Analiza danych z mikroskopii wielowymiarowej z wykorzystaniem Cell-ACDC

Francesco Padovani; Timon Stegmaier; Benedikt Mairhörmann; Kurt M. Schmoller

doi:10.3791/68954

Method Article

Analiza danych z mikroskopii wielowymiarowej z wykorzystaniem Cell-ACDC

DOI:

10.3791/68954

⸱

November 7th, 2025

Francesco Padovani*¹ , Timon Stegmaier*¹ , Benedikt Mairhörmann¹^,²^,³ , Kurt M. Schmoller¹

¹Institute of Functional Epigenetics, Molecular Targets and Therapeutics Center, Helmholtz Zentrum München, ²Institute of Network Biology, Molecular Targets and Therapeutics Center, Helmholtz Zentrum München, ³Institute of AI for Health, Computational Health Center, Helmholtz Zentrum München

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokładna analiza danych z mikroskopii wielowymiarowej wymaga złożonych procesów pracy. Ten artykuł pokazuje, jak korzystać z oprogramowania Cell-ACDC. Wykorzystuje nowoczesne modele oparte na AI do segmentacji, śledzenia, analizy genetyki komórek oraz ilościowej analizy danych mikroskopowych. Co istotne, uzupełnia te modele innowacyjnym ramowym systemem półautomatycznej korekty wyników modeli.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najnowsze osiągnięcia w mikroskopii ilościowej dla nauk przyrodniczych umożliwiły biologom eksperymentalnym badanie komórek z niespotykaną dotąd rozdzielczością i szybkością. Jednocześnie rewolucja AI dramatycznie zwiększyła ilość informacji, które można wydobyć z danych z wielowymiarowej mikroskopii. Jednak ogromna ilość generowanych danych oraz złożoność nowoczesnych modeli AI stanowią poważne wąskie gardło na etapie analizy obrazów. Cell-ACDC to otwartoźródłowe, przyjazne użytkownikowi oprogramowanie, które zapewnia zaawansowane, kompleksowe rozwiązanie do segmentacji, śledzenia i analizy ilościowej pojedynczych komórek w danych mikroskopii wielowymiarowej. Jest dostosowany do biologów eksperymentalnych, którzy mogą nie posiadać zaawansowanej wiedzy technicznej potrzebnej do wdrożenia takich modeli. Ten artykuł pokazuje, jak wykorzystać ramy do łatwego wykorzystania najnowszych modeli oraz wielu narzędzi do inteligentnej i półautomatycznej korekcji danych, aby zmaksymalizować ilość dostępnych informacji biologicznych. Cell-ACDC obsługuje dane wielokanałowe, time-lapse oraz z-stack mikroskopii oraz zapewnia dedykowany zestaw narzędzi dostosowany do każdego typu wymiarowości danych. Dzięki modułowej konstrukcji, która umożliwia płynną integrację nowych modeli i bezpośredni dostęp do nich przez biologów, Cell-ACDC ma potencjał, by służyć jako narzędzie referencyjne do analizy danych mikroskopicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia stała się podstawą przyspieszenia odkryć biologicznych na każdym etapie badań i rozwoju, od nauk podstawowych ^1,2,3 po odkrywanie i testowanie leków ^4,5 oraz na zadziwiającym zakresie rozmiarów, od hodowli komórkowych po tkanki ^6,7, organoidy ^8,9 i całe organizmy¹⁰. Te zaawansowane techniki mikroskopii mają jednak dwie główne wady. Po pierwsze, dane mikroskopowe są z natury duże¹¹, zwłaszcza przy pozyskiwaniu wielu wymiarów (np. czasu i objętości). Po drugie, dokładne wyodrębnienie bogatych informacji biologicznych z danych wymaga zastosowania zaawansowanych ram analizy obrazów, które często opierają się na modelach AI. To zadanie może być trudne dla biologów eksperymentalnych. Dlatego etapy przetwarzania, przetwarzania i analizy danych mogą znacznie spowolnić badania naukowe, jednocześnie zmniejszając potencjał do nowych odkryć. Idealnie byłoby, aby ramy programowe do analizy bioobrazów wspierały użytkownika na każdym etapie analizy, od obsługi surowych plików mikroskopowych, przez segmentację i śledzenie, po analizę dalszą w celu wydobycia biologicznych wniosków. W praktyce szybki rozwój nowego oprogramowania do analizy bioobrazów, choć był pozytywnym efektem, miał efekt uboczny w postaci stworzenia rozproszonego krajobrazu narzędzi specyficznych dla konkretnego etapu analizy lub wymagającego zaawansowanej wiedzy programistycznej. Pozostawia to użytkownika przed trudnym zadaniem stworzenia workflow analityki, co często skutkuje nieoptymalnymi potokami, w których dane są wielokrotnie zapisywane, przetwarzane i konwertowane, aby były kompatybilne z kolejnym narzędziem. Ponadto rozwój analizy bioimage nie jest ustandaryzowany do jednego języka programowania, wiele narzędzi jest rozwijanych jako wtyczki ImageJ¹² lub QuPath¹³ (Java), wtyczki Napari (Python)¹⁴ czy skrypty Pythona. W niektórych przypadkach to trudne środowisko skłania naukowców do wyboru analizy ręcznej, co nie tylko jest powolne, ale także wprowadza uprzedzenia u ludzi i utrudnia powtarzalność.

Aby rozwiązać ten problem, opracowano Cell-ACDC (Cell-Analysis of the Cell Division Cycle)¹⁵, otwartoźródłowy zestaw narzędzi graficznych napisany w Pythonie do analizy danych z mikroskopii wielowymiarowej. Co istotne, Cell-ACDC oferuje wiele wstępnie zaimplementowanych i automatycznie instalowanych (w razie potrzeby) nowoczesnych modeli zarówno do segmentacji (Cellpose, StarDist, Segment Anything, YeaZ, YeastMate, itd.16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ^,^27,28) oraz śledzenia (Trackastra, Trackpy, Bayesian Tracker, Cell-ACDC itd.19,29,30,31,32,33,34). Modele te uzupełnione są ramami do wizualizacji danych adnotowanych oraz komputerowo wspomaganymi ręcznymi korektami. Dodatkowo, w ramach tych samych ram, Cell-ACDC udostępnia moduł dla każdego etapu potoku analizy obrazów, automatycznie dbając o obsługę, przetwarzanie i zapisywanie danych (Rysunek 1). Bardziej szczegółowo, umożliwia użytkownikowi wykonywanie segmentacji instancji (np. pojedynczych komórek), śledzenia obiektów, adnotacji stanów komórek (np. etap cyklu komórkowego) oraz różnych form ilościowości, w tym analizy dostępnych kanałów fluorescencyjnych.

Jedną z głównych zalet Cell-ACDC jest analiza danych z mikroskopii czasopoślizgowej na żywo z komórek, co stanowi poważne wyzwania ze względu na konieczność spójności między punktami czasowymi. Chociaż istnieje wiele modeli do automatycznej segmentacji i śledzenia pojedynczych komórek, ręczne korekty pozostają niezbędne do rozwiązywania złożonych zagadnień biologicznych. Cell-ACDC oferuje zestaw narzędzi specjalnie zaprojektowanych do usprawnienia procesu korekcji. Integruje inteligentne algorytmy, aby zminimalizować liczbę ręcznych regulacji. Co istotne, korekty są automatycznie propagowane we wszystkich istotnych ramach przyszłych i przeszłych, zachowując integralność danych przez całą analizę. Ze względu na modułową konstrukcję i rosnącą bazę użytkowników, priorytetem jest ciągły rozwój tego oprogramowania, a dalsze wysiłki koncentrowane są na integracji nowych modeli i odpowiadaniu na zmieniające się potrzeby społeczności.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Cell-ACDC został zaprojektowany tak, aby był jak najbardziej przejrzysty i intuicyjny dla użytkowników bez doświadczenia programistycznego. Osiąga się to głównie poprzez podział procesu analizy na mniejsze, łatwe do śledzenia kroki oraz udostępnianie dodatkowych informacji za pomocą podpowiedzi i przycisków informacyjnych. Ponieważ Cell-ACDC obejmuje szeroki zakres kroków, których kolejność wykonania często nie jest sekwencyjna, na Rysunku 2 pokazano tabelę decyzyjną. Poniższy przewodnik przedstawi konkretny przykład. Kroki 10 i 11 mogą być użyte do importu innych danych zamiast korzystania z dostarczonych danych pobranych w kroku 3.

1. Instalacja Cell-ACDC

UWAGA: Cell-ACDC jest obecnie dystrybuowany jako pakiet Python za pośrednictwem Python Package Index (PyPI) i może być instalowany za pomocą polecenia install "cellacdc[torch]".

Konfiguracja Miniforge
1. Pobierz instalator ze strony Miniforge (szczegóły w Tabeli Materiałów ).
2. Instaluj Miniforge: Na Windows uruchom pobrany instalator i postępuj zgodnie z instrukcjami. Dla Maca lub Linuksa otwórz terminal i wykonaj następujące polecenie:
  curl -L -O "https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Miniforge3-$(uname)-$(uname -m).sh
3. Po zakończeniu instalacji otwórz właściwy terminal, postępując zgodnie z poniższymi instrukcjami:
  1. Na Windows naciśnij Win + S, wpisz Miniforge Prompt i naciśnij Enter.
  2. Na Maca/Linuksa: otwórz aplikację Terminal.
Zarządzaj środowiskiem wirtualnym.
1. W poleceniu wpisz następujące polecenie, aby utworzyć środowisko wirtualne. Następnie naciśnij Enter , aby wykonać polecenie.
  conda create -y -n acdc python=3.12
2. Aktywuj środowisko, uruchamiając:
  CONDA aktywuj ACDC
Instalacja
1. Gdy środowisko jest aktywne, zainstaluj Cell-ACDC, uruchamiając następujące polecenie:
  Instalacja "CellacDC[Torch]"
2. Po instalacji uruchom Cell-ACDC -y , aby oprogramowanie dokończyło konfigurację.

2. Funkcjonowanie Cell-ACDC

Otwórz właściwy terminal (patrz krok 1.1.3).
Aktywuj środowisko, uruchamiając polecenie:
CONDA aktywuj ACDC
Rozpocznij Cell-ACDC uruchamiając następujące polecenie:
Cell-ACDC

3. Pobieranie danych próbnych

UWAGA: Przykładowe dane zostaną pobrane na "C:\Users\%USERNAME%\acdc-appdata\acdc-examples\TimeLapse_2D\Position_8" na Windowsie oraz do "~/acdc-appdata/acdc-examples/TimeLapse_2D/Position_8" na MacOS i Linux. Jeśli przewodnik powitalny nie jest wyświetlany, wybierz Help > Welcome Guide (Rysunek 3B) w menu głównego okna launchera Cell-ACDC (Rysunek 1).

Wybierz Pobierz i przetestuj za pomocą przykładu z czasopoklatkowym (Rysunek 3B).
Poczekaj, aż pobieranie się skończy.
Kliknij Nie, dziękuję, aby przestać ładować dane bezpośrednio do interfejsu graficznego.

4. Moduł przygotowania danych

UWAGA: Dane można wyrównać przed segmentacją oraz wybrać regiony zainteresowania (ROI). Te kroki są opcjonalne, ale korzystne, jeśli pole widzenia jest przesuwane w czasie lub jeśli interesujące są tylko części danych.

Kliknij moduł przygotowań danych startowych...w głównym oknie otwierającym moduł przygotowania danych (Rysunek 1A, moduł wstępnego przetwarzania danych).
Wybierz folder zawierający dane.
1. Kliknij ikonę folderu na pasku narzędzi nowego okna, aby załadować dane mikroskopii (Rysunek 4A).
2. Wybierz folder zawierający dane, a następnie potwierdź wybór, naciskając Select Folder.
Wybierz kanał do procesu wyrównania, korzystając z menu rozwijanego, aby wybrać kanał phase_contr . Następnie naciśnij OK , aby potwierdzić wybór (rysunek 4B).
Naciśnij OK , aby potwierdzić właściwości obrazu (rysunek 4C).
UWAGA: Jeśli pracujesz z danymi stosu z, ale do segmentacji należy używać tylko jednego fragmentu, wybierz odpowiedni fragment z za pomocą suwaka. Użyj przycisków na pasku narzędzi, aby zastosować zaznaczenie do innych klatek, jeśli zajdzie taka potrzeba.
Uruchom proces wyrównania.
1. Kliknij przycisk start , który również znajduje się na pasku narzędzi (rysunek 5A).
2. Kliknij Tak , aby rozpocząć proces wyrównania.
  UWAGA: Kliknij Nie , aby pominąć wyrównanie.
3. Naciśnij OK , aby potwierdzić, że informacja o wypełnieniu została zaakceptowana.
  UWAGA: Ustawienie może zająć trochę czasu, w zależności od rozmiaru danych.
4. Naciśnij OK , aby zakończyć wyrównanie po zakończeniu procesu.
Ustaw ROI i ROI w tle.
1. Przejdź do ostatniej klatki filmu segmentacyjnego, używając suwaka wyboru klatek w dolnej części GUI przygotowania danych.
2. Dostosuj automatycznie dodawany zwrot z inwestycji w tło, przeciągając go po obrazie lub zmieniając rozmiar za pomocą diamentów. Upewnij się, że ROI w tle nie zawiera komórek. Zostaw zwrot z inwestycji (rysunek 5B).
  UWAGA: Aby zdefiniować dodatkowe ROI, kliknij przycisk dodaj przycięcie ROI (znajdujący się w pasku narzędzi) i zaznacz je w przeglądarce. Zazwyczaj zwrot z inwestycji powinien być jak najmniejszy, a jednocześnie obejmować wszystkie interesujące komórki w odpowiednich ramkach. Aby jednak zapewnić powtarzalność w ramach tego protokołu, zaleca się jego niemodyfikowanie.
Aby przyciąć wybrane zwroty z inwestycji do nowych plików obrazów, kliknij najbardziej lewy przycisk Przycięcia .
UWAGA: Ten krok jest opcjonalny. Jeśli nie są potrzebne przycięte obrazy, okno można zamknąć. Współrzędne wszystkich ROI i ROI tła są zapisywane automatycznie i mogą być później wykorzystane do segmentacji. Jeśli zwrot z inwestycji nie został zmieniony, te przyciski nic nie zrobią. Opcje kadrowania obejmują kierunki XY, z-kroje lub określone zakresy czasowe. Każdy przycisk jest oznaczony wymiarami, które będą przycinane.
Zapisz wyrównane dane
1. Zamknij okno za pomocą przycisku zamykania okna (np. X w prawym górnym rogu w Windows lub czerwony punkt w lewym górnym rogu na macOS lub Linux).
2. Naciśnij Tak, zapisz wyrównane dane , aby je zapisać.
3. Kliknij Tak, zapisz ponownie wyrównane dane , aby potwierdzić.
Zapisz przycięte dane, jeśli krok 4.7 nie został pominięty i zwrot z inwestycji nie został zmodyfikowany.
1. Wybierz Tak, zapisz przycięte dane, aby zapisać przycięte dane.
2. Naciśnij Tak, przytnij, aby potwierdzić zapis plonu.
3. Kliknij OK , aby potwierdzić domyślną ścieżkę folderu.
  UWAGA: Wybierz inny folder, aby zachować nieprzycięte dane.
4. Wybierz Tak, nadpisuj, aby potwierdzić, czy wcześniej użyto domyślnej ścieżki.
5. Naciśnij OK , aby potwierdzić po zakończeniu procesu.

5. Znalezienie najlepszego modelu i parametrów segmentacji

UWAGA: Cell-ACDC oferuje interfejs graficzny z informacją zwrotną w czasie rzeczywistym, aby znaleźć najlepsze parametry segmentacji (Rysunek 6). Zazwyczaj modele te są dostarczane przez podmioty trzecie, z których każda posiada własną dokumentację. To użytkownik jest odpowiedzialny za określenie najlepszego modelu segmentacji i jego optymalnych parametrów, a także należy sprawdzić dokumentację danego modelu, aby uzyskać dodatkowe informacje.

Kliknij na Launch GUI...w głównym oknie (Rysunek 1A, moduł Wizualizuj i popraw).
Załaduj dane próbne.
1. Kliknij ikonę folderu na pasku narzędzi nowego okna, aby otworzyć menu wyboru folderów.
2. Wybierz folder zawierający dane, a następnie naciśnij Wybierz folder , aby potwierdzić wybór.
Wybierz kanał do wizualizacji. Użyj menu rozwijanego, aby wybrać kanał phase_contr segmentacji, a następnie wybierz Ok , aby potwierdzić.
Dokończ ładowanie danych.
1. Naciśnij OK , aby potwierdzić domyślną nazwę maski segmentacji.
2. Kliknij OK, aby załadować pozycje , aby potwierdzić właściwości obrazu.
3. Wybierz Nie , aby zapobiec ładowaniu dodatkowych danych fluorescencyjnych.
W selektorze trybu (Rysunek 6, "Selektor trybu") wybierz tryb Segmentacja i Śledzenie.
Znajdź najlepsze ustawienia wstępnego przetwarzania.
1. Przejdź do Obraz > Wstępne przetwarzanie... w górnym menu otwierającym niestandardowe okno wstępnego przetwarzania (Rysunek 7A).
2. Wybierz Usuń gorące piksele lub inny pożądany krok wstępnego przetwarzania w menu rozwijanym.
3. Użyj ikony trybika , aby inicjować i zmienić ustawienia w kroku. Użyj przycisku info , aby wyświetlić informacje o kroku i dostępnych parametrach. Nie zmieniaj tych ustawień.
4. Użyj ikony plus, aby dodać jeszcze jeden krok.
5. Wybierz Skalowanie Intensywności i potwierdź ustawienia, powtarzając kroki 5.6.1 i 5.6.2.
6. Zaznacz pole podglądu , aby zobaczyć efekty kroków na żywo.
7. Kliknij Zastosuj do wszystkich klatek (Rysunek 7B).
8. Naciśnij Zapisz wstępnie przetworzone dane , aby rozpocząć proces zapisu.
9. Naciśnij OK , aby potwierdzić domyślną nazwę.
10. Zamknij okno przepisu na przygotowanie do wstępnego przetwarzania .
Znajdź najlepsze ustawienia segmentacji.
1. Wybierz Segment > Segment wyświetlany na górnej wstążce, a następnie wybierz YeaZ_v2 (Rysunek 8A).
2. Naciśnij OK , aby pobrać YeaZ_v2 , jeśli zostanie o to poproszony.
  UWAGA: Pobieranie może zająć kilka minut. Postępy są wyświetlane w oknie konsoli. Nie zamykaj interfejsu graficznego podczas pobierania, nawet jeśli nie reaguje.
3. Zachowaj domyślne parametry bez zmian.
  UWAGA: Większość parametrów ma przyciski informacyjne , które dostarczają szczegółowych wskazówek.
4. Włącz postprocessing, sprawdzając parametry segmentacji (Rysunek 8B).
5. Zaakceptuj parametry, klikając OK.
  UWAGA: Segmentacja może zająć chwilę, w zależności od złożoności modelu, rozmiaru obrazu i specyfikacji komputera. Szczególnie wersja Cellpose 4 może być bardzo wolna.
6. Jeśli zapytasz o aktywację automatycznej segmentacji, wybierz Nr
7. Sprawdź, czy segmentacja działa dobrze.
8. Powtórz krok 5.7.1, aby ponownie otworzyć parametry segmentacji.
9. Jeśli wyniki segmentacji są zgodne z oczekiwaniami, naciśnij Save all parameters to the recipe file. W przeciwnym razie zmień parametry segmentacji i powtórz kroki od 5.7.4 do 5.7.8.
10. Użyj tekstowego wejścia , aby nadać przepisowi segmentacji nazwę testu.
11. Kliknij OK , aby zaakceptować nazwę.
12. Naciśnij OK , aby dokończyć zapisywanie workflow.
13. Zamknij ekran wyboru parametrów.
Zamykanie okna GUI
1. Zamknij okno GUI.
2. Naciśnij Nie , aby nie zapisywać przed zamknięciem.

6. Segmentowanie i śledzenie (przetwarzanie wsadowe)

Kliknij moduł segmentacji Launch ... w głównym oknie (Rysunek 1A, moduł "Segment i śledzenie").
1. Wybierz przykładowe dane. Użyj selektora folderów Cell-ACDC, aby wybrać folder zawierający dane, a następnie naciśnij Select Folder , aby potwierdzić wybór.
Wybierz parametry przetwarzania wsadowego.
1. Wybierz kanał phase_contr_preprocessed jako kanał do segmentacji. Naciśnij OK , aby potwierdzić wybór.
  UWAGA: Niektóre modele używają dodatkowego kanału jako wejścia. Ten kanał można później wybrać przy ustawianiu innych parametrów segmentacji.
2. Potwierdź właściwości obrazu, klikając OK.
Ustaw ustawienia modelu segmentacji.
1. Wybierz YeaZ_v2 jako model, który powinien być używany do segmentacji, a następnie potwierdź wybór, klikając OK.
2. Kliknij Załadowaj zapisany przepis...przycisk do załadowania wcześniej zapisanego przepisu.
3. Wybierz segmentation_recipe_test.ini z listy, a następnie potwierdź wybór, klikając OK.
4. Odrzuć komunikat o pomyślnym ładowaniu, naciskając OK.
5. Potwierdź parametry, wybierając OK.
Potwierdź inne ustawienia segmentacji.
1. Naciśnij OK , aby zaakceptować domyślną nazwę pliku segmentacji.
2. Wybierz Nie , aby potwierdzić, że cały obraz powinien być segmentowany.
3. Wybierz OK , aby ustawić klatkę stopową jako ostatnią klatkę timelapse.
Ustaw ustawienia śledzenia. Wybierz YeaZ jako metodę śledzenia, a następnie potwierdź wybór, naciskając OK.
Uruchom procedurę segmentacji i śledzenia.
1. Kliknij Uruchom teraz, aby uruchomić potok segmentacji i śledzenia.
  UWAGA: Może to zająć kilka godzin, w zależności od rozmiaru obrazu, złożoności modelu i specyfikacji komputera. W testach segmentacja danych testowych YeaZ_v2 trwała około 2 minut na urządzeniu bez GPU.
2. Kliknij OK , aby zakończyć segmentację.

7. Korygowanie błędów segmentacji i śledzenia

UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, komórki brakujące w bieżącej ramce w porównaniu do poprzedniej są oznaczone żółtym konturem i ID. Nowo wykryte komórki pojawiają się z czerwonym ID i grubym konturem. Komórki uznane za utracone są oznaczone zielonym konturem i ID.

Kliknij na Launch GUI...w głównym oknie (Rysunek 1A, moduł "Visualise and correct").
Załaduj dane próbne.
1. Kliknij ikonę folderu w pasku paska nowego okna.
2. Wybierz folder zawierający dane, a następnie naciśnij Wybierz folder , aby potwierdzić wybór.
Wybierz kanał do wizualizacji. Użyj menu rozwijanego, aby wybrać kanał phase_contr_preprocessed, a następnie wybierz Ok , aby potwierdzić.
Wybierz nazwę maski segmentacyjnej. Wybierz Ładowanie wybrane , aby załadować plik segmentacji utworzony w poprzednim kroku.
Zakończ proces ładowania danych.
1. Potwierdź właściwości obrazu, klikając OK, aby załadować pozycje.
2. Wybierz Nie , aby zapobiec ładowaniu dodatkowych danych fluorescencyjnych.
Użyj selektora trybu (rysunek 6, "Selektor trybu"), aby wybrać tryby segmentacji i śledzenia .
UWAGA: Użyj pól wyboru na dole interfejsu, aby zmienić wyświetlane adnotacje. Obrazy po lewej i prawej mogą wyświetlać różne adnotacje.
Wybierz tracker w czasie rzeczywistym. W pasku menu (rysunek 6, "Menu bar") przejdź do Śledzenia > Wybierz algorytm śledzenia w czasie rzeczywistym i wybierz pożądany tracker czasu rzeczywistego. Stosuj 2-stopniowy podział Cell-ACDC lub Cell-ACDC 2 dla drożdży pączkujących lub symetryczny podział Cell-ACDC dla innych organizmów.
Popraw segmentację i śledzenie.
1. Używaj strzałek w lewo i prawo, aby nawigować między klatkami.
2. Przejdź do klatki 10.
3. Naciśnij S , aby aktywować narzędzie do ręcznego oddzielania końców.
4. Użyj myszy prawym przyciskiem myszy , aby automatycznie podzielić maskę segmentacji komórki 1.
5. Przejdź do klatki 14.
6. Naciśnij B , aby aktywować pędzel.
7. Narysuj brakującą maskę segmentacji dla pączka za pomocą lewego przycisku myszy.
8. Przejdź kolejne klatki, poprawiając błędy segmentacji i śledzenia. Korzystaj z dostępnych narzędzi (Rysunek 6, "Edytuj pasek narzędzi"). Popraw przynajmniej do klatki 42.
  UWAGA: Większość narzędzi ma podpowědkę wyjaśniającą ich funkcjonalność. Najedź kursorem na narzędzie, aby wyświetlić podpowiedź.

8. Adnotacje cyklu komórkowego

UWAGA: Przechodź do tego etapu dopiero po zakończeniu korekt segmentacji i śledzenia dla wszystkich interesujących nas klatek. Stosuj właściwy tryb adnotacji w zależności od typu podziału komórki (symetryczny, np. komórki ssaków, lub asymetryczny, np. drożdże pączkujące). Dane próbne można znaleźć w sekcji "Komórki dzielące się asymetrycznie", krok 8.1. Krok 8.2 opisuje ogólny sposób pracy dla symetrycznych komórek dzielących.

Komórki dzielące się asymetrycznie
UWAGA: W przypadku organizmów takich jak drożdże pączkujące pąki można przypisać matkom. Oba obiekty muszą być obecne w tej samej klatce. Domyślnie wyświetlany jest oczekiwany etap cyklu komórkowego na podstawie adnotacji dotyczących drożdży pączkujących. Etap cyklu komórkowego pąków jest wyświetlany na czerwono, natomiast u wszystkich innych obiektów na biało. Matki są połączone z pąkami przerywaną, żółtą linią.
1. Aktywuj analizę cyklu komórkowego za pomocą selektora trybu (Rysunek 6, "Selektor trybu").
2. Wybierz Tak, przejdź do klatki 1 , gdy zostanie o to poproszone.
3. Używaj strzałek w lewo i prawo, aby nawigować między klatkami.
4. Przejdź do klatki 41. Kliknij OK , aby zaakceptować inicjalizację tabeli Cell Cycle Annotation po zapytaniu o to.
5. Kliknij prawym przyciskiem myszy na komórkę 1 lub jej zawiązek, aby oddzielić połączenie i oznaczyć zdarzenie podziału komórki.
6. Kontynuuj, aż wszystkie odpowiednie klatki zostaną obejrzone. Koryguj błędy w automatycznych przypisaniach macierzystych pąków za pomocą dostępnych narzędzi (Rysunek 6, "Edytuj pasek narzędzi").
7. Dostępne narzędzia
  UWAGA: Te narzędzia, z wyjątkiem narzędzia Break/Rebind Mother-Bud Association , można aktywować za pomocą konfigurowalnego skrótu lub naciskając odpowiednie przyciski na pasku narzędzi.
  1. Przypisz Bud do Matki (A): Aktywuj narzędzie Przypisz Bud do Matki . Naciśnij i przytrzymaj prawy przycisk myszy na słuchawkach. Przeciągnij do odpowiadającej komórki macierzystej i zwolnij przycisk myszy.
    UWAGA: Używaj tego narzędzia, gdy automatyczne przypisywanie pąków matkom jest nieprawidłowe.
  2. Przypisuj Nieznaną Historię (U): Aktywuj narzędzie Przypisuj Nieznaną Historię . Użyj prawego przycisku myszy , aby kliknąć komórkę, która powinna być oznaczona jako mająca nieznaną historię.
    UWAGA: Użyj tego narzędzia do ręcznego adnotowania komórek o nieznanej historii, pomagając skorygować niejednoznaczności linii genealogicznej tam, gdzie automatyczne wnioskowanie jest niewystarczające.
  3. Ponowne inicjalizowanie adnotacji cyklu komórkowego
    UWAGA: Użyj tej opcji, aby ponownie uruchomić algorytm adnotacji cyklu komórkowego od bieżącej ramki wzwyż. Zapewnia to spójność z najnowszymi korektami lub aktualizacjami danych segmentacji/śledzenia.
  4. Przerwanie/ponowne powiązanie matki z pąkiem: Upewnij się, że nie wybierasz żadnego innego narzędzia. Kliknij prawym przyciskiem myszy na istniejącą parę macierzystych kwiatów, aby przerwać połączenie, lub ponownie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby przywrócić połączenie.
Symetryczne komórki dzielące się
UWAGA: Ta funkcja jest w fazie testów beta i wkrótce zostanie oficjalnie wydana. Możliwe jest przypisanie dwóch lub więcej komórek potomnych do jednej komórki macierzystej. Potencjalne komórki macierzyste to te obecne w poprzednim ujęciu, ale nieobecne w obecnym, podczas gdy potencjalne komórki potomne to nowo pojawiające się komórki w obecnym układzie.
1. Aktywuj podział normalny: drzewo linii za pomocą selektora trybu (rysunek 6, "Selektor trybu").
2. Wybierz Tak, przejdź do klatki 1 , gdy zostanie o to poproszone.
3. Używaj strzałek w lewo i prawo, aby nawigować między klatkami.
4. Popraw błędy w automatycznych przypisaniach matka-córka za pomocą dostępnych narzędzi (Rysunek 6, "Edytuj pasek narzędzi").
5. Propaguj zmiany po wezwaniu, klikając Propaguj.
6. Dostępne narzędzia
  UWAGA: Narzędzia te można aktywować za pomocą skrótu lub odpowiednich przycisków na pasku narzędzi.
  1. Znajdź matkę dla nowego identyfikatora komórki (F): Aktywuj narzędzie Znajdź matkę dla nowego identyfikatora komórki . Kliknij prawym przyciskiem myszy na nową komórkę, aby przechodzić przez kandydujące komórki macierzyste. Shift + Kliknij prawym przyciskiem myszy , aby cofnąć się między kandydatami.
    UWAGA: Użyj tego narzędzia do przypisania lub modyfikacji matki komórki potomnej.
  2. Ustaw nieznaną matkę (U): Aktywuj narzędzie Ustaw Nieznaną Matkę . Kliknij prawym przyciskiem na komórkę, której matka jest nieznana.
    UWAGA: Użyj tego narzędzia, aby ręcznie oznaczyć matkę komórki jako nieznaną.

9. Zapisywanie danych

Przejdź do File > Zapisz w górnej wstążce.
Kliknij, ustaw pomiary...aby wybrać pożądane wymiary.
Zaznacz pole wyboru obok metryk mCitrine lub innych pożądanych pomiarów.
Kliknij OK , aby potwierdzić.
Kliknij Tak , aby zapisać pomiary.
Kliknij OK, aby potwierdzić ramkę, do której wartości należy zapisać.
Kliknij Nie , gdy pojawi się pytanie o łączenie danych.

10. Stwórz strukturę danych

UWAGA: Ta sekcja omawia przygotowanie danych mikroskopowych do segmentacji i śledzenia. Można to pominąć podczas korzystania z danych demonstracyjnych, które są pobierane w sekcji "Pobieranie danych próbki". Struktura danych, która zostanie wygenerowana, została przedstawiona na rysunku 9.

Włóż plik(y) do pustego folderu.
UWAGA: Obsługiwane są formaty mikroskopii takie jak .czi (Zeiss), .lif (Leica) i .nd2 (Nikon), a także pliki pojedyncze .tif i .png.
Kliknij na moduł 0. Stwórz strukturę danych... w głównym oknie (Rysunek 1A, moduł "Utwórz strukturę danych").
Wybierz BioIO lub Fiji Macro.
1. Jeśli używasz Windowsa , kliknij Użyj BioIO, a dla użytkowników MacOS i Linux wybierz Użyj makra Fiji.
  UWAGA: W poniższym miejscu zakłada się, że używany jest Windows.
2. Jeśli pojawi się poproszenie o instalację BioIO, naciśnij OK , aby zainstalować.
3. Wybierz układ plików mikroskopowych. Wybierz opcję odpowiadającą układowi plików mikroskopii w menu rozwijanym, a następnie naciśnij OK , aby potwierdzić.
Wybierz foldery źródłowe i docelowe oraz strategię ładowania danych
1. Naciśnij Koniec, aby potwierdzić, że pliki znajdują się w pustym folderze.
2. Użyj selektora folderów Cell-ACDC, aby wybrać folder zawierający plik(y).
3. Naciśnij Wybierz folder , aby wybrać folder.
4. Naciśnij ponownie Wybierz folder , aby wybrać ten sam folder co docelowy.
  UWAGA: Surowy plik mikroskopii nie jest usuwany.
5. Wybierz Tak, załaduj całą pozycję naraz.
Jeśli pojawi się poproszenie o zainstalowanie podpakietu BioIO, naciśnij OK , aby zainstalować.
Ustaw metadane pliku wejściowego.
1. Popraw metadane.
  UWAGA: Sprawdź podwójnie "Kolejność wymiarów", klikając ikonę oczka obok pól nazw kanałów . Inne metadane z pliku raw są podświetlane.
2. Naciśnij OK , aby potwierdzić metadane.
3. Naciśnij Tak , aby potwierdzić kolejność wymiarów.
Poczekaj, aż proces się zakończy.
Naciśnij Tak , aby zamknąć okno po zakończeniu procesu.
UWAGA: Tworzenie struktury danych może zająć wiele godzin, w zależności od rozmiaru danych.

11. Narzędzia do wstępnego przetwarzania danych

UWAGA: W głównym oknie dostępnych jest kilka opcji przetwarzania obrazów przed przejściem do analizy. Aby uzyskać dostęp do tych narzędzi, przejdź do rozwijanego menu Utilities w pasku menu głównego okna (Rysunek 1B, "Utilities"), najedź kursorem na Przetwarzanie obrazu, a następnie wybierz opcję, którą należy użyć. Dwa przykłady to:

Łącz kanały: Użyj tego do połączenia dwóch lub więcej kanałów obrazowych.
UWAGA: Na przykład można uśrednić dwa kanały fluorescencyjne.
Zmiana rozmiaru obrazów: Użyj tego, aby zmniejszyć rozmiar bardzo dużych zbiorów danych obrazowych.
UWAGA: Może to znacznie przyspieszyć czas przetwarzania i w wielu przypadkach ma niewielki lub żaden wpływ na jakość segmentacji.

12. Rozwiązywanie problemów

Jeśli Cell-ACDC się zawiesi, zgłoś błąd na stronie GitHub Cell-ACDC, przechodząc do zakładki Problemy i klikając zielony przycisk Nowy problem . Stosuj się do dostarczonego szablonu, aby uwzględnić wszystkie istotne informacje potrzebne do diagnozy i rozwiązania problemu. Alternatywnie, możesz szukać pomocy na forum image.sc , używając tagu #cell-acdc lub skontaktować się z jednym z autorów korespondujących. W wielu przypadkach, zwłaszcza po zainstalowaniu pakietu, samo ponowne uruchomienie oprogramowania może rozwiązać problem.
Jeśli Cell-ACDC zawiesza się lub przestaje odpowiadać, sprawdź konsolę pod kątem aktualizacji postępów. Długie czasy segmentacji, zwłaszcza przy użyciu modeli wymagających obliczeniowo, takich jak Cellpose w wersji 4, lub przy przetwarzaniu dużych zbiorów danych, są normalne. Jeśli Cell-ACDC pozostaje nieodpowiadający, odwołaj się do kroku 12.1 po dalsze instrukcje.
Jeśli automatyczna segmentacja błędnie uwzględnia tło, sprawdź, czy etap wstępnego przetwarzania nie wygładził tła. Wiele modeli segmentacji jest trenowanych na obrazach raw (nieprzygotowanych wstępnie) i może działać słabo, gdy tło nie ma wystarczającej tekstury.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilościowa ilościowa objętość jądrowa w sferoidach nowotworowych w 3D

Zautomatyzowana mikroskopia 3D (z-stacks) umożliwia naukowcom wizualizację złożonych systemów wielokomórkowych, takich jak organoidy. Aby ilościowo określić właściwości sygnału morfologicznego i fluorescencyjnego na poziomie pojedynczych komórek, często wymagana jest segmentacja komórek w 3D. Poniższy przykład pokazuje, jak Cell-ACDC może segmentować jądra w organoidy zawierające tysiące komórek z kanału barwienia jądrowego i ilościowo określać ich objętość (dane z ^Ref.9). Segmentacja była przeprowadzana za pomocą niestandardowego modelu Cellpose, który został wytrenowany i opublikowany w ^Ref.9. Wytrenowany model Cellpose może być używany bezpośrednio w Cell-ACDC poprzez podanie ścieżki do pliku wag w interfejsie graficznym podczas wyboru parametrów modelu dla Cellpose v2. Segmentacja została wykonana za pomocą drugiego modułu Cell-ACDC do przetwarzania wszystkich obrazów w grupach (Rysunek 1A, moduł "Segment i śledzenie"). Następnie wynik został zwizualizowany w interfejsie GUI trzeciego modułu (Rysunek 1A, moduł "Visualize and correct"). Moduł ten został zoptymalizowany do wizualizacji tysięcy pojedynczych obiektów z wieloma opcjami adnotacji (np. kontury, nakładane maski segmentacyjne lub identyfikatory tekstu). Po obliczeniu pomiarów z masek 3D wszystkie dostępne pomiary były dokumentowane bezpośrednio w interfejsie graficznym. Dostępne są po przejściu do górnego paska menu (rysunek 6, "Menu bar"), wybraniu menu Pomiary , a następnie Ustaw pomiary.... Okno okienkowe pozwala użytkownikom uzyskać informacje specyficzne dla pomiarów z przycisków informacyjnych i wybrać, które pomiary chcą zapisać. Dla reprezentatywnych wyników na Rysunku 10 użyto "cell_vol_fl_3D", czyli objętości każdego obiektu obliczonej przez pomnożenie łącznej liczby wokseli w obiekcie przez kwadrat rozmiaru piksela i głębokość wokseli. Właściwości te są automatycznie wyodrębniane z pliku surowego mikroskopu lub dostarczane przez użytkownika. Obliczenie pomiarów z tego interfejsu wymaga załadowania obrazów RAW. Aby usprawnić proces i umożliwić przetwarzanie wsadowe, pomiary można również obliczyć z menu Utilities (rysunek 1B, "Utilities"), przechodząc do podmenu Pomiary , a następnie obliczaj pomiary dla jednego lub więcej eksperymentów. Na koniec rozkład objętości jądrowej został narysowany jako reprezentatywny wynik (Rysunek 10). Analiza ta ujawnia znaczącą część małych jąder, prawdopodobnie z powodu artefaktów segmentacji. Można je łatwo usunąć, filtrując małe obiekty z maski segmentacji. Jednocześnie bardzo duże jądra mogą być wynikiem połączenia jąder podczas segmentacji. Zawsze zaleca się wykreślanie rozkładu objętości obiektów (np. pojedynczych komórek) w celu identyfikacji artefaktów i uzyskania dodatkowych informacji biologicznych o rozmiarze komórek.

Ilościowa ilościowa analiza danych z mikroskopii poklatkowej

Dzięki mikroskopii poklatkowej dynamika komórkowa może być bezpośrednio obserwowana na poziomie pojedynczych komórek. Poza segmentacją komórek, wyodrębnianie dynamiki czasowej wymaga dodatkowej analizy, w tym śledzenia komórek i adnotacji rodowodu komórek. Ze względu na współzależność tych etapów analizy, błędy wprowadzone na początku potoku mogą przenosić się na kolejne etapy. W związku z tym konieczne jest ciągłe wizualizowanie i korekta błędów segmentacji, śledzenia i adnotacji. Poniżej pokazuje, że Cell-ACDC nadaje się do realizacji tych zadań. Wybrano dwa zestawy danych dwóch różnych organizmów modelowych: 1) drożdże pączkujące (szczep DCY001-1 z ^Ref.35, gdzie dwa białka histonów H2B, Htb1 i Htb2, są oznaczone mCytrynem) oraz 2) embrionalne komórki macierzyste myszy (mESC, dane z ^Ref.22).

Te dwa zestawy danych podkreślają dwa tryby adnotacji dostępne w Cell-ACDC: asymetryczny i symetryczny (czyli symetryczna cytokineza, czyli "normalna") podział komórek. Ponieważ sposób podziału się różni, oba organizmy wymagają innego systemu śledzenia i adnotacji.

W podziale asymetrycznym komórka matka tworzy pąk, który rośnie i ostatecznie rozdziela się, tworząc komórkę potomną. Po podziale komórka macierzysta zachowuje swój oryginalny identyfikator komórki, a jej numer generowania wzrasta o jeden, podczas gdy komórka potomna otrzymuje nowy identyfikator komórki, a jej numer generowania jest ustawiany na jeden. Faza pączkowania odpowiada fazom S/G2/M cyklu komórkowego i jest tak oznaczana w Cell-ACDC. Te opcje adnotacji pomagają odpowiadać na typowe pytania biologiczne związane z cyklem komórkowym u drożdży pączkujących.

W przypadku podziału "symetrycznego" (np. komórek ssaków) komórka macierzysta dzieli się na dwie komórki potomne. Komórka macierzysta, czyli jej identyfikacja, znika podczas podziału, a dwie komórki potomne otrzymują nowe identyfikatory. Dodatkowo liczba generacji komórek potomnych jest zwiększona o jeden względem komórki macierzystej. Cell-ACDC śledzi także identyfikator rodzica, identyfikator korzenia (oryginalną komórkę przodka na początku linii rodowej) oraz identyfikator siostrzany.

Dla obu trybów adnotacji opracowano innowacyjne ramy korygujące błędy adnotacji, gdzie poprawka jest automatycznie przekazywana do wszystkich przeszłych i przyszłych istotnych punktów czasowych. Wizualizacja, adnotacje i korekta zostały wykonane w interfejsie GUI trzeciego modułu (Rysunek 1A, moduł "Visualize and correct" oraz Rysunek 6). Aby segmentować i śledzić komórki w zbiorze danych 1, zastosowano model YeaZ_v2²⁶ do kanału kontrastu fazowego, natomiast dla kanału jądrowego (histonowego) zastosowano model StarDist²⁵ . Następnie, korzystając z narzędzia Tracking and lineage > Track i/or count sub-cellular objects (Rysunek 1B, menu Utilities ), Cell-ACDC przypisał każdemu jądru identyfikator komórki odpowiadającej komórki, zapewniając spójność między tabelami generowanymi z masek cell a nucleus.

Dla zbioru danych 2 zastosowano model segmentacji DeepSea²² . Wszystkie trzy modele są już dostępne w Cell-ACDC, co pokazuje zaletę integracji kilku modeli segmentacji z oprogramowaniem.

Po poprawieniu błędów segmentacji i śledzenia anonotowano rodowody komórek, obliczano cechy numeryczne oraz przeprowadzano dalszą analizę. Dla zbioru danych 1 kolumna TaYFP_amount_autoBkgr oraz liczba segmentowanych jąder (rysunek 11A) zostały narysowane względem czasu. "TaYFP" to nazwa kanału nuklearnego. "amount_autoBkgr" to wskaźnik pośredni dla całkowitej ilości białka komórkowej wyekstrahowanej z obrazów epifluorescencyjnych³⁶. Oblicza się ją jako różnicę między średnią intensywnością fluorescencji w każdej masce komórki a medianą tła, pomnożoną przez powierzchnię komórki (w pikselach). Tutaj mediana tła jest obliczana ze wszystkich pikseli, które nie są podzielone na komórki. Jak można się spodziewać, ilość H2B zaczyna rosnąć w momencie wyłaniania się pąków (rysunek 11A-ii) i osiąga stałą wartość przed podziałem jądrowym (rysunek 11A-iii). Jest to ważna kontrola jakości homeostazy białek histonowych, ponieważ ilość białek histonowych jest oczekiwana jako zależna od cyklu komórkowego. Dodatkowo, wykres liczby jąder w czasie potwierdza, że ilość białek histonowych osiąga maksimum mniej więcej w okolicach podziału jądrowego.

Dla zbioru danych 2 wykreślono powierzchnię komórki w czasie wybranej komórki podlegającej podziałowi komórki. Zgodnie z oczekiwaniami, powierzchnia komórki rośnie, aż osiągnie maksymalną wartość (rysunek 11B-i). Następnie zmniejsza się aż do podziału komórki (rysunek 11B-ii) wraz ze skurczem komórki. Na koniec cykl zaczyna się od nowa dla dwóch komórek potomnych. To kolejna zalecana analiza, ponieważ sprawdzenie zmian rozmiaru komórek w trakcie cyklu komórkowego jest niezbędne, aby potwierdzić, że komórki rosną i dzielą się zgodnie z oczekiwaniami (lub nie, w przypadku konkretnych mutantów).

figure-results-1
Rysunek 1: Moduły Cell-ACDC. (A) Przegląd 4 głównych modułów, które mogą być wystrzeliwane z głównego wyrzutni Cell-ACDC. Po segmentacji, śledzeniu i adnotacji danych mikroskopijnych, cechy numeryczne można obliczyć zarówno z trzeciego modułu ("Wizualizuj i popraw"), jak i z (B) menu Narzędzia na górnym pasku menu. "Utilities" to procedury, które mogą działać automatycznie na wielu zbiorach danych bez udziału użytkownika. Oprócz obliczania pomiarów, inne narzędzia obejmują łączenie wielu tabel wyjściowych w jedną tabelę, śledzenie obiektów subkomórkowych oraz wstępne przetwarzanie obrazów. Cell-ACDC obsługuje dane 2D, 3D (z-stack lub time-lapse) oraz 4D (z-stacki w czasie), z dowolną liczbą dodatkowych kanałów. Tabela wyjściowa z cechami numerycznymi może być następnie wykorzystana do dalszej analizy i odkryć biologicznych (Rysunek 10 i Rysunek 11). W tym celu na stronie Cell-ACDC na GitHub dostępne są notatniki Jupyter, które zawierają przykłady wykresów dostępnych z tabeli wyjściowej. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Schemat decyzyjny cell-ACDC. Schemat blokowy określający moduł do wykorzystania w zależności od typu zbioru danych i wymagań analitycznych. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Pobierz przykładowe dane. (A) Otwarty przewodnik powitalny. (B) Pobieranie przykładowych danych potrzebnych do replikacji protokołu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Ładowanie danych do przygotowania danych. (A) Załaduj dane do interfejsu GUI przygotowującego dane. (B) Wybierz kanał do załadowania. (C) Edycja i potwierdzenie metadanych obrazu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-5
Rysunek 5: Uruchom proces przygotowania danych. (A) Rozpocznij proces. (B) ROI pozycji (dla przycinania) oraz ROI tła. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej liczby.

figure-results-6
Rysunek 6: Interfejs trzeciego modułu do wizualizacji i poprawy wyników. Zrzut ekranu interfejsu trzeciego modułu (GUI ("Visualise and correct" na Rysunku 1A) z podświetlonymi elementami. Zwróć uwagę, że większość przycisków na paskach ma podpowiedź (dostępną po nałożeniu kursora myszy na przycisk) wyjaśniającą, jak używać tej konkretnej funkcji. Selektor trybu może być używany do przełączania się między 5 trybami: "Viewer", "Segmentation and Tracking", "Cell cycle analysis" (dla komórek dzielących się asymetrycznie), "Normal division: Lineage tree" (dla komórek dzielących się symetrycznie, np. komórek ssaków) oraz "Niestandardowe adnotacje". Należy zauważyć, że pasek narzędzi lub pasek menu często znajduje się w innych interfejsach graficznych (np. moduł "Data pre-processing", Rysunek 1). Paska narzędzi Edycja zawiera wszystkie funkcje, które można użyć do edycji i korygowania błędów segmentacji i śledzenia (np. pędzel, gumka, identyfikator edycji itp.). Załadowany obraz jest wyświetlany w widoku dwóch paneli, co jest pomocne, gdy potrzebne są różne opcje adnotacji (np. informacje o cyklu komórki na lewym obrazie i ID na prawym obrazie). Prawy obraz można również wyłączyć (kliknij prawym przyciskiem myszy na obraz i odznacz Pokaż obraz lustrzany). Każdy panel obrazów ma suwak LUT po boku, który pozwala szybko regulować poziomy intensywności. Klikając prawym przyciskiem myszy na kontrolkę LUT, użytkownik może wybrać różne mapy kolorów dla obrazów intensywności. Dodatkowo, po prawej stronie, znajduje się selektor LUT do nałożenia koloru etykiet segmentacji na obrazy intensywności (opcja adnotacji zwana maskami Segm). Po lewej stronie opcji adnotacji dla lewego obrazu znajdują się dodatkowe przełączniki do sterowania ustawieniami, takimi jak automatyczne zapisywanie, rozmiar czcionki itp. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Wizualizacja wstępnego przetwarzania w głównym interfejsie graficznym. (A) Otwórz dialog wstępnego przetwarzania. (B) Wstępne przetwarzanie dialogu z parametrami używanymi w inicjalizacji protokołu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-8
Rysunek 8: Wizualizuj wyjście segmentacji w głównym interfejsie graficznym. (A) Wybierz model segmentacji. (B) Ustalić parametry segmentacji. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-9
Rysunek 9: Struktura teczek wymagana przez Cell-ACDC. Aby działać z Cell-ACDC, dane muszą być ułożone w określoną strukturę folderów. Chociaż Cell-ACDC udostępnia moduł do automatycznego generowania tej struktury, ważne jest, aby zrozumieć, jak powinna ona wyglądać. Po pierwsze, wszystkie pliki muszą znajdować się w folderze o nazwie Images. Następnie wszystkie muszą zacząć od tej samej nazwy, tzw. "basename_". Minimalnym wymaganym zestawem plików jest jednokanałowy plik TIFF (2D, 3D z-stack lub 3D+time) oraz plik CSV kończący się na "_metadata.csv". Ten plik musi być tabelą z dwiema kolumnami, pierwszą kolumną nazywaną Description , a drugą kolumną o wartościach, i powinien zawierać co najmniej wpisy dla SizeT oraz SizeZ dla liczby klatek i z-slice, odpowiednio. Jeśli plik obrazu nie zawiera wycinków z, rozmiar Z musi być ustawiony na 1. To samo dotyczy zdjęć bez poklatku czasowego, gdzie rozmiar T musi wynosić 1. Jako plik CSV, wpis to pojedyncza linia Description, value, oddzielona przecinkiem, np. SizeZ,1. Dla wielu kanałów musi być wygenerowany jeden plik TIFF na kanał. Folder Images należy następnie umieścić w folderze o nazwie "Position_1". Dozwolone są różne stanowiska, które muszą być oznaczone kolejnymi numerami. Podczas ładowania danych do dowolnego modułu Cell-ACDC użytkownik może wybrać konkretny folder Position lub cały folder eksperymentu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-10
Rysunek 10: 3D ilościowa ilościowa struktura organoidów nowotworowych. Zrzut ekranu reprezentatywnego organoidu nowotworowego (dane z⁹) załadowanego do interfejsu trzeciego modułu Cell-ACDC (po lewej), przykładowe z-wycinki z czerwonymi konturami podkreślającymi maski segmentacyjne (w środku) oraz histogram rozkładu objętości komórkowej obliczony na podstawie masek segmentacji 3D (po prawej). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-11
Rysunek 11: Ilościowa analiza danych z mikroskopii poklatkowej. (A) Zrzut ekranu z mikroskopii poklatkowej z komórek pączkujących drożdży załadowanych do interfejsu trzeciego modułu Cell-ACDC (po lewej) oraz ilościowa ilościowa ilość białka histonu H2B w czasie w reprezentatywnym cyklu komórkowym (po prawej). Powiększene obrazy pokazują przykładową komórkę i jej pąk (białe strzałki) na początku cyklu komórkowego (i), w momencie wyłaniania się pąków (ii) oraz przy podziale jądrowym (iii). Dane pochodzą z Chatzitheodoridou i ^in.35 (B) Zrzut ekranu z mikroskopii poklatkowej danych z mikroskopii poklatkowej załadowanych do trzeciego modułu GUI Cell-ACDC (po lewej) oraz powierzchni komórki (μm²) przedstawionej jako funkcja czasu reprezentatywnej komórki podlegającej podziałowi komórkowemu. Powiększone obrazy pokazują przykładową komórkę i jej potomki w maksymalnej powierzchni komórki przed podziałem (i), podziałem na dwie komórki potomne (ii) oraz ostatnią analizowaną klatkę po podziale (iii). Dane pochodzą z Zargari i in. ^22,33. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza danych z mikroskopii wielowymiarowej często wymaga użycia nowoczesnych modeli opartych na AI. Jednak te narzędzia są rozwijane szybko i stanowią istotną barierę wejścia do ich adopcji. Dodatkowo biolodzy często potrzebują wizualizacji wyniku, aby skutecznie poprawić błędy. Tutaj pokazano, jak naukowcy mogą wykorzystać Cell-ACDC do rozwiązywania tych wyzwań.

Kluczowym krokiem przedstawionego protokołu jest wybór optymalnego modelu segmentacji. Cell-ACDC zawiera interfejs graficzny umożliwiający wizualny wybór (Rysunek 1A, moduł "Visualise and correct"). Dostępne są także narzędzia do przygotowywania danych i przetwarzania wsadowego wielu zbiorów danych (Rysunek 1A, Tworzenie struktury danych, Wstępne przetwarzanie danych, Moduły Segment i Śledzenie oraz Narzędzia). Użytkownicy są zachęcani do zgłaszania problemów i udzielania opinii na forum image.sc (używając tagu #cell-acdc) lub poprzez otwarcie numeru na stronie Cell-ACDC na GitHubie.

Chociaż Cell-ACDC był już używany na stosunkowo dużych danych, takich jak sferoidy na obrazach z tysiącami jąder⁹ lub dane poklatkowe z pączkującymi drożdżami z setkami komórek na klatkę, program musi załadować całe dane jednokanałowe do pamięci RAM, aby działać poprawnie. Zaleca się około trzykrotność rozmiaru pliku obrazu w dostępnej pamięci, aby zapewnić stabilną wydajność. Obecnie zbiory danych przekraczające dostępną pamięć systemową nie mogą być przetwarzane, ale planowane jest wsparcie dla ładowania poza rdzeniem (leniwe) poprzez integrację OME-Zarr³⁷.

Obecnie jednym z głównych ograniczeń Cell-ACDC jest częściowe wsparcie dla zbiorów danych 3D+time, ponieważ większość narzędzi została opracowana zarówno do 3D z-stack, jak i 2D+time danych. W związku z tym przyszłe wersje Cell-ACDC rozszerzyą jego możliwości o pełne wsparcie dla danych 3D+time. Dodatkowo pracujemy nad rozszerzeniem ram adnotacji rodowodu komórkowego dla komórek dzielących się "symetrycznie" (np. komórek ssaków), czyli tych, w których komórka matka dzieli się na dwie komórki potomne (w przeciwieństwie do drożdży pączkowych, gdzie komórka matka raz na cykl komórkowy daje pojedynczą komórkę potomną poprzez pąkowanie). Na koniec, obecnie Cell-ACDC jest ograniczony do danych, których dane jednokanałowe mieszczą się całkowicie w pamięci RAM. Dlatego planujemy wdrożyć leniwe ładowanie, jak wspomniano powyżej.

Od momentu wprowadzenia Cell-ACDC jest nieustannie ulepszany, na przykład poprzez dodawanie nowych modeli segmentacji i śledzenia, nowych ram adnotacji (np. dla komórek ssaków, obecnie w fazie testów beta) oraz różnych usprawnień wydajności. Dzięki tym osiągnięciom naukowcy mogli wykorzystać Cell-ACDC do przyspieszenia badań i umożliwienia odkryć naukowych ^{6,9,16,35,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48}^,⁴⁹. To, co wyróżnia ten framework programowy w porównaniu z istniejącymi metodami 14,27,50,51, to jego zdolność do wykorzystywania i uzupełniania istniejących modeli, dzięki czemu korzysta z rozwoju społeczności. Dalszy rozwój Cell-ACDC jest aktywnie prowadzony, aby uczynić go ramą odniesienia do analizy danych z mikroskopii wielowymiarowej.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Mario Vitacolonnie i Rudolfowi Rüdigerowi za podzielenie się danymi o sferoidach na rys. 10 oraz współpracownikom z Instytutu Epigenetyki Funkcjonalnej, Pascalowi Falter-Braunowi i Carstenowi Marrowi, za cenne dyskusje. Szczególne podziękowania dla kilku użytkowników, którzy udzielili nieocenionych opinii, przetestowali nowe funkcje i cierpliwie zgłaszali problemy. Prace te zostały sfinansowane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) w ramach projektu 416098229, Stowarzyszenia Helmholtza oraz wspólną szkołę badawczą Munich School for Data Science.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
NIEMOWLĘ	Julian Pietsch	10.7554/eLife.79812	Opcjonalne oprogramowanie do segmentacji i śledzenia może być automatycznie zainstalowane z Cell-ACDC
Tracker bayesowski	Kristina Ulicna	10.3389/fcomp.2021.734559	Opcjonalne oprogramowanie do śledzenia może być automatycznie zainstalowane w Cell-ACDC
Cell-ACDC	Francesco Padovani	10.1186/s12915-022-01372-6	Oprogramowanie
Jądra linii zarodkowej komórkowej	Cristina Piñ eiro Ló pez / Ana Rita Rodrigues Neves / Ivana avka	10.17912/MICROPUB. BIOLOGIA.001062	Opcjonalne oprogramowanie segmentacyjne może być automatycznie zainstalowane z Cell-ACDC
Cellpose wersja 2	Carsen Stringer	10.1038/s41592-020-01018-x	Opcjonalne oprogramowanie segmentacyjne może być automatycznie zainstalowane z Cell-ACDC
Cellpose wersja 3	Carsen Stringer	10.1038/s41592-025-02595-5	Opcjonalne oprogramowanie segmentacyjne może być automatycznie zainstalowane z Cell-ACDC
Cellpose wersja 4 (Cellpose-SAM)	Marius Pachitariu	10.1101/2025.04.28.651001	Opcjonalne oprogramowanie segmentacyjne może być automatycznie zainstalowane z Cell-ACDC
Komputer	-	-	Zobacz zalecane specyfikacje poniżej
Komputer - CPU	Jakikolwiek	-	Zalecane minimum 4 rdzenie, 2,5 GHz i nbsp;
Komputer - GPU	Nvidia (preferowana)	-	(Opcjonalnie) Zalecana minimalna wartość 8GB VRAM
Komputer - Przestrzeń na dysku twardym	Jakikolwiek	-	4GB + 3 x rozmiar pliku mikroskopowego
Komputer - System operacyjny	Microsoft, Apple, inni	-	Obsługiwane są Windows, MacOS i Linux
Komputer - RAM	Jakikolwiek	-	3 x rozmiar pliku o pojedynczej pozycji, minimum 16GB
DeepSea	Abolfazl Zargari	10.1016/j.crmeth.2023.100500	Opcjonalne oprogramowanie do segmentacji i śledzenia może być automatycznie zainstalowane z Cell-ACDC
DeLTA	Jean-Baptiste Lugagne / Owen M. O' Connor	10.1101/720615 / 10.1371/journal.pcbi.1009797	Opcjonalne oprogramowanie do segmentacji i śledzenia może być automatycznie zainstalowane z Cell-ACDC
InstanSeg	Thibaut Goldsborough	10.48550/arXiv.2408.15954	Opcjonalne oprogramowanie segmentacyjne może być automatycznie zainstalowane z Cell-ACDC
Miniforge	Conda-Forge	-	Link do pobrania instalatora ze strony Miniforge: https://conda-forge.org/download/
Omnipose	Kevin Cutler	10.1038/s41592-022-01639-4	Opcjonalne oprogramowanie segmentacyjne może być automatycznie zainstalowane z Cell-ACDC
pomBseen	Makoto Ohira	10.1371/journal.pone.0291391	Opcjonalne oprogramowanie segmentacyjne może być automatycznie zainstalowane z Cell-ACDC
SAM (Model Segment Anything)	Aleksander Kirillow	10.48550/arXiv.2304.02643	Opcjonalne oprogramowanie segmentacyjne może być automatycznie zainstalowane z Cell-ACDC
StarDist	Uwe Schmidt / Martin Weigert	10.1007/978-3-030-00934-2_30 / 10.1109/WACV45572.2020.9093435 / 10.1109/ISBIC56247.2022.9854534	Opcjonalne oprogramowanie segmentacyjne może być automatycznie zainstalowane z Cell-ACDC
TAPIR	Carl Doersch	10.48550/arXiv.2306.08637	Opcjonalne oprogramowanie do śledzenia może być automatycznie zainstalowane w Cell-ACDC
Trackastra	Benjamin Gallusser	https://doi.org/10.48550/arXiv.2405.1570	Opcjonalne oprogramowanie do śledzenia może być automatycznie zainstalowane w Cell-ACDC
Trackpy	Daniel Allan	10.5281/zenodo.1213240	Opcjonalne oprogramowanie do śledzenia może być automatycznie zainstalowane w Cell-ACDC
YeastMate	David Bunk	10.1093/bioinformatyka/btac107	Opcjonalne oprogramowanie segmentacyjne może być automatycznie zainstalowane z Cell-ACDC
YeaZ	Nicola Dietler	10.1038/s41467-020-19557-4	Opcjonalne oprogramowanie do segmentacji i śledzenia może być automatycznie zainstalowane z Cell-ACDC

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cuny, A. P., Schlottmann, F. P., Ewald, J. C., Pelet, S., Schmoller, K. M. Live cell microscopy: from image to insight. Biophys Rev. 3, 021302(2022).
Hugelier, S., Colosi, P. L., Lakadamyali, M. Quantitative single-molecule localization microscopy. Annu Rev Biophys. 52, 139-160 (2023).
Tavakoli, M. R., et al. Light-microscopy-based connectomic reconstruction of mammalian brain tissue. Nature. 642, 398-410 (2025).
Seal, S., et al. Cell painting: a decade of discovery and innovation in cellular imaging. Nat Methods. 22, 254-268 (2025).
Robertson, M. J., Meyerowitz, J. G., Skiniotis, G. Drug discovery in the era of cryo-electron microscopy. Trends Biochem Sci. 47, 124-135 (2022).
Al-Refaie, N., et al. Fasting shapes chromatin architecture through an mTOR/RNA Pol I axis. Nat Cell Biol. 26, 1903-1917 (2024).
Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21, 61-79 (2020).
Ko, J., Hyung, S., Cheong, S., Chung, Y., Li Jeon, N. Revealing the clinical potential of high-resolution organoids. Adv Drug Deliv Rev. 207, 115202(2024).
Vitacolonna, M., et al. A multiparametric analysis including single-cell and subcellular feature assessment reveals differential behavior of spheroid cultures on distinct ultra-low attachment plate types. Front Bioeng Biotechnol. 12, 1422235(2024).
Qian, N., Weinstein, J. A. Spatial transcriptomic imaging of an intact organism using volumetric DNA microscopy. Nat Biotechnol. , (2025).
Wallace, C. T., St. Croix, C. M., Watkins, S. C. Data management and archiving in a large microscopy-and-imaging, multi-user facility: microscopy and data management. Mol Reprod Dev. 82, 630-634 (2015).
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
Bankhead, P., et al. QuPath: open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7, 16878(2017).
Sofroniew, N., et al. napari: a multi-dimensional image viewer for Python. Zenodo. , (2025).
Padovani, F., Mairhörmann, B., Falter-Braun, P., Lengefeld, J., Schmoller, K. M. Segmentation, tracking and cell cycle analysis of live-cell imaging data with Cell-ACDC. BMC Biol. 20, 174(2022).
Piñeiro López, C., Rodrigues Neves, A. R., Čavka, I., Gros, O. J., Köhler, S. Segmentation of C. elegans germline nuclei. microPubl Biol. , (2023).
Ohira, M., Rhind, N. pomBseen: an automated pipeline for analysis of fission yeast images. PLoS One. 18, e0291391(2023).
Goldsborough, T., et al. InstanSeg: an embedding-based instance segmentation algorithm optimized for accurate, efficient and portable cell segmentation. arXiv. , (2024).
Pietsch, J. M., et al. Determining growth rates from bright-field images of budding cells through identifying overlaps. Elife. 12, e79812(2023).
Bunk, D., et al. YeastMate: neural network-assisted segmentation of mating and budding events in Saccharomyces cerevisiae. Bioinformatics. 38, 2667-2669 (2022).
Cutler, K. J., et al. Omnipose: a high-precision morphology-independent solution for bacterial cell segmentation. Nat Methods. 19, 1438-1448 (2022).
Zargari, A., et al. DeepSea is an efficient deep-learning model for single-cell segmentation and tracking in time-lapse microscopy. Cell Rep Methods. 3, 100500(2023).
Lugagne, J. B., Lin, H., Dunlop, M. J. DeLTA: automated cell segmentation, tracking, and lineage reconstruction using deep learning. PLoS Comput Biol. 16, e1007673(2020).
Kirillov, A., et al. Segment anything. arXiv. , (2023).
Weigert, M., Schmidt, U. Nuclei instance segmentation and classification in histopathology images with StarDist. IEEE Int Symp Biomed Imaging Challenges (ISBIC). , (2022).
Dietler, N., et al. A convolutional neural network segments yeast microscopy images with high accuracy. Nat Commun. 11, 5723(2020).
Stringer, C., Pachitariu, M. Cellpose3: one-click image restoration for improved cellular segmentation. Nat Methods. 22, 592-599 (2025).
Pachitariu, M., Stringer, C. Cellpose 2.0: how to train your own model. Nat Methods. 19, 1634-1641 (2022).
Gallusser, B., Weigert, M. Trackastra: transformer-based cell tracking for live-cell microscopy. arXiv. , (2024).
Allan, D. B., Caswell, T., Keim, N. C., van der Wel, C. M., Verweij, R. W. soft-matter/trackpy: v0.6.4. Zenodo. , (2024).
Ulicna, K., Vallardi, G., Charras, G., Lowe, A. R. Automated deep lineage tree analysis using a Bayesian single cell tracking approach. Front Comput Sci. 3, 734559(2021).
Doersch, C., et al. TAPIR: tracking any point with per-frame initialization and temporal refinement. arXiv. , (2023).
Zargari, A., et al. DeepSea is an efficient deep-learning model for single-cell segmentation and tracking in time-lapse microscopy. Cell Rep Methods. 3, 100500(2023).
O'Connor, O. M., Alnahhas, R. N., Lugagne, J. B., Dunlop, M. J. DeLTA 2.0: a deep learning pipeline for quantifying single-cell spatial and temporal dynamics. PLoS Comput Biol. 18, e1009797(2022).
Chatzitheodoridou, D., Bureik, D., Padovani, F., Nadimpalli, K. V., Schmoller, K. M. Decoupled transcript and protein concentrations ensure histone homeostasis in different nutrients. EMBO J. 43, 5141-5168 (2024).
Schmoller, K. M., Turner, J. J., Kõivomägi, M., Skotheim, J. M. Dilution of the cell cycle inhibitor Whi5 controls budding-yeast cell size. Nature. 526, 268-272 (2015).
Moore, J., et al. OME-Zarr: a cloud-optimized bioimaging file format with international community support. Histochem Cell Biol. 160, 223-251 (2023).
Seshadri, A., Badrinarayanan, A. Exonuclease action of replicative polymerase gamma drives damage-induced mitochondrial DNA clearance. EMBO Rep. 26, 1385-1405 (2025).
Dengler, L., et al. When mitochondria fall apart: unbalanced mitochondrial segregation triggers loss of mtDNA in the absence of mitochondrial fusion. bioRxiv. , (2025).
Xiao, J., Turner, J. J., Kõivomägi, M., Skotheim, J. M. Whi5 hypo- and hyper-phosphorylation dynamics control cell-cycle entry and progression. Curr Biol. 34, 2434-2447.e5 (2024).
Roussou, R., et al. Real-time assessment of mitochondrial DNA heteroplasmy dynamics at the single-cell level. EMBO J. 43, 5340-5359 (2024).
Padovani, F., et al. SpotMAX: a generalist framework for multi-dimensional automatic spot detection and quantification. bioRxiv. , (2024).
Lanz, M. C., et al. Genome dilution by cell growth drives starvation-like proteome remodeling in mammalian and yeast cells. Nat Struct Mol Biol. 31, 1859-1871 (2024).
Kukhtevich, I., et al. The origin of septin ring size control in budding yeast. bioRxiv. , (2024).
Chadha, Y., Kukhtevich, I. V., Padovani, F., Schneider, R., Schmoller, K. M. Single-cell imaging reveals a key role of Bck2 in budding yeast cell size adaptation to nutrient challenges. bioRxiv. , (2024).
Seel, A., et al. Regulation with cell size ensures mitochondrial DNA homeostasis during cell growth. Nat Struct Mol Biol. 30, 1549-1560 (2023).
Schuh, L., et al. Altered expression response upon repeated gene repression in single yeast cells. PLoS Comput Biol. 18, e1010640(2022).
Kukhtevich, I. V., et al. Quantitative RNA imaging in single live cells reveals age-dependent asymmetric inheritance. Cell Rep. 41 (7), 111656(2022).
Freitag, M., et al. Single-molecule experiments reveal the elbow as an essential folding guide in SMC coiled-coil arms. Biophys J. 121, 4702-4713 (2022).
Sugawara, K., Çevrim, Ç, Averof, M. Tracking cell lineages in 3D by incremental deep learning. Elife. 11, e69380(2022).
Ershov, D., et al. TrackMate 7: integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nat Methods. 19, 829-832 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Analiza danych z mikroskopii wielowymiarowej z wykorzystaniem Cell-ACDC

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles