Identyfikacja biomarkerów molekularnych związanych z odpornością w zaburzeniach ze spektrum autyzmu przy użyciu proteomiki akwizycji niezależnej od danych i uczenia maszynowego

Jun He; Qingqing Hu; Sifeng Wang; Xiaohui Gong; Ni Gan; Li Huang; Haofeng Chen; Jie Dai; Hong Yu; Shuanglin Xiang; Xiangwen Peng

doi:10.3791/68949

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Identyfikacja biomarkerów molekularnych związanych z odpornością w zaburzeniach ze spektrum autyzmu przy użyciu proteomiki akwizycji niezależnej od danych i uczenia maszynowego

551 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68949

⸱

26 września 2025

Jun He^*¹^,² , Qingqing Hu^*³ , Sifeng Wang^*¹^,² , Xiaohui Gong^*¹ , Ni Gan¹ , Li Huang³ , Haofeng Chen⁴ , Jie Dai⁴ , Hong Yu⁴ , Shuanglin Xiang¹ , Xiangwen Peng¹^,²

¹College of Life Sciences, Hunan Normal University, ²Changsha Maternal and Child Health Hospital, Affiliated to Hunan Normal University, ³Changsha Central Hospital, Affiliated to University of South China, ⁴Shanghai Bioprofile Technology Co., Ltd.

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystujący niezależną od danych spektrometrię mas akwizycji i uczenie maszynowe, który zidentyfikował osiem białek związanych z odpornością jako dokładne biomarkery do wczesnej diagnozy zaburzeń ze spektrum autyzmu, potwierdzone za pomocą testu immunoenzymatycznego.

Streszczenie

W badaniu przedstawiono powtarzalny protokół identyfikacji biomarkerów białkowych surowicy związanych z zaburzeniami ze spektrum autyzmu (ASD) przy użyciu spektrometrii mas niezależnej od danych (DIA) w połączeniu z uczeniem maszynowym (ML). DIA umożliwia bezstronne profilowanie proteomu surowicy w wysokiej rozdzielczości, w tym białek o niskiej liczebności, zapewniając jednocześnie odtwarzalność we wszystkich próbkach. Podejścia ML zastosowano w celu wybrania diagnostycznie informacyjnych paneli białkowych i poprawy odporności modelu. Analiza obejmowała surowicę 99 dzieci z ASD i 70 osób z grupy kontrolnej w tym samym wieku. Białka o wysokiej obfitości zostały zubożone, peptydy przygotowano przy użyciu standardowych procedur trawienia i frakcjonowania, a DIA przeprowadzono na spektrometrze masowym o wysokiej rozdzielczości. Przetwarzanie danych i kwantyfikacja pozwoliły zidentyfikować białka o zróżnicowanej ekspresji, które poddano analizie wzbogacenia funkcjonalnego. Osiem białek związanych z odpornością okazało się silnymi kandydatami do opracowania biomarkerów. Model regresji logistycznej wytrenowany na tych białkach osiągnął dokładność 95,27%, wartość Kappa 0,9025 i AUC 1,000 w walidacji krzyżowej. Odkrycia te pokazują potencjał proteomiki opartej na DIA w połączeniu z uczeniem maszynowym jako solidnej ramy do odkrywania biomarkerów w ASD i adaptacji w szerszych badaniach klinicznych.

Wprowadzenie

Zaburzenie ze spektrum autyzmu (ASD) to grupa zaburzeń neurorozwojowych o wczesnym początku, charakteryzujących się niejednorodnością etiologii i obrazu klinicznego. Podstawowe cechy obejmują uporczywe deficyty w komunikacji społecznej i interakcji, a także ograniczone, powtarzające się zachowania, zainteresowania lub czynności. W Stanach Zjednoczonych rozpowszechnienie wynosi około 2,3% wśród 8-letnich dzieci i około 2,2% wśród dorosłych, co podkreśla jego wpływ na zdrowie publiczne 1,2,3,4. Czynniki ryzyka są zróżnicowane, w tym predyspozycje genetyczne, dysregulacja immunologiczna i prenatalne narażenie środowiskowe ^5,6,7. Wczesna diagnoza i interwencja mogą znacznie poprawić wyniki rozwojowe, sprawiając, że identyfikacja obiektywnych i wiarygodnych biomarkerów jest głównym celem badań nad ASD ^8,9,10. Protokół ten opiera się na naszych wcześniej opublikowanych pracach wykorzystujących proteomikę niezależnego od danych pozyskiwania (DIA) i uczenie maszynowe w celu identyfikacji białek związanych z odpornością jako potencjalnych biomarkerów wczesnej diagnozy^{ASD 11}.

Pomimo szeroko zakrojonych wysiłków, obecnie nie istnieją żadne specyficzne i powszechnie zwalidowane biomarkery do klinicznej diagnozy ASD¹². Proponowane kandydatury – takie jak zmiany w mikrobiomie jelitowym¹³, podwyższony poziom interleukiny-6 (IL-6)¹⁴, zmiany w neurotroficznym czynniku pochodzenia mózgowego (BDNF)¹⁵ i markery stresu oksydacyjnego, takie jak glutation¹⁶ – pozostają wstępne i nie są odtwarzalne do użytku klinicznego. Proteomika okazała się obiecującym podejściem do identyfikacji sygnatur molekularnych specyficznych dla choroby, a w kilku badaniach zbadano różne próbki biologiczne (krew, ślina, mocz, PBMC) pod kątem białek o zróżnicowanej ekspresji 8,17,18,19,20,21,22 . Na przykład Bao i in. wykazali, że białka zapalne zidentyfikowane przez proteomikę Olink mogą pomóc we wczesnej diagnozie ASD (17), podczas gdy inne badania sugerują, że wspólne szlaki proteomiczne i metaboliczne mogą dawać solidne biomarkery pomimo genetycznej heterogeniczności ASD²³.

Spektrometria mas DIA cieszy się coraz większym zainteresowaniem ze względu na kompleksowe i powtarzalne profilowanie białek. W przeciwieństwie do tradycyjnej akwizycji zależnej od danych (DDA), która selektywnie fragmentuje najbardziej intensywne jony, DIA fragmentuje wszystkie jony prekursorowe w predefiniowanych oknach m/z. Zapewnia to głębsze pokrycie proteomu i lepszą odtwarzalność w dużych kohortach, co jest kluczową zaletą w porównaniach klinicznych¹⁴. Badania porównawcze pokazują, że DIA wykrywa bardziej ilościowe peptydy niż DDA, szczególnie w przypadku białek o niskiej liczebności, z mniejszą zmiennością między przebiegami¹⁴.

Opierając się na tych postępach, zastosowaliśmy analizę proteomiczną opartą na DIA do próbek surowicy od 99 dzieci z ASD i 70 dzieci z grupy kontrolnej, po wyczerpaniu białek o wysokiej obfitości. Nasze odkrycia podkreślają potencjał białek związanych z odpornością jako markerów molekularnych do wczesnej diagnozy ASD i pokazują wartość proteomiki opartej na DIA w odkrywaniu biomarkerów w połączeniu z rygorystyczną metodologią¹¹.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół został przeprowadzony zgodnie z Deklaracją Helsińską i został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną w Szpitalu Zdrowia Matki i Dziecka Changsha; Uzyskano świadomą zgodę od uczestników.

1. Identyfikacja dzieci z autyzmem za pomocą DSM-5

Gromadzenie historii medycznej i informacji ogólnych
1. Historia rozwoju
  1. Zbierz informacje na temat wczesnego rozwoju pacjenta, w tym postępów językowych, społecznych i motorycznych.
  2. Zwróć uwagę na wszelkie opóźnienia lub nieprawidłowości rozwojowe (np. opóźnienie językowe, trudności w interakcjach społecznych).
2. Historia rodzinna
  1. Zapytaj o historię autyzmu lub innych zaburzeń neurorozwojowych w rodzinie.
3. Aktualny poziom funkcjonalny
  1. Oceń wydajność pacjenta w życiu codziennym, w tym w nauce, pracy, interakcjach społecznych i umiejętnościach niezależnego życia.
Korzystanie z kryteriów diagnostycznych DSM-5
1. Utrzymujące się deficyty w komunikacji społecznej i interakcjach społecznych
  1. Upewnij się, że spełnione są co najmniej dwa z następujących trzech kryteriów:
    1. Deficyty wzajemności społeczno-emocjonalnej – brak normalnego kontaktu wzrokowego, mimiki twarzy lub mowy ciała oraz trudności w nawiązywaniu przyjaźni lub związków odpowiednich do wieku.
    2. Deficyty w niewerbalnych zachowaniach komunikacyjnych – szukaj wyzwań w używaniu gestów, mimiki lub tonu głosu do przekazywania emocji i ograniczonego zrozumienia niewerbalnych wskazówek od innych.
    3. Deficyty w rozwijaniu, utrzymywaniu i rozumieniu relacji – to trudności z przystosowaniem się do różnych kontekstów społecznych oraz brak zainteresowania rówieśnikami lub niezdolność do angażowania się w zabawę z wyobraźnią.
2. Ograniczone, powtarzające się wzorce zachowań, zainteresowań lub działań
  1. Upewnij się, że spełnione są co najmniej dwa z następujących czterech kryteriów:
    1. Stereotypowe lub powtarzające się ruchy motoryczne (np. machanie rękami, kołysanie ciałem lub powtarzające się używanie przedmiotów).
    2. Nacisk na identyczność lub zrytualizowane wzorce zachowań – szukaj skrajnego stresu z powodu drobnych zmian w rutynie.
    3. Wysoce ograniczone, zafiksowane zainteresowania - szukaj wyjątkowo intensywnego skupienia się na określonych tematach lub działaniach.
    4. Nadreaktywność lub hiporeaktywność na bodźce sensoryczne – szukaj nietypowych reakcji na bodźce sensoryczne, takie jak dźwięki, światła lub dotyk.
Ocena początku i nasilenia objawów
1. Czas wystąpienia objawów – potwierdź, że objawy występowały we wczesnym dzieciństwie (zazwyczaj przed 3 rokiem życia), nawet jeśli stają się bardziej widoczne później.
2. Wpływ objawów – potwierdź, że objawy powodują znaczne upośledzenie w społecznych, zawodowych lub innych ważnych obszarach funkcjonowania.
3. Poziomy ważności
  UWAGA: Zgodnie z DSM-5 nasilenie ASD jest podzielone na trzy poziomy (tabela uzupełniająca S1).
  1. Skategoryzuj jako poziom 1, jeśli pacjent wymaga tylko łagodnego wsparcia.
  2. Klasyfikuj jako poziom 2, jeśli pacjent wymaga znacznego wsparcia (umiarkowany).
  3. Klasyfikuj jako poziom 3, jeśli pacjent wymaga bardzo znacznego wsparcia (ciężkiego).
Wykluczenie innych potencjalnych przyczyn
1. Badanie lekarskie Przeprowadź niezbędne oceny medyczne (np. badania genetyczne, obrazowanie mózgu), aby wykluczyć inne schorzenia, które mogą powodować podobne objawy (np. zespoły genetyczne, upośledzenie słuchu, niepełnosprawność intelektualna).
2. Ocena chorób współistniejących: Oceń obecność chorób współistniejących (np. zespół nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi, zaburzenia lękowe, depresja, padaczka itp.).

2. Przygotowanie próbki do analizy spektrometrii mas DIA

Zgodność z zasadami etycznymi i pobieranie próbek
1. Uzyskaj świadomą zgodę rodziców lub opiekunów prawnych dzieci w wieku 3-7 lat, u których zdiagnozowano zaburzenia ze spektrum autyzmu (ASD).
2. Klasyfikuj pacjentów według poziomów nasilenia od 1 do 3 zgodnie z kryteriami diagnostycznymi określonymi w amerykańskim DSM-5 dla autyzmu (krok 1.3.3).
3. Pobranie próbek surowicy od uczestników. Upewnij się, że wszystkie próbki zostały przetworzone w ciągu czterech godzin od pobrania krwi, aby zapobiec degradacji białka. Podczas przetwarzania próbki należy przechowywać na lodzie.
Usuwanie białek o wysokiej liczebności
1. Użyj komercyjnego zestawu, aby zubożyć białka o wysokiej obfitości z 60 μl surowicy na próbkę, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko zrównoważyć kolumnę zubożającą buforem wiążącym, załadować próbkę surowicy i pozwolić jej przejść przez kolumnę pod przepływem grawitacyjnym. Zebrać przepływ, który zawiera frakcję białkową o niskiej liczebności.
2. Zmierz całkowite stężenie białka za pomocą testu BCA. Normalizować wszystkie próbki do końcowego stężenia 0,5-1,0 μg/μl przed mineralizacją w roztworze. Upewnij się, że każda próbka zawiera co najmniej 100 μg białka do późniejszej analizy.
Trawienie białek
UWAGA: Trawienie białek przeprowadzono metodą FASP opisaną przez Wiśniewskiego i ^wsp.24.
1. Dodaj detergent, ditiotreitol (DTT) i jodoacetamid (IAA) do buforu UA (bufor mocznikowy), aby zablokować zredukowaną cysteinę.
2. Zawiesinę białkową z trypsyną trawić w proporcji 50:1 przez noc w temperaturze 37 °C.
Odsalanie peptydów, oczyszczanie i frakcjonowanie w odwróconych fazach o wysokim pH
1. Odwirować mieszaniny peptydów w temperaturze 16 000 × g przez 15 minut w temperaturze °C w celu usunięcia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń.
2. Przenieść supernatant (zawierający strawione peptydy) do nowej probówki mikrowirówkowej o niskim poziomie wiązania, aby zminimalizować straty adsorpcji.
3. . Przygotować mikrokolumny C18 (we własnym zakresie wypełnione żywicą C18) poprzez wstępne kondycjonowanie 100% metanolem (20 μl) i równoważenie 0,1% (v/v) kwasu trifluorooctowego (TFA) w wodzie (bufor A; 20 μL).
4. Załaduj próbkę peptydu na mikrokolumnę. Przemyć kolumnę 20 μl buforu A w celu usunięcia soli, detergentów i zanieczyszczeń niepeptydowych.
5. Elute oczyszczone peptydy za pomocą 20 μL 80% acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA.
6. Wysuszyć wymyte peptydy w próżni za pomocą odśrodkowego koncentratora próżni. Wysuszone peptydy należy przechowywać w temperaturze -8 °C do czasu dalszego użycia.
7. Rozpuść wysuszone peptydy w 0,1% kwasie mrówkowym przed analizą LC-MS/MS.
8. 2.4.8. Określić ilościowo stężenie peptydu, mierząc absorbancję przy 280 nm (OD₂₈₀) za pomocą spektrofotometru, uwzględniając udział reszt tryptofanu i tyrozyny w celu dokładnego określenia ilościowego.
  Do frakcjonowania mieszanin peptydów przy użyciu HPLC z odwróconymi fazami o wysokim pH należy użyć kolumny C18 (3,5 μm, 2,1 x 150 mm) na systemie HPLC o natężeniu przepływu 0,3 ml/min, faza ruchoma A: 10 mM mrówczanu amonu w wodzie, pH 10 (skorygowane wodorotlenkiem amonu), faza ruchoma B: 10 mM mrówczanu amonu w 90% acetonitrylu, Odczyn pH 10. Wykonaj elucję gradientową, aby zebrać 60 frakcji na próbkę w ciągu ~60 minut.
9. Połącz co trzecią frakcję, aby zmniejszyć nadmiarowość, co daje 20 zbiorczych frakcji na próbkę. Wysuszyć każdą zebraną frakcję w próżni w celu dalszej analizy.
  UWAGA: Otrzymane frakcje peptydowe są teraz gotowe do analizy nano-LC-MS/MS.

3. Zgłoszenie do analizy spektrometrii mas DIA

Analiza spektrometrii mas DIA
1. Zwiększyć peptyd akwizycji zależnej od danych (DDA) z frakcji HPRP standardowymi peptydami iRT i rozdzielić je za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC) w układzie nano-HPLC z kolumną (75 μm x 150 mm; 2 μm kulki C18, 120 A) przy natężeniu przepływu 300 nL/min z fazą ruchomą A: 0,1% kwas mrówkowy w wodzie, faza mobilna B: 0,1% kwas mrówkowy w 95% acetonitrylu.
2. Eluować peptydy przez 60 minut z gradientem liniowym buforu B ustawionym w następujący sposób: 0 - 2 min, gradient liniowy od 2% do 5% buforu B; 2 - 42 min, gradient liniowy od 5% do 20% bufora B; 42 - 50 min, gradient liniowy od 20% do 35% bufora B; 50 - 52 min, gradient liniowy od 35% do 90% bufor B; 52 - 60 min, bufor B utrzymywany na poziomie 90%.
3. Przeanalizować wymyte peptydy na referencyjnym spektrometrze masowym. Pozyskiwanie danych MS za pomocą zależnej od danych metody top20, dynamicznie wybierającej najliczniejsze jony prekursorowe ze skanu badawczego (350 - 1500 m/z) pod kątem fragmentacji HCD.
4. Uruchom instrument z włączonym trybem rozpoznawania peptydów . Jako wewnętrzny wzorzec do wzorcowania masy należy użyć masy blokady 445,120025 Da. Uzyskaj pełne skany MS w rozdzielczości 70 000 przy m/z 200 i 17 500 przy m/z 200 w przypadku skanowania MS/MS. Ustaw maksymalny czas wstrzykiwania na 50 ms dla MS i 30 ms dla MS/MS, znormalizuj energię zderzenia na 28, okno izolacji na 1,6 Th, a czas trwania dynamicznego wyłączenia na 30 s.
Analiza LC-MS/MS do akwizycji niezależnej od danych (DIA)
1. Zwiększ peptydy z każdej próbki za pomocą iRT równomiernie i osobno.
2. Wykonać LC-MS/MS na kwadrupolowym spektrometrze masowym sprzężonym z systemem nano-HPLC. Ustaw warunek LC w taki sam sposób, jak w przypadku powyższej metody atrybucji opartej na danych. Wykonaj skan geodezyjny od 400 do 1 200 m/z w rozdzielczości 60 000 z celem AGC 3E6 i czasem iniekcji 30 ms. Skany DIA MS/MS można uzyskać w rozdzielczości 15 000 z oknem izolacyjnym 20 m/z i docelowym AGC 1E6 i czasem wstrzykiwania 50 ms. Ustawia znormalizowaną energię zderzenia na 30.
3. Rejestruj widma pełnych skanów MS i DIA odpowiednio w typach profilu i centroidów.
Przeszukiwanie bazy danych sekwencji
1. Analizuj dane DDA MS za pomocą oprogramowania DIA².
2. Przeszukaj dane dotyczące stwardnienia rozsianego w ludzkiej bazie danych UniProtKB (łącznie 186 532 wpisów, pobranych 10.2019 r.), wzbogaconej białkami składającymi się z 11 sekwencji peptydowych iRT.
3. Wybierz trypsynę jako enzym trawienny. Określ maksymalną liczbę dwóch pominiętych miejsc rozszczepienia i tolerancję masy 4,5 ppm dla jonów prekursorowych i 20 ppm dla jonów fragmentacyjnych do przeszukiwania bazy danych. Zdefiniuj karbamidometylację cystein jako ustaloną modyfikację i acetylację N-końcowego białka oraz utlenianie metioniny jako zmienne modyfikacje do przeszukiwania baz danych.
4. Filtruj wyniki wyszukiwania w bazie danych i eksportuj je z <1% wskaźnikiem fałszywych odkryć (FDR) odpowiednio na poziomie dopasowanym do widma peptydów i białka.
Wykonywanie przetwarzania danych pierwotnych
1. Analiza danych DIA MS została przeanalizowana za pomocą oprogramowania DIA [34, 35] w celu wygenerowania biblioteki spektralnej na podstawie wyników wyszukiwania. Użyj ustawień domyślnych wyszukiwania i dynamicznego iRT do przewidywania czasu przechowywania. Upewnij się, że korekcja zakłóceń dla skanowania MS/MS jest włączona.
2. Eksportuj wyniki z <1% FDR na poziomie peptydu.

4. Różnicowa analiza białek

Przeprowadź testowanie hipotez za pomocą testu t-Studenta w połączeniu ze zmianą fałdowania (FC) w http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=70.
1. Zaloguj się do platformy chmurowej i przejdź do narzędzia Hypothesis Testing Analysis . Prześlij plik z danymi ilościowymi wstępnie przetworzonego białka (np. w formacie CSV lub TXT).
2. W ustawieniach parametrów wybierz Test t-Studenta jako metodę statystyczną i próg istotności przy wartości p < 0,05. Zdefiniuj próg zmiany składania jako FC > 1.5 lub FC < 1/1.5. Kliknij przycisk Uruchom analizę i poczekaj na wygenerowanie wyników.
3. Pobierz plik wyjściowy zawierający wartości p, log2(FC) i status istotności dla każdego białka.
  UWAGA: To podejście oparte na dwóch kryteriach równoważy istotność statystyczną z istotnością biologiczną, zapewniając solidną identyfikację białek o zróżnicowanej ekspresji (DEP).

5. Analiza ścieżki sygnału

Wizualizacja wykresu wulkanu
1. Przejdź do narzędzia w http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=63, a następnie do strony narzędzia do tworzenia wykresów wulkanów .
  1. Prześlij plik z wynikami analizy DEP z sekcji 4.
  2. Konfiguruj parametr wizualizacji: Oś X: log2(Fold Change) - wskazuje kierunek zmiany; Oś Y: -log10(wartość-p) - odzwierciedla istotność statystyczną; Kodowanie kolorem: Czerwony : znacznie podwyższone białka (p < 0,05 i FC > 1,5); Niebieski : znacznie obniżone białka (p < 0,05 i FC < 0,667); Szary : białka nieistotne (p ≥ 0,05 lub 1/1,5 ≤ FC ≤ 1,5).
  3. Kliknij przycisk Generuj obraz i pobierz obraz w wysokiej rozdzielczości (format PDF/SVG) do publikacji.
Mapa cieplna grupowania hierarchicznego
1. Przejdź do narzędzia na stronie http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=17
  1. Uzyskaj dostęp do narzędzia do grupowania map cieplnych .
  2. Przekaż filtrowaną macierz wyrażeń DEP.
  3. Ustaw następujące parametry: Metoda normalizacji: wierszowy wskaźnik Z w celu wyeliminowania różnic w skali; Metryka odległości: odległość euklidesowa; Metoda grupowania: pełne grupowanie hierarchiczne z powiązaniami; Opcjonalnie: włącz grupowanie kolumn i/lub wierszy w zależności od grupowania próbek.
  4. Kliknij przycisk Uruchom , aby wygenerować mapę cieplną.
  5. Pobierz i zapisz mapę cieplną jako obraz gotowy do publikacji.
    UWAGA: Mapa cieplna wizualnie przedstawia podobieństwo i rozbieżność wzorców ekspresji białek w próbkach.
Adnotacja funkcjonalna GO i analiza wzbogacania
1. Zainstaluj i załaduj wymagane pakiety języka R:
  biblioteka(clusterProfiler)
  biblioteka(org. Hs.eg.db)
  biblioteka(ggplot2)
2. Zamień identyfikatory białek (np. Uniprot lub symbole genów) na identyfikatory Entrez:
  entrez_ids <- bitr(diff_proteins, fromType = "UNIPROT", toType = "ENTREZID", OrgDb = org. Hs.eg.db)
3. Wykonaj analizę wzbogacania GO:
  go_enrich <- enrichGO(gene = entrez_ids$ENTREZID, OrgDb = org. Hs.eg.db, keyType = "ENTREZID", ont = "BP")
4. Wizualizacja wyników za pomocą wykresów kropkowych:
  1. dotplot(go_enrich, pokażKategoria = 20)
    Formuła:
    Bogaty czynnik = (a/b) / (c/d)
    Gdzie:
    a = liczba funkcji DEP przypisanych do terminu;
    b = łączna liczba programów "Cyfrowa Europa";
    c = liczba białek tła przypisanych do terminu;
    d = całkowita liczba białek tła.
Adnotacja i analiza wzbogacania ścieżek KEGG
1. Przeprowadź analizę wzbogacenia firmy KEGG:
  kegg_enrich <- enrichKEGG(gen = entrez_ids$ENTREZID, organizm = "ma")
2. Wizualizacja wyników ścieżki KEGG:
  barplot(kegg_enrich, showCategory = 20)
3. Dostosuj wykresy za pomocą ggplot2 do formatowania publikacji.

6. Wstępne badania przesiewowe białek z wykorzystaniem analizy krzywej ROC

Przygotowanie danych: Załaduj zestaw danych proteomicznych zawierający wszystkie białka o zróżnicowanej ekspresji (DEP) zidentyfikowane z zaburzeń ze spektrum autyzmu (ASD) i grup kontrolnych. Upewnij się, że zestaw danych zawiera wartości ekspresji białek dla obu grup, z wyraźnymi etykietami wskazującymi ASD i próbki kontrolne.
Wykonaj analizę krzywej ROC.
1. Użyj pakietu pROC w R, aby przeprowadzić analizę krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) dla każdego białka.
2. Oceń zdolność każdego białka do rozróżnienia między ASD a grupą kontrolną, obliczając obszar pod krzywą (AUC).
  AUC = 0,5: Brak dyskryminacji (równoznaczna z przypadkowym przypadkiem).
  0,7 ≤ AUC < 0,8: Dopuszczalna dyskryminacja.
  0,8 ≤ AUC < 0,9: Doskonała dyskryminacja.
  AUC ≥ 0,9: Wyjątkowa dyskryminacja.
  UWAGA: AUC reprezentuje prawdopodobieństwo, że losowo wybrana osoba z grupy ASD ma wyższy poziom białka niż losowo wybrana osoba z grupy kontrolnej. Wyższe AUC wskazuje na lepszą skuteczność diagnostyczną, przy czym wartości powyżej 0,8 są ogólnie uważane za klinicznie istotne w badaniach biomarkerów.
3. Zapisz wartości AUC dla wszystkich białek.
Wybierz potencjalne biomarkery.
1. Zidentyfikuj białka o AUC większym niż 0,7 jako potencjalne biomarkery.
2. Eksport listy potencjalnych biomarkerów do dalszej analizy.
Wizualizacja wyników.
1. Użyj pakietu ggplot2 w języku R, aby utworzyć wizualizacje krzywych ROC dla białek o najwyższej wydajności.
2. Uwzględnij wartości AUC w legendach wykresu, aby zapewnić przejrzystość.

7. Wtórne badanie przesiewowe przy użyciu Random Forest

Przygotuj dane wejściowe.
1. Użyj listy potencjalnych biomarkerów uzyskanych z analizy ROC jako danych wejściowych do losowej analizy lasu.
2. Upewnij się, że zestaw danych jest odpowiednio sformatowany, z wierszami reprezentującymi próbki i kolumnami reprezentującymi wartości ekspresji białka.
Trenowanie modelu lasu losowego.
1. Zastosuj algorytm lasu losowego przy użyciu pakietu randomForest w języku R.
2. Ustaw liczbę drzew (ntree) na 500, a liczbę zmiennych losowo próbkowanych przy każdym podziale (mtry) na pierwiastek kwadratowy z całkowitej liczby obiektów.
3. Oceń ważność funkcji przy użyciu metryki MeanDecreaseAccuracy, która mierzy zmniejszenie dokładności modelu po usunięciu określonej funkcji.
4. Trenowanie losowego modelu lasu przy użyciu pakietu randomForest w języku R:
  R. biblioteka(randomForest)
  # Przykład: przewidywanie grupy (np. ASD vs. kontrola) na podstawie poziomów białka
  rf_model <- losowyLas(x = protein_data,
  y = jako.czynnik(grupa),
  importance = TRUE, # Wymagane do obliczenia ważności funkcji
  ntree = 500) # Liczba drzew
5. Wyodrębnij metryki ważności funkcji przy użyciu funkcji importance():
  R. importance_scores < – znaczenie(rf_model)
6. Pobierz wartości MeanDecreaseAccuracy i posortuj je w kolejności malejącej:
  R. mean_dec_acc <- importance_scores[ , "ŚredniaDokładnośćZmniejszenia"]
  importance_rank <- sort(mean_dec_acc, malejąco = PRAWDA)
7. Wizualizacja ważności funkcji za pomocą wbudowanej funkcji varImpPlot():
  R. varImpPlot(rf_model, main = "Znaczenie cechy (średni spadek dokładności)")
  UWAGA: Metryka MeanDecreaseAccuracy odzwierciedla, jak istotna jest każda funkcja dla wydajności predykcyjnej modelu. Duży spadek dokładności po usunięciu wskazuje na duże znaczenie. Takie podejście jest szczególnie przydatne w odkrywaniu biomarkerów, ponieważ pomaga nadać priorytet białkom lub genom o najsilniejszej mocy dyskryminacyjnej między grupami.
8. Eksportowanie ocen ważności na potrzeby raportowania lub analizy podrzędnej:
  R. importance_table <- data.frame(
  Cecha = nazwy(importance_rank),
  MeanDecreaseAccuracy = importance_rank
  )
  write.csv(importance_table, "feature_importance.csv", row.names = FAŁSZ)
9. Uszereguj białka na podstawie ich wyników MeanDecreaseAccuracy.
10. Wybierz 15 pierwszych białek z najwyższymi wynikami MeanDecreaseAccuracy jako najważniejsze cechy do późniejszego modelowania.
11. Wyeksportuj listę tych białek w celu dalszej walidacji.
  UWAGA: Białka o niskich wartościach MeanDecreaseAccuracy mogą mieć minimalny wpływ na wydajność modelu, jeśli zostaną usunięte.
12. Podkreśl biologiczne znaczenie wybranych białek, szczególnie tych związanych z funkcjami immunologicznymi lub szlakami zaangażowanymi w ASD.

8. Połącz wyniki, aby ostatecznie wybrać biomarker.

UWAGA: Upewnij się, że R jest zainstalowany z następującymi pakietami: pROC, randomForest i ggplot2. Upewnij się, że zestaw danych proteomicznych jest wstępnie przetworzony i znormalizowany przed analizą. Zapisz listy potencjalnych biomarkerów i wykresów wizualizacji jako osobne pliki do wglądu.

Integrowanie wyników.
1. Porównaj wyniki analizy ROC i losowych badań przesiewowych lasów, aby zidentyfikować nakładające się białka.
2. Priorytetowo należy traktować białka, które pojawiają się w obu analizach jako wysoce wiarygodne potencjalne biomarkery.
3. Wykonaj dodatkowe kroki walidacji, takie jak walidacja krzyżowa typu leave-one-out (LOOCV), aby potwierdzić solidność wybranych biomarkerów.
4. Wykorzystaj modele regresji logistycznej do oceny dokładności predykcyjnej połączonego zestawu biomarkerów.
5. Twórz krzywe ROC i wykresy precyzji kompletności dla końcowego zestawu biomarkerów za pomocą pakietu ggplot2.
6. Uwzględnij wskaźniki, takie jak AUC i wartości precyzji kompletności, aby zademonstrować potencjał diagnostyczny wybranych biomarkerów.

9. Dwukierunkowy wybór funkcji

Przygotuj dane i zdefiniuj model.
1. Załaduj zestaw danych zawierający wartości ekspresji białek i odpowiadające im etykiety (np. ASD a kontrola). Upewnij się, że zestaw danych jest wstępnie przetworzony i znormalizowany.
2. Zdefiniuj model początkowy: Do klasyfikacji należy użyć uogólnionego modelu liniowego (GLM) z rodziną dwumianową.
3. Użyj AIC jako metryki oceny, aby porównać modele podczas wyboru funkcji.
Dokonaj wyboru funkcji do przodu.
1. Zacznij od pustego modelu zawierającego tylko termin przecięcia.
2. Dodawaj jedną funkcję na raz w oparciu o największą redukcję AIC.
3. Zapisuj wartość AIC po każdym dodaniu. Zatrzymać się, gdy nie obserwuje się dalszego zmniejszania AIC.
Dokonaj wyboru funkcji wstecz.
1. Trenowanie modelu przy użyciu wszystkich dostępnych funkcji.
2. Usuwaj pojedynczą funkcję na raz w oparciu o najmniejszy wzrost AIC.
3. Zapisuj wartość AIC po każdym usunięciu. Zatrzymać się, gdy nie obserwuje się dalszego zmniejszania AIC.
4. Połącz kroki do przodu i do tyłu.
Przełączaj się między wyborem do przodu i do tyłu.
1. Wykonaj jedną rundę wyboru funkcji do przodu, a następnie natychmiast jedną rundę wyboru funkcji do tyłu. Powtarzaj ten proces, dopóki nie zaobserwuje się dalszych ulepszeń w AIC.
2. Alternatywne podejście: Zacznij od wyboru funkcji wstecz, a następnie wykonaj wybór funkcji do przodu. Oceń efekt dodania wcześniej usuniętych elementów z powrotem do modelu.
Sfinalizuj wybrane funkcje.
1. Eksportuj ostateczną listę wybranych elementów i odpowiadających im współczynników (Rysunek uzupełniający S1).

10. Walidacja krzyżowa dwukierunkowego wyboru cech z wykorzystaniem regresji logistycznej z metodą leave-one-out

UWAGA: Upewnij się, że R jest zainstalowany z następującymi pakietami: caret, pROC i ggplot2. Zestaw danych proteomicznych powinien zostać wstępnie przetworzony i znormalizowany przed analizą. Zapisz macierz pomyłek, krzywą ROC i podsumowanie modelu jako osobne pliki w celach informacyjnych.

Przygotuj dane i zdefiniuj model.
1. Załaduj zestaw danych zawierający wartości ekspresji białek i odpowiadające im etykiety (np. ASD vs. kontrola) z pliku GLMSTEP/bothFitModel.txt. Upewnij się, że zestaw danych jest wstępnie przetworzony i znormalizowany.
2. Zdefiniuj początkowy model przy użyciu uogólnionego modelu liniowego (GLM) z rodziną dwumianową do klasyfikacji.
3. Użyj dokładności i współczynnika Kappa jako metryk oceny, aby ocenić wydajność modelu podczas krzyżowej walidacji.
Wykonaj krzyżową walidację typu leave-one-out.
1. Zainicjuj krzyżową walidację przy użyciu pakietu daszka w języku R, aby zaimplementować krzyżową walidację typu leave-one-out (LOOCV).
2. Dopasuj model regresji logistycznej przy użyciu ośmiu wybranych funkcji.
3. Rejestruj dokładność i współczynnik Kappa dla każdej iteracji walidacji krzyżowej.
Przeanalizuj wyniki krzyżowej walidacji.
1. Podsumuj wyniki.
  UWAGA: Wyniki procesu LOOCV będą wyglądać następująco (jak w tym badaniu): Uogólniony model liniowy, 169 próbek, 8 predyktorów, 2 klasy: 'A', 'B', Ponowne próbkowanie: Leave-One-Out Cross-Validation , Podsumowanie wielkości prób: 168, 168, 168, 168, 168, 168, ... , Wyniki ponownego próbkowania: Dokładność Kappa 0,9526627 0,9024531.
2. Interpretowanie metryk.
  UWAGA: W tym przypadku model osiągnął dokładność 0,9527 i współczynnik Kappa 0,9025 , co wskazuje na doskonałą zgodność między przewidywanymi i obserwowanymi wynikami.
  1. Spójrz na współczynnik Kappa, aby ocenić moc predykcyjną modelu. Współczynnik Kappa mieści się w zakresie od -1 do 1, gdzie 0 oznacza losowe przewidywanie, a 1 oznacza doskonałą zgodność.
    UWAGA: W tym badaniu wartość Kappa wynosząca 0,9025 odzwierciedla silną moc predykcyjną modelu.
Oceń współczynniki modelu.
1. Zbadaj współczynniki modelu regresji logistycznej, aby zrozumieć udział każdej cechy. Oceń odchylenie zerowe, odchylenie resztkowe i AIC, aby potwierdzić dopasowanie modelu.
  UWAGA: Na przykład w tym badaniu otrzymaliśmy odchylenie zerowe: 2,2928e+02 dla 168 stopni swobody, odchylenie szczątkowe: 2,2378e-07 dla 160 stopni swobody, AIC: 18, liczba iteracji punktacji Fishera: 25.
Wizualizuj wyniki.
1. Utwórz macierz pomyłek, aby zwizualizować predykcyjną wydajność modelu.
2. Wykreśl krzywą charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC), aby ocenić wydajność klasyfikacyjną modelu.
3. Zinterpretuj wynik s. Oblicz pole pod krzywą (AUC), aby uzyskać klasyfikacyjny wskaźnik wydajności modelu.
  UWAGA: Krzywa ROC pokazuje kompromis między odsetkiem wyników prawdziwie dodatnich a wskaźnikiem wyników fałszywie dodatnich. Pole pod krzywą (AUC) powinno być bliskie 1, co wskazuje na doskonałe wyniki klasyfikacji. Krzywa ROC odzwierciedla zmiany w odsetku wyników prawdziwie dodatnich i fałszywie dodatnich w modelu przy różnych progach. Im większa wartość AUC, tym lepsza wydajność modelu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Badaniem objęto 99 dzieci z ASD i 70 osób z grupy kontrolnej w tym samym wieku (3-7 lat), o zrównoważonym rozkładzie płci (tabela uzupełniająca S2). Surowicę pobrano po całonocnym poście przy użyciu standardowych protokołów: krew pobrano do probówek separatora surowicy, pozostawiono do krzepnięcia w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie odwirowano w temperaturze 1500 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Supernatant podano i przechowywano w tempera...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół opisany w tym manuskrypcie przedstawia kompleksowe podejście do identyfikacji biomarkerów molekularnych związanych z odpornością w zaburzeniach ze spektrum autyzmu (ASD) przy użyciu spektrometrii mas niezależnej od danych akwizycji (DIA) i technik uczenia maszynowego. Ważne kroki w ramach protokołu zapewniają wiarygodne i powtarzalne wyniki, a jednocześnie wskazują obszary, w których mogą być konieczne modyfikacje lub rozwiązywanie problemów (tabela 2).

Jednym z klucz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękuję wszystkim członkom centralnego laboratorium oraz tym, którzy pomogli w realizacji tego projektu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki i chemikalia	Acetonitryl (klasa HPLC)	Fisher Naukowy	A18-50
Odczynniki i chemikalia	Wodorowęglan amonu (NH? HCO?)	Sigma-Aldrich	38939
Odczynniki i chemikalia	Mrówczan amonu	Sigma-Aldrich	90265
Odczynniki i chemikalia	Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Thermo Fisher Naukowy	23212
Odczynniki i chemikalia	Ditiotreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
Odczynniki i chemikalia	Kwas mrówkowy (0,1%)	Thermo Fisher Naukowy	28905
Odczynniki i chemikalia	Jodoacetamid (IAA)	Sigma-Aldrich	I1149 powiedział:
Odczynniki i chemikalia	Metanol (klasa HPLC)	Fisher Naukowy	A452-4
Odczynniki i chemikalia	Kwas trifluorooctowy (TFA)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T6508
Odczynniki i chemikalia	Mocznik	Sigma-Aldrich	U5378 powiedział:
Zestawy i specjalistyczne odczynniki	Zestaw do oznaczania białek BCA	Thermo Fisher Naukowy	23227
Zestawy i specjalistyczne odczynniki	Wkłady C18 Sep-Pak	Wody	WAT023590
Zestawy i specjalistyczne odczynniki	C18 StageTips (domowej roboty)	3M Empore&handel;
Zestawy i specjalistyczne odczynniki	Zestaw do usuwania niedoboru białka o wysokiej obfitości	Millipore Sigma	122642
Zestawy i specjalistyczne odczynniki	Standardowe peptydy iRT	Biognosys Sp. z o.o.
Zestawy i specjalistyczne odczynniki	Zestaw Lizozymu ELISA	Wuhan Fine Biotech Co.	Sp. z o.o.
Zestawy i specjalistyczne odczynniki	Mieszanka enzymów trypsyny i LysC	Preparat Promega	Zobacz materiał V5071
Sprzęt	Wirówka	Eppendorf powiedział:	5430R
Sprzęt	Easy-nLC 1200 System	Thermo Fisher Naukowy
Sprzęt	Spektrofotometr Nanodrop One	Thermo Fisher Naukowy	ND-JEDEN-W
Sprzęt	Q Exaktywny spektrometr masowy HF-X	Thermo Fisher Naukowy
Sprzęt	Koncentrator SpeedVac	Thermo Fisher Naukowy	SPD131DDA
Sprzęt	Wirówka z wirnikiem kubełkowym	Rozmaity
Sprzęt	Kolumna Waters XBridge BEH130	Wody	C18, 3.5 μ m, 2,1 razy; 150 mm
Sprzęt	Agilent 1260 HPLC System	Agilent	1260 Nieskończoność II
Oprogramowanie i narzędzia online	Bioprzewodnik (pakiety R)	bioconductor.org
Oprogramowanie i narzędzia online	daszek (pakiet R)	CRAN	caret_6.0-93
Oprogramowanie i narzędzia online	clusterProfiler (pakiet języka R)	Bioprzewodnik	4.0.5
Oprogramowanie i narzędzia online	DIA-NN	Oprogramowanie DIA-NN	Wersja 1.8
Oprogramowanie i narzędzia online	ggplot2 (pakiet R)	CRAN	3.4.0
Oprogramowanie i narzędzia online	Maksymalna ilość	Instytut Maxa Plancka	1.6.17
Oprogramowanie i narzędzia online	omickits.com	Platforma chmurowa OmiKits	http://www.omickits.com
Oprogramowanie i narzędzia online	pROC (pakiet R)	CRAN	1.18.0
Oprogramowanie i narzędzia online	randomForest (pakiet R)	CRAN	4.7-1.1
Oprogramowanie i narzędzia online	Spektronauta Pulsar X	Biognosys Sp. z o.o.	17
Oprogramowanie i narzędzia online	Baza danych dla ludzi UniProtKB	uniprot.org	Wydanie 2019_10Release 2019_10
Inne materiały	Probówki mikrowirówkowe o niskim poziomie wiązania	Eppendorf powiedział:	30120094
Inne materiały	Probówki separatora surowicy (SST)	BD Nauki biologiczne	367988
Inne materiały	3M Empore&handel; Dyski C18	3 mln

Bibliografia

Ophir, Y., Rosenberg, H., Tikochinski, R., Dalyot, S., Lipshits-Braziler, Y. Screen time and autism spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. JAMA Netw Open. 6 (12), e2346775(2023).
He, S., Zhou, F., Tian, G., Cui, Y., Yan, Y. Effect of anesthesia during pregnancy, delivery, and childhood on autism spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. J Autism Dev Disord. 54 (12), 4540-4554 (2024).
Alkhonezan, S. M., Alkhonezan, M. M., Alshayea, Y., Bukhari, H., Almhizai, R. Factors influencing the lives of parents of children with autism spectrum disorder in saudi arabia: A comprehensive review. Cureus. 15 (11), e48325(2023).
Larson, C., Thomas, H. R., Crutcher, J., Stevens, M. C., Eigsti, I. M. Language networks in autism spectrum disorder: A systematic review of connectivity-based fmri studies. Rev J Autism Dev Disord. 12 (1), 110-137 (2025).
Kodak, T., Bergmann, S. Autism spectrum disorder: Characteristics, associated behaviors, and early intervention. Pediatr Clin North Am. 67 (3), 525-535 (2020).
Zwaigenbaum, L., et al. Early intervention for children with autism spectrum disorder under 3 years of age: Recommendations for practice and research. Pediatrics. 136 (Suppl 1), S60-S81 (2015).
Whitehouse, A. J. O., et al. Effect of preemptive intervention on developmental outcomes among infants showing early signs of autism: A randomized clinical trial of outcomes to diagnosis. JAMA Pediatr. 175 (11), e213298(2021).
Ngounou Wetie, A. G., et al. A pilot proteomic analysis of salivary biomarkers in autism spectrum disorder. Autism Res. 8 (3), 338-350 (2015).
Mota, F. S. B., et al. Potential protein markers in children with autistic spectrum disorder (asd) revealed by salivary proteomics. Int J Biol Macromol. 199, 243-251 (2022).
Corbett, B. A., et al. A proteomic study of serum from children with autism showing differential expression of apolipoproteins and complement proteins. Mol Psychiatry. 12 (3), 292-306 (2007).
Hu, E., et al. Data independent acquisition proteomics and machine learning reveals that proteins associated with immunity are potential molecular markers for early diagnosis of autism. Clin Chim Acta. 573, 120238(2025).
Shen, L., et al. Biomarkers in autism spectrum disorders: Current progress. Clin Chim Acta. 502, 41-54 (2020).
Yap, C. X., et al. Autism-related dietary preferences mediate autism-gut microbiome associations. Cell. 184 (24), 5916-5931.e17 (2021).
Zhang, H., et al. The use of data independent acquisition based proteomic analysis and machine learning to reveal potential biomarkers for autism spectrum disorder. J Proteomics. 278, 104872(2023).
Francis, K., et al. Brain-derived neurotrophic factor (bdnf) in children with asd and their parents: A 3-year follow-up. Acta Psychiatr Scand. 137 (5), 433-441 (2018).
Bjorklund, G., et al. The impact of glutathione metabolism in autism spectrum disorder. Pharmacol Res. 166, 105437(2021).
Bao, X. H., et al. Olink proteomics profiling platform reveals non-invasive inflammatory related protein biomarkers in autism spectrum disorder. Front Mol Neurosci. 16, 1185021(2023).
Ngounou Wetie, A. G., et al. Comparative two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of the salivary proteome of children with autism spectrum disorder. J Cell Mol Med. 19 (11), 2664-2678 (2015).
Suganya, V., Geetha, A., Sujatha, S. Urine proteome analysis to evaluate protein biomarkers in children with autism. Clin Chim Acta. 450, 210-219 (2015).
Shen, L., et al. Itraq-based proteomic analysis reveals protein profile in plasma from children with autism. Proteomics Clin Appl. 12 (3), e1700085(2018).
Shen, L., et al. Proteomics study of peripheral blood mononuclear cells (pbmcs) in autistic children. Front Cell Neurosci. 13, 105(2019).
Mesleh, A., et al. Blood proteomics analysis reveals potential biomarkers and convergent dysregulated pathways in autism spectrum disorder: A pilot study. Int J Mol Sci. 24 (8), 7443(2023).
Yang, J., et al. Association between plasma proteome and childhood neurodevelopmental disorders: A two-sample mendelian randomization analysis. EBioMedicine. 78, 103948(2022).
Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
Wu, Y., et al. Quantitative proteomics analysis of serum and urine with dia mass spectrometry reveals biomarkers for pediatric obstructive sleep apnea. Arch Bronconeumol. 61 (2), 67-75 (2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Biomarkery immunologiczne proteom surowicy biomarkery bia kowe r nicowa ekspresja bia ek wzbogacenie funkcjonalne regresja logistyczna