Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł badawczy

Ochronna rola klotho w uszkodzeniu kardiomiocytów spowodowanym hipoksją i reoxygenacją poprzez regulację kaskady sygnalizacyjnej NF-κb

303 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68946

⸱

5 grudnia 2025

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Jinan Lixia District People's Hospital, 2Department of Nuclear Medicine, Jinan Central Hospital, 3Department of Infectious Diseases, Jinan Central Hospital, 4Department of Coronary Heart Diseases, Jinan Central Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten ocenia ochronną rolę nadekspresji klotho w kardiomiocytach H9C2 pod wpływem niedotlenienia i reoxygenacji za pomocą testów molekularnych i funkcjonalnych.

Streszczenie

Celem tego badania było zbadanie ochronnej roli klotho w kardiomiocytach poddanych urazom hipoksji/reoxygenacji (H/R). Model H/R in vitro został opracowany z wykorzystaniem kardiomioblastów szczurów H9C2, które zostały transfekowane wektorami lentiwirusowymi o nadekspresji klotho. Komórki podzielono na sześć grup eksperymentalnych: kontrola, H/R, kontrola ujemna (NC), nadekspresja klotho, PDTC (inhibitor NF-κB) oraz grupa kombinowana leczona klotho i lipopolisacharydem (LPS). Poziomy ekspresji Klotho określano za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym oraz western blottingu. Żywotność komórek mierzono za pomocą testu MTT, natomiast apoptoza oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. Ekspresja białek zaangażowanych w szlak sygnalizacji NF-κB została przeanalizowana za pomocą western blottingu, a ekspresja komórkowa cytokin prozapalnych oceniono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Nadmierna ekspresja klotho znacząco podniosła poziom klotho w komórkach H9C2 i prowadziła do poprawy żywotności komórek, zmniejszenia apoptozy oraz zmniejszenia komórkowej ekspresji cytokin prozapalnych w porównaniu z grupą H/R. Analiza Western blot wykazała, że nadekspresja klotho, jak również leczenie PDTC, hamowała aktywację szlaków NF-κB, co wskazuje obniżony stosunek p-P65/P65 oraz podwyższone poziomy p-IκBα/IκBα. Efekty te zostały częściowo odwrócone po współleczeniu z LPS. Wyniki te sugerują, że klotho zapewnia kardioprotekcję przed uszkodzeniem wywołanym przez H/R poprzez modulację sygnalizacji NF-κB, redukcję stanu zapalnego i wspieranie przeżycia komórek. Protokół ten dostarcza powtarzalnej metody badania molekularnych mechanizmów leżących u podstaw urazu mięśnia sercowego z niedokrwieniem i reperfuzją oraz potencjału terapeutycznego klotho w stanie zapalnym serca.

Wprowadzenie

Ostry zawał mięśnia sercowego (AMI) jest głównie spowodowany niedokrwieniem następującym reperfuzją, co skłoniło do szeroko zakrojonych badań nad mechanizmami uszkodzeń niedotlenienia mięśnia sercowego/reoxygenacji (H/R) 1,2,3. Kluczowym aspektem uszkodzenia mięśnia sercowego H/R jest apoptoza komórek, która znacząco przyczynia się do patologicznego postępu AMI 4,5.

Najnowsze badania wykazały zdolność sygnału czynnika jądrowego kappa B (NF-κB) w uszkodzeniu mięśnia sercowego H/R poprzez modulację odpowiedzi zapalnych na bodźce takie jak lipopolisacharyd (LPS)6,7,8. Aktywacja NF-κB zachodzi za pomocą dwóch odrębnych mechanizmów: kanonicznych i niekanonicznych szlaków9. W ścieżce kanonicznej aktywacja zależy od degradacji inhibitora kappa B alfa (IκBα)10 wywołanej fosforylacją. Jednak zgłoszono również, że fosforylacja podjednostki NF-κB p65 może wywoływać apoptozę, potencjalnie niezależnie od degradacji IκBα11. Klotho, jednoprzepustowe białko transbłonowe, reguluje metabolizm fosforanów i wapnia oraz hamuje sygnalizację insuliny 12,13,14. Pojawiające się dowody wskazują, że Klotho wywiera hamujące działanie na aktywację NF-κB w różnych tkankach, w tym w nerkach, hipokampie oraz starzejących się komórkach, łagodząc tym samym stan zapalny i uszkodzenia tkanek 15,16,17. Pomimo tych postępów, rola Klotho w AMI oraz jego potencjalna interakcja ze szlakiem NF-κB podczas urazu mięśnia sercowego H/R pozostają w dużej mierze niezbadane.

Z metodologicznego punktu widzenia model in vitro H/R z wykorzystaniem kardiomioblastów szczurów H9C2 oferuje kilka zalet w porównaniu z modelami zwierzęcimi, w tym kontrolowane napięcie tlenowe, powtarzalność oraz zmniejszoną zmienność. Ponadto nadekspresja Klotho podlegana lentiwirusem umożliwia stabilną i efektywną modulację ekspresji genów, umożliwiając bezpośrednie badanie jej wpływu funkcjonalnego. Te podejścia sprawiają, że protokół jest praktyczny, opłacalny i dostępny dla badań mechanistycznych, jednocześnie unikając wyzwań etycznych i logistycznych związanych z eksperymentami in vivo .

Z praktycznego punktu widzenia komórki H9C2 są szeroko wykorzystywane w badaniach sercowo-naczyniowych, ponieważ zachowują wiele właściwości kardiomiocytów, choć nie w pełni naśladują fenotypu dojrzałych kardiomiocytów. Wybrany stan H/R (5 godzin niedotlenienia po 1 godzinie reoxygenacji) mieści się w zakresie powszechnie stosowanym do modelowania urazu niedokrwiowo-reperfuzyjnego in vitro. Podobnie, transdukcja lentiwirusowa z wielokrotnością infekcji (MOI) około 100 jest standardowym podejściem do osiągnięcia efektywnej nadekspresji przy kontrolowalnej cytotoksyczności. Chociaż te cechy zwiększają zastosowanie protokołu, należy uwzględnić ograniczenia takie jak niepełne powtórzenie środowiska in vivo . Dlatego niniejsze badanie ma na celu zbadanie, jak Klotho chroni komórki mięśnia sercowego przed uszkodzeniem H/R oraz ustanowienie powtarzalnego protokołu oceny jego interakcji z sygnalizacją NF-κB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem linii komórkowej H9C2 szczura kardiomioblastowego (ATCC, CRL-1446) były wykonywane zgodnie z instytucjonalnymi przepisami dotyczącymi biobezpieczeństwa. W badaniu nie brało bezpośredniego udziału żadnych zwierząt ani ludzi. Rysunek 1 ilustruje graficzny przepływ pracy w potoku projektowania i analizy eksperymentalnej. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Hodowla komórkowa

Linia komórkowa H9C2 szczura kardiomioblastowego (ATCC, CRL-1446) została krioprezerwowana w ciekłym azocie przy użyciu medium zamrażającego składającego się z Zmodyfikowanego Medium Orła Dulbecco (DMEM, wysoka glukoza, 4,5 g/L) wzbogaconego o 10% surowicę płodową bydła (FBS) i 10% dimetylsulfoksyd (DMSO). Do odzyskania mrożone fiolki były szybko rozmrażane w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty, a następnie natychmiast przenoszone do wcześniej podgrzanego DMEM. Pożywka hodowla była przygotowywana z 10% FBS, 100 U/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny, 3,7 g/l wodorowęglanu sodu oraz 1 mM pirotrowęglana sodu. Komórki utrzymywano w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO₂. We wszystkich eksperymentach użyto komórek H9C2 pomiędzy przepustkami 6 a 20. Wczesne fragmenty (P20) nie były wykorzystywane, aby uniknąć dryfu fenotypowego związanego z przejściem.

2. Nadekspresja lentiwirusowa Klotho w komórkach H9C2

Trzecia generacja, samoinaktywujący się lentiwirusowy wektor kodujący pełnowymiarowy gen szczura Klotho (Kl) pod kontrolą promotora EF1α, został zastosowany do ustanowienia stabilnej nadekspresji w komórkach H9C2. Konstrukcja zawierała reporter P2A-EGFP do wizualizacji, elementy regulujące wirusa wirusa zapalenia wątroby świstaka (WPRE) oraz centralnego traktu polipurynowego (cPPT) do stabilności transkryptu oraz kasetę oporną na puromycynę napędzaną promotorem PGK do selekcji. Cząstki lentiwirusowe były wytwarzane w HEK293T komórkach poprzez współtransfekcję plazmidu transferowego plazmidami psPAX2 (gag/pol/rev) i pMD2.G (VSV-G) w stosunku 4:3:1 przy użyciu polietylenyiny (PEI; DNA: PEI = 1:3, w/św). Supernatanty pobierano w 48 i 72 godzinach, oczyszczano przez wirówkę w 3 000 × g przez 10 minut, filtrowano przez membranę PES o pojemności 0,45 μm i koncentrowano przez ultrawirowanie w 25 000 × g przez 2 godziny w 4 °C. Pellety wirusowe zostały ponownie zawieszone w PBS zawierającym 1% albuminy surowicy bydłej (BSA), a miaki funkcjonalne (TU/mL) zostały określone przez zakażenie komórkami z ograniczeniem rozcieńczenia komórek HEK293T odczytem EGFP po 72 godzinach. Komórki H9C2 zostały zasiane w płytkach 6-dołkowych w ilości 2 × 105 komórek na odwiert, co skutkowało około 60% konfluencją w momencie transdukcji. Cząstki lentiwirusowe dodano w zakresie wielokrotności infekcji (MOI) 100 w 1 mL świeżego podłoża hodowlanego, uzupełnionego polibrenem (8 μg/mL) w celu zwiększenia efektywności infekcji. Inokulum zostało usunięte po 12 godzinach i zastąpione 2 mL kompletnego nośnika. Po 72 godzinach od zakażenia skuteczność transdukcji została zweryfikowana za pomocą fluorescencji EGFP pod mikroskopem fluorescencyjnym. Do ustanowienia stabilnych linii komórkowych aplikowano puromycynę (2 μg/mL, wcześniej titrowaną) przez 3-5 dni zaczynając od 48 godzin po zakażeniu, z zmianami medium co 48 godzin. Nadekspresja Klotho została potwierdzona przez RT-qPCR oraz immunoblotowanie. Wszystkie procedury lentiwirusowe przeprowadzono w warunkach zabezpieczenia biologicznego poziomu 2 (BSL-2), a wszystkie odpady wirusowe zostały inaktywowane 10% wybielaczem przez co najmniej 30 minut przed utylizacją.

3. Grupy eksperymentalne

Komórki H9C2 zostały zasiane w płytkach 6-dołkowych (powierzchnia wzrostu 9,6 cm²) po 3 × 10⁵ komórkach na odwór, co dało około 70%-80% zbieżności po 24 godzinach, co było wymaganą gęstością do przetwarzania hipoksji/reoxygenacji (H/R) oraz kolejnych testów. Po nocnym przyłączeniu komórki zostały podzielone na sześć grup eksperymentalnych: (1) Grupa kontrolna, która nie otrzymała dodatkowego leczenia; (2) grupa H/R, która przeszła hipoksję/reoxygenację (H/R) w zamkniętej modułowej komorze hipoksji, po czym nastąpiła ekspozycja na 5 godzin hipoksji (1% O₂, 94% N₂, 5% CO₂) i 1 godzinę reperfuzji (5% CO₂), jak opisanowcześniej 18; (3) Grupa Negatywnej Kontroli (NC), w której komórki były transfekowane pustym wektorem 24 godziny przed leczeniem H/R; (4) grupa Klotho, w której komórki zostały transfekowane wektorami lentiwirusowymi kodującymi Klotho 24 godziny przed leczeniem H/R; (5) Grupa leczenia dietokarbaminianem pirrolidiny (PDTC), która była leczona inhibitorem szlaku NF-κB PDTC o dawce 200 mg/L przez 24 godziny przed leczeniem H/R19; (6) Grupa Klotho + LPS, w której komórki zostały transfekowane wektorami lentiwirusowymi kodującymi Klotho, a następnie leczone lipopolisacharydem w dawce 1 mg/L przez 24 godziny przed leczeniem H/R20.

4. qRT-PCR

Komórki H9C2 były zasiewane w płytkach 6-dołkowych o gęstości 1 × 10⁶ komórki na dołek. Po leczeniu całkowite RNA zostało wyizolowane za pomocą protokołu ekstrakcji fenol-chloroformowej. Krótko dodano 1 ml odczynnika na dołek, następnie ekstrakcję chloroformu, wytrącenie izopropanolu i przemycie 75% etanolem. Pellet RNA był suszony na powietrzu i rozpuszczany w wodzie wolnej od RNazy. Stężenie i czystość RNA były określane spektrofotometrycznie. Do syntezy cDNA 1 μg całkowitego RNA zostało przepisane odwrotnie za pomocą komercyjnego zestawu do transkrypcji odwróconej zgodnie z protokołem producenta, w tym usuwaniem DNA genomowego i losowym primowaniem heksamerów. Ilościowe PCR w czasie rzeczywistym wykonano w systemie PCR w czasie rzeczywistym z chemią SYBR Green w następujących warunkach: początkowa denaturacja w 95 °C przez 30 s, następnie 40 cykli 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 30 s. Sekwencje zapalników zostały zaprojektowane przy użyciu Primer-BLAST (NCBI) i zsyntetyzowane przez komercyjnego dostawcę: (1) Klotho: F 5′-TAAGGTTCAAGTATGGAGAC-3′, R 5′-GGGCGTTCACACACTTATTATTAT-3′; (2) β-aktyna (kontrola wewnętrzna): F 5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′, R 5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′. Poziomy ekspresji względnej obliczono metodą 2^-ΔΔCT, a specyficzność amplifikacji potwierdzono przez pojedynczy pik krzywej topnienia.

5. Western blot

Białka były ekstrahowane z komórek H9C2 za pomocą buforu radioimmunoprecipitacyjnego (RIPA) (200 μL na dołek z płytki 6-dołkowej) uzupełnionego koktajlem inhibitorów proteazy na lodzie. Stężenia białek zmierzono za pomocą testu kwasu bicynchoninowego (BCA), a równe ilości białka (20-30 μg) na jeden tor załadowano na 10% żel SDS-PAGE do separacji elektroforetycznej. Białka były przenoszone na membrany poliwinylinofluorku (PVDF) za pomocą mokrego systemu transferu przy napięciu 100 V przez 90 minut w 4 °C. Błony blokowano mlekiem beztłuszczowym o stężeniu 5% przygotowanym w TBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano przez noc w 4 °C z pierwotnymi przeciwciałami przeciwko Klotho (1:500), fosfo-p65 (1:500), p65 (1:500). fosfo-IκBα (1:500), IκBα (1:500) oraz β-aktyna (1:1000). Po trzech płukaniach TBST błony były inkubowane przeciwciałami wtórnymi (1:1000) sprzężonymi z nadkrzepksydazą chrzanu (HRP) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Pasma białkowe były wizualizowane za pomocą ulepszonego systemu detekcji chemiluminescencji, a natężenia sygnału określano za pomocą oprogramowania ImageJ przy użyciu identycznych ustawień progowych.

6. Test MTT

Komórki H9C2 zostały zasiewane na płytach z 96 dołkami o gęstości 2 × 10³ komórek na odwiert w 100 μL kompletnego medium i inkubowane przez noc, aby umożliwić przyleganie. Do każdego otworu dodano objętość 10 μL roztworu MTT (5 mg/mL w PBS) i inkubowano przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w warunkach nawilżonych z 5% CO₂. Po inkubacji starannie usuwano supernatant, a następnie dodawano 100 μL dimetylosulfenu (DMSO) w celu rozpuszczenia kryształów formazonu, po czym nastąpiła inkubacja przez 10 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem. Następnie zmierzono absorpcję na 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Oczekiwanym efektem wizualnym było pojawienie się fioletowych kryształów formazonu w żywotnych komórkach przed dodaniem DMSO oraz jednorodnego fioletowego roztworu po rozpuszczeniu.

7. Cytometria przepływowa

Komórki pobierano 24 godziny po zabiegu trypsynizacją i wirówką w 1 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Pellet komórkowy został ponownie zawieszony w 100 μL buforu wiążącego 1× (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl₂, pH 7,4). Annexin V-APC i jodek propidium (PI) zostały wymieszane w proporcji 1:2, aby przygotować roztwór barwienia o pojemności 15 μL, który dodano do zawiesiny komórkowej. Mieszanka była inkubowana przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po inkubacji dodano 400 μL tego samego buforu wiązania, a próbki natychmiast analizowano za pomocą cytometru przepływowego. Zebrano łącznie 10 000 zdarzeń na próbkę. Dane zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania FlowJo. Komórki były najpierw bramkowane na podstawie rozpraszania w przód (FSC) i rozpraszania bocznego (SSC), aby wykluczyć zanieczyszczenia, a następnie nastąpiło kwadrantowe bramkowanie Annexin V vs. PI, aby rozróżnić żywotne komórki (Annexin V-/PI-), wczesne komórki apoptotyczne (Annexin V+/PI-) oraz późne komórki apoptotyczne/martwicze (Annexin V+/PI+). Barwienia V-dodatnie/PI-ujemne Annexin wskazywały na wczesną apoptozę, natomiast podwójnie dodatnie barwienia Annexin V/PI wskazywały na późną apoptozę lub martwicę.

8. Immunofluorescencja

Komórki H9C2 zostały zasiewane na sterylnych szklanych pokrywkach w płytkach 6-dołkowych o gęstości 1 × 10⁵ komórek na dołek i poddawane zabiegom. Komórki były fiksowane 4% paradehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej, permeabilizowane 0,1% Tritonem X-100 w PBS przez 10 minut oraz blokowane 5% surowicą bydłą (BSA) w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Pokrywki były inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C z pierwotnymi przeciwciałami przeciwko TNF-α (1:200), IL-1β (1:200) i IL-6 (1:100). Po trzech płukaniach w PBS komórki były inkubowane przeciwciałami wtórnymi znakowanymi przez fitoerytrynę (PE) (1:500) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Jądra były kolorowane DAPI przez 5 minut. Pokrywki montowano na szklanych szkiełkach z medium antyfade, a sygnały fluorescencyjne wizualizowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Obrazy zostały przeanalizowane za pomocą ImageJ (wersja 1.54). Czerwona fluorescencja wskazywała na ekspresję cytokin, natomiast niebieska fluorescencja oznaczała jądra.

9. Analiza statystyczna

Wszystkie dane zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania SPSS. Wyniki wyrażane są jako średnia ± odchylenie standardowe (SD) z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Dla porównań wielu grup zastosowano jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA), a następnie test post hoc Tukeya. Wartość P < 0,05 uznano za istotną statystycznie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nadmierna ekspresja klotho poprawia przeżywalność komórek i łagodzi uszkodzenia zapalne wywołane przez NF-κB

Aby potwierdzić skuteczność dostarczania genów, ekspresję Klotho zmierzono zarówno na poziomie mRNA, jak i białka. Komórki nadekspresyjne klotho wykazały solidny wzrost w porównaniu z grupami kontrolnymi z hipoksją/reoxygenacją (H/R) i negatywnymi (p < 0,05; Rysunek 2A,B). ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu badana była ochronna rola Klotho w kardiomiocytach narażonych na uszkodzenia niedotlenienia/reoxygenacji (H/R), a nadekspresja Klotho znacząco poprawiała żywotność komórek, zmniejszała apoptozę i hamowała ekspresję cytokin prozapalnych. Efekty te towarzyszyły zmniejszonej fosforylacji p65 oraz zwiększonej fosforylacji IκBα, co sugeruje, że hamowanie sygnalizacji NF-κB przyczynia się do fenotypu ochronnego. Farmakologiczna inhibicja NF-κB przez PDTC wywołała efekty podobne do nadekspresji Klotho, podczas gdy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4% paradehyduBiosharpXG1050
Roztwór barwienia Annexin V APC/PIElabscienceE-CK-A217
Zestaw do syntezy cDNAQiagen205410
Rozwiązanie DAPIBioFroxx1155MG010
Dulbecco' Zmodyfikowany Eagle Medium (DMEM)HyCloneSH30243.01B
Zestaw do wykrywania odczynników ECLMeilunbioMA0186-1
Zasilacz elektroforezy (POWER PAC 200)Bio-RadPOWER PAC 200
Serum bydła płodu (FBS)VivaCellC04001-500, C04002-500
Cytometr przepływowy (Gallios)Beckman CoulterGallios
Mikroskop fluorescencyjny (BK6000)Chongqing OptecBK6000
Rozpuszczalnik formazanowySolarbioM1020
Przeciwciało przeciw IgG kozom sprzężonym z HRPBethylA120-101P
LPS (NF-κ Agonista Ścieżki B)Sigma-AldrichL2630
Czytnik mikropłyt (Model K3)ThermoK3
Komora inkubatora modułowego (Komora Hipoksji)Billups-RothenbergMIC-101
Rozwiązanie MTTKajmany21795
PDTC (NF-κ Inhibitor szlaku B)Sigma-AldrichP8765
Przeciwciało przeciw IgG kozy sprzężone z PEBiossbs-0295G-PE
Polibren (bromek heksadymetrowy)InvitrogenX2351
Membrana PVDFMerckISEQ00010
Rabbit Anti-Rat IL-1β PrzeciwciałaBiorbytorb378927
Przeciwciało IL-6 przeciwko królikom przeciwko szczuromZEN BIO384702
Rabbit Anti-Rat Iκ Bα PrzeciwciałaBiorbytorb223182
Przeciwciało przeciwko Klotho KrólikaBiorbytorb333711
Przeciwciało przeciw szczurom królika p65Biorbytorb229138
Rabbit Anti-Rat Phospho-Iκ Bα PrzeciwciałaBiorbytorb223035
Rabbit Anti-Rat Phospho-NF-κ Przeciwciało B p65Biorbytorb304662
Rabbit Anti-Rat TNF-α PrzeciwciałaBiorbytorb106548
Przeciwciało przeciwszczurze dla królików i beta;-aktynyHuabioET1702
System PCR w czasie rzeczywistym ilościowym (LightCycler 96)RocheLight Cycler96
Bufor lizy RIPAMredaMO52447
Zestaw do przygotowania żelu SDS-PAGEElabscienceE-IR-R305
Zestaw odczynników TRIzolTechnologie życia15596-018

Bibliografia

  1. SupplemenDong, G., et al. Rg1 prevents myocardial hypoxia/reoxygenation injury by regulating mitochondrial dynamics imbalance via modulation of glutamate dehydrogenase and mitofusin 2. Mitochondrion. 26, 7-18 (2016).
  2. Liu, J., et al. Rhein protects the myocardiac cells against hypoxia/reoxygenation-induced injury by suppressing GSK3β activity. Phytomedicine. 51, 1-6 (2018).
  3. Yang, H., Wang, C., Zhang, L., Lv, J., Ni, H. Rutin alleviates hypoxia/reoxygenation-induced injury in myocardial cells by up-regulating SIRT1 expression. Chem Biol Interact. 297, 44-49 (2019).
  4. Liang, W., Guo, J., Li, J., Bai, C., Dong, Y. Downregulation of miR-122 attenuates hypoxia/reoxygenation (H/R)-induced myocardial cell apoptosis by upregulating GATA-4. Biochem Biophys Res Commun. 478 (3), 1416-1422 (2016).
  5. Zhang, R. -Y., Qiao, Z. -Y., Liu, H. -J., Ma, J. -W. Sonic hedgehog signaling regulates hypoxia/reoxygenation-induced H9C2 myocardial cell apoptosis. Exp Ther Med. 16 (5), 4193-4200 (2018).
  6. Chen, H., Zhang, R. -Q., Wei, X. -G., Ren, X. -M., Gao, X. -Q. Mechanism of TLR-4/NF-κB pathway in myocardial ischemia reperfusion injury of mouse. Asian Pac J Trop Med. 9 (5), 503-507 (2016).
  7. Wang, R., et al. Leonurine alleviates LPS-induced myocarditis through suppressing the NF-κB signaling pathway. Toxicology. 422, 1-13 (2019).
  8. Luo, M., et al. Ginsenoside Rg1 attenuates cardiomyocyte apoptosis and inflammation via the TLR4/NF-κB/NLRP3 pathway. J Cell Biochem. 121 (4), 2994-3004 (2020).
  9. Yoon, S., et al. NF-κB and STAT3 cooperatively induce IL6 in starved cancer cells. Oncogene. 31 (29), 3467-3481 (2012).
  10. Yu, H., Lin, L., Zhang, Z., Zhang, H., Hu, H. Targeting NF-κB pathway for the therapy of diseases: mechanism and clinical study. Signal Transduct Target Ther. 5 (1), 209(2020).
  11. Bu, Y., et al. Targeting NF-κB RelA/p65 phosphorylation overcomes RITA resistance. Cancer Lett. 383 (2), 261-271 (2016).
  12. Xu, Y., Sun, Z. Molecular basis of Klotho: from gene to function in aging. Endocr Rev. 36 (2), 174-193 (2015).
  13. Urakawa, I., et al. Klotho converts canonical FGF receptor into a specific receptor for FGF23. Nature. 444 (7120), 770-774 (2006).
  14. Degaspari, S., et al. Altered KLOTHO and NF-κB-TNF-α signaling are correlated with nephrectomy-induced cognitive impairment in rats. PLoS One. 10 (5), e0125271(2015).
  15. Teocchi, M. A., Ferreira, A. ÉD., de Oliveira, E. P. L., Tedeschi, H., D'Souza-Li, L. Hippocampal gene expression dysregulation of Klotho, nuclear factor kappa B and tumor necrosis factor in temporal lobe epilepsy patients. J Neuroinflammation. 10 (1), 53(2013).
  16. Salminen, A., Kauppinen, A., Kaarniranta, K. Emerging role of NF-κB signaling in the induction of senescence-associated secretory phenotype (SASP). Cell Signal. 24 (4), 835-845 (2012).
  17. Feng, X., Luo, Q., Wang, H., Zhang, H., Chen, F. MicroRNA-22 suppresses cell proliferation, migration and invasion in oral squamous cell carcinoma by targeting NLRP3. J Cell Physiol. 233 (9), 6705-6713 (2018).
  18. Benoist, L., et al. Stimulation of P2Y11 receptor protects human cardiomyocytes against hypoxia/reoxygenation injury and involves PKCε signaling pathway. Sci Rep. 9 (1), 11613(2019).
  19. Zhang, J. -J., et al. Pyrrolidine dithiocarbamate inhibits nuclear factor-κB pathway activation, and regulates adhesion, migration, invasion and apoptosis of endometriotic stromal cells. Mol Hum Reprod. 17 (3), 175-181 (2011).
  20. Zeng, Y., et al. Klotho inhibits the activation of NLRP3 inflammasome to alleviate lipopolysaccharide-induced inflammatory injury in A549 cells and restore mitochondrial function through SIRT1/Nrf2 signaling pathway. J Physiol Investig. 66 (5), 335-344 (2023).
  21. Jin, M., et al. Klotho ameliorates cyclosporine A-induced nephropathy via PDLIM2/NF-κB p65 signaling pathway. Biochem Biophys Res Commun. 486 (2), 451-457 (2017).
  22. Wu, C., et al. The function of miR-199a-5p/Klotho regulating TLR4/NF-κB p65/NGAL pathways in rat mesangial cells cultured with high glucose and the mechanism. Mol Cell Endocrinol. 417, 84-93 (2015).
  23. Kwon, H. -J., et al. Stepwise phosphorylation of p65 promotes NF-κB activation and NK cell responses during target cell recognition. Nat Commun. 7 (1), 11686(2016).
  24. Shi, H., Berger, E. A. Characterization of site-specific phosphorylation of NF-κB p65 in retinal cells in response to high glucose and cytokine polarization. Mediators Inflamm. 2018, 3020675(2018).
  25. Chen, G., et al. α-Klotho is a non-enzymatic molecular scaffold for FGF23 hormone signalling. Nature. 553 (7689), 461-466 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Nadekspresja klotohusygnalizacja NF-KappaBkomórki H9C2Western blotcytometria przepływoważywotność komórekcytokiny prozapalneniedokrwienie mięśnia sercowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.