Testy wypływu lipoproteiny o wysokiej gęstości

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokoły pomiaru ilości fluorescencyjnego fosfolipidu specjalnie usuwanego z cząstek dawcy lipidów za pomocą lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL) obecnej w całym ludzkim osoczu lub surowicy. Wykazaliśmy, że ten wskaźnik funkcjonalności HDL przewiduje występ chorób sercowo-naczyniowych.

Streszczenie

Poziomy lipoproteiny HDL-cholesterolu (HDL) (HDL-C) w osoczu są obecnie kluczowym wskaźnikiem klinicznej oceny ryzyka chorób sercowo-naczyniowych (CVD). Usuwanie lipidów płytki nazębnej z komórek oraz osadów zewnątrzkomórkowych w ścianie tętnicy za pomocą HDL jest jedną z kilku funkcji antyaterogetycznych HDL, które mogą tłumaczyć jego odwrotny związek z ryzykiem chorób CVD. Usuwanie cholesterolu komórkowego in vitro za pomocą HDL okazało się ostatnio jeszcze lepszym predyktorem ryzyka chorób układowych niż HDL-C.

HDL składa się z niejednorodnej populacji cząstek, które pełnią różne funkcje. Cząstki HDL zaangażowane w usuwanie miażdżycowych lipidów płytki nazębnej zawierają wymienne apolipoproteiny, głównie apolipoproteiny A-I, które dysocjują się od cząstki, a następnie usuwają lipidy płytki nazębnej. Początkujący HDL powstaje w wyniku rozpuszczania i usuwania zarówno fosfolipidów, jak i cholesterolu z domen komórkowych błony komórkowej generowanych przez ABCA1 za pomocą wymiennych apolipoprotein pochodzących z HDL. Proces ten odgrywa kluczową rolę zarówno w zapobieganiu, jak i regresi blaszki miażdżycowej.

Tutaj opisujemy protokół dla testu fosfolipidowego wypływu bezkomórkowego, specyficznego dla HDL (HDL-SPE), który wcześniej wykazaliśmy jako zdolność do przewidywania ryzyka wystąpienia CVD. Ten test konkretnie mierzy usuwanie niewymiennego fluorescencyjnego fosfolipidu z cząstki lipidu za pomocą apolipoproteiny HDL. Nasze badania kliniczne przypadków i kontrol wykazały, że test HDL-SPE działa tak dobrze, a potencjalnie nawet lepiej niż "złoty standard" testu zdolności wypływu cholesterolu opartego na komórkach, który jest żmudnym i technicznie złożonym testem, który często wykorzystuje radioaktywny cholesterol.

Celem tego protokołu jest umożliwienie zarówno badaczom podstawowym, jak i klinicznym oceny funkcjonalności HDL w mobilizacji lipidów, za pomocą prostego, standaryzowanego, wolnego od komórek i wysokoprzepustowego testu. Test ten może być wykorzystywany przez podstawowych naukowców do uzyskania informacji o mechanizmach leżących u podstaw wydzielania lipidów podleganych HDL oraz do badania nowych leków terapeutycznych poprawiających funkcjonalność HDL. HDL-SPE może również służyć jako kliniczny test diagnostyczny laboratoryjny do oceny ryzyka CVD.

Wprowadzenie

Badanie wysokogęstościowego lipoproteinowego specyficznego wydzielania fosfolipidów (HDL-SPE) mierzy funkcjonalność HDL i jest przeznaczone do zastosowań w badaniach biomedycznych oraz laboratoriach diagnostycznych klinicznych, aby (i) uzyskać dalsze informacje na temat mechanizmów leżących u podstaw usuwania lipidów z zmian miażdżycowych przez HDL, (ii) stanowić nową platformę do poprawy oceny ryzyka chorób układu krążenia oraz (iii) opracować nowe terapie do leczenia chorób sercowo-naczyniowych.

HDL-cholesterol (HDL-C) jest ważnym czynnikiem determinującym ryzyko CVD¹, jednak jego użyteczność jest ograniczona, ponieważ podwyższone poziomy HDL-C (>80 mg/dL) wiążą się ze zwiększonym ryzykiem CVD ^2,3,4,5. Podwyższone poziomy HDL-C mogą oznaczać nagromadzenie dysfunkcyjnego HDL, które ma zmniejszoną zdolność do usuwania^lipidów płytki miażdżycowej w tętnicach.

Test zdolności wypływu cholesterolu komórkowego (CEC) był pierwszym testem in vitro opracowanym do pomiaru funkcjonalności HDL. W tym testie hodowlowane makrofagi (mysie lub ludzie), zazwyczaj oznaczane ^{3 H}- lub fluorescencyjnym Bodipy-cholesterolem, są inkubowane z osoczem lub surowicą uszczuploną apoB. Procent wypływu cholesterolu oblicza się na podstawie ilości fluorescencji/radioaktywności powiązanej z komórkami i medium, ^7,8,9. Test CEC okazał się lepszym predyktorem incydentu CVD niż HDL-C⁷. Test CEC nie nadaje się do przekształcenia w rutynowy test diagnostyczny kliniczny, głównie ze względu na wymagania dotyczące hodowli komórkowej i długiego czasu trwania (np. dni). Ponadto test CEC jest ograniczony przez swoją wrodzoną zmienność (np. różne typy komórek, techniki znakowania oraz zubożenie lipoproteiny β, co wpływa na skład HDL¹⁰).

Kilka grup badawczych opracowało testy wypływu cholesterolu HDL bez komórek, które służą jako narzędzia do zdobywania nowych informacji o funkcjonowaniu HDL oraz potencjalnego przekształcenia w kliniczny test diagnostyczny w celu lepszej oceny ryzyka CVD^11,12. Te testy wypływu zazwyczaj obejmują wiele etapów i wykorzystują cząstkę dawcy lipidów oznaczoną fluorescencyjnym cholesterolem, a podobnie jak test CEC, wymagają albo zużycia lipoprotein β, albo alternatywnie wychwytu cząstek zawierających apoA-I za pomocą przeciwciał anty-apoA-I, aby zmierzyć wypływ cholesterolu HDL w osoczu. Chociaż te alternatywne testy zostały potwierdzone jako powiązane w różnym stopniu z ryzykiem CVD, do tej pory tylko jeden¹³, oceniający kurs wymiany apoA-I, przewiduje ryzyko Incydentu CVD¹⁴. Co ciekawe, kinetyka wymiany apoA-I w osocze i poza nią wykazała niezależne powiązanie z CEC¹⁵ i znacznie zmniejszoną u pacjentów z ostrym zespołem wieńcowym¹⁶. Ponadto wykazano, że kilka wymiennych apolipoproteinów HDL pośredniczy zarówno w cholesterolu, jak i fosfolipidach z komórek ekspresujących ABCA1 in vitro¹⁷.

Opracowaliśmy alternatywne podejście do oceny funkcjonalności HDL¹⁸. Prosty, szybki i wiarygodny test opisany tutaj wymaga tylko dwóch składników, mianowicie całych próbek osocza (lub zwierzęcia) lub surowicy (świeżej lub zamrożonej przez rozmrażenie) oraz fluorescencyjnej cząstki dawcy pokrytej lipidami. Test mierzy zdolność apoA-I i innych wymiennych apolipoprotein związanych z HDL w całym osoczu/surowicy do usuwania niewymiennej, grupowo oznaczonej głową fluorescencyjnej fosfatydylethanolaminy (PE) z cząstki dawcy¹⁸ pokrytej lipidami (Rysunek 1).

Cząstki dawcy w tym badaniu to kryształy hydratu krzemianu wapnia (CSH) pokryte cholesterolem, fosfolipid fosfatydylocholina (PC) oraz fluorescencja PE. Wymienne apolipoproteiny związane z HDL, głównie apoA-I, uwalniane z cząstek HDL, wiążą się z cząstkami dawcy, a następnie dysocjują się wraz z lipidami cząstek dawcy, w tym fluorescencyjnym PE. W ten sposób HDL, ale nie inne lipoproteiny obecne w całym osoczu/surowicy, pobierają fluorescencyjną PE z cząstek dawcy ^18,19. Całe osocze/surowica jest inkubowana z fluorescencyjnymi lipidami pokrytymi hydratami krzemianu wapnia (LC-CSH) oraz solą fizjologiczną w temperaturze 37 °C, z wstrząsaniem przez 1 godzinę. Ponieważ LC-CSH ma około dwukrotnie większą gęstość niż woda, cząstki dawcy są łatwo oddzielane od plazmy przez niskoprędkościową wirówkę.

Procent wypływu PE mierzony w badaniach klinicznych jest zazwyczaj normalizowany przez podzielenie wartości fluorescencji PE nabytej przez HDL w supernatancie mieszaniny reakcji próbki klinicznej przez wartość uzyskaną przez HDL w referencyjnym osoczu kontrolowanym w ludzkim osoczu. Normalizacja do osady referencyjnej jest przeprowadzana w celu skorygowania zmian w przygotowaniu odczynników. W zastosowaniach badawczych % wypływu PE można określić, obliczając fluorescencję supernatantu PE podzieloną przez całkowitą fluorescencję (fluorescencja supernatantów PE + fluorescencja LC-CSH). Wartości pomiarów fluorescencyjnego supernatantu są wklejane do szablonu w plikach arkuszy kalkulacyjnych w celu obliczenia %PE Efflux (Tabela Uzupełniająca 1 dla potrójnych pomiarów oraz Tabela Uzupełniająca 2 dla pomiarów duplikacyjnych). Instrukcje dotyczące wykonywania tych obliczeń w arkuszu kalkulacyjnym są przedstawione jako pliki uzupełniające (Plik Uzupełniający 1, Plik Uzupełniający 2, Plik Uzupełniający 3, Plik Uzupełniający 4, Plik Uzupełniający 5, Plik Uzupełniający 6, Plik Uzupełniający 7 oraz Plik Uzupełniający 8), a przykładowe obliczenia przedstawiono jako Tabela Uzupełniająca 3.

Rysunek 1: Test HDL-SPE. Specyficzne dla HDL wydzielanie fosfolipidów jest badane w płytkach z 96 dołkami. Słone i kryształy hydratów krzemianu wapnia (szare) pokryte lipidami (LC-CSH), w tym niewymienialne lissaminerhodaminowe markerowane fosfatydylethanolaminą (LRh-PE; czerwone warstwy błonowe) oraz do 30 całych próbek osocza/surowicy (żółte; w trzech egzemplarzach) są ładowane na płytki 96-dołkowe. Po mieszaniu przez godzinę w temperaturze 37 °C w termomieszaczu, płytki są krótko wirowane, aby rozpylić cząstki dawcy LC-CSH. Alikwoty supernatantów, zawierające HDL oznaczone specjalnie LRh-PE, są przenoszone na czarną płytkę zawierającą detergent (rozpuszczający Lh-Rh-PE) oraz sól fizjologiczną. Następnie fluorescencja PE jest mierzona fluorimetrem. Sól fizjologiczna (kontrola negatywna; NC), do korekcji tła oraz zebrane zdrowe ludzkie osocze (kontrola pozytywna; PC) do normalizacji płytek, są ładowane zamiast próbki plazmy/surowicy w ostatnim zestawie dołków. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Protokół

Pobieranie krwi odbywa się zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskich z 1975 roku (https://www.wma.net/what-we-do/medical-ethics/declaration-of-helsinki/), zaktualizowanej w 2013 roku, i powinna być zgodna z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi świadomej zgody.

1. Przygotowanie fluorescencyjnych fosfolipidowych cząstek lipidowych dawcy

1. Tworzenie filmu lipidowego
   UWAGA: Przygotuj i wydawaj roztwory w okapu chemicznym. Noś fartuch laboratoryjny, rękawiczki i okulary ochronne. Roztwory chloroformu utylizować w organicznych odpadach chemicznych, roztwory Triton X-100 (bez osocza) w odpadach chemicznych oraz roztwory zawierające osocze w odpadach biologicznych/medycznych.
   1. Kup roztwory lipidowe w chloroformie od sprzedawcy lub przygotuj je w laboratorium:
      25 mg/mL: 1,2-dimyryztoyl-sn-glicero-3-fosfocholina (DMPC):
      10 mg/mL: Cholesterol
      1 mg/mL: 1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(lissaminerhodamina B sulfonyl) [LRh-PE]
      UWAGA: Używaj szklanych rurek z zakręcaną głowką. Zabezpiecz nakrętkę taśmą teflonową.
      Przechowywać w temperaturze -20 ^°C.
   2. Określ ilość potrzebnego LC-CSH i przygotuj odpowiednią liczbę szklanych tub.
      W chemicznym okapie do każdej rurki z borokrzemowego szkła o średnicy 10 mm 150 mm dodaj następujące składniki: 472 μL roztworu DMPC (17,7 μmol, 11,8 mg), 339 μL roztworu cholesterolowego (8,8 μmol, 3,39 mg) oraz 305 μL LRh-PE (200 nmol, 0,305 mg). Krótko zmieszać wir.
   3. W chemicznym okapie wysusz mieszaninę lipidową w szklanej rurce pod delikatnym strumieniem N₂ przez 1 godzinę, aby utworzyć suchy lipidowy film na dnie rurki.
      UWAGA: Przepływ N₂ powinien powodować jedynie lekkie falowanie powierzchni płynu.
   4. W badaniach wymagających kilku płytek 96-dołkowych przez dni lub tygodnie, przygotuj dużą partię LC-CSH, którą można alicytać do rurek lub użyć do produkcji gotowych do użytku płytek LC-CSH, przechowywanych w temperaturze -20 °C lub -80 °C. Zobacz kroki 2.2.1-2.2.2 poniżej.
2. Pokrywanie hydratu krzemianu wapnia fluorescencyjną warstwą lipidową
   UWAGA: Podczas kontaktu z nawilżaniem krzemianu wapnia należy nosić fartuch laboratoryjny, rękawiczki, maseczkę oraz okulary ochronne.
   1. Włóż do szklanej rurki z wysuszonymi lipidami stożek papieru wagowego. Dodaj 80 mg hydratu krzemianu wapnia (CSH) w proszku (odczynnika usuwającego lipidy) do szklanej rurki za pomocą stożka papieru wagowego, aby skierować proszek do podstawy probówki. Natychmiast dodaj 2 ml soli fizjologicznej do szklanej rurki zawierającej wysuszone lipidy i CSH. Przykryj górę tubki parafilmem.
   2. Wiruj ręcznie, aby usunąć większość lipidu z dna szklanej rurki. Włóż szklaną rurkę do otworu wykonanego w platformie styropianowej przymocowanej do górnej części wiru. Przymocuj rurkę do platformy wirowej za pomocą wzmocnionej taśmy.
      UWAGA: Wstępnie dostosuj prędkość wiru, aby mieszanka mogła przesunąć się mniej więcej do połowy szklanej rury.
   3. Wiruj przez 10 minut. Po wirowaniu potwierdzić, że na ściance rurki nie pozostał żaden lipid. W razie potrzeby można ręcznie przeprowadzić wiry, aż nie pozostanie żaden lipid. Przenieś całkowitą objętość szklanej rurki do stożkowej rurki plastikowej o pojemności 15 mL, używając pipety o pojemności 1 mL. Opłucz ścianki szklanej dodatkowej soli fizjologicznej 3 mL i przelej do tej samej stożkowej plastikowej rurki o pojemności 15 mL.
3. Mycie LC-CSH
   1. Wiruj plastikową rurkę o pojemności 15 mL zawierającą lipidowy powlekany CSH (LC-CSH) przez 2 minuty w dawce 935 × g w temperaturze 4 °C, aby rozpylić cząstki dawcy. Ostrożnie usuń supernatant przez aspirację próżniową za pomocą długiej, bardzo cienkiej końcówki pipety.
   2. Zacznij od góry supernatantu i powoli przesuwając końcówkę pipety wzdłuż boku rurki, przechylaj rurkę podczas wyjmowania supernatantu. Zostaw niewielką ilość (≈ 200 μL) soli fizjologicznej, aby zapobiec przypadkowemu zasysaniu LC-CSH z pelletu. Dodaj tyle soli fizjologicznej, by całkowita objętość wynieść 5 mL.
   3. Powtórz kroki 1.3.1-1.3.2 cztery razy. Po ostatnim myciu dodaj tyle soli fizjologicznej, aby końcowa objętość wyniosła 2,5 mL.
      UWAGA: Przechowywać w przygotowaniach LC-CSH w 4 °C przez 2 tygodnie lub w -20 °C lub -80 °C do 6 miesięcy.
4. Przygotowanie dużych partii gotowych do użycia płyt LC-CSH
   UWAGA: To podejście umożliwia przygotowanie płytek pomiarowych o jednolitym składzie odczynników z tej samej partii LC-CSH, minimalizując tym samym zmienność pomiarów między płytami.
   1. Przygotuj 12 probówek LC-CSH (2,5 mL x 12 probówek), zgodnie z opisaniem w krokach 1.1.1-1.3.2 powyżej. Połącz całą zawartość wszystkich 12 probówek w stożkowej plastikowej tubce o pojemności 50 mL (30 ml objętości całkowitej). Ostrożnie przeprowadzić wir, aby uzyskać jednorodny rozkład cząstek LC-CSH, i podać 6 mL do plastikowej stożkowej rurki o pojemności 15 mL. Powtórz cztery razy, aby uzyskać łącznie 5 plastikowych stożkowych rurek, z których każda zawiera 6 mL LC-CSH.
   2. Każda rurka dostarcza wystarczającą ilość LC-CSH do produkcji 5 gotowych do użytku płyt LC-CSH (zawierających 50 μL na odwiert dla wszystkich 96 dołków w jednej płycie). Zobacz kroki 2.2.1-2.2.2 poniżej.

2. Inkubacja próbek osocza/surowicy z fluorescencyjnymi fosfolipidowymi cząstkami lipidowymi (LC-CSH)

1. Pojedyncze tablice do natychmiastowego użytku.
   1. Pipeta włóż 75 μL soli fizjologicznej do każdego dołka płyty o pojemności 0,3 mL z 96 dołkami, używając tylu dołków, ile potrzeba do analizy zestawu próbek. Pipeta 100 μL soli fizjologicznej do potrójnych dołków kontroli negatywnej (NC) oraz 75 μL soli fizjologicznej do duplikatów dołków z dodatnim kontrolowaniem (PC) (Rysunek 2). Użyj pipety wielokomorowej do podawania.
   2. Przed podawaniem LC-CSH przerób 15 mL plastikową tubkę z materiału 3 razy, po 10 sekund każda. Używając pipety z pojedynczym dołkiem, rozprowadź 50 μL LC-CSH po prawej stronie dołków zawierających sól fizjologiczną. Szybko podawaj po 50 μL do tylko 3 dołków. Powtórz protokół wiru przed podaniem LC-CSH do kolejnych 3 otworów.
      UWAGA: Procedura ta jest kluczowa, aby zapewnić, że ciężki LC-CSH, który samoistnie się osadza, jest jednorodnie zawieszony, co pozwala na jednakowe dawkowanie ilości do każdego odwiertu.
   3. Obróć płytę z 96 odwiertami o 180°, tak aby lewa strona odwiertu była teraz przesunięta w prawo. Pipeta 25 μL próbek plazmy/surowicy wzdłuż prawej strony studni (Rysunek 2). Do dołków PC należy dodać 25 μL referencyjnego standardowego ludzkiego normolipidemicznego osocza/surowicy w organizmie. Całkowita objętość na odwiert dla testu wynosi 150 μL.
      UWAGA: Procedura ta zapobiega krzyżowemu zanieczyszczeniu osocza/surowicy LC-CSH, ponieważ są one podawane po przeciwnych stronach studni.
   4. Szczelnie uszczelnij płytkę folią klejącą. Inkubuj szczelną płytę z 96 dołkami w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 1200 obr./min w termomieszaczu. Po zakończeniu inkubacji wyjmij płytkę z termomieszarki i umieść ją na lodzie. Wiruj płytę przez 2 minuty w temperaturze 4 °C (aby zatrzymać reakcję transferową) przy 935 g , aby rozpylić cząstki dawcy.
2. Gotowe do użycia tablice LC-CSH
   1. Do użytku rozmroz mrożone talerze gotowe do użycia (patrz kroki 1.4.1-1.4.2 dla przygotowania talerzy) na zimno (4 °C do 10 °C) przez 2 godziny (lub noc, jeśli to konieczne). Wirówka przez 2 minuty w temperaturze 4 °C przy 935 × g , aby zebrać cały materiał (125 μL) razem. Ostrożnie usuń folię klejącą, aby nie rozpryskać zawartości dołków.
   2. Podaj 25 μL próbek osocza/surowicy z soli fizjologicznej i referencyjnego osocza ludzkiego w trzech egzemplarzach do odpowiednich dołków (Rysunek 1) na płytce gotowej do użycia, na lodzie, i zapieczętuj folią klejącą. Inkubuj szczelny 96-dołek w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 1200 obr./min w termomieszaczu. Wyjmij płytę z termomieszacza i włóż do lodu. Wiruj płytę przez 2 minuty w temperaturze 4 °C (aby zatrzymać reakcję transferową) przy 935 × g (aby rozpylić cząstki dawcy).

Rysunek 2: Podawanie odczynników do studni bez zanieczyszczenia krzyżowego. Podawaj osocze/surowicę i LC-CSH na przeciwległe ściany dołków. Zanieczyszczenie krzyżowe minimalizuje się, jeśli płytka zostanie obrócona o 180° po pierwszym wydaniu LC-CSH. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

3. Pomiar fluorescencyjnego wypływu fosfolipidów do osocza/surowicy HDL

1. Przejście na czarną płytę i pomiar fluorescencji
   1. Ostrożnie usuń warstwę klejącą, aby nie ruszyć granulki LC-CSH.
      UWAGA: Jeśli wystąpi przerwanie granulek, ponownie wiruj.
   2. Przelej 50 μL supernatantu z 96-dołowej płyty reakcyjnej do wgłębień 96-dołkowej czarnej płyty polistyrenowej o płaskim dnie do pomiarów fluorescencji. Użyj pipety wielokomorowej.
      UWAGA: Nie zasysaj LC-CSH. Jeśli tak się stanie, wstrzyknij z powrotem do studni i ponownie wiruj.
   3. Napełnij zbiornik zwykłą solą fizjologiczną. Dodaj 50 μL soli fizjologicznej do każdego dołka za pomocą pipety wielodołkowej.
   4. Przygotuj 1% TX-100, dodając 90 mL wody destylowanej do 10 mL roztworu zapasowego Triton X-100 10% w plastikowej kolbie Erlenmeyer o pojemności 125 mL. Napełnij zbiornik 1% Triton-X 100.
   5. Dodaj 100 μL 1% Triton X-100 w temperaturze pokojowej do każdego dołka i wymieszaj, delikatnie pipetując 2-3 razy w górę i w dół za pomocą pipety wielodołkowej. Unikaj tworzenia bąbelków. Przebij pęcherzyki powietrzem z pipety transferowej 3 mL.
   6. Zmierz fluorescencję lissaminerhodaminy fluorimetrem (wzbudzenie 540 nm / emisja 600 nm).
2. Obliczanie wypływu %PE
   1. Obliczenie wypływu PE
      1. %PE wydzielanie = ([całkowity supernatant w osocze lub surowicy grypy - supernatant NC FLU]/całkowita grypa)) × 100
         FLU = jednostki fluorescencyjne; NC = kontrola negatywna. Ponieważ do pomiaru fluorescencji na dołek używa się tylko 50 μL z 150 μL mieszaniny reakcji supernatantowej, należy to skorygować w następujący sposób:
      2. Całkowity supernatant GRYPA/studnia = Zmierzony poziom GRYPY 50 μL (płytka) × 3
      3. Całkowita GRYPA na 150 μL mieszaninę/dołek reakcji = Całkowita GRYPA emitowana przez 50 μL LC-CSH.
         UWAGA: Fluorescencja LC-CSH oblicza się zgodnie z opisaniem poniżej (krok 4.2.5).
   2. Znormalizowane obliczenia wypływu %PE
      1. Użyj znormalizowanego wypływu %PE do korekty różnic między testami wykonywanymi w różnych warunkach (np. eksperymenty przeprowadzone w różne dni, różnice w partiach).
      2. Użyj tego wzoru do obliczenia znormalizowanego %PE efflux:
         Normalizowany %PE Efflux = Próbka supernatantu %PE efflux value (FLU)/dodatnia referencyjna kontrola supernatant %PE efflux FLU value.
      3. Użyj identycznego zgromadzonego osocza ludzkiego od zdrowych dawców z prawidłowym profilem lipidowym jako kontroli referencyjnej. Nie ma potrzeby obliczania całkowitej ilości FLU/studni nadmiaru, ponieważ ta wartość jest taka sama zarówno dla próbki, jak i dla źródła.
      4. Dla próbek potrójnych wklej surowe dane uzyskane w kroku 3.1.6 do arkusza kalkulacyjnego (Tabela Uzupełniająca 1). W przypadku próbek duplikatów wklej surowe dane uzyskane w kroku 3.1.6 do arkusza kalkulacyjnego (Tabela Uzupełniająca 2).

4. Krzywa standardowa LC-CSH

UWAGA: Krzywa standardowa LC-CSH służy do obliczania ilości sygnału fluorescencyjnego PE obecnego w aliquotach LC-CSH na odwiert. Zazwyczaj stosuje się 50 μL LC-CSH/dołek. Ta wartość może być użyta do obliczenia %PE wypływu do HDL w próbce znormalizowanej do całkowitej GRYP (patrz krok 3.2.1) obecnej w mieszance reakcji.

%PE efflux = ((jednostki fluorescencji supernatantu [GRYPA] - nadmiarnik z soli fizjologicznej FLU)/(całkowity LC-CSH FLU)) x 100.

1. Szeregowe rozcieńczenie LC-CSH
   1. Przygotuj 10-krotnie i 100-krotnie rozcieńczone zapasy stockowego LC-CSH (zgodnie z krokami 1.1.1-1.3.3):
      10-krotne rozcieńczenie: 100 μL LC-CSH + 900 μL 1% Triton X-100
      100-krotne rozcieńczenie: 100 μL 10-krotnie rozcieńczonego LC-CSH + 900 μL 1% Triton X-100
   2. Podawaj potrójne próbki 10- i 100-krotnie rozcieńczonego LC-CSH do płytki inkubacyjnej z 96 dołkami dla krzywej standardowej (patrz Rysunek 3).
   3. Dodaj wystarczającą objętość 1% Triton X-100 do odwiertów zawierających LC-CSH, aby uzyskać końcową objętość 200 μL (patrz Tabela 1).
2. Rozpuszczalność LC-CSH do pomiaru fluorescencji
   1. Uszczelnij płytę folią klejącą i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze 24 °C, potrząsając przy 1200 obr./min. Płyta wirówkowa przez 2 minuty w temperaturze 4 °C przy 935 × g. Ostrożnie usuń taśmę klejącą.
   2. Używając pipety wielowarstwowej, mieszaj próbki pipetując w górę i w dół 2-3 razy. Przelej 100 μL LC-CSH na dołek na 96-dołkowy polistyren płytę płaskiego do pomiarów fluorescencji, używając pipety wielodołkowej.
   3. Do każdej studni dodaj 100 μL o stężeniu 1% Triton-X w temperaturze pokojowej, używając pipety wielowarstwowej. Mieszaj, pipetując w górę i w dół 2-3 razy.
   4. Zmierz fluorescencję fluorimetrem (wzbudzenie 540 nm/emisja 600 nm).
   5. Wklej wartości fluorescencji zmierzone za pomocą fluorimetru do szablonu analizy regresji liniowej w Tabeli Uzupełniającej 1 , zgodnie z Plikiem Uzupełniającym 3. Końcowe stężenia LC-CSH na standardowej płycie pomiarowej krzywej przedstawiono w Tabeli 2.

Rysunek 3: Tablica dla krzywej standardowej LC-CSH. Seryjnie rozcieńczony LRh-PE-oznaczony LC-CSH jest podawany do płytki z 96 dołkami, jak pokazano. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Ostateczna koncentracja	10 razy rozcieńczone	100-krotnie rozcieńczone	1% Triton X-100	Razem
LC-CSH	LC-CSH	LC-CSH	Detergent	Volumy
(μL/well)	(μL)	(μL)	(μL)	(μL)
10	100	0	100	200
5	50	0	150	200
2.5	25	0	175	200
1	0	100	100	200
0.5	0	50	150	200
0.25	0	25	175	200

Tabela 1: Objętości odczynników dodawanych do studni płyty inkubacyjnej dla standardowej krzywej LC-CSH.

Rozpuszczalność	Sól fizjologiczna	Razem	Dodano	Mierzone
LC-CSH	Volumy	Volumy	LC-CSH	LC-CSH
(μL)	(μL)	(μL)	(μL/well)	(μL/well)
100	100	200	10	5
100	100	200	5	2.5
100	100	200	2.5	1
100	100	200	1	0.5
100	100	200	0.5	0.25
100	100	200	0.25	0.125

Tabela 2: Objętości odczynników dodawanych do studni płytki pomiarowej dla krzywej standardowej LC-CSH.

Wyniki

Metody analityczne

Jak wspomniano powyżej, analizy próbek HDL-SPE mogą być modyfikowane do różnych zastosowań, co pokazano poniżej. Przed przeprowadzeniem badań na próbkach badawczych najpierw przeprowadza się walidację krzywej standardowej, powtarzalność oraz testy stężenia w osoczu, aby opanować wymagane techniki. Po pierwsze, przeprowadzić analizę krzywej standardowej LC-CSH w celu oceny jakości preparatów LC-CSH. Następnie wykonaj test powtarzalności. Na koniec należy wyko...

Dyskusja

HDL-C jest kluczowym czynnikiem określającym ryzyko chorób sercowo-naczyniowych (CVD), a tym samym potrzebę stosowania leczenia obniżającego lipidy lub innych potencjalnych profilaktycznych metod^{leczenia 1}. Funkcja HDL w komórkowym wypływie cholesterolu in vitro okazała się jeszcze lepszym predyktorem wystąpień chorób sercowo-naczyniowych niż HDL-C⁷. Niestety, ten test komórkowy nie nadaje się do konwersji na wysokoprzepustowy test laboratoryjny kliniczny do rutyno...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,2-dimyryztoyl-sn-glicero-3-fosfocholina	Avanti Research	850345	14:0 PC (DMPC) Rozpuszczalność chloroformu
1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(lisamina rodamina B sulfonyl) (sól amonowa)	Avanti Research	810150-C	Roztwór chloroformu LRh-PE
Folia klejąca	Biosystemy stosowane	4306311	MicroAmp przezroczysta folia klejąca
Bay Corporation Taśma Teflonowa o wysokiej gęstości 1/2 cala x 520	Rozwiązania do testów medycznych	86732
Rurki ze szkła borokrzemowego 20 mm i ostre; 150 mm	Fisher Scientific	14-961-33
Wirówka	Thermo Scientific	Seria Sorvall X Pro
Chloroform	Sigma-Aldrich	366927	odpowiedni do HPLC i ge; 99.8%
Proszek cholesterolowy	Sigma-Aldrich	C8667	3β-Hydroksy-5-cholesten, 5-Cholesten-3β-ol
Papier wagowy szklinowy	Cole-Palmer	UX-01338-02	Do obsługi LC-CSH
Płytka inkubacyjna	USA Scientific	1402-9700	TempPlate 96 well pół skirt 0,2mL płyty PCR
Środek usuwający lipidy (LRA)	Supelco	13358-U	LC-CSH
Tablica pomiarowa	Greiner bio-one	655076	Mikropłytka, PS, 96-dołek, F-DNO (STUDNIA KOMINA),; FLUOTRAC, WIĄZANIE MEDYCZNE
Microsoft Excel	Microsoft 365 MSO	Wersja 2507
Końcówki MultiFlex Pipet	Fisher Scientific	50-550-206	Dla aspirującego supernatantu podczas płukania LC-CSH
Czytnik płyt wieloznacznych	Perkin Elmer	1420-050	Victor3 Wallac1420 Licznik Multilabel
Sól fizjologiczna	Jakość biologii i innych źródeł;	114-055-101	Do wielokrotnego zastosowania
Parafilm	Cole-Palmer	HS23452	Aby zakryć szklaną górę rury podczas wirowania
Flaszki Erlenmeyera z polikabonami	Fisher Scientific	10-041-8	Dla 10% roztworu Triton-X
Zgromadzone osocze ludzkie (krew) Heparyna Li	Innovative Research Inc	IPLAWBLIH	Osocza referencyjna, kontrola dodatnia (PC)
Surfact-Amps X 100	Thermo Scientific	28314	10% Triton X-100, rozcieńczony 10x wodą destylowaną
Termomieszarka	Eppendorf	5382000023	Termomikser C z termoblokiem 96-dołkowym
Smartblock termomiksera	Eppendorf	5306000006	SmartBlock z 96 studni
Pipety transferowe (3 mL, Falcon)	Fisher Scientific	13-711-9CM	Do usuwania bąbelków z górnej części studni
Mieszacz wirowy	Daigger	3030A	Uchwyt na szklaną rurkę na górze