano łącznie sześć próbek krwi żylnej o pojemności 10 ml, trzy rano (08:00) i trzy wieczorem (20:00). W badaniu użyto sterylnych probówek PRF ze szkła bez dodatków (10 ml). W sesji porannej probówkę 1 użyto do pełnej morfologii krwi (CBC), probówkę 2 do analizy kortyzolu w surowicy, a rurkę 3 do przygotowania PRF, a następnie analizę czynnika wzrostu. W sesji wieczornej probówkę 4 użyto do morfologii krwi, probówkę 5 do analizy kortyzolu w surowicy, a rurkę 6 do przygotowania PRF i analizy czynnika wzrostu. Na podstawie czasu pobrania krwi próbki podzielono na dwie grupy: grupa 1 składała się z czystego PRF przygotowanego z krwi porannej (08:00), a grupa 2 składała się z czystego PRF przygotowanego z krwi wieczornej (20:00).
3. PRF przygotowanie
Próbki krwi odwirowywano przy 708 x g przez 12 minut w temperaturze pokojowej za pomocą wirówki wyposażonej w rotor o stałym kącie nachylenia 40° i szklane probówki o pojemności 10 ml. Zastosowane urządzenie miało regulowany promień wirnika w zakresie od 88 mm do 110 mm; W tym badaniu wybrano promień 88 mm w celu standaryzacji protokołu. Podczas zabiegu nie stosowano żadnych leków przeciwzakrzepowych. Po odwirowaniu otrzymane PRF poddano makroskopowej ocenie w celu zapewnienia prawidłowego formowania, które charakteryzuje się gładką i jednorodną powierzchnią, elastycznym i cylindrycznym kształtem oraz zwartą, zwartą konsystencją.
4. Analiza ELISA czynnika wzrostu
Skrzepy PRF ostrożnie oddzielono od warstwy czerwonych krwinek za pomocą sterylnych nożyczek. Każdy skrzep zważono, a pożywkę hodowlaną RPMI-1640 dodano w stosunku 1:1 w stosunku wagowym (g = ml) w celu standaryzacji środowiska inkubacji we wszystkich próbkach i zapewnienia spójnej dyfuzji rozpuszczalnych czynników wzrostu z matrycy PRF. Stosunek ten pozwala na proporcjonalną ekstrakcję w oparciu o wielkość skrzepu, minimalizując zmienność stężeń czynnika wzrostu spowodowaną nierówną masą skrzepu. Próbki inkubowano w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 100 obr./min i temperaturze 3 °C przez 24 godziny i 72 godziny w celu zapewnienia równomiernej dyfuzji czynników wzrostu z matrycy PRF do pożywki hodowlanej. Po inkubacji supernatanty zebrano i przechowywano w temperaturze -8 °C do czasu analizy. Stężenia czynników wzrostu określono ilościowo przy użyciu komercyjnych zestawów ELISA, w tym FGFR, VEGF, IGF-1, PDGF i TGF-β1, zgodnie z protokołem przygotowaniaproducenta 9,10.
5. Etapy testu ELISA
Wzorce i próbki (po 100 μl każda) dodano do studzienek i inkubowano w temperaturze 3 °C przez 90 minut. Studnie zostały następnie trzykrotnie przemyte buforem do płukania. Następnie do każdej studzienki dodano 100 μl przeciwciała znakowanego biotyną i inkubowano w temperaturze 3 °C przez 60 minut, po czym wykonano trzy dodatkowe płukania. Następnie dodano 100 μl roztworu peroksydazy chrzanowej (HRP) i inkubowano w temperaturze 3 °C przez 30 minut. Po kolejnych trzech płukaniach dodano 100 μl odczynnika substratowego i inkubowano przez 15 minut. Na koniec do każdej studzienki dodano 50 μl roztworu zatrzymującego i zmierzono absorbancję przy 450 nm.
6. Analiza statystyczna
Zmienne jakościowe zostały wyrażone jako częstości i procenty, natomiast dane liczbowe przedstawiono odpowiednio jako średnią ± odchylenie standardowe lub medianę (minimum-maksimum). Normalność zmiennych numerycznych oceniano za pomocą próby Shapiro-Wilka. Zmienne, które nie spełniały założenia normalności, w szczególności stężenia czynników wzrostu i poziomy kortyzolu, analizowano za pomocą testów nieparametrycznych, w tym testu rangi ze znakiem Wilcoxona dla porównań par i współczynnika korelacji rang Spearmana dla asocjacji. Wszystkie analizy statystyczne zostały wykonane przy użyciu oprogramowania IBM SPSS Statistics. Wartość p <0,05 uznano za statystycznie istotną. Wszystkie porównania przeprowadzono w obrębie grupy kontrolnej pod kątem zmienności międzyosobniczej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wszyscy 20 ochotnicy (10 kobiet i 10 mężczyzn w wieku od 18 do 25 lat) ukończyło badanie bez utraty próby. Pełne wyniki morfologii krwi potwierdziły, że parametry płytkowe i hematologiczne mieściły się w normalnych zakresach referencyjnych we wszystkich próbkach, potwierdzając wiarygodność preparatów PRF.
Porównanie parametrów krwi między rankiem a wieczorem
Poziomy kortyzolu były istotnie wyższe w próbkach porannych w porównaniu z wieczornymi (p < 0,001), co odzwiercied...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opierając się na znanej okołodobowej regulacji aktywności płytek krwi i wydzielania hormonów, początkowo postawiono hipotezę, że czas pobierania krwi (rano vs. wieczorem) może zmieniać zawartość czynnika wzrostu PRF. Badanie to miało na celu sprawdzenie, czy taka zmienność czasowa istnieje, a jeśli tak, to czy koreluje ona z poziomem kortyzolu w surowicy i parametrami hematologicznymi. Badanie zostało zaprojektowane jako badanie pilotażowe mające na celu zbadanie okołodobowej zmienności uwalniania czynnika wzros...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| WIRÓWKA | DUO | 913023410238 | |
| ZESTAWY ELISA | Dobry test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | IGF-1 (Nr katalogowy:EH0165) | |
| ZESTAWY ELISA | Dobry test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | PDGF (Nr katalogowy:EH3531) | |
| ZESTAWY ELISA | Dobry test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | FGFR (Nr katalogowy:EH0715) | |
| ZESTAWY ELISA | Dobry test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | VEGF (Nr katalogowy: EH0327) | |
| ZESTAWY ELISA | Dobry test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. | TGF-β 1(Nr katalogowy: EH0287) | |
| Rurki PRF |  | 6370 |
Bibliografia
- Dohan, D. M., et al. Platelet-rich fibrin (PRF): A second-generation platelet concentrate. Part I: Technological concepts and evolution. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 101 (3), e37-e44 (2006).
- Ehrenfest, D. M. D., Rasmusson, L., Albrektsson, T. Classification of platelet concentrates: From pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Trends Biotechnol. 27 (3), 158-167 (2009).
- Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. Circadian control of the immune system. Nat Rev Immunol. 13 (3), 190-198 (2013).
- Haus, E., Smolensky, M. Biological clocks and shift work: Circadian dysregulation and potential long-term effects. Cancer Causes Control. 17, 489-500 (2006).
- Weitzman, E. D., et al. Twenty-four hour pattern of the episodic secretion of cortisol in normal subjects. J Clin Endocrinol Metab. 33 (1), 14-22 (1971).
- Scheer, F. A., et al. The human endogenous circadian system causes greatest platelet activation during the biological morning independent of behaviors. PLoS One. 6 (9), e24549(2011).
- Aoto, K., et al. Circadian variation of growth factor levels in platelet-rich plasma. Clin J Sport Med. 24 (6), 509-512 (2014).
- Richmond, J. Y., McKinney, R. W. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , US Government Printing Office. (2009).
- Hyslop, P. A., Bender, M. H. Methods for sample preparation for direct immunoassay measurement of analytes in tissue homogenates: ELISA assay of amyloid β-peptides. Curr Protoc Neurosci. 18 (1), 7.20.21-7.20.27 (2002).
- ELISA sample preparation protocol. , FineTest. (2022).
- Karolczak, K., et al. Plasma concentration of cortisol negatively associates with platelet reactivity in older subjects. Int J Mol Sci. 24 (1), 717(2022).
- Bass, J., Takahashi, J. S. Circadian integration of metabolism and energetics. Science. 330 (6009), 1349-1354 (2010).
- Atkinson, G., Todd, C., Reilly, T., Waterhouse, J. Diurnal variation in cycling performance: Influence of warm-up. J Sports Sci. 23 (3), 321-329 (2005).
- Petrovsky, N., Harrison, L. C. The chronobiology of human cytokine production. Int Rev Immunol. 16 (5-6), 635-649 (1998).
- Hilderink, J. M., et al. Within-day biological variation and hour-to-hour reference change values for hematological parameters. Clin Chem Lab Med. 55 (7), 1013-1024 (2017).
- Xie, Y., et al. FGF/FGFR signaling in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 5 (1), 181(2020).
- Farooq, M., Khan, A. W., Kim, M. S., Choi, S. The role of fibroblast growth factor (FGF) signaling in tissue repair and regeneration. Cells. 10 (11), 3242(2021).
- Murgo, E., Falco, G., Serviddio, G., Mazzoccoli, G., Colangelo, T. Circadian patterns of growth factor receptor-dependent signaling and implications for carcinogenesis. Cell Commun Signal. 22 (1), 319(2024).
- McCarthy, T. L., Centrella, M., Canalis, E. Cortisol inhibits the synthesis of insulin-like growth factor-I in skeletal cells. Endocrinology. 126 (3), 1569-1575 (1990).
- Dong, J., et al. The proliferative effect of cortisol on bovine endometrial epithelial cells. Reprod Biol Endocrinol. 17, 1-9 (2019).
- Moraes, L. A., et al. Ligand-specific glucocorticoid receptor activation in human platelets. Blood. 106 (13), 4167-4175 (2005).
- Deutsch, V., et al. Sustained leukocyte count during rising cortisol level. Acta Haematol. 118 (2), 73-76 (2007).
- Lightman, S. L., Conway-Campbell, B. L. The crucial role of pulsatile activity of the HPA axis for continuous dynamic equilibration. Nat Rev Neurosci. 11 (10), 710-718 (2010).
- Gabbitas, B., Pash, J. M., Delany, A. M., Canalis, E. Cortisol inhibits the synthesis of insulin-like growth factor-binding protein-5 in bone cell cultures by transcriptional mechanisms. J Biol Chem. 271 (15), 9033-9038 (1996).
- Gado, M., Baschant, U., Hofbauer, L. C., Bad Henneicke, H. to the bone: The effects of therapeutic glucocorticoids on osteoblasts and osteocytes. Front Endocrinol. 13, 835720(2022).
- Raica, M., Cimpean, A. M. Platelet-derived growth factor (PDGF)/PDGF receptors (PDGFR) axis as target for antitumor and antiangiogenic therapy. Pharmaceuticals. 3 (3), 572-599 (2010).
- Li, J., Forhead, A., Dauncey, M., Gilmour, R., Fowden, A. Control of growth hormone receptor and insulin-like growth factor-I expression by cortisol in ovine fetal skeletal muscle. J Physiol. 541 (2), 581-589 (2002).
- Al-Sharabi, N., et al. Proteomic analysis of mesenchymal stromal cells secretome in comparison to leukocyte- and platelet-rich fibrin. Int J Mol Sci. 24 (17), 13057(2023).
- Coucke, B., et al. Leukocyte- and platelet-rich fibrin for enhanced tissue repair: An in vitro study characterizing cellular composition, growth factor kinetics and transcriptomic insights. Mol Biol Rep. 51 (1), 954(2024).
- Chtourou, H., Souissi, N. The effect of training at a specific time of day: A review. J Strength Cond Res. 26 (7), 1984-2005 (2012).
- Kang, Y. H., et al. Platelet-rich fibrin is a bioscaffold and reservoir of growth factors for tissue regeneration. Tissue Eng Part A. 17 (3-4), 349-359 (2011).
- Miron, R. J., et al. Use of platelet-rich fibrin in regenerative dentistry: A systematic review. Clin Oral Investig. 21, 1913-1927 (2017).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.