Modelowanie farmakoforów dla celów z obszernymi bibliotekami ligandów: studium przypadku SARS-CoV-2 Mpro

Podsumowanie

W artykule przedstawiono protokół konstruowania modelu farmakoforu konsensusu poprzez integrację cech molekularnych z wielu ligandów. Metoda ta ma zastosowanie w pracach nad odkrywaniem leków ukierunkowanych na dowolny cel biologiczny o znanych konformacjach związanych z ligandem, umożliwiając identyfikację kluczowych cech interakcji dla wirtualnych badań przesiewowych i racjonalnego projektowania leków.

Streszczenie

Farkofor określa przestrzenny układ cech molekularnych wymaganych do optymalnych interakcji między związkiem a jego celem biologicznym. Modele te można uzyskać, analizując interakcje międzycząsteczkowe między celem a zestawem znanych ligandów w ich konformacjach wiązania. Farmakofor oparty na konsensusie integruje wspólne cechy wielu ligandów, zmniejszając błąd systematyczny modelu i zwiększając moc predykcyjną. Jednak wygenerowanie solidnego farmakoforu opartego na konsensusie z dużego i zróżnicowanego chemicznie zestawu ligandów stanowi wyzwanie techniczne.

W tym miejscu przedstawiamy protokół budowy farmakoforów konsensusu przy użyciu ConPhar, narzędzia informatycznego typu open source zaprojektowanego do identyfikacji i grupowania cech farmakoforycznych w wielu kompleksach związanych z ligandami. Protokół obejmuje generowanie, udoskonalanie i stosowanie modeli do wirtualnego badania przesiewowego ultradużych bibliotek molekularnych. Jako studium przypadku zastosowaliśmy metodę do głównej proteazy SARS-CoV-2 (Mpro), używając stu niekowalencyjnych inhibitorów skrystalizowanych z celem. Uzyskany w ten sposób model farmakoforowy pozwolił uchwycić kluczowe cechy interakcji w regionie katalitycznym Mpro i umożliwił identyfikację nowych potencjalnych ligandów.

Strategia ta ma szerokie zastosowanie do każdego celu biologicznego, dla którego dostępne są konformacje związane z ligandem. Jest to szczególnie cenne dla celów z obszernymi zestawami danych ligandów i wspiera racjonalne odkrywanie leków poprzez usprawnienie identyfikacji nowych kandydatów o pożądanych profilach interakcji.

Wprowadzenie

Modelowanie farmakoforowe jest podstawową techniką w komputerowym wspomaganiu projektowania leków, umożliwiającą identyfikację istotnych cech molekularnych odpowiedzialnych za aktywność biologiczną ^1,2. Farmakor określa przestrzenny układ cech, takich jak donory wiązań wodorowych, akceptory, pierścienie aromatyczne i regiony hydrofobowe, wymagane do interakcji molekularnej między ligandem a celem biologicznym³. Gdy dostępnych jest wiele kompleksów ligand-cel, zarówno z krystalografii eksperymentalnej, jak i modelowania molekularnego, wspólne wzorce interakcji można zintegrować z modelami farmakoforowymi konsensusu, zwiększając niezawodność modelu i zwiększając dokładność wirtualnych badań przesiewowych ^4,5.

Pomimo użyteczności farmakoforów opartych na konsensusie, ich wytwarzanie pozostaje wyzwaniem technicznym, zwłaszcza gdy ligandy są zróżnicowane strukturalnie. Dostępnych jest kilka narzędzi programowych do generowania farmakoforów z poszczególnych ligandów, ale brakuje ustandaryzowanych procedur integracji wielu zestawów funkcji w spójny model ^6,7. Co więcej, niewiele platform oferuje kompleksowe przepływy pracy, które obsługują grupowanie, filtrowanie i eksportowanie funkcji w formatach kompatybilnych z narzędziami do przesiewania i wizualizacji⁸. Ograniczenia te ograniczyły szerokie zastosowanie farmakoforów konsensusu w wysiłkach związanych z odkrywaniem leków na dużą skalę.

Aby wypełnić tę lukę, ConPhar został opracowany jako nowatorskie narzędzie typu open source, zaprojektowane specjalnie do systematycznej ekstrakcji, grupowania i modelowania konsensusu cech farmakoforycznych z obszernych zestawów wstępnie wyrównanych kompleksów ligand-cel. W przeciwieństwie do istniejącego oprogramowania, ConPhar oferuje elastyczne dostrajanie parametrów, automatyczną integrację funkcji i kompatybilność z wieloma formatami wyjściowymi, ułatwiając generowanie solidnych modeli konsensusu odpowiednich dla wirtualnych potoków przesiewowych. W ten sposób narzędzie to pozwala przezwyciężyć wcześniejsze wąskie gardła w obsłudze dużych i zróżnicowanych chemicznie bibliotek ligandów, zwiększając odtwarzalność i skalowalność w przepływach pracy związanych z modelowaniem farmakoforów.

Aby zademonstrować to podejście, przedstawiamy powtarzalny protokół konstruowania konsensusowych modeli farmakoforowych na podstawie zbiorów kompleksów ligand-cel. Przepływ pracy integruje narzędzia typu open source do ekstrakcji cech farmakoforów, grupowania, wizualizacji i dalszych zastosowań. W ramach studium przypadku zastosowaliśmy protokół do głównej proteazy SARS-CoV-2 (Mpro), krytycznego celu terapeutycznego z obszernymi danymi strukturalnymi⁹. Opracowaliśmy zestaw danych 100 ligandów niekowalencyjnych skrystalizowanych wspólnie z Mpro (wpisy PDB na dzień 27 maja 2025 r.), z wyłączeniem form apo i redundantnych kompleksów. Poszczególne cechy farmakoforyczne zostały wyodrębnione i połączone w model konsensusu za pomocą ConPhar, narzędzia zaprojektowanego specjalnie do grupowania cech¹⁰. Ten przypadek ilustruje zdolność protokołu do ujawniania konserwatywnych wzorców interakcji i wspierania racjonalnego badania przesiewowego ultradużych bibliotek.

Protokół

1. Metoda 1

1. Przygotowanie ligandów do generowania farmakoforów konsensusowych
   1. Dopasuj wszystkie kompleksy białko-ligand za pomocą oprogramowania PyMOL¹¹.
   2. Wyodrębnij każdy wyrównany konformer liganda i zapisz go jako osobny plik w formacie SDF.
      UWAGA: Inne formaty, takie jak MOL, MOL2 i PDB, mogą być również używane dla opisanego tutaj protokołu.
2. Generowanie plików JSON farmakoforów przy użyciu programu Pharmit¹²
   1. Prześlij każdy plik liganda indywidualnie do Pharmit, korzystając z opcji Load Features (patrz Spis materiałów , aby uzyskać link do Pharmit).
   2. Użyj opcji Zapisz sesję , aby pobrać odpowiedni plik JSON farmakoforu.
3. Organizowanie plików JSON do użycia w ConPhar
   1. Przechowuj wszystkie pobrane pliki JSON w jednym folderze. Pliki te zostaną przesłane do środowiska Google Colab w następnej metodzie.

2. Metoda 2

1. Konfigurowanie środowiska Google Colab
   1. Uruchom nowy notatnik Google Colab: Otwórz Google Colab w przeglądarce internetowej i utwórz nowy notatnik oraz dostosuj ustawienia, aby korzystać z wcześniejszej wersji, wybierając opcję Środowisko uruchomieniowe → Zmień wersję środowiska uruchomieniowego → 2025.07.
   2. Zainstaluj narzędzia Conda i PyMOL. Kod wymagany do zainstalowania Conda i PyMOL w Google Colab jest dostępny tutaj w formie kursywy w celach informacyjnych, a pełny skrypt wykonywalny jest również dostępny w pliku pomocniczym 1.
      # Zainstaluj CondaColab: Włącza obsługę środowiska Conda w Google Colab
      z IPython.utils importuj operacje we/wy
      importowanie tqdm.notebook
      Importowanie systemu operacyjnego
      Razem = 100
      z tqdm.notebook.tqdm(total=total) jako pbar:
      za pomocą io.capture_output() w postaci, w jakiej została przechwycona:
      # Zainstaluj CondaColab
      !install -q condacolab
      Import Condacolab
      condacolab.install()
      pbar.aktualizacja(10)
      # Zaktualizuj ścieżkę Pythona, aby zlokalizować zainstalowane pakiety
      Import sys
      sys.path.append('/usr/local/lib/python3.7/site-packages/')
      pbar.aktualizacja(20)
      # Zainstaluj pakiet PyMOL za pomocą mamba z kanału Schrödinger
      %shell mamba install -c schrodinger pymol-bundle --yes
      pbar.aktualizacja(90)
   3. Sprawdź pomyślne wykonanie: Uruchom komórkę, klikając ikonę odtwarzania lub naciskając Shift + Enter. Po pomyślnym wykonaniu nad komórką pojawi się poziomy zielony pasek (patrz Rysunek 1).
2. Zainstaluj pakiet ConPhar Python i zaimportuj wymagane moduły
   1. Zainstaluj i zaimportuj ConPhar. Kod wymagany do zainstalowania pakietu ConPhar i zaimportowania niezbędnych modułów do Google Colab jest tutaj podany kursywą w celach informacyjnych, a pełny skrypt wykonywalny jest również dostępny w pliku pomocniczym 1.
      # Zainstaluj pakiet do analizy farmakoforów ConPhar
      import pymol
      !install conphar
      z konfaru. Farmakofory importują parse_json_pharmacophore, show_pharmacophoric_descriptors, save_pharmacophore_to_pymol, save_pharmacophore_to_json, compute_concensus_pharmacophore
      Importowanie systemu operacyjnego
      Importowanie pand jako PD
      UWAGA: Instrukcja importu z conphar. Farmakofory są podzielone na wiele linii dla jasności, ale powinny być wprowadzone jako pojedyncza ciągła linia. Narzędzie ConPhar (https://github.com/AngelRuizMoreno/ConcensusPharmacophore) jest aktywnie rozwijane. Obecny protokół korzysta ze stabilnej wersji (0.1.2), która została zweryfikowana pod kątem opisanej procedury. Użytkownicy są zachęcani do korzystania z tej wersji, aby zapewnić odtwarzalność.
   2. Potwierdź pomyślną instalację: Uruchom komórkę, klikając ikonę odtwarzania lub naciskając Shift + Enter. Po pomyślnej instalacji i zaimportowaniu narzędzi ConPhar pojawi się komunikat potwierdzający (patrz Rysunek 2).
3. Wczytywanie indywidualnych modeli farmakoforów z plików JSON
   1. Utwórz folder dla plików JSON farmakoforu. Kod wymagany do utworzenia folderu do przechowywania plików wejściowych farmakoforu w Google Colab jest tutaj podany kursywą w celach informacyjnych, a pełny skrypt wykonywalny jest również dostępny w pliku pomocniczym 1.
      # Utwórz folder do przechowywania wejściowych plików JSON
      os.makedirs("JSON_FOLDER", exist_ok=Prawda)
      UWAGA: To polecenie tworzy folder automatycznie, jeśli jeszcze nie istnieje.
   2. Prześlij pliki JSON do folderu: Kliknij ikonę folderu w lewym panelu Colab, otwórz nowo utworzony folder i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać Prześlij. Dodaj wymagane pliki JSON (patrz rysunek 3).
      UWAGA: Upewnij się, że pliki są zgodne z oczekiwanym formatem wygenerowanym przez firmę Pharmit.
4. Analizowanie i konsolidowanie funkcji farmakoforycznych
   1. Wyodrębnij cechy farmakoforyczne z przesłanych plików. Kod wymagany do przeanalizowania przesłanych plików JSON, wyodrębnienia cech farmakoforycznych i zapisania ich w jednej ramce danych w Google Colab jest dostępny tutaj w formie kursywy w celach informacyjnych, a pełny skrypt wykonywalny jest również dostępny w pliku pomocniczym 1.
      p4_table=pd. Ramka danych()
      Dla pliku w OS.listdir('/content/JSON_FOLDER'):
      Jeśli '.json' w pliku:
      próbować:
      p4,lig,rec=parse_json_pharmacophore(f"/treść/JSON_FOLDER/{plik}")
      P4['ligand']=file.replace('.json','')
      p4_table=pd.concat([p4_table,p4],ignore_index=Prawda)
      z wyjątkiem wyjątku:
      przechodzić
      p4_table
   2. Uruchom komórkę, klikając ikonę odtwarzania lub naciskając Shift + Enter , aby wygenerować skonsolidowaną ramkę danych (patrz Rysunek 4). Powstała w ten sposób skonsolidowana ramka danych kompiluje wszystkie cechy farmakoforyczne wyodrębnione z poszczególnych ligandów w ujednoliconą tabelę, ułatwiając grupowanie i analizę statystyczną.
      UWAGA: Skrypt zawiera podstawową obsługę wyjątków w celu pominięcia zniekształconych plików JSON podczas przetwarzania, aby zapobiec przerwom w przepływie pracy. Biorąc pod uwagę dużą liczbę plików, wcześniejsze sprawdzenie każdego z nich jest niepraktyczne; Zamiast tego skrypt można zmodyfikować tak, aby wydrukował nazwę dowolnego pliku, którego nie można załadować, dzięki czemu użytkownik może go sprawdzić i poprawić indywidualnie.
5. Wygeneruj i zapisz konsensus Farmakofor
   1. Wyświetlić wszystkie deskryptory farmakoforyczne. Kod wymagany do wizualizacji deskryptorów farmakoforycznych wyodrębnionych z plików wejściowych w Google Colab jest dostępny tutaj w formie kursywy w celach informacyjnych, a pełny skrypt wykonywalny jest również dostępny w pliku pomocniczym 1.
      show_pharmacophoric_descriptors(p4_table)
   2. Uruchom komórkę, klikając ikonę odtwarzania lub naciskając Shift + Enter , aby zwizualizować grupowanie cech farmakoforycznych (patrz rysunek 5). Wyniki grupowane w klastry cech grupują podobne cechy farmakoforyczne w wielu ligandach na podstawie ich pozycji przestrzennej, umożliwiając identyfikację konserwatywnych wzorców interakcji.
   3. Zapisz model farmakoforu w formacie PyMOL. Kod wymagany do wygenerowania i zapisania modelu farmakoforu konsensusu w formacie zgodnym z PyMOL w Google Colab jest dostępny tutaj w formie kursywy w celach informacyjnych, a pełny skrypt wykonywalny jest również dostępny w pliku pomocniczym 1.
      save_pharmacophore_to_pymol(p4_table, out_file='ConPhar_pymol.pse')
   4. Uruchom komórkę, aby utworzyć odpowiedni plik .pse (patrz Rysunek 6).
   5. Zapisz model farmakoforu w formacie JSON. Kod wymagany do wygenerowania i zapisania modelu farmakoforu konsensusu w formacie zgodnym z Pharmit w Google Colab jest dostępny tutaj w formie kursywy w celach informacyjnych, a pełny skrypt wykonywalny jest również dostępny w pliku pomocniczym 1.
      ​save_pharmacophore_to_json(p4_table,out_file=
      "ConPhar_pharmit.json")
   6. Uruchom komórkę, aby utworzyć odpowiedni plik .json (patrz Rysunek 6).
   7. Generuj dane wyjściowe z klastrami cech i dendrogramy. Kod wymagany do wygenerowania plików farmakoforowych konsensusu pogrupowanych według typu funkcji, w tym formatów kompatybilnych z PyMOL i Pharmit oraz wizualizacji dendrogramu w Google Colab jest dostępny tutaj w formie kursywy w celach informacyjnych, a pełny skrypt wykonywalny jest również dostępny w pliku pomocniczym 1.
      concensus,links=compute_concensus_pharmacophore
      (p4_table,save_data_per_descriptor=Prawda,out_folder='/treść')
   8. Uruchom komórkę, klikając ikonę odtwarzania lub naciskając Shift + Enter (patrz Rysunek 7). Wyniki wyświetlają wizualizacje dendrogramu, które w postaci drzewa reprezentują hierarchiczne relacje między zgrupowanymi cechami farmakoforycznymi, pomagając użytkownikom interpretować stopień podobieństwa i bliskość przestrzenną między klastrami.
      UWAGA: Ten krok zapisuje wiele plików wyjściowych i figur w określonym folderze.
   9. Eksportuj wyniki farmakoforu konsensusu do pliku CSV. Kod wymagany do zapisania ostatecznej tabeli farmakoforów konsensusu w formacie CSV w Google Colab jest tutaj dostępny w formie kursywy w celach informacyjnych, a pełny skrypt wykonywalny jest również dostępny w pliku pomocniczym 1.
      concensus.to_csv('consensus_result.csv', index=Fałsz)
   10. Uruchom komórkę, klikając ikonę odtwarzania lub naciskając Shift + Enter , aby wyeksportować dane farmakoforu konsensusu do pliku CSV o nazwie consensus_result.csv w celu dalszej analizy (patrz Rysunek 8).
       UWAGA: Plik CSV ułatwia dalsze zastosowania, takie jak analiza statystyczna lub wizualizacja w arkuszu kalkulacyjnym.
6. Wykorzystanie konsensusu Farmakofor do wirtualnych badań przesiewowych
   1. Eksportuj farmakofor konsensusu w formacie JSON. Upewnij się, że plik zawiera współrzędne przestrzenne dla wszystkich obiektów. Ten format jest bezpośrednio kompatybilny z internetowymi narzędziami do badań przesiewowych, takimi jak Pharmit¹². Aby przeprowadzić wirtualne badanie przesiewowe, prześlij plik JSON farmakoforu na serwer Pharmit za pomocą opcji Load Features . Serwer umożliwia udoskonalanie modelu poprzez modyfikowanie, dodawanie lub usuwanie funkcji, a także sprawdzanie pod kątem dużych bibliotek złożonych, takich jak PubChem¹³lub ZINC¹⁴.
      UWAGA: Wszystkie skrypty wymagane do odtworzenia analiz opisanych w tym badaniu są dostępne w pliku pomocniczym 1 i można uzyskać do nich interaktywny dostęp za pośrednictwem https://colab.research.google.com/drive/1Zj8DjazV6mJM-we9iOpoGTZt8JfW4I7D?usp=sharing. Czytelnicy są zachęcani do stworzenia osobistej kopii notatnika Colab w celu uruchamiania i modyfikowania analiz bez zmiany oryginalnego skryptu.

Rysunek 1: Zrzut ekranu przedstawiający pierwszy blok kodu używany do skonfigurowania środowiska Google Colab przez zainstalowanie CondaColab. Poziomy niebieski pasek postępu pojawia się nad komórką podczas wykonywania i zmienia kolor na zielony po pomyślnym zakończeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zrzut ekranu drugiego bloku kodu używanego do instalacji pakietu ConPhar w Google Colab. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Zrzut ekranu przedstawiający pliki JSON farmakoforu pomyślnie przesłane do wyznaczonego folderu w Google Colab. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Zrzut ekranu przedstawiający kod używany do wyodrębniania cech farmakoforycznych z plików JSON i konsolidowania ich w jedną ramkę danych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wizualizacja grupowania cech farmakoforycznych wygenerowanych podczas budowy modelu farmakoforu konsensusu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Zrzut ekranu przedstawiający pomyślne wygenerowanie plików farmakoforowych konsensusu w formatach kompatybilnych z PyMOL i Pharmit. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Zrzut ekranu przedstawiający generowanie plików farmakoforów konsensusu pogrupowanych według typu funkcji, w tym danych wyjściowych dla wizualizacji PyMOL, Pharmit i dendrogramu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Zrzut ekranu przedstawiający pomyślny eksport danych farmakoforu konsensusu do pliku consensus_result.csv. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Sto kompleksów Mpro skrystalizowanych z różnymi niekowalencyjnymi inhibitorami zostało wyrównanych, jak pokazano na rysunku 9A. Każdy ligand został następnie wyodrębniony jako pojedynczy plik (rysunek 9B), a następnie przesłany na serwer Pharmit. Sesja została zapisana w celu wygenerowania odpowiedniego pliku JSON (patrz Rysunek 9C).

Rysunek 9: Przygotowanie ligandów do modelowania farmakoforów w drodze konsensusu. (A) Strukturalne wyrównanie trzech reprezentatywnych kompleksów Mpro skrystalizowanych z niekowalencyjnymi inhibitorami. (B) Superpozycja 100 ligandów uwzględnionych w tym badaniu. (C) Przesłanie każdego liganda na serwer Pharmit za pomocą opcji "Załaduj funkcje", a następnie wygenerowanie pliku JSON za pomocą opcji "Zapisz sesję". Obie opcje są oznaczone czerwonymi strzałkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kompletny zestaw plików JSON wykorzystano do wygenerowania modelu farmakoforu konsensusu, który zawierał 1450 cech farmakoforycznych pogrupowanych w 110 klastrów: 23 aromatyczne (Aro), 30 akceptorów wiązań wodorowych (HBA), 16 donorów wiązań wodorowych (HBD), 36 hydrofobowych (Hyd) i 5 ujemnie naładowanych (Anion) klastrów (Rysunek 10A, Tabela uzupełniająca 1). Zidentyfikowaliśmy większe klastry dla każdej funkcji w celu ich włączenia do modelu konsensusu. Spośród klastrów Aro wybraliśmy te, które zawierają ponad 20 elementów. Z grup HBA, HBD i Hyd zachowaliśmy klastry z co najmniej 50 elementami. Żaden z klastrów anionów nie miał więcej niż 4 członków, więc zostały one wyłączone z modelu konsensusu (rysunek 10B). Te progi liczbowe (>20 członków dla Aro; ≥50 dla HBA, HBD i Hyd) zostały empirycznie zdefiniowane na podstawie rozkładu rozmiarów klastrów, aby nadać priorytet najbardziej konserwatywnym i gęsto zaludnionym wzorcom interakcji.

Rycina 10: Grupowanie cech farmakoforycznych ze 100 kompleksów Mpro-ligand. (A) Rozkład 1450 cech farmakoforycznych: aromatyczny (Aro) w kolorze fioletowym, akceptor wiązań wodorowych (HBA) w kolorze pomarańczowym, donor wiązań wodorowych (HBD) w kolorze białym, hydrofobowy (Hyd) w kolorze zielonym i ujemnie naładowany (Anion) w kolorze czerwonym. (B) Klastry zawierające ≥10 członków są pokazane dla Aro, HBA, HBD i Hyd; wyświetlane są wszystkie klastry anionów. Największe klastry - zdefiniowane jako te, które mają ≥20 elementów dla Aro i ≥50 członków dla HBA, HBD i Hyd oraz ≥4 członków dla anionów - są wyróżnione kropkowanymi kulami. Liczba członków w każdym z największych klastrów jest wyraźnie wskazana. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tak więc nasz konsensusowy model farmakoforowy obejmował 11 cech: 3 cechy aromatyczne (Aro), Aro 1, 2 i 3, pochodzące z klastrów mających odpowiednio 20, 24 i 45 członków; 4 akceptory wiązań wodorowych (HBA), HBA 1, 2, 3 i 4, z klastrów liczących odpowiednio 51, 55, 77 i 81 członków; 2 donory wiązań wodorowych (HBD) z klastrów liczących odpowiednio 51 i 71 członków; i 2 cechy hydrofobowe (Hyd) z gromad liczących odpowiednio 50 i 52 członków (patrz rysunek 11A).

Model farmakoforowy został wykorzystany do przeszukania bazy danych PubChem przy użyciu strategii opisanej wcześniej¹⁰, ale nie znaleziono żadnych dopasowań. Aby zwiększyć elastyczność wyszukiwania, usunięto cechę aromatyczną Aro 1 – pochodzącą z najmniejszego i najmniej reprezentatywnego klastra. Ta korekta doprowadziła do zidentyfikowania dwóch trafień, w tym konformera związku z CID PubChem 101267741 i 10285538 (patrz rysunek 11B). Strukturę chemiczną 2D 101267741 złożonego przedstawiono na rysunku 11C. Co ciekawe, ten zidentyfikowany związek dobrze mieści się w kieszeni na wiązania Mpro. Analiza porównawcza z kokrystalizowanym ligandem 38a¹⁵ (PDB ID: 9HAJ) pokazuje, że konformer pasujący do farmakoforu 101267741 jest zakopany jeszcze głębiej niż 38a w podkieszeniach S1 i S2 Mpro. Jednak 38a zajmuje szerszy obszar kieszeni, głównie ze względu na boczny łańcuch etylokarboksyamidowy, który rozciąga się w kierunku kieszeni S1′. Niemniej jednak, kluczowe oddziaływania międzycząsteczkowe 38a obejmują inne ugrupowania, a nie ten łańcuch boczny. Natomiast 101267741 złożony tworzy 11 oddziaływań międzycząsteczkowych, w tym siedem wiązań wodorowych i cztery kontakty hydrofobowe. W porównaniu z trzema wiązaniami wodorowymi i dwoma oddziaływaniami hydrofobowymi utworzonymi przez 38a, tryb wiązania związku 101 wydaje się silniejszy (ryc. 11D).

Rysunek 11: Wyszukiwanie farmakoforów w bazie danych PubChem. (A) Kompletny model farmakoforu konsensusu zawiera 11 cech: 3 aromatyczne (fioletowy), 4 akceptory wiązań wodorowych (pomarańczowy), 2 donory wiązań wodorowych (biały) i 2 hydrofobowe (zielony). (B) Zidentyfikowany konformer związku PubChem 101267741 zgodny ze zredukowanym modelem farmakoforu po usunięciu cechy Aro 1 oraz (C) Zidentyfikowano dwuwymiarową strukturę chemiczną związku. (D) Analiza porównawcza sposobów wiązania związku 38a (magenta; od PDB ID: 9HAJ) i związku PubChem CID 101267741 (zielony) do kieszeni katalitycznej SARS-CoV-2 Mpro. Odpowiednie oddziaływania międzycząsteczkowe dla każdego związku są pokazane po prawej stronie. Wiązania wodorowe i oddziaływania hydrofobowe są pokazane jako linie przerywane odpowiednio w kolorze niebieskim i szarym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik pomocniczy 1: Skrypt przepływu pracy farmakoforu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela 1: Grupowanie Podsumowanie cech farmakoforycznych. Liczba klastrów, pręty na grupę, współrzędne środka ciężkości i promienie klastra Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Modelowanie farmakoforów pomaga w racjonalnym odkrywaniu leków¹⁶. Szczegółowo opisany tutaj protokół został wykorzystany do wygenerowania konsensusu farmakoforu dla głównej proteazy SARS-CoV-2 (Mpro), zaczynając od dziesiątek inhibitorów niekowalencyjnych, ale można go zastosować do dowolnego celu biologicznego o znanych konformacjach związanych z ligandem, zwłaszcza tych z obszernymi zestawami danych ligandów. W porównaniu z indywidualnymi modelami farmakoforowymi lub modelami opartymi wyłącznie na ligandach, to podejście oparte na konsensusie zwiększa niezawodność i zmniejsza błąd systematyczny poprzez integrację wielu konformacji ligandów. Konsensusowy model farmakoforowy wygenerowany przez ten protokół może być stosowany do różnych bibliotek molekularnych, w tym do publicznych baz danych, takich jak ChEMBL¹⁷i ZINC¹⁴, kolekcji komercyjnych i zastrzeżonych wewnętrznych bibliotek związków. Ta wszechstronność umożliwia eksplorację szerokich i zróżnicowanych przestrzeni chemicznych w wirtualnych kampaniach przesiewowych, zwiększając w ten sposób prawdopodobieństwo identyfikacji nowych związków bioaktywnych. W ten sposób ten przepływ pracy wspiera identyfikację nowych związków bioaktywnych o pożądanych profilach interakcji.

Jednym z krytycznych etapów tego protokołu jest dokładne przygotowanie i wyrównanie kompleksów ligand-cel. Precyzyjne wstępne wyrównanie ligandów w ich bioaktywnych konformacjach jest niezbędne do zapewnienia znaczącej i niezawodnej integracji cech, ponieważ niewspółosiowość może osłabić moc predykcyjną modelu¹⁰. Aby osiągnąć optymalne wyrównanie, zalecamy wykonanie superpozycji strukturalnej przy użyciu konserwatywnych reszt miejsca wiązania białek lub atomów szkieletu. W przypadku zestawów danych z różnymi ligandami wyrównanie kluczowych punktów interakcji lub cech farmakoforycznych zwiększa spójność w całym zestawie. Ponadto zaleca się staranną ręczną kontrolę i korektę konformacji ligandów odstających, aby zapobiec artefaktom, które mogłyby zmniejszyć dokładność modelu. Ponadto otwarty charakter ConPhar ułatwia integrację z innymi przepływami pracy obliczeniowej, a także zaawansowane korekty parametrów klastrowania. Doświadczeni użytkownicy mogą modyfikować parametry grupowania cech farmakoforycznych, aby uzyskać równowagę między ogólnością a swoistością modelu. Modyfikacje te mogą być kierowane przez rozmiar zestawu danych ligandów, różnorodność chemiczną lub złożoność docelową. Na przykład, gdy mamy do czynienia z bardzo zróżnicowanymi ligandami, stopniowe grupowanie lub analiza podgrup mogą lepiej uchwycić istotne cechy¹⁸.

Narzędzie ConPhar jest obecnie aktywnie rozwijane. Zapewnia to znaczną elastyczność dla użytkowników, którzy chcą dostosować narzędzie do konkretnych potrzeb badawczych, w tym integrację z uzupełniającymi potokami oprogramowania. Ponieważ jednak oprogramowanie może nadal ulegać zmianom, zachęca się użytkowników do monitorowania oficjalnych aktualizacji i zapoznawania się z dokumentacją specyficzną dla wersji. Zgłaszanie napotkanych problemów przyczyni się do jego ciągłego ulepszania i szerszej walidacji przez społeczność. Nasz protokół zbuduje modele z kompleksowymi wzorcami interakcji, a tym samym będą mogły być wykorzystane do wirtualnego badania przesiewowego dużych bibliotek. W naszych reprezentatywnych wynikach wykorzystano otrzymany farmakofor do identyfikacji dwóch nowych potencjalnych ligandów dla regionu katalitycznego Mpro. Ostatecznie ta metoda farmakoforu opartego na konsensusie usprawnia identyfikację trafień i przyspiesza optymalizację potencjalnych klientów.

Identyfikujemy jednak następujące ograniczenia protokołu: i) zależność od wysokiej jakości struktur związanych z ligandami, ponieważ dane o niskiej rozdzielczości mogą zmniejszyć dokładność modelu; ii) ryzyko przeoczenia unikalnych i ważnych interakcji kluczowych dla określonych ligandów, ponieważ farmakofor konsensusu kładzie nacisk na cechy wspólne; oraz (iii) na odtwarzalność mogą mieć wpływ różne definicje cech w różnych narzędziach programowych¹⁹. Ograniczenia te można jednak przezwyciężyć poprzez udoskonalenie struktury układu białko-ligand za pomocą symulacji dynamiki molekularnej²⁰, utrzymanie klastrów w oparciu o wiedzę użytkownika oraz konsekwentne stosowanie oprogramowania do identyfikacji cech farmakoforycznych.

Chociaż konsensusowy model farmakoforowy w tym protokole nie został zweryfikowany przy użyciu klasycznych wskaźników binarnych, jego zdolność predykcyjna została wykazana w poprzednim badaniu¹⁰. W tej pracy wykorzystano niezależny zestaw testowy 78 chemicznie zróżnicowanych ligandów do walidacji uniwersalnego farmakoforu wygenerowanego przy użyciu tej samej metodologii. Zestaw walidacyjny zawierał ligandy o podobieństwie ≤0,5 Tanimoto, masach cząsteczkowych od 200 do 700 g/mol, wiązaniach obrotowych ≤17 i co najmniej trzech cechach farmakoforycznych. Model z powodzeniem zidentyfikował znane substancje aktywne, co potwierdza jego przydatność w wirtualnych przepływach pracy związanych z badaniami przesiewowymi oraz jego niezawodność w przypadku chemicznie zróżnicowanych kandydatów.

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia budowę modeli farmakoforowych, które ujmują kompleksowe wzorce interakcji charakterystyczne dla celu. Jest to szczególnie cenne w przypadku celów z obszernymi danymi ligandowymi, takich jak proteazy wirusowe, kinazy i receptory jądrowe²¹. Wygenerowane modele nadają się do wirtualnych badań przesiewowych dużych bibliotek związków, ułatwiając identyfikację nowych kandydatów bioaktywnych. Podkreślając konserwatywne i funkcjonalnie istotne cechy, podejście oparte na farmakoforach opartych na konsensusie wspiera zarówno wykrywanie trafień na wczesnym etapie, jak i późniejszą optymalizację potencjalnych klientów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Współpraca z Google	Google LLC	https://colab.google	Platforma internetowa do uruchamiania notatników w języku Python; używany tutaj do wykonywania skryptów ConPhar i PyMOL do modelowania farmakoforów konsensusu.
Przemysł farmaceutyczny	Laboratorium Koesa na Uniwersytecie w Pittsburghu	https://pharmit.csb.pitt.edu/search.html	Platforma internetowa do interaktywnych wirtualnych badań przesiewowych farmakoforów i eksploracji przestrzeni chemicznej, umożliwiająca przesyłanie plików ligandów i generowanie funkcji farmakoforu
PyMOL	Schrö dinger, Inc.	https://www.pymol.org	Oprogramowanie do wizualizacji molekularnej i wyrównywania strukturalnego używane do białek– Superpozycja i analiza zespolonego liganda
Obsługa skryptu przepływu pracy Pharmacophore File 1	Google LLC	https://colab.research.google.com/drive/1Zj8DjazV6mJM-we9iOpoGTZt8JfW4I7D?usp=sharing	Pełny skrypt wykonywalny do instalacji Conda, PyMOL i uruchamiania przepływu pracy farmakoforu w Google Colab. Dostarczany również jako plik pomocniczy 1.