Artykuł metodologiczny

Model myszy oparty na bieżni do badania uderzeń gorąca z ciągłym monitorowaniem temperatury skóry

DOI:

10.3791/68922

⸱

14 października 2025

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Genetics and Development of Complex Phenotypes, School of Life Sciences, Fudan University, 2Department of Endocrinology, Jinshan Hospital, Fudan University, 3Institutes of Biomedical Sciences, School of Life Sciences, Inner Mongolia University, 4Department of Endocrinology and Metabolism, Zhongshan Hospital, Human Phenome Institute, Fudan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to ustanawia mysi model uderzeń gorąca w okresie menopauzy poprzez połączenie jajnikomii z termogenezą wywołaną wysiłkiem fizycznym i ciągłym monitorowaniem temperatury skóry ogona w wysokiej rozdzielczości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uderzenia gorąca znacznie pogarszają jakość życia kobiet w okresie menopauzy, jednak leżące u ich podstaw mechanizmy neuronalne i skuteczne terapie pozostają słabo poznane. Dużym wyzwaniem w tej dziedzinie jest brak wiarygodnych modeli zwierzęcych i nieinwazyjnych metod ciągłego monitorowania temperatury skóry. W tym przypadku opracowano mysi model łączący owariektomię z termogenezą wywołaną wysiłkiem fizycznym w celu zbadania uderzeń gorąca. Korzystając z rejestratora telemetrycznego zabezpieczonego wydrukowanym w 3D rękawem ogonowym, temperatura skóry ogona była stale monitorowana w stanie bezstresowym. Ponadto kamery termowizyjne stanowią uzupełniającą metodę monitorowania produkcji i rozpraszania ciepła, co pozwala na bardziej kompleksową ocenę temperatury ciała. Korzystając z tego modelu, stwierdzono, że myszy po owariektomii wykazywały wyższy wzrost temperatury skóry i niższą temperaturę ciała, skutecznie naśladując fenotyp uderzenia gorąca obserwowany w okresie menopauzy. Podejście to ustanawia precyzyjny model monitorowania uderzeń gorąca i będzie cenne dla naukowców zajmujących się termoregulacją, neurobiologią i badaniami klinicznymi nad menopauzą.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uderzenia gorąca są jednymi z najczęstszych i najbardziej destrukcyjnych objawów menopauzy, znacznie pogarszając jakość życia1. Epizody te charakteryzują się nagłym wzrostem temperatury skóry, po którym następuje przejściowy spadek temperatury ciała2, któremu często towarzyszy przyspieszone tętno, niepokój i zawroty głowy3. Pomimo ich głębokiego wpływu, skuteczność terapii pozostaje ograniczona4, co podkreśla potrzebę głębszego zrozumienia mechanizmów leżących u ich podstaw.

Kluczowym krokiem w badaniu uderzeń gorąca jest opracowanie wiarygodnych modeli zwierzęcych, które dokładnie odwzorowują dysfunkcję termoregulacji. Obecnie podstawowym podejściem jest wycięcie owariektomii (OVX), która wywołuje zmianę temperatury skóry i ciała5. Jednak zmiany te są często niespójne, ponieważ mogą być zakłócone przez stres lub wahania temperatury otoczenia6. Co więcej, uchwycenie sporadycznych zdarzeń przypominających uderzenia gorąca pozostaje wyzwaniem. Metody alternatywne wykorzystują środki farmakologiczne (np. senktyd, kapsaicynę, tamoksyfen lub nalokson) w celu wywołania ostrego rozszerzenia naczyń krwionośnych skóryu gryzoni 7,8,9. Podczas gdy związki te powodują szybki, mierzalny wzrost temperatury skóry, ich inwazyjne podawanie i efekty zależne od dawki komplikują interpretację reakcji termoregulacyjnych. Co więcej, nie jest jasne, czy rozszerzenie naczyń krwionośnych wywołane lekami w pełni podsumowuje warunki fizjologiczne naturalnych uderzeń gorąca. Dlatego pilnie potrzebny jest bardziej wyrafinowany i niezawodny model zwierzęcy.

Ćwiczenia są dobrze znanym modulatorem temperatury ciała i zostały powiązane z indukcją uderzeń gorąca u ludzi10. Niektóre badania wykorzystywały wymuszone ćwiczenia na myszach, aby naśladować wzorce rozpraszania ciepła przypominające uderzenia gorąca 11,12,13. Chociaż podejście to zapewnia nieinwazyjny sposób na wywoływanie wahań temperatury, monitorowanie temperatury skóry u aktywnych myszy, szczególnie za pomocą termografii w podczerwieni, jest technicznie trudne. Dodatkowo, kompleksowa ocena objawów przypominających uderzenia gorąca wymaga ciągłego, długoterminowego rejestrowania zarówno temperatury ogona (skóry), jak i rdzenia ciała.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano zoptymalizowany model myszy, łączący owariektomię z ćwiczeniami indukowanymi na bieżni, aby niezawodnie wywoływać reakcje termoregulacyjne podobne do uderzeń gorąca. W eksperymencie myszy C57BL/6J od 8 do 10 tygodni trzymano w standardowych warunkach (cykl 12:12 jasny-ciemny, 22 °C ±1 °C, 50% ± 10% wilgotności). Co więcej, telemetryczny rejestrator temperatury zabezpieczony wydrukowaną w 3D tuleją ogonową został zaprojektowany, aby umożliwić bezstresowe, ciągłe monitorowanie temperatury ogona u swobodnie poruszających się myszy. Zastosowano również termografię w podczerwieni, aby dostarczyć uzupełniających danych na temat produkcji i rozpraszania ciepła. Model ten będzie służył jako cenne narzędzie do badania mechanizmów uderzeń gorąca i oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody te zostały zaprojektowane dla modeli mysich. Badania na myszach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Fudan (2021JS0040). Przed wdrożeniem protokołu zwierzęta były trzymane zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywania. W tym badaniu samice myszy C57BL/6J w wieku od 8 do 10 tygodni o wadze 20-23 g były trzymane w standardowych warunkach (12:12 h cykl jasno-ciemny, 22 °C ± 1 °C, 50% ± 10% wilgotności). Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie eksperymentalne

  1. Przygotuj dziesięć 8-10 tygodniowych samic myszy trzymanych w standardowych warunkach (cykl jasny-ciemny 12:12, 22 °C ±1 °C, 50% ± 10% wilgotności) z jedzeniem ad libitum i wodą.
  2. Losowo przydziel myszy do grup OVX i pozorowanych (n = 5 / grupa). Zgrupowany dom, aby pomóc w synchronizacji cykli rujowych.
  3. Konfiguracja protokołu bieżni
    1. Otwórz oprogramowanie sterujące bieżnią "TSE Treadmill (USB) 5.1.7_2" na podłączonym komputerze (rysunek uzupełniający 1).
    2. Zainicjuj nowy plik eksperymentalny, wybierając pozycję Plik > Zainicjuj nowy plik na pasku menu.
    3. Zaprogramuj uruchomiony protokół:
      1. Ustaw pierwszy segment: przyspieszenie 0-20 s od 0-0,17 m/s.
      2. Ustaw drugi segment: 20-150 s stała prędkość na 0,17 m/s.
      3. Ustaw trzeci segment: przyspieszenie 150-170 s od 0,17-0,25 m/s.
      4. Ustaw ostatni segment: 170-600 s stała prędkość na 0,25 m/s10,12.
        UWAGA: Nie używaj stymulacji elektrycznej w tym eksperymencie, aby uniknąć dodatkowego stresu.

2. Monitorowanie cyklu rujowego

  1. Wymazy z pochwy należy wymazywać na szkiełku barwiącym codziennie o tej samej porze każdego dnia przez 8 kolejnych dni, przepłukując 100 μl sterylnego PBS za pomocą pipety.
  2. Próbki suszyć na powietrzu na szkiełkach przez 24 godziny w dygestorium.
  3. Próbki zanurzyć na krótko w 100% metanolu w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Metanol jest toksyczny przez wdychanie, spożycie lub kontakt ze skórą. Używaj w dobrze wentylowanym dygestorium, noś rękawice nitrylowe i unikaj iskier/płomieni.
  4. Rozcieńczyć komercyjny 20× barwnik Giemsa do 1× za pomocą PBS.
  5. Zabarwić szkiełka utrwalone metanolem za pomocą 1× Giemsa w ciemności przez 1-2 godziny.
  6. Zbadaj cytologię pochwy, aby określić stadia rujowe na podstawie tych badań14,15.
  7. Kontynuuj eksperymenty, gdy myszy są w proestrus (ryc. 2B).
    UWAGA: Z myszami należy obchodzić się delikatnie, aby uniknąć zakłóceń cyklu spowodowanych stresem. Unikaj głębokiego wkładania końcówek pipet, aby zapobiec ciąży rzekomej.

3. Operacja wycięcia jajników

  1. Zapisz wagę myszy i znieczul myszy izofluranem. Użyj poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia podczas operacji.
  2. Ogol włosy w okolicy grzbietowo-bocznej obustronnie przed tylnymi nogami i zdezynfekuj 70% etanolem i jodem na przemian 3 razy.
  3. Wykonaj nacięcie przykręgosłupowe o długości 1 cm na skórze i użyj narzędzia o końcówce, aby oddzielić skórę od leżącej poniżej tkanki mięśniowej. Następnie wykonaj nacięcie w ścianie mięśniowej. Odsłoń poduszeczki tłuszczowe jajników za pomocą wacików.
  4. Podwiązywać naczynia krwionośne jajników za pomocą szwów. Wycięcie jajników nożyczkami chirurgicznymi16.
  5. Zamknij nacięcie warstwami, mięśniami i skórą za pomocą niewchłanialnych szwów. Delikatnie oczyść skórę wokół miejsca operowanego solą fizjologiczną, aby usunąć zaschniętą krew lub resztki peelingu antyseptycznego.
  6. W przypadku pozorowanych kontroli odetnij kawałek poduszeczki tłuszczowej bez dotykania jajników.
  7. Monitoruj stan zdrowia myszy codziennie przez 7 dni po operacji.
    UWAGA: Upewnij się, że myszy są trzymane na poduszce grzewczej w temperaturze około 35 °C przez cały proces znieczulenia.

4. Implantacja rejestratora temperatury rdzenia

  1. Programowanie i inicjalizacja rejestratora (rysunek uzupełniający 2).
    1. Włóż rejestrator temperatury pionowo do stacji dokującej.
    2. Kliknij Recorder > Connect na pasku menu oprogramowania.
    3. Wybierz opcję Edit > New Measurement Seq. Def. z paska menu.
    4. Wybierz opcję Wiele interwałów nagrywania z opcji trybu nagrywania.
    5. Ustaw parametry: Data rozpoczęcia: [RRRR-MM-DD GG:MM], Data zakończenia: [RRRR-MM-DD GG:MM], Interwał nagrywania: 5 min.
    6. Dodaj ustawienie interwałów do sekwencji.
    7. Kliknij Rejestrator > rozpocznij nową sekwencję pomiarową.
  2. Pod narkozą ogol się i zdezynfekuj skórę brzucha.
    UWAGA: Ta procedura implantacji rejestratora temperatury jamy brzusznej może być wykonywana wraz z operacją OVX, aby uniknąć wielu operacji.
  3. Wykonaj 2 cm nacięcie skóry w linii środkowej około 1 cm poniżej przepony.
  4. Przedłuż nacięcie wzdłuż kresy białej, aby otworzyć jamę otrzewnej.
  5. Delikatnie włóż rejestrator temperatury rdzenia do jamy brzusznej wzdłuż płaszczyzny strzałkowej.
    UWAGA: Prawidłowe umieszczenie ma kluczowe znaczenie dla dokładnych odczytów temperatury. Unikaj powierzchownego umieszczania w pobliżu skóry, ponieważ temperatura otoczenia może zakłócać pomiary.
  6. Zszyj nacięcie brzucha za pomocą niewchłanialnych szwów 5-0.
  7. Zdezynfekuj brzuch roztworem jodu.
    UWAGA: Uważnie obserwuj zwierzę podczas rekonwalescencji. Utrzymuj ciepłe otoczenie za pomocą poduszki grzewczej, aż myszy w pełni się obudzą.

5. Mocowanie rejestratora temperatury montowane na ogonie

  1. Programowanie i inicjalizacja rejestratora (patrz procedura kroku 4.1, Modyfikowanie interwału nagrywania na 2 min).
  2. Oczyść ogon za pomocą machnięcia etanolem. Zdezynfekuj rękaw 3D 70% etanolem i zamocuj rejestrator temperatury wewnątrz rękawa.
  3. Nałóż szybkoutwardzalny klej na rękaw. Ustaw rejestrator 1 cm od podstawy ogona (Rysunek 1A). Upewnij się, że powierzchnia detekcyjna rejestratora jest w bliskim kontakcie ze skórą. Upewnij się, że rejestrator jest zamocowany po brzusznej stronie ogona, aby zminimalizować obciążenie ruchem.
  4. Przytrzymaj go na miejscu z naciskiem przez 2 minuty. W razie potrzeby użyj krótkiego znieczulenia w celu precyzyjnego umieszczenia.
    UWAGA: Codziennie monitoruj obrzęk ogona lub oderwanie się rejestratora po umieszczeniu. Prawidłowo podłączone urządzenie może pozostać w dobrym stanie przez co najmniej 3 dni.

6. Bieganie na bieżni i zbieranie danych

  1. Zaaklimatyzuj myszy na bieżni podczas fazy światła przez 3 dni, korzystając z protokołu w kroku 1.3.
    1. Umieść myszy pojedynczo na stacjonarnym pasie bieżni. Odczekaj 10 minut na eksplorację środowiska i przyzwyczajenie się.
    2. Wykonaj protokół:
      1. Kliknij przycisk Zmierz. Kliknij Start , aby zainicjować bieżnię.
      2. Wybierz opcję Start Profile (Profil początkowy ), aby uruchomić zaprogramowany uruchomiony protokół.
  2. Zamocuj rejestrator temperatury ogona na 24 godziny przed eksperymentami, aby zapewnić dobre przyzwyczajenie (patrz krok 5).
  3. Bieżnia działająca w lekkiej fazie dnia eksperymentalnego:
    1. Rejestruj temperaturę podstawową przez 30 s za pomocą kamery na podczerwień 10 minut przed treningiem. Temperatura rdzenia jest rejestrowana jednocześnie za pomocą wszczepionego rejestratora temperatury jamy brzusznej.
    2. Uruchom myszy na bieżni zgodnie z protokołem w kroku 1.3.
      UWAGA: Upewnij się, że myszy działają nieprzerwanie przez 600 s. Jeśli myszy przestaną biegać, delikatnie zachęcaj do kontynuowania ruchu za pomocą szczotki do włosów.
    3. Po biegu na bieżni przenieś myszy do czystych klatek. Zmierz temperaturę ogona za pomocą termografii w podczerwieni po 0 min, 5 min, 10 min i 15 min po wysiłku.

7. Analiza danych

  1. W przypadku danych dotyczących podczerwieni i temperatury rdzenia:
    1. Oblicz linię bazową jako średnią temperaturę przed treningiem.
    2. Wykreślić ΔT (temperatura po wysiłku fizycznym – linia podstawowa) dla każdego punktu czasowego.
  2. Dla danych rejestratora temperatury ogona:
    1. Użyj 10-minutowej średniej przed ćwiczeniem jako punktu odniesienia.
    2. Obliczaj ΔT w odstępach 2 minut przez 15 minut po wysiłku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowanie niezawodnego systemu monitorowania termoregulacyjnego

Aby stworzyć wiarygodny model do pomiaru temperatury rdzenia i skóry, zaprojektowano niestandardową osłonę ogonową wydrukowaną w 3D, aby bezpiecznie przymocować rejestrator temperatury 1 cm od podstawy ogona (rysunek 1A), umożliwiając ciągły i precyzyjny pomiar rozpraszania ciepła podczas uderzeń gorąca wywołanych wys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to ustanawia praktyczny i ilościowy model myszy do badania uderzeń gorąca w okresie menopauzy, wypełniając krytyczną lukę w tej dziedzinie. Integracja jajnikomii z termogenezą wywołaną wysiłkiem fizycznym z powodzeniem podsumowuje podstawowe cechy uderzeń gorąca u ludzi, a mianowicie szybki wzrost temperatury skóry ogona, po którym następuje spadek temperatury głębokiej ciała18. Model ten łączy w sobie i rozszerza mocne strony istniejących podejść, wzmacniając zmiany temperatury i umożliwi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium za pomoc w przygotowaniu tego manuskryptu. Prace te były wspierane przez fundusze z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin 32171144 oraz Niezakaźne choroby przewlekłe - National Science and Technology Major Project (2024ZD0530300).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wszczepialny rejestrator temperatury dla zwierzątGwiazda-OddiCzas letni nano-T
Myszy C57BL/6JGemPharmatechN000013
Roztwór do barwienia GiemsaBeyotimeZobacz materiał C0133
Obrazy termowizyjne w podczerwieni VarioCAM (wersja VarioCAM)Głowica VC HD 980
Systemy bieżniTSETreadmill_6M

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stearns, V., et al. Hot flushes. Lancet. 360 (9348), 1851-1861 (2002).
  2. Gombert-Labedens, M., Kristine, V., Andrea, F., Maloney, S. K., Baker, F. C. Effects of menopause on temperature regulation. Temperature. 12 (2), 92-132 (2025).
  3. Kronenberg, F. Menopausal hot flashes: A review of physiology and biosociocultural perspective on methods of assessment. J Nutr. 140 (7), 1380S-1385S (2010).
  4. Koysombat, K., Mcgown, P., Nyunt, S., Abbara, A., Dhillo, W. S. New advances in menopause symptom management. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 38 (1), 101774(2024).
  5. Kobayashi, T., et al. Elevation of tail skin temperature in ovariectomized rats in relation to menopausal hot flushes. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 278 (4), R863-R869 (2000).
  6. Krajewski-Hall, S. J., Blackmore, E. M., Mcminn, J. R., Rance, N. E. Estradiol alters body temperature regulation in the female mouse. Temperature (Austin). 5 (1), 56-69 (2018).
  7. Krull, A. A., Larsen, S. A., Clifton, D. K., Neal-Perry, G., Steiner, R. A. A comprehensive method to quantify adaptations by male and female mice with hot flashes induced by the neurokinin B receptor agonist senktide. Endocrinology. 158 (10), 3259-3268 (2017).
  8. Merchenthaler, I., et al. The effect of estrogens and antiestrogens in a rat model for hot flush. Maturitas. 30 (3), 307-316 (1998).
  9. Zhang, Z., et al. Estrogen receptor alpha in the brain mediates tamoxifen-induced changes in physiology in mice. Elife. 10, e63333(2021).
  10. Witkowski, S., et al. Acute increases in physical activity and temperature are associated with hot flash experience in midlife women. Menopause. 31 (7), 600-607 (2024).
  11. Ban, Y. -H., et al. A hop extract Lifenol improves postmenopausal overweight, osteoporosis, and hot flash in ovariectomized rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2018 (1), 2929107(2018).
  12. Shuto, H., et al. Forced exercise-induced flushing of tail skin in ovariectomized mice, as a new experimental model of menopausal hot flushes. J Pharmacol Sci. 98 (3), 323-326 (2005).
  13. Wilhelms, D. B., et al. CGRP is critical for hot flushes in ovariectomized mice. Front Pharmacol. 9, 1452(2018).
  14. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538(2012).
  15. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: Review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicol Pathol. 43 (6), 776-793 (2015).
  16. Rowe, A. A., Issioui, Y., Johnny, B., Wert, K. J. Murine orchiectomy and ovariectomy to reduce sex hormone production. J Vis Exp. (201), e64379(2023).
  17. Goldman, J. M., Murr, A. S., Cooper, R. L. The rodent estrous cycle: Characterization of vaginal cytology and its utility in toxicological studies. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. 80 (2), 84-97 (2007).
  18. Freedman, R. R. Physiology of hot flashes. Am J Hum Biol. 13 (4), 453-464 (2001).
  19. Zhang, Z., et al. Estrogen-sensitive medial preoptic area neurons coordinate torpor in mice. Nat Commun. 11 (1), 6378(2020).
  20. Ekambaram, G., Sampath Kumar, S. K., Joseph, L. D. Comparative study on the estimation of estrous cycle in mice by visual and vaginal lavage method. J Clin Diagn Res. 11 (1), Ac05-Ac07 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model uderze gor camyszy owariektomizowanetermoregulacjawiczenia na bie nirejestrator telemetrycznykamera na podczerwiebadania nad menopauzwewn trzna temperatura cia a

Powiązane artykuły