Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ustanowienie i utrzymanie organoidów raka prostaty pochodzących od pacjentów: szczegółowy protokół eksperymentalny

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68912

⸱

14 listopada 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Jiangnan University Medical Center (Wuxi No. 2 People's Hospital), 2Wuxi School of Medicine, Jiangnan University

W tym artykule

Podsumowanie

Heterogeniczność raka prostaty i oporność na leczenie pozostają wyzwaniami. Opisujemy protokół generowania organoidów pochodzących od pacjentów (PDO), które zachowują kluczowe cechy guza rodzicielskiego. Ten standaryzowany model wspiera badania przesiewowe leków i postępy w medycynie precyzyjnej.

Streszczenie

Rak prostaty (PCa) to wysoce zróżnicowany nowotwor i główna przyczyna śmiertelności związanej z nowotworem u mężczyzn, z istotnymi wyzwaniami klinicznymi w zakresie leczenia oporności na leczenie i postępu choroby. Istniejące modele przedkliniczne, takie jak dwuwymiarowe (2D) linie komórkowe i ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX), mają ograniczenia w wiernym oddaniu złożoności PCa, w tym heterogeniczność nowotworów, sygnalizację zależną od receptorów androgenowych (AR) oraz interakcje mikrośrodowiskowe. Aby wypełnić tę lukę, badanie przedstawia solidny i powtarzalny protokół ustanawiający organoidy pochodzenia od pacjentów (PDO), które zachowują cechy genetyczne, fenotypiczne i histologiczne guzów rodzicielskich. Metoda ta umożliwia hodowlę organoidów zarówno z lokalnej, jak i zaawansowanej PCa, dostarczając biologicznie istotny model do badania mechanizmów chorób, odpowiedzi na leki oraz odkrywania biomarkerów. Wyniki pokazują zdolność protokołu do generowania organoidów z różnych próbek klinicznych, z zastosowaniami w wysokoprzepustowym przesiewaniu leków oraz medycynie precyzyjnej. Oferując ustandaryzowany przepływ pracy, który odpowiada na kluczowe wyzwania techniczne, badanie podkreśla znaczenie PDO jako wszechstronnych narzędzi do rozwoju badań nad rakiem prostaty i opracowywania skuteczniejszych strategii terapeutycznych.

Wprowadzenie

Rak prostaty (PCa) pozostaje jednym z najczęstszych nowotworów u mężczyzn na świecie, ustępującym jedynie rakowi płuc pod względem śmiertelności związanej z nowotworem. Według najnowszych badań epidemiologicznych, globalna częstość zachorowań na PCa stale rośnie, a prognozuje się, że liczba nowych przypadków raka prostaty rocznie wzrośnie z 1,4 miliona w 2020 roku do 2,9 miliona do 2040roku. Pomimo postępów we wczesnym wykrywaniu i rozwoju nowych terapii, w tym terapii deprywacji androgenów (ADT) i środków celowanych, rak prostaty pozostaje istotnym wyzwaniem klinicznym ze względu na swoją heterogeniczność oraz nieuchronny rozwój oporności na leczenie, szczególnie w zaawansowanych stadiach2. Rak prostaty oporny na kastrację (CRPC), który pojawia się po niepowodzeniu ADT, stanowi śmiertelną formę choroby, charakteryzującą się słabymi wynikami przeżycia i ograniczonymi opcjami terapeutycznymi3. Zrozumienie molekularnych mechanizmów napędzających postęp choroby i oporność jest zatem kluczowe dla identyfikacji nowych celów terapeutycznych i poprawy wyników leczenia pacjentów.

Opracowanie modeli przedklinicznych, które wiernie oddają złożoność raka prostaty u człowieka, jest kluczowe dla rozwoju badań w tej dziedzinie. Tradycyjne hodowle komórek 2D, choć szeroko stosowane, nie oddają heterogeniczności komórkowej, architektury guza i mikrośrodowiska obserwowanych in vivo4. W rezultacie translacyjne zastosowanie tych modeli jest ograniczone, szczególnie do badania postępu guza, oporności na leki oraz dynamicznych interakcji między komórkami nowotworowymia mikrośrodowiskiem guza. Dla porównania, ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX) oraz hodowle organoidów stały się bardziej zaawansowanymi narzędziami łączącymi konwencjonalne linie komórkowe z klinicznymi guzami 4,5,6.

Systemy hodowli organoidów zrewolucjonizowały modelowanie nowotworów. Te trójwymiarowe (3D) struktury pochodzą z tkanek pacjentów i mogą zachować cechy histologiczne, genomiczne oraz fenotypowe oryginalnego guza 7,8,9,10. Co ważne, organoidy raka prostaty zachowują kluczowe cechy heterogeniczności choroby, w tym sygnalizację AR, odporność na leczenie oraz niestabilność genomową, co czyni je idealnymi narzędziami do badań translacyjnych 11. W porównaniu z modelami PDX, organoidy są bardziej opłacalne, skalowalne i podatne na modyfikację genetyczną, co ułatwia wysokoprzepustowe badania leków, odkrywanie biomarkerów oraz badania funkcjonalne. Platformy organoidalne już wykazały obiecujące wyniki w innych nowotworach, w tym rakach jelita grubego, piersi i trzustki, podkreślając ich potencjał dla spersonalizowanej onkologii 4,12.

Jednak ustanowienie i utrzymanie organoidów raka prostaty (PCO) wiąże się z unikalnymi wyzwaniami technicznymi. Nabłonek prostaty jest z natury zależny od sygnalizacji androgenowej i wsparcia macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), co wymaga specjalistycznych warunków hodowlanych. Ponadto rak prostaty wykazuje szeroki zakres zachowań klinicznych, od miejscowych guzów wrażliwych na hormony po wysoce agresywne, oporne na leczenie CRPC, co dodatkowo komplikuje rozwój powtarzalnych układów organoidalnych11,12. Skuteczne protokoły generowania PCO muszą uwzględniać te biologiczne złożoności poprzez optymalizację kluczowych etapów, w tym przetwarzania tkanek, trawienia enzymatycznego, osadzania ECM oraz suplementacji kluczowymi czynnikami wzrostu, hormonami i małymi cząsteczkami. Takie protokoły są niezbędne do zapewnienia wierności organoidów wobec guzów rodzicielskich oraz ułatwienia ich zastosowania w dalszych analizach.

W niniejszym badaniu przedstawiamy szczegółowy i powtarzalny protokół dotyczący ustanawiania i długoterminowego utrzymania PDO. Nasz proces obejmuje cały proces – od pozyskiwania tkanek i przetwarzania biopsji oraz próbek chirurgicznych, po przekazywanie organoidów, kriokonserwację i resuscytację (Rysunek 1). Protokół ten został zoptymalizowany w celu zachowania integralności fenotypowej i genomowej tkanek nowotworowych prostaty, umożliwiając solidne systemy hodowli 3D odpowiednie do szerokiego zakresu zastosowań, w tym profilowania genomowego, testów odpowiedzi na leki oraz testów funkcjonalnych. Warto zauważyć, że nasza metoda rozwiązuje typowe techniczne przeszkody, takie jak niskie wskaźniki sukcesu hodowli organoidów, nieoptymalny wzrost oraz trudności w późniejszym passage, a także dostarcza ustandaryzowanych wytycznych, co ułatwia powtarzalność w różnych laboratoriach.

Opracowanie wiarygodnych modeli organoidów raka prostaty ma ogromne znaczenie zarówno dla badań podstawowych, jak i translacyjnych13. Systemy te oferują potężną platformę do rozszyfrowania mechanizmów chorobowych, identyfikacji nowych celów terapeutycznych oraz rozwijania podejść precyzyjnych do medycyny dostosowanej do indywidualnych pacjentów. Poprzez rozwiązywanie istniejących luk technicznych i dostarczanie kompleksowego protokołu, nasza praca ma na celu przyspieszenie wdrażania technologii organoidów w badaniach nad rakiem prostaty oraz wsparcie globalnych działań na rzecz zwalczania tej trudnej choroby14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie to zostało przeanalizowane i zatwierdzone przez Komisję Etyki Medycznej Szpitala Ludowego Wuxi nr 2 (numer zatwierdzenia: Y-38 (2023)). Wszyscy uczestnicy przekazali pisemne formularze wyraziły świadomą zgodę. Dane pacjentów zostały zdeidentyfikowane, aby zapewnić ochronę prywatności zgodnie z normami etycznymi.

1. Zbieranie próbek

  1. Pozyskiwanie tkanek
    1. Przygotowanie przed próbkowaniem
      1. Kryteria włączenia: Upewnij się, że wszyscy uczestnicy mają potwierdzoną diagnozę raka prostaty, ustaloną na podstawie badań patologicznych lub obrazowych. Pobieranie próbek nowotworów z resekcji chirurgicznej, biopsji lub innych próbek klinicznych. Upewnij się, że wszyscy uczestnicy mają 18 lat lub więcej i nie mają innych nowotworów, aby wykluczyć potencjalne zakłócenia innych nowotworów w badaniach nad rakiem prostaty. Od wszystkich uczestników zbieraj pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu i pozwól na wykorzystanie ich próbek do badań naukowych.
      2. Kryteria wykluczenia: Wyklucz pacjentów, których próbki nie zawierają wystarczającej ilości tkanki nowotworowej do hodowli lub analizy. Wykluczyć pacjentów, którzy wycofali zgodę lub nie są w stanie dostarczyć wymaganych próbek podczas badania.
    2. Próbki biopsji rdzenia prostaty: Użyj specjalnej igły, aby pobrać próbki z tkanki prostaty. Natychmiast umieść tkankę w roztworze konserwującym (Advanced DMEM/F-12 (adDMEM/F-12) medium + roztwór inhibitora skały (rozcieńczenie 1:2000)) i przetransportuj ją do laboratorium na lodzie, zapewniając dostawę w ciągu 24 godzin.
      UWAGA: Precyzyjnie celuj w tkankę nowotworową prostaty i wykonuj wielomiejscowe pobieranie próbek w różnych obszarach anatomicznych. Wykonaj 1-2 nakłucia na miejsce, każde z ≥ 1 cm próbek rdzeniowych.
    3. Próbki radykalnej prostatektomii: Po pobraniu szybko umieszczać próbki w roztworze konserwującym (medium adDMEM/F-12 + roztwór inhibitora skał (rozcieńczenie 1:2000)) i transportować na lodzie, zapewniając dostarczenie do laboratorium w ciągu 24 godzin.
      UWAGA: Więcej fragmentów tkanek można uzyskać za pomocą radykalnej prostatektomii15.
      Pobieraj próbki ≥ 1g (≈ średnicy 5 mm), minimalizując zanieczyszczenie tkanką normalną. Koordynacja przedoperacyjna z klinicystami, aby określić: 1) rdzeń guza; 2) tkanka okołonowa; 3) normalna kontrola. Priorytetowo wybieraj twarde fragmenty z szaro-żółtym przebarwieniem. Jeśli nie ma jej obecności, wprowadź systematyczne losowe próbkowanie. Informacje o zbieraniu próbek można znaleźć w Tabeli 1 .
  2. Przetwarzanie próbek
    1. Oznakowanie i kategoryzacja: Wyraźnie oznaczaj pobrane próbki tkanki (w tym imię pacjenta, numer hospitalizacji, nazwę tkanki, miejsce tkanki oraz typ tkanki).
    2. Krioprezerwacja: Przetwarzanie próbek tkanek natychmiast (≤ 12 godzin po pobraniu). Umieść próbki w roztworze konserwującym o temperaturze wstępnie schłodzonej (4 °C) (medium adDMEM/F-12 + roztwór inhibitora skały (rozcieńczenie 1:2000)) i przechowuj je w temperaturze 4 °C. Dalsze kroki eksperymentalne wykonuj w ciągu 4-6 godzin, aby uzyskać optymalne rezultaty.
  3. Transport i przechowywanie
    1. Transport w łańcuchu chłodniczym: Transport próbek tkanek do laboratorium w warunkach niskich temperatur.
    2. Rejestracja próbki: Po przybyciu do laboratorium należy szczegółowo zweryfikować i zarejestrować informacje o próbce, w tym podstawowe dane osobowe pacjenta, typ tkanki, nazwę oraz miejsce pobierania próbek.
  4. Odbiór laboratoryjny i inspekcja:
    1. Inspekcja próbek: Otwórz próbki w szafce zabezpieczeń biologicznych i sprawdź pod kątem ewentualnych utraty, zanieczyszczeń lub widocznych nieprawidłowości.
    2. Sekcja próbki: Pobierz próbkę i umieść ją w naczyniu do hodowli. Użyj nożyczek do tkanek lub skalpela, aby podzielić próbkę na małe kawałki (około 1-3 mm³) do wykorzystania w kolejnych eksperymentach.

2. Procedury eksperymentalne

  1. Przygotowanie zawiesin komórek pierwotnych tkanek
    1. Konserwacja: Umieść zebrane bloki tkanek w 50 mL sterylnych stożkowych rurkach wirówkowych, upewniając się, że tkanki są kategoryzowane według typu. Odpowiednio oznacz każdą tubę. Do każdej probówki należy dodawać roztwór konserwujący (medium adDMEM/F-12 + roztwór inhibitora skały (rozcieńczenie 1:2000)) do każdej rurki, aż tkanka zostanie całkowicie zanurzona. Przechowuj próbki w temperaturze 4 °C do dalszego przetwarzania.
      UWAGA: Typy tkanek powinny obejmować zarówno tkanki nowotworowe, jak i nienowe. Przykładowe etykiety powinny zazwyczaj zawierać numer dokumentacji medycznej.
    2. Separacja tkanek: Za pomocą sterylnych pęset, przenieś próbki tkanek raka prostaty do średniej wielkości naczynia do hodowli. Przemyj tkankę 2-3 razy 2 mL soli fizjologicznej Dulbecco z buforem fosforanowym (D-PBS), aby usunąć krew i zanieczyszczenia. Ostrożnie usuń tkankę tłuszczową, mięśnie i inne elementy nienabłonkowe za pomocą cienko zakończonej pęsety, zachowując jedynie obszary nabłonkowe. Następnie pokrój oczyszczoną tkankę na małe fragmenty o wielkości około 1-3 mm³ nożyczkami.
      UWAGA: Całkowite usunięcie składników nienabłonkowych jest kluczowe w zastosowaniach końcowych, ponieważ zanieczyszczenie tkanki stromalnej lub tłuszczowej może obniżyć efektywność i specyficzność izolacji komórek. Utrzymuj sterylne warunki przez cały zabieg, aby zminimalizować ryzyko skażenia mikroorganizmów.
    3. Trawienie tkanek: Przenieś przygotowane fragmenty tkanek do probówek do przetwarzania tkanek. Dodaj do każdej probówki roztwór trawienia tkanki nowotworowej (Tabela 2). Aktywuj urządzenie do trawienia (aparat do przygotowania zawiesiny jednokomórkowej) za pomocą programu dysocjacji tkanek średniotwardych do dysocjacji enzymatycznej i mechanicznej.
      UWAGA: Protokół analizy jest następujący: obrót do przodu z prędkością 200 obr./min przez 3 s, obrót do tyłu z prędkością 200 obr./min przez 3 s, obrót do przodu z prędkością 300 obr./min przez 4 s, obrót do przodu z prędkością 600 obr./min przez 5 s, obrót do przodu z prędkością 600 obr./min przez 5 s, obrót do przodu z prędkością 400 obr./min przez 3 s, Obrót wsteczny przy 400 obr./min przez 3 sekundy. Ta sekwencja stanowi jeden cykl, który należy powtórzyć trzy razy. Po ukończeniu dwóch pierwszych cykli kontynuuj powolny obrót z prędkością 20 obr./min przez około 25 minut. Czas trwania może być dostosowywany w zależności od warunków eksperymentalnych. Trawić tkanki w temperaturze 37 °C przez 40 minut do 1 godziny.
    4. Zakończenie trawienia: Dodaj równą lub dwukrotną objętość podłoża uzupełnionego FBS adDMEM/F-12 do zawiesiny komórkowej, aby zakończyć aktywność enzymatyczną.
      UWAGA: Jeśli pozostał niestrawiony osad, pobierz supernatant, dodaj świeże enzymy trawienne do resztki i kontynuuj trawienie w temperaturze 37 °C przez kolejne 15-20 minut. Okresowo monitoruj proces i łącz zawiesiny komórkowe z obu etapów trawienia.
    5. Filtracja: Wstępnie zwilż sitko ogniwa o pojemności 100 μm 1 mL medium adDMEM/F-12, a następnie przefiltruj zawiesinę komórkową. Przepłucz probówkę do przetwarzania tkanek i sitko komórkowe dwukrotnie 5 mL medium adDMEM/F-12, uzupełnionym roztworem hamującym skalę (rozcieńczenie 1:2000). Zbierz filtrat do 50 mL sterylnej stożkowej rurki wirówki. Przepuścić zawieszenie przez sitko o średnicy 70 μm i zebrać wszystkie zawiesiny ogniwow do nowej rurki 50 mL.
      UWAGA: Liczba kroków filtracji oraz wielkość porów sita mogą być dostosowane do charakterystyki próbki.
    6. Liza czerwonych krwinek: Wiruj zebraną zawiesinę komórkową w dawce 200 × g przez 5 minut w 25 °C. Ostrożnie wyrzuć supernatant, a następnie ponownie zawiesijcie osad komórkowy w 2 mL buforu lizy czerwonych krwinek. Inkubuj zawieszenie na lodzie przez 2-3 minuty.
      UWAGA: Czas inkubacji w wyniku lizy czerwonych krwinek może być dostosowany w zależności od efektywności lizy. Przedłużona inkubacja może prowadzić do zwiększonej śmierci komórek. Zaleca się monitorowanie próbki pod mikroskopem, aby zapewnić pełną lizę czerwonych krwinek bez nadmiernego uszkodzenia innych typów komórek.
    7. Zakończ lizę: Dodaj 6 mL medium adDMEM/F-12 uzupełnionego roztworem inhibitora skalnego (rozcieńczenie 1:2000) do zawiesiny komórkowej. Przelej mieszankę do 15 mL stożkowej rurki wirówki i przełóż w wirówkę w 200 x g przez 5 minut w 25 °C. Usuń supernatant. Przemyj pellet ogniwa 1-2 razy tym samym uzupełnionym medium i przelej ostatnią zawiesinę komórki do probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 mL.
    8. Ocena żywotności: Wymieszaj 10 μL zawiesiny komórkowej z równą objętością roztworu trypanowego i obserwuj żywotność komórek pod mikroskopem.
      UWAGA: Jeśli zauważone zostaną znaczne ilości martwych komórek lub zanieczyszczeń, należy przeprowadzić niską wirówkę o niskiej prędkości w 50 x g przez 5 minut w 25 °C, aby usunąć je przed przystąpieniem do liczenia.
    9. Liczenie komórek: Ponownie zawiesić pellet w 1 mL medium adDMEM/F-12, rozcieńczyć zawiesinę w razie potrzeby (zazwyczaj w rozcieńczeniu 1:20) i umieścić 6 μL rozcieńczonej zawiesiny na hemocytometrze, aby liczyć komórki pod mikroskopem.
    10. Zbieranie pelletów komórkowych: Wirówka w 200 x g, 25 °C, przez 5 minut. Ostatni granulat komórki należy zebrać do probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 mL.

3. Ustanowienie organoidów z pierwotnych zawiesin komórkowych

  1. Siew: Określ wymaganą objętość żelu matrycowego na podstawie liczby komórek. Używając wcześniej schłodzonych końcówek pipet (przechowywanych w -20 °C), ostrożnie przenieś odpowiednią objętość żelu matrycowego do osadu komórkowego. Delikatnie mieszaj mieszankę komórkowo-żelową na lodzie, unikając powstawania pęcherzyków powietrza, aby zapewnić jednolite siewnictwo i optymalną integralność żelu matrycowego.
    UWAGA: Rozmroź żel matrycy w 4 °C przez noc przed użyciem. Upewnij się, że wszystkie narzędzia do obsługi, w tym końcówki i rurki pipet, są wstępnie schładzone, aby zapobiec przedwczesnemu żelowaniu.
  2. Powlekanie: Rozłóż mieszankę żelu z matrycy komórkowej na płytkę hodowlową o niskiej przyczepności 24 dołków, stosując około 30 μL na kroplę. Upewnij się, że każda kropla zawiera ponad 10 000 komórek, aby wspierać efektywne trójwymiarowe (3D) tworzenie struktur.
    UWAGA: Unikaj nadmiernego rozcieńczania żelu matrycowego. Aby zachować integralność strukturalną i wspierać formowanie hodowli 3D, żel matrycowy powinien stanowić ponad 70% całkowitej objętości mieszaniny. Organoidy pochodzące z próbek biopsji człowieka i prostatektomii są równoważne, różnią się głównie wydajnością żywotnych komórek, a w tym protokole zastosowano identyczne gęstości nasienia.
  3. Inkubacja: Umieść płytkę hodowlę w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5%CO2 na 5 minut, pozwalając żelowi macierzowemu wstępnie się zastygnąć. Odwróć płytę i odstaw ją na 20 minut, aby żel matrycy pozostał w formie 3D. Dodaj 800-1000 μL medium hodowlanego (Tabela 3) do każdego dołku. Wymieniaj podłoże co 2-3 dni.
    UWAGA: Upewnij się, że żel matrycy nie jest naruszony podczas etapu inwersji, aby zachować strukturę 3D.

4. Przechodzenie organoidów

  1. Zbieranie i przygotowanie organoidów: Za pomocą wstępnie schłodzonej końcówki pipety mechanicznie rozbijaj żel matrycowy w celu rozbicia skupisk organoidów. Przepłukaj każdy dołek 1-2 razy adDMEM/F-12 medium + roztwór inhibitora skalnego (rozcieńczenie 1:2000). Przenieś rozdrobnione skupiska wraz z pożywką do 15 mL sterylnej stożkowej rurki wirówki. Wirować w 200 × g przez 5 minut w 25 °C i wyrzucić supernatant.
    UWAGA: Gdy organoidy osiągają średnicę 100 μm (zazwyczaj w dniu hodowli 14). Jeśli zbyt duża średnia objętość zakłóca zakłócenia mechaniczne, zasysaj część ośrodka przed rozbiciem klastrów. Żel matrycowy resztkowy, który przylega do powierzchni płyty, delikatnie zeskrobaj końcówką pipety i spłuknij 2-3 razy medium adDMEM/F-12 + roztworem inhibitora skał (rozcieńczenie 1:2000). Wszystkie płukania powinny być połączone z początkową kolekcją dla maksymalnej wydajności.
  2. Dysocjacja organoidalna: Ponownie zawiesij powstały pellet w 2 mL wcześniej podgrzanego, rekombinowanego enzymu trypsynowego. Pipetuj w górę i w dół, aby rozpocząć dysocjację, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez 15-30 minut. Monitoruj dysocjację pod mikroskopem co 5 minut, aż małe skupiska komórek (około 5-6 komórek na klaster) zdominują pole, następnie przejdź do kolejnego kroku.
    UWAGA: Terminowe zakończenie trawienia jest kluczowe, aby uniknąć nadmiernej dysocjacji i zachować żywotność komórek. Częste obserwacje mikroskopowe zapewniają, że trawienie zostaje zatrzymane w optymalnym momencie powstawania klasterów.
  3. Zakończenie trawienia: Zakończenie trawienia poprzez dodanie równej lub podwójnej objętości podłoża adDMEM/F-12 wzbogaconego surowicą płodową (FBS), aby ograniczyć aktywność enzymatyczną. Wiruj w 200 x g przez 5 minut w 25 °C i wyrzuć supernatant.
  4. Usuwanie żelu matrycowego: Ponownie zawiesić pellet w 2 mL roztworu do odzyskiwania komórek i inkubować w temperaturze 4 °C przez 20-40 minut, aby rozpuścić resztki żelu matrycowego. Wiruj w 200 x g przez 5 minut w 4 °C, odrzucaj supernatant i powtarzaj mycie dwukrotnie z medium adDMEM/F-12, aby wyeliminować pozostałości matrycy. Przełóż ostatni granulat do sterylnej probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 mL do dalszego przetwarzania.
    UWAGA: Inkubacja w niskiej temperaturze jest kluczowa dla skutecznej depolimeryzacji żelu matrycowego przy jednoczesnym zachowaniu integralności komórek. Minimalizuj czas poza zimnym środowiskiem, aby zapobiec przedwczesnej ponownej żelacji.
  5. Siew i hodowla: Przystąpić do ponownego zasiewania rozłączonych klastrów organoidów zgodnie z procedurami opisanymi w krokach 3.1-3.3. Należy zapewnić odpowiednią gęstość komórek i stosunek żelu macierzowego dla optymalnej reformy struktury 3D.
    UWAGA: Szczegółowe protokoły dotyczące kriokonserwacji, rozmrażania, ponownego osadzania i przetwarzania histologicznego są dostępne na życzenie.

5. Kriokonserwacja organoidów

  1. Pobieranie organoidów: Usuwanie płytki hodowli z inkubatora i mechaniczne dysocjowanie agregatów organoidów hydrożelowych za pomocą wstępnie schłodzonej końcówki pipety. Przenieś rozłączone kruszywa wraz z podłożem hodowlanym do stożkowej rurki wirówki o pojemności 15 mL. Przepłukaj studnie 2-3 razy medium adDMEM/F-12, łącząc płukania z pierwotną zawiesiną. Wiruj w 200 × g przez 5 minut w 25 °C i wyrzucaj supernatant.
    UWAGA: Aby zapewnić maksymalną wydajność, delikatnie rozbijaj agregaty organoidowe, nie powodując nadmiernych szkód. Wszystkie płukania powinny być łączone z pierwotną kolekcją, aby zmniejszyć utratę organoidów podczas procesu pobierania.
  2. Dysocjacja enzymatyczna: Dodaj 2-4 mL wcześniej podgrzanego roztworu enzymu rekombinowanego trypsyny do pelletu organoidalnego w stożkowej rurce i delikatnie wymieszaj zawiesinę. Inkubuj zawiesinę w 37 °C przez 15-20 minut. Monitoruj proces dysocjacji mikroskopowo co 5 minut.
    UWAGA: W razie potrzeby delikatnie pipetować, aby pomóc w rozbiciu większych skupisk na mniejsze agregaty (około 5-6 komórek na skupisko). Do krioprezerwacji konieczne są krótsze czasy trawienia, aby zapobiec nadmiernej dysocjacji i utracie żywotności komórek. Częsta obserwacja zapewnia, że trawienie zostaje przerwane na odpowiednim etapie, aby zachować integralność organoidów.
  3. Zakończenie trawienia: Dodaj równą lub większą ilość substratu adDMEM/F-12 z dodatkiem FBS, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną. Wiruj w wirówce 200 × g przez 5 minut w 4 °C i odrzucaj supernatant.
    UWAGA: Jeśli granulek nie zawiera żelu matrycowego resztkowego, przejdź do kroku 5,5 do kriochrony. Jeśli zanieczyszczenie żelem matrycowym utrzymuje się, przejdź do kroku 5.4.
  4. Usunięcie żelu matrycowego (opcjonalnie): Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w kroku 4.4, aby usunąć żel matrycowy. Ponownie zawiesij pellet w 2 mL roztworu odzyskującego komórkę i inkubuj w temperaturze 4 °C przez 20-40 minut. Wiruj w 200 × g przez 5 minut w 4°C, wyrzucaj supernatant i powtarzaj proces mycia 1-2 razy, aby zapewnić całkowite usunięcie żelu matrycowego.
    UWAGA: Usunięcie żelu matrycowego jest kluczowe, aby zapewnić, że tylko komórki rozłączone są kriopkonserwowane. Niepełne usunięcie żelu może wpłynąć na żywotność i integralność strukturalną organoidów po rozmrożaniu.
  5. Krioprezerwacja: Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1,5 mL medium zamrażającego organoidy poprzez delikatne pipetowanie, aby zapewnić równomierne zawieszenie. Przełóż zawiesinę do kriovialu i przechowuj w temperaturze -80 °C dla krótkotrwałej konserwacji. Po 24 godzinach przelej fiolki do ciekłego azotu do długotrwałego przechowywania.
    UWAGA: Upewnij się, że pożywka kriokonserwacyjna jest dokładnie wymieszana z komórkami, aby zapobiec nierównomiernemu zamarzaniu, które może prowadzić do uszkodzenia komórek. Fiolki powinny być niezwłocznie przelane do ciekłego azotu po krótkim okresie przechowywania, aby zapewnić długotrwałe zachowanie i zapobiec degradacji komórek.

6. Odzyskiwanie organoidów

  1. Rozmrażanie kriokonserwowanych organoidów: Usunięcie kriovialnych organoidów z magazynowania ciekłego azotu lub -80 °C. Natychmiast zanurz fiolkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i delikatnie mieszaj, aż zawartość całkowicie się rozmrozi. Po zakończeniu rozmrażania należy przenieść zawiesinę organoidową do stożkowej rurki wirówki o pojemności 15 mL, używając wstępnie schłodzonej (-20 °C) pipety.
    UWAGA: Szybkie i równomierne rozmrażanie jest kluczowe, aby zminimalizować uszkodzenia komórek wywołane kriogenicznie. Używaj wstępnie schłodzonych końcówek pipet, aby zapobiec przedwczesnemu nagrzewaniu się i formowaniu żelu matrycowego podczas transferu.
  2. Usuwanie krioprotektantu: Ostrożnie dodaj 1-2 mL medium adDMEM/F-12 wzdłuż ścianki stożkowej, aby stopniowo rozcieńczać krioprotektant. Delikatnie mieszaj przez inwersję. Wirówka w 200 × g przez 5 minut w 4 °C i wyrzuć supernatant.
    UWAGA: Unikaj intensywnego pipetowania lub wirowania na tym etapie, ponieważ nagłe zmiany osmotyczne i naprężenia mechaniczne mogą zagrozić żywotności organoidów. Podejście powolnego rozcieńczania minimalizuje wstrząs komórkowy.
  3. Mycie i ponowna zawieszka: Dodaj 1 ml świeżego adDMEM/F-12 medium do pelletu. Delikatnie zawiesz komórki za pomocą wstępnie schłodzonej (-20 °C) końcówki pipety, aby zapobiec przedwczesnemu przyleganiu żelu macierzy. Przenieś zawiesinę do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
    UWAGA: Utrzymanie niskiej temperatury podczas mycia jest niezbędne, aby zapobiec ponownemu składaniu składników żelu matrycowego wywołanym przez termiczne, co mogłoby utrudnić późniejszą reformację organoidów.
  4. Zbieranie: Wirówka w 200 × g przez 5 minut w 4 °C i wyrzuć supernatant. Powtórz proces mycia 2-3 razy, aby zapewnić całkowite usunięcie pozostałości krioprotektującego i zanieczyszczeń.
  5. Siew i hodowla: Ponownie zawiesz ostatni pellet komórkowy w pożywce hodowli organoidów przygotowanej zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi. Należy kontynuować zasiewanie zgodnie z protokołem opisanym w krokach 3.1-3.3, zapewniając odpowiednią proporcję żelu macierzowego i gęstość komórek, aby umożliwić ponowne ustanowienie struktury 3D.
    UWAGA: Żywotność i regeneracja komórek po rozmrożeniu w dużej mierze zależą od delikatnego traktowania, właściwego rozcieńczania krioprotektantów oraz natychmiastowego przywrócenia wspierającego środowiska żelu matrycowego 3D.

7. Przetwarzanie wstępne do charakterystyki organoidów

  1. Pobieranie organoidów: Mechanicznie rozdziela agregaty, gdy średnica organoidów osiąga 70-100 μm i przenosi je do stożkowej rurki o pojemności 15 mL z podłożem do dalszej hodowli. Przepłucz studnie 2-3 razy medium adDMEM/F-12 i połącz te wody z organoidalną zawiesiną. Wirówka w 200 × g przez 5 minut w 25 °C i wyrzuć supernatant.
    UWAGA: Do małych zbiorów (np. 1-2 doły) używaj rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, aby zapewnić efektywną obsługę i zmniejszyć straty próbek. Uważaj, aby nie zakłócać struktur organoidalnych podczas dysocjacji.
  2. Ponowna zawiesina: Ponownie zawiesić pellet w 1 mL medium adDMEM/F-12 i przenieść do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Wirówka w 200 × g przez 5 minut w 25°C i wyrzuć supernatant.
    UWAGA: Upewnij się, że pellet jest dokładnie zawieszony przed wirowaniem, aby zapobiec zgrudzaniu się i umożliwić jednolite przetwarzanie w kolejnych etapach.
  3. Mycie i utrwalanie: Dodaj 1 ml D-PBS do pelletu i delikatnie mieszaj przez pipetowanie lub inwersję. Wiruj w 200 × g przez 5 minut w 25 °C, odrzucaj supernatant i powtarzaj proces mycia 1-2 razy. Utrwal pellet 1-2 mL 4% paraformaldehydu (PFA) i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Ostrożnie wykonuj procedury mycia, aby zapewnić dokładne usunięcie pozostałego medium i innych zanieczyszczeń. Utrwalenie paradehydu jest kluczowe dla zachowania morfologii organoidów na potrzeby dalszej analizy.
  4. Mycie po fiksacji: Wirówka próbek w 200 × g przez 5 minut w 4 °C i wyrzucać supernatant. Przemyj stałe próbki 2-3 razy D-PBS, delikatnie mieszając palcami lub delikatną inwersją, aby zapewnić prawidłowe rozłożenie bufora płukania i zapobiec utracie organoidów.
    UWAGA: Prawidłowe mycie po fiksacji jest niezbędne do usunięcia nadmiaru paradehydu i zmniejszenia zabarwień w tle w zastosowaniach pozatlecznych, takich jak immunohistochemia.
  5. Ponowne utrwalanie etanolu: Delikatnie zawiesij granulat w 1 mL mieszanki 70% etanolu za pomocą palcowego pstryknięcia i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Wirówka w 200 × g przez 5 minut w 4 °C i odrzuca supernatant.
    UWAGA: Utrwalanie etanolu na tym etapie pomaga zachować integralność organoidów i przygotować próbki do osadzenia lub dalszego przetwarzania. Zadbaj o równomierną zawieszinę w etanolu, aby uniknąć nierównomiernego ustabilizowania.
  6. Klirens żelu matrycowego (opcjonalnie): Jeśli pozostałość żelu matrycowego pozostaje w pellecie, należy postępować zgodnie z protokołem opisanym w kroku 4.4, aby go usunąć. Ten etap polega na ponownym zawieszeniu pelletu w roztworze do odzysku komórek i inkubacji w temperaturze 4 °C przez 20-40 minut, następnie następuje wirowanie i wielokrotne płukania w celu zapewnienia całkowitego usunięcia żelu.
    UWAGA: Usunięcie żelu matrycowego jest szczególnie ważne w dalszej analizie histologicznej lub obrazowaniu, ponieważ żel resztkowy może zakłócać przecinanie i analizę tkanek.
  7. Osadzanie agarozy: Przygotuj około 6 ml agarozy 2% przez roztapienie w temperaturze 96 °C podczas wiązania organoidów etanolowych. Wymieszaj 100 μL stopionej agarozy z pelletem organoidalnym, zapewniając minimalne powstawanie pęcherzyków powietrza. Przelej mieszankę do formy, zatwardzaj w 4°C, a następnie przetworz do osadzania parafiny.
    UWAGA: Końcówki pipety podgrzewane (z przyciętymi końcówkami), aby zapobiec zapychaniu się. Osadzenie w agarozie ułatwia zachowanie struktury organoidalnej, jednocześnie umożliwiając łatwe przetwarzanie i sekcjonowanie. Unikaj powstawania pęcherzyków podczas mieszania, aby zapewnić równomierne osadzenie i optymalne cięcie tkanek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Morfologiczne i dynamiczne cechy wzrostu organoidów raka prostaty pochodzących od pacjentów
Organoidy raka prostaty pochodzące od pacjentów zostały pomyślnie ustalone ze świeżych tkanek nowotworowych pobranych podczas zabiegów klinicznych. Początkowe powstawanie organoidów zwykle obserwowano w ciągu 5-7 dni od hodowli (Rysunek 2). Pod mikroskopią w świetle organoidy wykazywały wyraźne cechy morfologiczne, tworząc zwarte, dobrze zdefiniowane sferoidy lub struktury przypo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ustanowienie PDO dla PCa stanowi kluczowy postęp w modelowaniu przedklinicznym, oferując znaczące przewagi w porównaniu z konwencjonalnymi hodowlami komórek 2D i PDX16. Metoda przedstawiona w tym badaniu umożliwia generowanie organoidów, które wiernie oddają histologiczne, genetyczne i fenotypowe cechy pierwotnego guza. Zachowując heterogeniczność guza, w tym sygnalizację AR i architekturę komórkową, organoidy stanowią bardziej biologicznie istotną platformę do badania postępu raka prostaty, oporn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy z wdzięcznością dziękują wsparciu Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 82172831) oraz Kluczowemu Projektowi Badawczemu Komisji ds. Zdrowia i Planowania Rodziny Prowincji Jiangsu (Grant nr X20240121).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
A 83-01TOCRIS2939
adMEM/F12Gibco12634010
Szafka bezpieczeństwa biologicznegoJinan Xinbeixi Biotechnology Co., Ltd
Roztwór do odzyskiwania komórekCorning354253
WirówkaShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdM1416R
Rurki wirówkoweNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
Cultrex PathClear BMR& D3533-010-02
Cultrex Obniżony Czynnik Wzrostu BME, typ 2R& D3533-005-02
Pojemniki hodowlane (płytki o niskiej przyczepności z 24 dołkami)TermoNunc-174930-ZX
DHTISOREAG521-18-6
Waga elektronicznaNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
Serum bydlęce płodoweGibco10099141
GlutaminePlus-200mMR& DB90210
HEPESR& D1254/10
Inkubator do hodowli komórek nawilżonych (37 stopni; C, 5% CO2)Shanghai Hetian Scientific Instrument Co., LtdHY-160SY
LodówkaNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
Średniej wielkości naczynia kulturoweAbsinabs7005
Suplement medialny N21-MAX (50X)R& DAR008
N-acetylcysteinaSigmaA9165-5G
NikotynamidR& D3533-010-02
NormocynaInvivogenANT-NR-2
Pipet-aid pipetowanieNanjing Hotspot Scientific Instrument Co., Ltd
PipetyNanjing Hotspot Scientific Instrument Co., Ltd
PrimocinInvivogenANT-PM-2
rhEGFR& D236-EG-01M
rhFGFR& D233-FB-025
rhFGF-10R& D345-FG-025
rhNogginR& D6057-NG-100
rhR-Spondin 1R& D4656-RS-100
SB 202190TOCRIS1264
Aparat do przygotowania zawiesiny jednokomórkowejNapęd na tylne kołaDSC-400
Nożyczki do tkanek/skalpelNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
TryplE ExpressGibco126A04013
Zestaw do dysocjacji guza, ludzkiMiltenyi Biotec130-095-929
PęsetaNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
kąpiel wodnaChangzhou Zhongjie Eksperymentalna Produkcja Instrumentów, LtdHH-600
Dichlorek Y-27632R& D1254/10

Bibliografia

  1. James, N. D., et al. The lancet commission on prostate cancer: planning for the surge in cases. Lancet. 403 (10437), 1683-1722 (2024).
  2. Knutson, T. P., et al. AR alterations inform circulating tumor DNA detection in metastatic castration resistant prostate cancer patients. Nat Commun. 15 (1), 10648(2024).
  3. Haffner, M. C., et al. Framework for the pathology workup of metastatic castration-resistant prostate cancer biopsies. Clin Cancer Res. 31 (3), 466-478 (2025).
  4. Fang, Z., Li, P., Du, F., Shang, L., Li, L. The role of organoids in cancer research. Exp Hematol Oncol. 12 (1), 69(2023).
  5. Sachs, N., Clevers, H. Organoid cultures for the analysis of cancer phenotypes. Curr Opin Genet Dev. 24, 68-73 (2014).
  6. Zhou, L., Zhang, C., Zhang, Y., Shi, C. Application of organoid models in prostate cancer research. Front Oncol. 11, 736431(2021).
  7. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  8. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
  9. Puca, L., et al. Patient-derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nat Commun. 9 (1), 2404(2018).
  10. Pamarthy, S., Sabaawy, H. E. Patient-derived organoids in prostate cancer: improving therapeutic efficacy in precision medicine. Mol Cancer. 20 (1), 125(2021).
  11. Karkampouna, S., et al. Patient-derived xenografts and organoids model therapy response in prostate cancer. Nat Commun. 12 (1), 1117(2021).
  12. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  13. Neal, J. T., Kuo, C. J. Organoids as models for neoplastic transformation. Annu Rev Pathol. 11, 199-220 (2016).
  14. Waseem, M., Wang, B. D. Organoids: an emerging precision medicine model for prostate cancer research. Int J Mol Sci. 25 (2), (2024).
  15. Moschovas, M. C., Patel, V. Neurovascular bundle preservation in robotic-assisted radical prostatectomy: how I do it after 15,000 cases. Int Braz J Urol. 48 (2), 212-219 (2022).
  16. Li, Y., Qin, M., Liu, N., Zhang, C. Organoid development and applications in gynecological cancers: the new stage of tumor treatment. J Nanobiotechnology. 23 (1), 20(2025).
  17. Xiang, D., et al. Building consensus on the application of organoid-based drug sensitivity testing in cancer precision medicine and drug development. Theranostics. 14 (8), 3300-3316 (2024).
  18. Van Hemelryk, A., et al. Patient-derived xenografts and organoids recapitulate castration-resistant prostate cancer with sustained androgen receptor signaling. Cells. 11 (22), 3632(2022).
  19. Zhao, H., et al. Patient-derived bladder cancer organoids as a valuable tool for understanding tumor biology and developing personalized treatment. Adv Sci (Weinh). 12 (13), e2414558(2025).
  20. Polak, R., Zhang, E. T., Kuo, C. J. Cancer organoids 2.0: modelling the complexity of the tumour immune microenvironment. Nat Rev Cancer. 24 (8), 523-539 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organoidy pochodz ce od pacjentahodowla organoid wtrawienie tkanki nowotworowejzatapianie w elu macierzyutrzymanie organoid wprzesiewy lek wmedycyna precyzyjnaekspresja receptora androgenowegoodkrywanie biomarker w
Ustanowienie i utrzymanie organoidów raka prostaty pochodzących od pacjentów: szczegółowy protokół eksperymentalny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.