Artykuł metodologiczny

Wiekowa dynamika lokomocji u Caenorhabditis elegans: analiza wykładnika Lyapunova

915 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68955

⸱

23 września 2025

 ,  ,  , 
1Physics and Astronomy Department, Vassar College

W tym artykule

Podsumowanie

Badanie to analizuje wpływ wieku na lokomocję u C. elegans poprzez pomiar największego wykładnika Lyapunova (LLE). Wraz z wiekiem C. elegans wykazują wzrost i późniejszy spadek kontroli motorycznej. Wyniki pokazują szczyt LLE po pięciu dniach, a następnie spadek wraz z wiekiem robaków.

Streszczenie

Niniejsze badanie bada wpływ wieku na mobilność Caenorhabditis elegans (C. elegans) za pomocą dynamicznej dyfrakcji optycznej (DOD) do oszacowania największego wykładnika Lyapunova (LLE). LLE, kluczowa miara w układach dynamicznych, ilościowo określa szybkość dywergencji lub zbieżności trajektorii w przestrzeni fazowej, wskazując na przewidywalność i chaos w dynamice układu, w tym przypadku zachowania lokomotywy robaka. Światło laserowe o długości 632 nm odbija się od pływającego robaka w kolumnie wodnej, tworząc wzór dyfrakcyjny. Fotodioda wykrywa światło w jednym punkcie w obrębie wzoru dyfrakcyjnego, rejestrując jednowymiarowy szereg czasowy podczas falowania robaka. Ten szereg czasowy pełni funkcję złożonej reprezentacji całego ruchu robaka, obejmując jego dynamikę lokomocji, ponieważ jeden punkt w wzorze dyfrakcyjnym jest superpozycją wszystkich punktów na robaku. Szeregi czasowe są następnie osadzane w przestrzeni fazowej o wyższych wymiarach, aby obliczyć LLE. C. elegans zazwyczaj żyje około 14 dni, podążając wzorcem wzrastającej i malejącej kontroli motorycznej wraz z wiekiem. Aby wyizolować efekty specyficzne dla wieku, robaki były przenoszone na świeże płytki agarowe zawierające E. coli co dwa dni, zapewniając odpowiednie starzenie (od 3 do 12 dni). Analiza kohorty 13 C. elegans wykazała, że LLE osiągnęła szczyt pięć dni po wykluciu, z tempem 1,34 ± 0,03 1/s. Ten szczyt oznacza krytyczny punkt rozwoju, w którym ruch robaków wykazuje największą złożoność i chaotyczne zachowanie. Zaobserwowane wartości LLE są zgodne z równaniem Moore'a, dobrze ugruntowanym modelem opisującym zmiany aktywności dobrowolnej związane z wiekiem, łączące spadek kontroli ruchowej i poziomu aktywności z rosnącym wiekiem u C. elegans.

Wprowadzenie

Lokomomocja Caenorhabditis elegans (C. elegans), mikroskopijnego robaka, była badana w celu pogłębienia zrozumienia układu neuronów ruchowych, ponieważ nicienie to jest neurologicznie proste, zawiera tylko 302 neurony1. C. elegans to organizm modelowy, który łatwo się utrzymuje, żyje tylko 14 dni2. Do poruszania się służy tylko około 72 neuronów z grupy 302 u C. elegans i znajdują się w całym dorosłym ciele nicienia1. Ruch niskowymiarowy (czyli na boki, do przodu i do tyłu) C. elegans sprawia, że jest to łatwy okaz do śledzenia odległości w LLE. Układy nerwowe nicieni są rozumiane w niesamowitym stopniu4.

Analiza wideo pomogła określić ilość ruchu C. elegans poprzez pomiar wielkości takich jak promień krzywizny, częstotliwości falowania oraz długość fali5. Pomiary te ustaliły zmienne kontrolne umożliwiające porównanie właściwości lokomotorycznych w różnych środowiskachi warunkach 6,7. Te informacje tworzą ewoluujący model obwodów napędzających lokomocję C. elegans8, a nawet umożliwiają tworzenie wirtualnych, jak i fizycznych symulacji dynamicznych robaków9.

Dynamiczna dyfrakcja optyczna (DOD)10 została również wykorzystana do ilościowego określenia lokomocji C. elegans. Podczas DOD niskonatężene światło laserowe zakrzywia się wokół żywego robaka, tworząc wzór dyfrakcji dalekiego pola znany jako wzór dyfrakcji Fraunhofera. Rozkład intensywności w żywym wzorcu zmienia się wraz z ruchem nicienia. Jednym z punktów dyfrakcji jest superpozycja wszystkich punktów na robaku, tak że zależna od czasu intensywność w wzorcu dyfrakcyjnym tworzy jednowymiarowy szereg czasowy zawierający informacje o dynamice lokomotorycznej11. Skupiamy się na zależnym od wieku Największym Wykładniku Ljapunowa (LLE) lokomocji, który obliczamy na podstawie eksperymentalnego jednowymiarowego szeregu czasowego. LLE na różnych etapach rozwoju jest porównywalny z innymi badaniami dotyczącymi wieku, pokazując, że obwody nerwowe przejawiają się w wzorcach lokomotorycznych, które można mierzyć za pomocą różnych narzędzi, takich jak analiza wideo czy DOD5.

DOD zapewnia szeregi czasowe wrażliwe na wiele skal, ponieważ wzór interferencji może rozłożyć ruch do ułamka używanej długości fali, a jednocześnie uwzględniać duże zmiany plastyczności (kształtu) gatunku. Ta cecha jest szczególnie przydatna, gdy układ jest wrażliwy na warunki początkowe, jak w systemach chaotycznych, gdzie niewielkie zmiany prowadzą do wykładniczych zmian trajektorii, znanych również jako efekt motyla12. Z tego powodu kluczowe jest rejestrowanie szeregów czasowych w tempie umożliwiającym rejestrowanie drobnych zmian, ponieważ te zmiany mogą powodować znaczące przesunięcia w miarę ewolucji systemu. Fotodioda (PD) może rejestrować szeregi czasowe szybciej niż wiele drogich kamer o dużej prędkości. Połączenie czułości przestrzennej w wzorze dyfrakcyjnym i wysokiej szybkości gromadzenia danych może oddać istotę chaotycznego układu13,14.

LLE opisuje wykładniczą dywergencję trajektorii przestrzeni fazowej. Przestrzeń fazowa zawiera wszystkie możliwe stany układu, opisane przez ich zmienne stanowe (lub współrzędne) oraz powiązane pochodne (lub pędy)15. Różne trajektorie opisują ewolucję układu dla różnych warunków początkowych. W układzie chaotycznym dwie pobliskie trajektorie będą się wykładniczo rozbiegać w czasie, a ta dywergencja jest kwantyfikowana przez dodatnią LLE. W układach fizycznych ta dywergencja objawia się propagowaniem niepewności w warunkach początkowych układu, a także niemożnością wiarygodnego przewidzenia stanu systemu po pewnym czasie, jak daje LLE14.

W systemach eksperymentalnych zmienne stanu są często nieznane; jednak topologię przestrzeni fazowej można odtworzyć tylko z jednej zmierzonej zmiennej, korzystając z twierdzenia16 osadzonego Takensa, konstruując jej wersje opóźnione czasowo (równoważne pochodnym czasowym). Każda wersja z opóźnieniem czasowym jest reprezentowana na osi; Razem opóźnienia czasowe tworzą wykres opóźniający, który jest topologicznie identyczny z wykresem fazowym, jeśli szereg czasowy jest nieskończenie długi. Eksperymentalne szeregi czasowe są ograniczone długością i dlatego mogą generować jedynie szacowane LLE ograniczone eksperymentalnymi niepewnościami.

Ruch C. elegans niesie dodatni LLE10, co jest wskaźnikiem chaosu. Młody organizm przechodzi zmiany lokomotoryczne w wieku17 lat. Większy LLE oznacza mniejszą przewidywalność w porównaniu do mniejszego LLE. LLE dostarcza wiarygodnej metody ilościowego określania wzorców ruchowych organizmu 10,13,14. Cechy lokomotoryczne nicieni są powiązane z neuronami w obrębie nicieni18. Według Cohena i in.19, lokomocyja nicieni zależy od neuronów ruchowych, co sugeruje, że badanie złożoności w poruszaniu nicieni jest również powiązane z jego obwodami neuronalnymi.

Kalibrujemy LLE na podstawie wieku, aby zminimalizować niepewność na potrzeby przyszłych badań. Wcześniejsze badania uśredniły LLE u nicieni13 lat w wieku od trzech do sześciu dni. Badanie to starannie monitorowało wiek nicieni, aby ułatwić rygorystyczną analizę spadków związanych ze starzeniem. Dodatkowo badane są zmiany w poruszaniu się w celu identyfikacji innych biologicznych zmian u C. elegans18. Równanie Moore'a śledzi parametry wieku związane z lokomocją20. Tutaj używamy zmodyfikowanej wersji równania Moore'a, która pozwala na elastyczność w określaniu mechanizmu lokomotorycznego do oceny, wprowadzonej jako marker czasowy T:

figure-introduction-1, (1)

gdzie P(t) oznacza wydajność, t to czas, a i c to parametry skalowania, natomiast b i d to charakterystyczne czasy odpowiednio wykładniczego wzrostu i spadku. Wykazano, że równanie Moore'a przewiduje trajektorie pozornie niezwiązanych ze sobą wielkości, takich jak szybkość i aktywność dobrowolna, w miarę starzenia się organizmów. Gatunki można scharakteryzować na podstawie kształtu krzywej określonego przez równanie Moore'a; t. j. niektóre gatunki mogą osiągnąć szczyt wcześniej niż inne21.

Protokół

1. Przygotowanie C. elegans do akwizycji danych

  1. Umieść 0,5 mL E. coli z OD600 na każdej talerzu agarowej Nematode Growth Medium (NGM), aby nicienie mogły je zjeść. Poczekaj, aż E. coli wyschnie na każdym talerzu agaru.
  2. Zdobyć płytkę kontrolną C. elegans od dowolnego dostawcy materiałów biologicznych, aby stworzyć nowe płytki C. elegans w celu kontroli wieku.
  3. Wysterylizuj platynowy kostkę za pomocą płomienia z palnika Bunsena lub podobnego. Użyj mikroskopu rozcinającego, aby wybrać 5-10 dorosłych dzikich C. elegans do umieszczenia w każdej płytki.
  4. Pozwól nicieniom składać jaja przez 4-5 godzin, zanim zbiorzesz dorosłe osobniki z talerza. Wysiaduj pozostałe nicienie i pozwól im je zbierać w wybranym dniu.
  5. W dniu zbierania danych napełnij optyczną kwarcową kuwetę o pojemności 4,5 mL o wymiarach 10 mm x 10 mm x 45 mm wodą destylowaną w temperaturze pokojowej tuż poniżej górnej części kuwety, aby zapobiec rozlaniu się po dodaniu plastikowej pokrywy. Zbierz 2-3 nicienie i delikatnie umieść je w kuwetcie. Gdy nicienie są już w cuwette, połóż ją na boku, aby łatwo ustawić robaka w wiązce laserowej. C. elegans może unosić się ku dnu, ale będzie kontynuował falowania pływania, dopóki jest całkowicie zanurzonyw wodzie.

2. Zbieranie danych

UWAGA: Poniższa procedura rejestrowania szeregu czasu musi być wdrażana każdego dnia o tej samej porze, aby zminimalizować niepewności wieku.

  1. Uruchom eksperyment opisany w poprzednim artykule22. Wprowadź niewielką modyfikację: zbuduj peryskop z dwoma lustrzanymi lustrami i umieścisz kuwettę na boku między nimi, aby ułatwić późniejsze wycentrowanie robaka w wiązce laserowej. Zamiast aparatu, umieść PD w wzorze dyfrakcyjnym (Rysunek 1).
    1. Ustawić lustra pionowo, aby zbudować wspomniany peryskop.
      UWAGA: To jedyne prace związane z laserowym wyrównaniem, które trzeba wykonać.
  2. Włącz laser HeNe (Helium Neon) i pozwól mu się rozgrzać, osiągając równowagę termiczną (~15 min).
  3. Uruchom cyfrowy oscyloskop, aby rozpocząć zbieranie danych. Ustaw parametry interwału czasowego i bufora pamięci na cyfrowym oscyloskopie. Ustaw interwał czasowy na 100 s i zaimplementuj bufor pamięci o co najmniej 100 kilopróbkach na sekundę (kS).
  4. Ustaw rozdzielczość na 1 kHz dla szybkości akwizycji danych i 12 bitów dla rozdzielczości amplitud, co pomaga rozróżnić złożoność na małych skalach23.
  5. Ustaw oscyloskop tak, aby centrował oscylacje intensywności, używając przesunięcia Auto AC , aby wycentrować szeregi czasowe przy zerze woltów.
  6. Wybierz 2-3 nicienie i delikatnie umieść w kuwetcie wypełnionej wodą destylowaną, aby łatwiej było znaleźć i wycentrować przynajmniej jednego robaka w promieniu laserowym. Nie potrząsaj kuwetą.
  7. Umieść kuwetę z 2-3 nicieniami w peryskopie i wycentruj 1 nicienie w wiązce laserowej.
    1. Gdy C. elegans jest wycentrowany w wiązce laserowej, około 50 cm od peryskopu tworzy się wzór dyfrakcji dalekiego pola.
  8. Umieść fotodiodę w wzorze dyfrakcyjnym dalekiego pola, gdy C. elegans przechodzi przez wiązkę lasera. Upewnij się, że PD jest ustawiony poza środkiem w wzorze dyfrakcyjnym, aby wychwycić światło dyfrakcyjne, a nie centralne maksimum (przepuszczona wiązka laserowa).
  9. Zbieraj co najmniej 10 sekund danych, aby wiarygodnie obliczyć LLE; tzn. do obliczenia stabilnego LLE potrzebnych jest co najmniej 10 000 punktów danych.
    UWAGA: Mniej punktów danych powoduje sztuczne wahania LLE.
  10. Powtarzaj powyższe dane dla każdego dnia 9-15 razy. Zbieraj dane dla osób w wieku 3-12 dni o tej samej porze dnia.

3. Analiza danych

UWAGA: Do analizy danych szeregi czasowe są osadzane w przestrzeni fazowej za pomocą wykresulag 16 , a następnie szacują LLE, obliczając dywergencję trajektorii.

  1. Wybierz fragmenty w szeregu czasowym, w którym nicienie swobodnie pływa wewnątrz wiązki laserowej, dokładnie analizując szeregi czasowe. Rysunek 2A pokazuje żywotną serię czasową z ciągłym sygnałem co najmniej 20 s.
  2. Przefiltruj szeregi czasowe pod kątem niskiego stosunku sygnału do szumu (Rysunek 2B). Ustal, poziom szumów nagrywając szereg czasowy bez robaka w kuwecie. Cechy szeregu czasowego, nie tylko amplituda, muszą mieć ponad dwukrotnie wyższy poziom szumu.
  3. Wyklucz wszelkie nasycone dane z odpowiedniego szeregu czasowego (rysunek 2C). Jeśli jest zbyt dużo danych, aby wydobyć przydatne informacje, wróć do sekcji Zbieranie danych powyżej, powtórz kroki od 2.7.1 do 2.9 i dostosuj poziom intensywności, odsuwając fotodiodę od centralnego maksimum.
  4. Określmy średnią częstotliwość daną przez
    figure-protocol-1   (2)
    gdzie f to częstotliwość, a P to widmo mocy (Rysunek 3). Można to wykonać obliczeniowo, używając szybkiej transformaty Fouriera (FFT), a następnie uśredniając częstotliwości. Wiele programów obliczeniowych posiada wbudowaną funkcję do obliczania średniej częstotliwości zbioru danych.
  5. Odbuduj topologię przestrzeni fazowej za pomocą metody opóźnienia czasowego. Wybierz szereg czasowy X i opóźnij ten ciąg o czas τ , aby rozstrzygnąć trajektorie (Rysunek 4). Optymalne opóźnienie czasowe określa się poprzez zidentyfikowanie pierwszego lokalnego minimum w informacji wzajemnej (MI)24:
    figure-protocol-2    (3)
    gdzie N to liczba punktów, Xi to punkt w szeregu czasowym X, a Xi+τ to punkt opóźniony w tym samym szeregu czasowym. p(Xi) to prawdopodobieństwo wystąpienia punktu X i, a p(Xi+τ) to prawdopodobieństwo wystąpienia Xi+τ. p(Xi, Xi+τ) to wspólne prawdopodobieństwo25 zarówno ciągu czasowego Xi, jak i opóźnionego ciągu czasowego Xi+τ pokrywających się.
  6. Zidentyfikuj pierwsze minimum na wykresie MI między 0,140 a 0,240 s (140 do 240 punktów danych), jak pokazano na rysunku 5. Nie ma dokładnej liczby opóźnienia; Głównym celem jest rozróżnienie trajektorii fazowych na tyle, by określić dywergencję.
  7. Użyj szeregu czasowego Xi oraz jego opóźnionych wersji przez τ, co ustalano przez minimalizację MI w poprzednim kroku.
  8. Określ wymiar osadzenia. Najbardziej odpowiednim wymiarem zanurzenia jest najniższy wymiar, dla którego fałszywi najbliżsi sąsiedzi (FNN) stabilizują się przy minimum (Rysunek 6)26. Stosuj metodę opracowaną przez Abarbanela i in.27,28.
  9. Użyj algorytmu Rosensteina29 do rekonstrukcji układu dynamicznego w przestrzeni fazowej i śledzenia rozbieżności pobliskich trajektorii w czasie. W szczególności wykorzystaj procedurę MATLAB Merve Kizilkaya, opublikowaną na forumMATLAB 30, aby obliczyć LLE. Ta procedura wymaga następujących danych wejściowych: szeregu czasowego, średniej częstotliwości atraktora, opóźnienia czasowego τ, szybkości pozyskiwania danych dla szeregu czasowego oraz przedziału dopasowania do dywergencji.
  10. Powtórz powyższą procedurę dla zbiorów danych 9-15, aby zmniejszyć niepewność szacunków LLE. Uśrednij LLE dla każdego dnia, a następnie dopasuj do krzywej Moore'a (Rysunek 7).

Wyniki

Mierząc LLE względem wieku, mierzyliśmy także inne wielkości często związane ze złożonymi układami dynamicznymi, takie jak częstotliwość atraktora, MI i FNN. Zebraliśmy dane z badań wiekowych od 3 do 12 dni. Robaki są zbyt małe i niedojrzałe, zanim skończą 3 dni, by ręcznie się nimi zajmować. Po 12 dniach robaki są starzejące się i prawie się nie ruszają, ponieważ ich obwody neuronalne się pogarszają, a układ nerwowy pogarsza sięo 31 dni.

Algorytm Rosensteina wybiera sąsiedni punkt w odstępie co najmniej jednego średniego okresu dla każdego punktu na osadzonej trajektorii. Zaczynając od wektora separacji między dwoma punktami na dwóch sąsiednich trajektoriach (Rysunek 8), algorytm śledzi ewolucję tej dywergencji. Odległość trajektorii początkowo rośnie wykładniczo z powodu chaotycznej natury układu32, a następnie ustępuje plateau, ponieważ trajektoria jest ograniczona. Wykreślenie logarytmu średniej rozbieżności w czasie śledzi rozdzielenie trajektorii (Rysunek 8 i Rysunek 9). Nachylenie liniowych najmniejszych kwadratów dopasowuje się do pierwszej części krzywej przed jej wyprostowaniem, co daje wiarygodne oszacowanie dla LLE33 układu. Należy zauważyć, że wybór zakresu dopasowania najmniejszych kwadratów oraz samego dopasowania jest niepewny. Czułość na warunki początkowe powoduje, że liniowy obszar dopasowania wykazuje oscylacyjne zachowanie podczas śledzenia dywergencji na atraktorze. Biologiczna zmienność między robakami, które były uśredniane dla każdej grupy wiekowej, przewyższa zmienność w liniowym dopasowaniu LLE dla jednego badania, co pokazano w poprzedniej publikacji10.

Seria czasowa (Rysunek 2A) pokazuje, że szczyty i doliny pokrywają się z aspektami poruszania się robaka, takimi jak zmiany częstotliwości, kształtu i orientacji pływania. Szeregi czasowe są aperiodyczne; Oscylacje w szeregu czasowym nigdy się nie powtarzają, a jednak pozostają ograniczone intensywnością. Częstotliwość jest stała, choć nieznacznie się waha, co wskazuje na złożoność i ograniczenie częstotliwości. Rysunek 10 pokazuje spadek częstotliwości pływania wraz z wiekiem robaka, który zanika się rozkłada 12 dnia. Średnia częstotliwość skacze po 12. dniu u większości robaków. To prawdopodobnie oznaka awarii obwodu nerwowego. Natomiast średnie opóźnienie τ, określone przez pierwsze minimum MI, rośnie wraz z wiekiem populacji, ponieważ cykl się wydłuża (Rysunek 11).

W naszym przypadku MI reprezentuje statystyczne nakładanie się dwóch opóźnionych szeregów czasowych. Jeśli MI jest minimalne, to nakładanie się trajektorii jest minimalne. Teoretycznie chaotyczne trajektorie nigdy się nie nakładają; jednak w praktyce, przy ograniczonych znaczących cyfrach i pewnym szumie eksperymentalnym, niektóre punkty będą się nakładać w granicach tolerancji24. Dążymy do minimalizacji możliwości nakładania się poprzez minimalizację MI. Różnica między zminimalizowanym MI a znacznie większym MI jest zilustrowana na Rysunku 4.

Wymiar osadzenia jest określany przez fałszywych najbliższych sąsiadów (FNN). Liczba FNN spłaszcza się o 5% lub mniej FNN wokół wymiarów osadzenia 3 lub 4. Na Rysunku 6 wiek nicieni nie wpływa na wymiar osadzenia, z wyjątkiem 12. dnia, gdy robak jest już prawie u końca swojego życia.

Trajektoria LLE podąża za krzywą Moore'a (Rysunek 7) z szczytem po 5 dniach, co wskazuje, że najbardziej nieprzewidywalna (i być może złożona) lokomocja występuje, gdy C. elegans są świeżo dojrzałe. Na Rysunku 7 wykres LLE od dni 3 do 12 pokazuje liniowy wzrost z szczytem po 5 dniach, a następnie spadek po 5 dniach. Słupki błędu na Rysunku 10 reprezentują odchylenie standardowe średniej 4,34 i odzwierciedlają kilka czynników, w tym różnorodność gatunków biologicznych oraz szacunki LLE. Różnice między robakami zwykle przeważają nad niepewnością w rutynie dopasowania LLE. Zmienność między dniami, jak dni 5 i 7, nie pokrywa się, więc dane są wyraźnie rozróżnialne. Trend LLE z wiekiem bardzo odpowiada równaniu Moore'a z wcześniejszego badania18, które opisuje wpływ wieku na pamięć i lokomocję u innych organizmów żywych.

LLE w Tabeli 1 są spójne, pokazując powolny wzrost, a następnie malejący trend wraz z wiekiem. Wartości są zgodne z wcześniej opublikowanymi wynikami na podstawie DOD10 oraz analizy wideo34,35.

figure-results-1
Rysunek 1: Eksperymentalny układ dyfrakcji dalekiego pola (nie narysowany w skali). Lusterka sterujące tworzą peryskop. Kuweta z C. elegans umieszczana jest między lusterkami sterującymi. Wiązka laserowa jest dyfrakcyjna przez robak i przemieszcza się w kierunku PD przez drugie lustro sterujące. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Szeregi czasowe intensywności. Szeregi czasowe DOD wykazują wahania intensywności podczas poruszania nicienia w wiązce laserowej, z (A) odpowiednim szeregiem czasowym do analizy danych. (B) Ten szereg czasowy wskazuje, że odstęp między 11 a 30 s nie wykazuje sygnału; Pokazuje jedynie poziom szumów systemu, ponieważ krótsze amplitudy stałe pochodzą głównie z rozproszonego światła. (C) Ta seria czasowa zawiera kilka przypadków nasyconych danych. Każdy punkt danych stanowi znaczący skok na wykresie, który jest odcięty i spłaszczany na szczytach i dołkach. W tym przykładzie kolce spłaszczają się, gdy intensywność waha się od -100 do 100 AU w zakresie od 45 do 50 s. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Spektrum mocy. Widmo mocy pokazuje maksimum około 0,95 Hz. Częstotliwości są rozproszone, ponieważ częstotliwość trajektorii atraktora się przesuwa i nigdy dokładnie się nie powtarza. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Dane eksperymentalne osadzone w wykresach 3D z opóźnieniami z dwoma różnymi opóźnieniami tej samej serii czasowej 9-dniowego robaka. Ta seria czasowa pokazuje, że lokomocja jest ograniczonym atraktorem zgodnym z teorią chaosu. (A) Trajektoria jest rozwiązywana przy użyciu pierwszego lokalnego minimum (MI ≈ 2,11), co daje opóźnienie około 0,183 s (183 punkty danych). Widoczne przecięcia trajektorii są wynikiem rzutowania na przestrzeń dwuwymiarową. (B) Ten wykres opóźnień pozostaje nierozwiązany przez niewłaściwe opóźnienie 0,002 s (2 punkty danych, (MI > 7)), ponieważ punkty są zbyt blisko siebie, by je rozróżnić, i nie wykazują rozbieżności. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-5
Rysunek 5: Wykładniczy spadek wzajemnej informacji. Pierwsze minimum w MI określa opóźnienie zbioru danych w 0,161 s (161 punktów danych) w tym konkretnym przypadku, aby rozstrzygnąć trajektorię fazową. To opóźnienie przesuwa wartość szeregu czasowego, aby odtworzyć atraktor w przestrzeni fazowej. Opóźnienie musi być tylko blisko pierwszego minimum, wystarczające, by rozstrzygnąć trajektorie. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-6
Rysunek 6: Średnie wymiary osadzenia odpowiednio w dniach 3, 5, 9 i 12. Powiększony widok wymiaru osadzenia służy do pokazania konkretnej różnicy między wymiarami osadzenia każdego dnia. Tylko dzień 12 wykazuje zauważalną różnicę. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-7
Rysunek 7: Średnia szacowanych LLE między dniem 3 a 12. LLE osiąga szczyt po 5 dniach. Przez maksymalnie 5 dni nicienie wykazują trajektorię wzrostu zgodną z przejściem od niedojrzałości do dojrzałości. Po tych 5 dniach nicienie doświadczają spadku rozbieżności. Niepewności są miarą odchylenia standardowego średniej, które jest zdominowane przez zmiany między robakami. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-8
Rysunek 8: Przedstawienie rozbieżności obecnej w teorii chaosu. Dodatnia LLE spowoduje, że początkowo bliskie trajektorie będą się z czasem rozchodzić. t to przedział czasowy, d to dywergencja, a x(t) to punkt w przestrzeni fazowej. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-9
Rysunek 9: Dywergencja trajektorii fazowej w skali logarytmicznej. Szacowany LLE to nachylenie liniowego dopasowania (1,08 1/s) w obszarze wznoszenia przed wypłaszczeniem się z powodu ograniczenia atraktora między 0,96 a 1,01 s. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

figure-results-10
Rysunek 10: Średnia częstotliwość występowania każdego dnia. Średnia z dnia 12 oznacza istotną zmianę sygnałów neurologicznych napędzających lokomocję. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-11
Rysunek 11: Średnie opóźnienie dla każdego dnia. MI prowadzi średnio do niższych opóźnień między dniem 3 a 6, podczas gdy wyższe średnie opóźnienie pojawia się między dniem 7 a 12. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Wiek (dni)Liczba zbiorów danychLLE (1/s)Odchylenie standardowe średniej (1/s)
3111.140.02
4151.200.03
5131.340.03
6111.230.02
7101.160.03
8121.130.02
9121.070.02
1091.000.03
1190.960.03
1290.920.02

Tabela 1: Liczba zbiorów danych i średnia LLE dla każdego dnia badania wiekowego. LLE są zgodne z wcześniejszymi danymi zebranymi przez DOD i pokazują rosnącą, a następnie malejącą trajektorię krzywej Moore'a na Rysunku 7. Zebrano 9-15 zbiorów danych na każdy dzień danych. Zbiory danych spadały wraz z wiekiem robaków ze względu na charakter degradacji mięśni i spadku nerwów, co powodowało zmniejszoną lokomocję.

Dyskusja

Kategoryzowaliśmy lokomocję C. elegans, analizując LLE w różnych wiekach, wspierając parametry takie jak częstotliwość pływania, wzajemna informacja (MI) oraz fałszywi najbliżsi sąsiedzi (FNN) – każdy z nich dostarcza dodatkowego wglądu w właściwości dynamiczne systemu. Deterministyczne i nieliniowe właściwości tego systemu badane są za pomocą metod danych zastępczych oraz wykresów rekurencji36.

Wykorzystanie DOD do ilościowego określenia wpływu starzenia się na lokomocję jest techniką uzupełniającą tradycyjną mikroskopię. Nie zastępuje to wizualnej inspekcji mikroskopijnych gatunków; Zapewnia spójny i efektywny sposób ilościowego określania lokomocji wykraczającej poza tradycyjne techniki. Ponieważ DOD omija analizę wideo, część obciążenia obliczeniowego jest z natury zarządzana przez technikę optyczną, ponieważ dyfrakcja bezpośrednio odwzorowuje rozkład intensywności na przestrzeń Fouriera. Superpozycja pola optycznego podczas dyfrakcji śledzi cały mikroskopijny gatunek gatunkowy. Idealnie rozdzielczość jest regulowana przez długość fali λ użytego światła, w tym przypadku 632 nm. Nawet przesunięcie o ułamek długości fali spowoduje zmianę intensywności. Z tego powodu rozdzielczość zależy od zasięgu i rozdzielczości fotodetektora oraz mocy lasera. Na przykład, jeśli detektor wykrywa sygnał szeregu czasowego, który waha się między dwoma napięciami, Vmin i Vmax, a rozdzielczość wynosi n bitów (patrz krok protokołu 2.4), to maksymalna rozdzielczość wynosi λ/n, czyli w naszym przypadku 632 nm/12. Teoretycznie metoda ta może być stosowana do każdego ciała, które zmienia swój kształt; jednak DOD jest szczególnie dobrze przystosowany do gatunków mikroskopijnych, ponieważ tanie lasery o odpowiednich długościach fal są łatwo dostępne i opłacalne.

Aby zapewnić wyraźny i spójny wzór dyfrakcyjny, robaka należy dokładnie śledzić i utrzymywać w centrum wiązki lasera podczas pływania. Jeśli robak wyjdzie z ustawienia, sygnał może się pogorszyć lub całkowicie utracić. Aby złagodzić problemy nasycenia fotodiodami i zmniejszyć szum stochastyczny, stosuje się filtr neutralnej gęstości, który osłabia intensywność lasera. To filtrowanie pomaga utrzymać zakres dynamiczny fotodiody i zapobiega przesyceniu w zarejestrowanym szeregu czasowym. Niemniej jednak, wszelkie segmenty danych wykazujące nadmierne nasycenie lub niskie stosunki sygnału do szumu są wyłączane z końcowej analizy, aby utrzymać jakość danych.

Dryf częstotliwości pływania tworzy ciągłe spektrum częstotliwości, które jest ustalonym wczesnym markerem chaosu13. Odwrotna zależność między średnią częstotliwością a MI sugeruje, że około 1/8 cyklu rozstrzyga trajektorię z wystarczającą dokładnością, aby oszacować LLE, podobnie jak rozdzielczość wymagana do analizy przebiegu sinusoidalnego.

Niski odsetek FNN wokół wymiarów osadzenia 3 i 4 na Rysunku 6 sugeruje niski poziom szumów zarówno w ruchu C. elegans, jak i w systemie optycznym. Jednak u 12-dniowych robaków odsetek FNN nieznacznie wzrasta, ale pozostaje znacznie poniżej 5%, niekoniecznie z powodu wzrostu prawdziwego wymiaru osadzenia, lecz prawdopodobnie ze względu na wzrost szumu w sygnale lokomotorycznym, przypisywany degradacji nerwowej u starzejących się organizmów34,37.

Zmiany w LLE w trakcie rozwoju pokazują, że stopień chaosu w lokomocji zmienia się wraz z wiekiem, co bardzo odpowiada przewidywaniom z równania Moore'a. Szczyt LLE we wczesnym okresie życia jest zgodny z cechami gatunków wybranych R, takich jak C. elegans, które muszą szybko rozwijać funkcje neuromięśniowe bez opieki rodzicielskiej. Co istotne, 70% długodystansowych połączeń neuronalnych powstaje, gdy robak osiąga zaledwie 20% dorosłego rozmiaru37,38. Natomiast gatunki wyselekcjonowane przez K, takie jak ludzie, wykazują wolniejszy rozwój neurologiczny, wspierany przez zaangażowanie rodzicielskie, co skutkuje opóźnionymi, ale bardziej złożonymi wzorcami ruchowymi. Różnice te odzwierciedlają się w czasie szczytowego LLE między gatunkami.

Krótki cykl życiowy C. elegans, około 14 dni, z szybkim rozwojem w ciągu pierwszych dwóch dni w czterech stadium larwalnych2, czyni go szczególnie odpowiednim do badania szczytowej złożoności w lokomocji. Podczas gdy wcześniejsze badania koncentrowały się na spadku struktury neuronów, aby wyjaśnić zmiany w lokomocji związane z wiekiem34,39, nasze badania łączą te fizyczne zmiany z chaotyczną dynamiką systemu. Integracja DOD z dynamiką nieliniową umożliwia precyzyjną ilościową charakterystykę na wielu skalach długości, oferując nowe wglądy w neuronalne czynniki napędzające zachowania. Stale pozytywny LLE na różnych etapach rozwoju silnie wspiera obecność chaotycznych zachowań w układzie lokomotorycznym.

Badanie to oferuje nowatorskie ramy metodologiczne do badania zmian zachowań związanych z wiekiem u C. elegans, poszerzając tym samym obecne rozumienie biologicznych i dynamicznych korelatów spadku ruchu. Dodatkowo potwierdza zastosowanie LLE jako wrażliwego biomarkera dla zmian neurologicznych związanych z wiekiem i wykazuje, że LLE jest wiarygodnym ilościowym wskaźnikiem dynamiki lokomotorycznej wpływającej na starzenie się.

DOD to potężna, nieinwazyjna metoda ilościowego określania lokomocji i chaosu u organizmów mikroskopijnych, najlepiej postrzegana jako uzupełnienie analizy wideo, a nie jej zamiennik. W obecnej wersji eksperymentu wymaga, aby nicienie miały co najmniej trzy dni, ponieważ młodsze robaki są zbyt małe, by dostarczać wiarygodne sygnały dyfrakcyjne. Jednowymiarowy szereg czasowy wyodrębniony z pojedynczego punktu w wzorze dyfrakcyjnym nieuchronnie kompresuje informacje przestrzenne, co może zaciemniać lokalną dynamikę na całym ciele organizmu. Podejścia wielokanałowe pomagają złagodzić to ograniczenie, weryfikując spójność parametrów w całym polu dyfrakcyjnym, choć subtelne heterogeniczności przestrzenne mogą być nadal pomijane. Dokładne oszacowanie LLE zależy dodatkowo od uzyskania wystarczająco długich, wolnych od szumów szeregów czasowych; praktyczne wyzwania, takie jak ruch robaka poza wiązką czy wahania środowiskowe, mogą obniżyć jakość danych i zmniejszyć zaufanie do wartości LLE. Jak we wszystkich metodach eksperymentalnych, szum pomiarowy i subiektywne decyzje podczas dopasowania LLE wprowadzają dodatkową niepewność, która dla pojedynczych pomiarów zazwyczaj utrzymuje się w okolicach 15%.

Przyszłe prace będą koncentrować się na pomiarze LLE w różnych warunkach eksperymentalnych, umożliwiając porównania między modelowanymi a mierzonymi LLE. Ułatwi to rozwój predykcyjnych modeli neurologicznych, które mogą pogłębić nasze zrozumienie, jak złożona kontrola ruchowa powstaje i pogarsza się z czasem. Będziemy również kontynuować badanie spójności naszych ustaleń, badając inne metody obliczeniowe, takie jak obliczanie płaszczyzny entropii-złożoności, aby ponownie zweryfikować deterministyczny charakter tego systemu biologicznego40.

Oświadczenia

Autor nie ma nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Vassar College oraz Lucy Maynard Salmon Research Fund za wsparcie finansowe. Dziękujemy również dr Kathleen Susman, dr Juanowi Merlo oraz dr Susannah Zhang za ich wgląd i wsparcie na wszystkich etapach tych badań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2 aluminiowe lusterka z przednią powierzchniąThorlabsPF10-03-F01
Laser HeNe 632 nmNewportLGX1Każdy laser z czerwonym światłem
Pusta miska PetriegoCarolina971632Plastikowe szalki Petriego, do których wlewamy nicienie wzrostowe agaru
Escherichia coli K12, żywy, bakteriofagowy gospodarzCarolina124500Wykorzystywany jako źródło pożywienia dla C. elegans; OD600
Mikroskop Leica S9iLeica MicrosystemsLED2500Mikroskop rozcinający
ZapalniczkaBic LightersKażde narzędzie sterylizujące używane do sterlizacji kilofa przed i po zerwaniu każdego robaka
MATLABMathWorksAlgorytm-Rutyna Rosensteina na forum MATLAB stworzony przez Merve Kizilkaya
Nicienie Growth AgarCarolina173520Przygotowana butelka mediów, 135 mL
FotodiodyThorlabsDET36ADetektor Si o napięciu 350-1100 nm
Picoscope5204Technologia PicoPP376Oscyloskop PC www.picotech.com
Platinum PickWykorzystywany do wyławiania C. elegans; To mały, ręcznie robiony kostek z szklanym elementem trzymanym w ręku i platynową łyżką 
Kwarcowa kuwetaKomórki Starna21/G/5Wypełnione wodą destylowaną, aby umieścić C. elegans w środku

Bibliografia

  1. Zhen, M., Samuel, A. D. C. elegans locomotion: small circuits, complex functions. Curr Opin Neurobiol. 33, 117-126 (2015).
  2. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , http://www.wormbook.org (2015).
  3. Gjorgjieva, J., Biron, D., Haspel, G. Neurobiology of Caenorhabditis elegans locomotion: where do we stand. Bioscience. 64 (6), 476-486 (2014).
  4. Boyle, J. H. C. elegans locomotion: an integrated approach. , https://core.ac.uk/download/pdf/43059.pdf (2009).
  5. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20982-20987 (2008).
  6. Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans. J Exp Biol. 210 (13), 2383-2389 (2007).
  7. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), e198(2008).
  8. Barbulescu, R., Mestre, G., Oliveira, A. L., Silveira, L. M. Learning the dynamics of realistic models of C. elegans nervous system with recurrent neural networks. Sci Rep. 13 (1), 467(2023).
  9. Sarma, G. P., et al. OpenWorm: overview and recent advances in integrative biological simulation of Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1758), 20170382(2018).
  10. Zanetti, R. F., Canavan, K. L., Zhang, S. G., Magnes, J. Multichannel measurements of C. elegans largest Lyapunov exponents using optical diffraction. Appl Opt. 62 (29), 7812-7818 (2023).
  11. Magnes, J., et al. Live C. elegans diffraction at a single point. Open J Biophys. 8, 155-162 (2018).
  12. Lorenz, E. N. The predictability of hydrodynamic flow. Trans N Y Acad Sci Ser II. 25 (4), 409-432 (1963).
  13. Magnes, J., et al. Chaotic markers in dynamic diffraction. Appl Opt. 59 (22), 6642-6650 (2020).
  14. Strogatz, S. H. Nonlinear dynamics and chaos: with applications to physics, biology, chemistry, and engineering. , Westview Press. Boulder, CO. (2001).
  15. Nolte, D. D. Introduction to modern dynamics: chaos, networks, space and time. , Oxford University Press. Oxford. (2015).
  16. Takens, F. Detecting strange attractors in turbulence. , Springer. Berlin. (1981).
  17. Murakami, H., et al. Manipulation of serotonin signal suppresses early phase of behavioral aging in Caenorhabditis elegans. Neurobiol Aging. 29 (7), 1093-1100 (2008).
  18. Marck, A., et al. Age-related changes in locomotor performance reveal a similar pattern for Caenorhabditis elegans, Mus domesticus, Canis familiaris, Equus caballus, and Homo sapiens. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 72 (4), 455-463 (2017).
  19. Cohen, N., Sanders, T. Nematode locomotion: dissecting the neuronal-environmental loop. Curr Opin Neurobiol. 25, 99-106 (2014).
  20. Moore, D. H. A study of age group track and field records to relate age and running speed. Nature. 253 (5489), 264-265 (2020).
  21. Varier, S., Kaiser, M. Evolution and development of brain networks: from Caenorhabditis elegans to Homo sapiens. Network. 22 (1-4), 143-147 (2011).
  22. Magnes, J., Susman, K., Eells, R. Quantitative locomotion study of freely swimming micro-organisms using laser diffraction. J Vis Exp. (68), e4412(2012).
  23. Tzepos, D., Trader, O., Magnes, J. 16th Chaotic Modeling and Simulation International Conference, , https://link.springer.com/book/10.1007/978-3-031-60907-7 (2024).
  24. Fraser, A., Swinney, H. Independent coordinates for strange attractors from mutual information. Phys Rev A. 33, 1134-1140 (1986).
  25. Starmer, J. The StatQuest illustrated guide to machine learning!!!: triple bam. , StatQuest Publications. (2022).
  26. Kizilkaya, M. MATLAB routine. , https://www.mathworks.com/matlabcentral (2020).
  27. Abarbanel, H. D. I., Kennel, M. B. Local false nearest neighbors and dynamical dimensions from observed chaotic data. Phys Rev E. 47, 3057-3068 (1993).
  28. Kizilkaya, M. False nearest neighbor algorithm. , https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/37239-minimum-embedding-dimension (2020).
  29. Rosenstein, M. T., Collins, J. J., De Luca, C. J. A practical method for calculating largest Lyapunov exponents from small data sets. Physica D. 65 (1-2), 117-134 (1993).
  30. Kizilkaya, M. Largest Lyapunov exponent with Rosenstein's algorithm. , https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/38424-largest-lyapunov-exponent-with-rosenstein-s-algorithm (2020).
  31. Liu, J., et al. Functional aging in the nervous system contributes to age-dependent motor activity decline in C. elegans. Cell Metab. 18 (3), 392-402 (2013).
  32. Zhang, S. G., Singhvi, A., Susman, K. M., Hastings, H. M., Magnes, J. Dynamic markers for chaotic motion in C. elegans. Nonlinear Dyn Psychol Life Sci. 26 (1), 21-43 (2022).
  33. Giordano, N. J., Nakanishi, H. Computational physics. , Upper Saddle River, NJ. (2006).
  34. Olsen, A., Vantipalli, M. C., Lithgow, G. J. Using Caenorhabditis elegans as a model for aging and age-related diseases. Ann N Y Acad Sci. 1067 (1), 120-128 (2006).
  35. Ahamed, T., Costa, A. C., Stephens, G. J. Capturing the continuous complexity of behaviour in Caenorhabditis elegans. Nat Phys. 17 (2), 275-283 (2021).
  36. Zhang, S. G., Singhvi, A., Susman, K. M., Hastings, H. M., Magnes, J. Dynamic markers for chaotic motion in C. elegans. Nonlinear Dyn Psychol Life Sci. 26 (1), 21-43 (2022).
  37. Kennel, M., Brown, R., Abarbanel, H. Determining embedding dimension for phase-space reconstruction using a geometrical construction. Phys Rev A. 45, 3403-3411 (1992).
  38. Varier, S., Kaiser, M. Evolution and development of brain networks: from Caenorhabditis elegans to Homo sapiens. Network. 22 (1-4), 143-147 (2011).
  39. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419, 808-814 (2002).
  40. Rosso, O. A., Larrondo, H. A., Martin, M. T., Plastino, A., Fuentes, M. A. Distinguishing noise from chaos. Phys Rev Lett. 99 (15), 154102(2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dynamika lokomocjidynamiczna dyfrakcja optycznalokomocja zale na od wiekuanaliza obwod w neuronalnychsynchronizacja nicienianaliza wzorca dyfrakcyjnegozanurzenie w przestrzeni fazowejcz stotliwo p ywania
Wiekowa dynamika lokomocji u Caenorhabditis elegans: analiza wykładnika Lyapunova
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.