Artykuł metodologiczny

Wykrywanie zachowań podatnych na agregację w mutantnych komórkach raka piersi P53 V157F przy użyciu fluorescencji wielopunktowej tioflawiny T

DOI:

10.3791/68921

⸱

30 grudnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, I-Shou University, 2School of Chinese Medicine for Post Baccalaureate, I-Shou University, 3Department of Medical Science and Biotechnology, I-Shou University, 4Department of Biomedical Engineering, I-Shou University, 5Department of Pathology, E-Da Hospital, 6Department of Physical Therapy, I-Shou University, 7Department of Occupational Therapy, I-Shou University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki raka piersi Hs578T zawierające mutację p53 V157F wykazują istotnie wyższą fluorescencję tioflawiny T w porównaniu z komórkami MCF7, co wskazuje na zwiększoną agregację białek. Pomiary fluorescencji wielopunktowej poprawiają dokładność i niezawodność wykrywania agregatów bogatych w β arkusze, podkreślając znaczenie mutacji p53 podatnych na agregację w badaniach nad rakiem oraz opracowywaniu strategii terapeutycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Supresor nowotworowy p53, zakodowany przez gen TP53 , odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu stabilności genomowej. Mutacje TP53 , szczególnie warianty hotspot, występują w około 50% nowotworów ludzkich i mogą prowadzić do utraty funkcji supresyjnych nowotworów lub nabycia właściwości zyskujących funkcje, w tym agregacji w struktury przypominające priony.

W tym badaniu oceniliśmy tendencję agregacji mutacji p53 V157F w komórkach raka piersi Hs578T w porównaniu z komórkami MCF7 wyrażającymi dziki typ p53. Agregację białek oceniono za pomocą barwienia Thioflavin T (ThT), a następnie fluorescencji ilościowej w 96-dołkowych testach płytkowych. Komórki były barwione roztworem ThT/Hoechst, myte i analizowane za pomocą czytnika mikropłyt przy określonych parametrach wzbudzenia i emisji. Analiza ilościowa z wykorzystaniem pomiarów fluorescencji pojedynczych i czteropunktowych wykazała, że komórki Hs578T wykazywały wzrost intensywności fluorescencji ThT o 3,20 do 4,26 razy w porównaniu do MCF7, co wskazuje na istotnie podwyższone poziomy agregatów bogatych w β arkuszy lub podobnych do amyloidu. Pomiary wielopunktowe potwierdziły powszechną i stałą obecność agregatów białkowych na powierzchni dołku. Wyniki te wspierają zastosowanie wielopunktowego odczytu płytek do dokładnego wykrywania agregacji białek w testach komórkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen TP53, który koduje białko supresorowe nowotworowe p53, jest zmutowany w około 50% nowotworów ludzkich 1,2. Takie mutacje nie tylko niwelują funkcje supresyjne nowotworowe p53, ale w niektórych wariantach hotspotów sprzyjają także powstawaniu agregatów podobnych do prionów 3,4. Te zagregowane formy mutanta p53 często zyskują właściwości wzmacniające funkcje, w tym zwiększoną odporność na terapie przeciwnowotworowe 5,6. Dlatego identyfikacja, które mutacje hotspotów p53 są podatne na agregację, jest kluczowe dla opracowania skutecznych strategii leczenia nowotworów z mutacją p53 7,8.

W naszych wcześniejszych badaniach zaobserwowaliśmy, że konkretne mutacje p53 w liniach raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) oraz raka piersi wykazują silne sygnały barwienia Thioflawina T (ThT), wskazujące na obecność zagregowanych białek. ThT to barwnik benzotiaazolowy, który specyficznie wiąże się z β warstwami amyloidu, powodując zwiększoną fluorescencję po wiązaniu9. Na przykład linia komórkowa Detroit 562 HNSCC, która przenosi mutację p53 R175H, wykazywała silne sygnały fluorescencji ThT10. Podobnie dwie inne linie komórkowe HNSCC, TW01 i HONE-1, obie zawierające mutację p53 R280T, również wykazały wyraźne barwienie ThT11. W tych przypadkach sygnały ThT współlokalizowały się z p53, co potwierdza obecność zagregowanego p5310,11.

W komórkach raka piersi MDA-MB-231 (mutacja p53 R280K) i T47D (mutacja p53 L194F) również wykazywały silne barwienie ThT z wyraźną współlokalizacją p53/ThT12. Dla porównania, komórki MCF7, które wykazują dziki typ p53, oraz komórki MDA-MB-468 (mutacja p53 R273H) wykazywały jedynie słabe sygnały ThT12. Podobnie komórki OECM-1 HNSCC z mutacją p53 V173L wykazały niskie poziomy barwienia ThT10.

W porównaniu z innymi metodami wykrywania agregacji białek – takimi jak testy pułapek filtracyjnych, transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) czy immunodbarwienie za pomocą przeciwciał specyficznych dla agregatu – analiza fluorescencji ThT oferuje kilka zalet. Jest nieniszcząca, szybka i stosowalna zarówno do komórek żywych, jak i stałych, bez rozległego przetwarzania. Chociaż testy pułapek filtracyjnych skutecznie wychwytują nierozpuszczalne kruszywa, wymagają one surowej denaturacji i nie nadają się do stosowania w żywych komórkach13. TEM umożliwia bezpośrednią wizualizację morfologii włókien, ale jest pracochłonny i o niskiej przepustowości14. Immunobarwienie specyficzne dla agregatów umożliwia wykrywanie in situ przy użyciu przeciwciał zależnych od konformacji, choć dostępność i swoistość przeciwciał mogą ograniczać15. Dla porównania, fluorescencja ThT – zwłaszcza w połączeniu z wielopunktowym odczytem na płytkach – oferuje proste, ilościowe i przestrzennie wiarygodne podejście do wykrywania struktur bogatych w β arkuszy lub podobnych do amyloidu.

Praktyczne względy są również kluczowe dla powtarzalności. Fluorescencja ThT koreluje liniowo ze stężeniem amyloidu w szerokim zakresie stężeń (0,2-500 μM), a sygnał szczytowy zwykle osiąga się przy 20-50 μM, w zależności od białka – choć samofluorescencja ThT może pojawić się przy ≥5 μM, a wyższe stężenia mogą wpływać na kinetykę agregacji16. Dlatego zaleca się zazwyczaj działające stężenie ThT na poziomie około 10-20 μM, aby zrównoważyć czułość przy jednoczesnym minimalizowaniu potencjalnych efektów na procesy agregacji16. W naszym protokole zapas 1 000x ThT (12 mM) jest rozcieńczany w stosunku 1:1 000, aby uzyskać stężenie robocze około 12. μM, które mieści się w tym zalecanym zakresie.

ThT preferencyjnie wiąże się z amyloidowymi strukturami bogatymi w β arkusze, które są charakterystyczne dla włókien amyloidowych. Ta specyficzność wynika z interakcji barwnika z architekturą krzyżową β włókien amyloidowych, gdzie powierzchnie utworzone przez β-nici stanowią miejsca wiązania dla ThT. W konsekwencji ThT może nie wykrywać skutecznie innych nieprawidłowo złożonych lub nieamyloidowych agregatów, które nie wykazują tej struktury bogatej w β arkusze17. Dlatego choć ThT jest cennym narzędziem do identyfikacji włókien amyloidowych, zaleca się stosowanie komplementarnych metod walidacji – takich jak współlokalizacja z immunofluorescencją p53 lub podejścia biofizyczne – aby zweryfikować tożsamość i swoistość wykrytych agregatów10,18.

Badania predykcyjne struktury sugerują, że mutacja p53 V157F przyjmuje konformację bardziej podatną na agregację niż białko typu dzikiego19. W tym badaniu porównaliśmy sygnały fluorescencji ThT między komórkami raka piersi Hs578T, które zawierają mutację V157F podatną na agregację, a komórkami raka piersi MCF7 wyrażającymi dziki typ p53. Za pomocą wielopunktowego testu barwienia ThT opartego na czytniku płytowym staraliśmy się ocenić skłonność do agregacji p53 V157F w porównaniu do dzikiego typu p53.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Siewnictwo komórkowe

  1. Aby ocenić żywotność komórek, wymieszaj 10 μL Trypan Blue z 10 μL komórek zawieszonych ponownie w 1x soli fizjologicznej Dulbecco z buforem fosforanowym (DPBS) w rurce mikrowirówki i dokładnie wymieszaj.
  2. Załaduj 10 μL mieszanki na suwak do licznika, a następnie policz aktywne ogniwa za pomocą automatycznego licznika ogniw.
  3. Na podstawie liczby żywotności należy zasiać 30 000 żywotnych komórek na odwiert na płytę hodowlową z 96 dołkami, z jedną studnią oznaczoną jako kontrolną bez barwienia, a pozostałe trzy do barwienia.

2. Inkubacja

  1. Umieść płytkę hodowlę w inkubatorzeCO2 i inkubuj przez 12 godzin w temperaturze 37 °C.

3. Przygotowanie świeżego materiału do bejcowania ThT (1 000x)

  1. Waż 0,02 g (20 mg) proszku ThT i rozpuszczaj go w 5,0 mL wody dejonizowanej. Dokładnie wymieszaj, aż proszek całkowicie się rozpuści.
    UWAGA: Preparat ten daje roztwór bulwarowy 1 000x ThT o końcowym stężeniu 4 mg/mL, co odpowiada 12,5 mM (ThT ma masę cząsteczkową ~318,85 g/mol). Roztwór o stężeniu 4 mg/mL daje 4 g/L. Podzielenie 4 g/L przez 318,85 g/mol daje 0,0125 mol/L, czyli ~12,5 mM).

4. Przygotowanie buforu barwiącego ThT z jądrowym kontrastem

  1. Przygotuj roztwór barwiący, dodając do 1 mL 1x DPBS i delikatnie wymieszaj, aby zapewnić jednorodność.
    1. Dodaj 1 μL świeżo przygotowanego zapasu 1000x ThT, co daje końcowe stężenie ThT 12,5 μM (1x).
    2. Dodaj 1 μL roztworu zapasowego Hoechst 33342 o stężeniu 1 mg/mL, co daje końcowe stężenie ~1 μg/mL (=1,6 μM).

5. Barwienie

  1. Usuń podłoże hodowlane z każdego dołku. Do każdego dołka do barwienia dodaj 100 μL przygotowanego bufora barwiącego ThT/Hoechst. Dodaj 100 μL 1x DPBS do kontroli bez barwników.

6. Inkubacja

  1. Umieść talerz w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej (25 °C) na 30 minut.

7. Pranie

  1. Ostrożnie zasysaj lub wyrzucaj roztwór barwiący z każdego dołku, uważając, aby nie zakłócić monowarstwy komórki.
  2. Dodaj 100 μL 1× DPBS do każdego otworu i pozwól na opcjonalne delikatne 30-sekundowe moczenie.
  3. Ostrożnie zasysaj lub wyrzuć roztwór DPBS.
  4. Powtórz mycie, dodając 100 μL świeżego 1x DPBS do każdego dołku, ponownie pozwalając na opcjonalne 30-sekundowe delikatne namoczanie, a następnie wyrzuć roztwór DPBS.
  5. Po drugim przepłukaniu dodaj 100 μL świeżego 1x DPBS do każdego otworu.

8. Pomiar fluorescencji

  1. Przed odczytem sygnału fluorescencyjnego usuń pokrywkę z płyty 96-dołkowej. Mierz fluorescencję jedną z dwóch metod: odczyt jednopunktowy lub czteropunktowy.
  2. Umieść płytkę z 96 dołkami w czytniku mikropłytek i mierz fluorescencję przy następujących ustawieniach: ThT fluorescencji: Wzbudzenie przy 450 nm, emisja przy 490 nm; Hoechst 33342 fluorescencja: Wzbudzenie przy 360 nm, emisja przy 460 nm; ustawienia czytelnika: Drżenie: 5 sekund przed czytaniem; Kierunek czytania: Najlepszy lektura; Czas integracji: 140 ms; Wysokość odczytu: 1,00 mm; Punkty na well: 1 (koniec końcowy) lub 4 (skan studni); Ustawienie wstudu: (Gęstość: 2; Odstęp punktów: 2,5).

9. Analiza danych

  1. Oblicz agregację białek w następujący sposób:
    figure-protocol-1
  2. Normalizuj intensywność fluorescencji ThT, ustawiając stosunek w komórkach MCF7 na 1 (kontrola bazowa).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać obecność agregatów białkowych bogatych w β arkusze w komórkach raka piersi, linie komórkowe MCF7 i Hs578T zostały poddane barwieniu ThT, a następnie kwantyfikacji fluorescencji. Jak pokazano na Rysunku 1, komórki zostały zasiane do czterech dołków płyty z 96 dołkami, z jednym odsłonem oznaczonym jako kontrolny bez barwienia. Pozostałe trzy studnie zostały zabarwione ThT zgodnie ze standardowym protokołem. Fluorescencję mierzono dwoma podejściami: (1) odczytem pojedynczego punktu p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas zasiewania komórek na płytkach z 96 dołkami często trudno jest osiągnąć równomierny rozkład na powierzchni dołka, ponieważ delikatne potrząsanie lub stuknięcie w płytkę, aby rozprowadzić komórki, nie zawsze jest możliwe. Ten nierówny rozkład może wprowadzać zmienność intensywności sygnału w całej studni. Wielopunktowe odczyty fluorescencji wykazały istotne różnice między różnymi obszarami w tej samej studni, podkreślając tę stronniczość i potencjalne wprowadzenie mylących wyników przy pomiarze tylko jednego punkt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy z wdzięcznością dziękują za pomoc techniczną udzieloną przez Podstawowe Laboratorium Medyczne na Wydziale Medycyny Uniwersytetu I-Shou. Prace te były wspierane grantami od E-DA Hospital [EDAHJ114001 dla C.-C.C.] oraz National Science and Technology Council na Tajwanie [NSTC 112-2813-C-214-032-B dla B.-H. C]

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płyta hodowla z 96 dołkamiPo prostuPC396-0100
Przeciwny przesuwInvitrogenC10228
Countess II FL Automatyczny Licznik Komórek Komórkowych Hrabiny II FLThermo Fisher Scientific  AMQAF1000
dPBSPo prostuCC704-0500
Rurka EppendorfaPo prostuPC101-5000
Hoechst 33342AAT Bioquest17530
SpectraMax iD3Urządzenia molekularne735-0391 
Thioflavin TSigma-AldrichT3516
Trypan BlueInvitrogenT10282

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Binayke, A., Mishra, S., Suman, P., Das, S., Chander, H. Awakening the "guardian of genome": Reactivation of mutant p53. Cancer Chemother Pharmacol. 83 (1), 1-15 (2019).
  2. Chen, C. C., et al. A simple and affordable method to create nonsense mutation clones of p53 for studying the premature termination codon readthrough activity of ptc124. Biomedicines. 11 (5), 1310(2023).
  3. Rangel, L. P., Costa, D. C., Vieira, T. C., Silva, J. L. The aggregation of mutant p53 produces prion-like properties in cancer. Prion. 8 (1), 75-84 (2014).
  4. Kim, S., An, S. S. Role of p53 isoforms and aggregations in cancer. Medicine (Baltimore). 95 (26), e3993(2016).
  5. Zhou, G., et al. Gain-of-function mutant p53 promotes cell growth and cancer cell metabolism via inhibition of ampk activation. Mol Cell. 54 (6), 960-974 (2014).
  6. Zhang, C., et al. Gain-of-function mutant p53 in cancer progression and therapy. J Mol Cell Biol. 12 (9), 674-687 (2020).
  7. De Oliveira, G. aP., et al. The status of p53 oligomeric and aggregation states in cancer. Biomolecules. 10 (4), 548(2020).
  8. Wang, H., Guo, M., Wei, H., Chen, Y. Targeting p53 pathways: Mechanisms, structures, and advances in therapy. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 92(2023).
  9. Sulatskaya, A. I., Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K. Interaction of thioflavin t with amyloid fibrils: Stoichiometry and affinity of dye binding, absorption spectra of bound dye. J Phys Chem B. 115 (39), 11519-11524 (2011).
  10. Cai, B. H., et al. Nampt inhibitor and p73 activator represses p53 r175h mutated HNSCC cell proliferation in a synergistic manner. Biomolecules. 12 (3), 438(2022).
  11. Cai, B. H., et al. Chlorophyllides repress gain-of-function p53 mutated hnscc cell proliferation via activation of p73 and repression of p53 aggregation in vitro and in vivo. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871 (3), 167662(2025).
  12. Wu, K. -Y., et al. Synergistic anticancer activity of hsp70 inhibitor and doxorubicin in gain-of-function mutated p53 breast cancer cells. Biomedicines. 13 (5), 1034(2025).
  13. Nasir, I., Linse, S., Cabaleiro-Lago, C. Fluorescent filter-trap assay for amyloid fibril formation kinetics in complex solutions. ACS Chem Neurosci. 6 (8), 1436-1444 (2015).
  14. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly: Insights from scanning transmission electron microscopy. J Struct Biol. 173 (1), 1-13 (2011).
  15. Kayed, R., et al. Fibril specific, conformation dependent antibodies recognize a generic epitope common to amyloid fibrils and fibrillar oligomers that is absent in prefibrillar oligomers. Mol Neurodegener. 2, 18(2007).
  16. Xue, C., Lin, T. Y., Chang, D., Guo, Z. Thioflavin t as an amyloid dye: Fibril quantification, optimal concentration and effect on aggregation. R Soc Open Sci. 4 (1), 160696(2017).
  17. Biancalana, M., Koide, S. Molecular mechanism of thioflavin-t binding to amyloid fibrils. Biochim Biophys Acta. 1804 (7), 1405-1412 (2010).
  18. Yang-Hartwich, Y., et al. P53 protein aggregation promotes platinum resistance in ovarian cancer. Oncogene. 34 (27), 3605-3616 (2015).
  19. Lei, J., et al. Insights into allosteric mechanisms of the lung-enriched p53 mutants v157f and r158l. Int J Mol Sci. 23 (17), 10100(2022).
  20. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  21. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochem Biophys Rep. 26, 100987(2021).
  22. Yoshimura, Y., et al. Distinguishing crystal-like amyloid fibrils and glass-like amorphous aggregates from their kinetics of formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (36), 14446-14451 (2012).
  23. Yang, D. S., et al. Mesoscopic protein-rich clusters host the nucleation of mutant p53 amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (10), e2015618118(2021).
  24. Hackl, E. V., Darkwah, J., Smith, G., Ermolina, I. Effect of acidic and basic ph on thioflavin t absorbance and fluorescence. Eur Biophys J. 44 (4), 249-261 (2015).
  25. Bom, A. P., et al. The p53 core domain is a molten globule at low ph: Functional implications of a partially unfolded structure. J Biol Chem. 285 (4), 2857-2866 (2010).
  26. Ano Bom, A. P., et al. Mutant p53 aggregates into prion-like amyloid oligomers and fibrils: Implications for cancer. J Biol Chem. 287 (33), 28152-28162 (2012).
  27. Muller, P., Ceskova, P., Vojtesek, B. Hsp90 is essential for restoring cellular functions of temperature-sensitive p53 mutant protein but not for stabilization and activation of wild-type p53: Implications for cancer therapy. J Biol Chem. 280 (8), 6682-6691 (2005).
  28. Arsic, N., et al. Δ133p53β isoform pro-invasive activity is regulated through an aggregation-dependent mechanism in cancer cells. Nat Commun. 12 (1), 5463(2021).
  29. Zhao, L., Punga, T., Sanyal, S. Delta133p53alpha and delta160p53alpha isoforms of the tumor suppressor protein p53 exert dominant-negative effect primarily by co-aggregation. Elife. 14, RP106469(2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Agregacja p53barwienie tioflawin Tdetekcja agregacji bia ekfluorescencja wielopunktowamutacja TP53agregaty amyloidoweczytnik mikrop ytekkom rki Hs578Tilo ciowe oznaczanie fluorescencji

Powiązane artykuły