Opracowywanie lekoopornych linii komórkowych do procedur eksperymentalnych

Podsumowanie

Lekooporne linie komórkowe umożliwiają zrozumienie mechanizmów oporności na leczenie i niekliniczną ocenę nowych związków, leków o zmienionym przeznaczeniu i terapii skojarzonych. W artykule przedstawiono protokół tworzenia opornych linii komórkowych poprzez wystawienie macierzystych linii komórkowych na stopniowy wzrost stężenia leku docelowego.

Streszczenie

Rozwój linii komórkowych opornych na leki jest niezbędny do zrozumienia mechanizmów oporności na leki i identyfikacji strategii przezwyciężenia niepowodzenia leczenia w terapii raka. Modele oporności umożliwiają przedkliniczną ocenę nowych związków, leków o zmienionym przeznaczeniu i terapii skojarzonych. Aby wytworzyć oporne komórki, rodzicielskie linie komórkowe raka są wielokrotnie wystawiane na stopniowo rosnące stężenia docelowego leku przez kilka tygodni. Komórki, które przeżywają i namnażają się na każdym etapie, są selekcjonowane, namnażane i wystawiane na działanie wyższych dawek leków. Rozwój oporności potwierdza się poprzez ilościowe określenie i porównanie wartości połowy maksymalnego stężenia hamującego (IC₅₀) między komórkami rodzicielskimi i opornymi za pomocą testów żywotności komórek i analizy regresji nieliniowej. Znacznie podwyższone wartości IC₅₀ wskazują na pomyślną adaptację do ciśnienia leku i rozwój oporności. Te oporne na leki linie komórkowe są dostępne do kompleksowych analiz, takich jak sekwencjonowanie mikromacierzy i pojedynczych komórek, a także różne eksperymenty in vitro lub in vivo. Modele te dostarczają cennych narzędzi do badania potencjalnych strategii terapeutycznych w celu przezwyciężenia oporności na leki.

Wprowadzenie

Chemioterapia jest najczęściej stosowaną opcją leczenia miejscowych nowotworów, które nie są podatne na operację lub radioterapię, lub nowotworów z przerzutami. Leki ukierunkowane molekularnie i chemioterapia są stosowane jako leczenie pierwszego rzutu w wielu nowotworach złośliwych, a ich skuteczność jest powszechnie uznawana. Niektóre nowotwory wykazują oporność na niektóre leki od początku leczenia, co sprawia, że leczenie jest nieskuteczne. Jednak w częstszych przypadkach leczenie, które początkowo było skuteczne, staje się nieskuteczne ze względu na rozwój oporności na leki, co prowadzi do progresji raka.

Oporność na leki jest spowodowana zarówno mutacjami genetycznymi, jak i reakcją epigenetyczną w komórkach nowotworowych, które wywołują ekspresję produktów genowych, które unikają leków lub wspomagają wzrost komórek^1,2. Co więcej, w wielu przypadkach oporność ta ewoluuje w oporność wielolekową, w której komórka nowotworowa staje się oporna na wiele leków^3,4. Dlatego identyfikacja mechanizmów oporności na leki i opracowanie strategii jej przezwyciężenia są niezwykle ważne dla postępu w leczeniu nowotworów.

Lekooporne linie komórkowe są często używanymi modelami do badania mechanizmów oporności terapeutycznej i odgrywają ważną rolę zarówno w eksperymentach in vitro, jak i in vivo⁵. Modele te są niezbędnymi narzędziami do głębszego zrozumienia szlaków działania leków, identyfikacji biomarkerów wpływających na skuteczność terapeutyczną oraz znalezienia strategii terapeutycznych hamujących powstawanie oporności na leki. Podstawowym procesem tworzenia lekoopornej linii komórkowej jest wywołanie oporności poprzez wystawienie linii komórkowej na rosnące poziomy docelowego leku^3,6.

Użyte stężenie i czas ekspozycji na lek są kluczowymi składnikami tego procesu. Na każdym poziomie stężenia podzbiór komórek, które przeżyły, jest amplifikowany, a następnie poddawany działaniu następnego stężenia leku w powtarzalny sposób. Ostatecznie uzyskuje się lekooporną linię komórkową, która ma zwiększone o połowę maksymalne stężenie hamujące (IC₅₀) dla leku w porównaniu z macierzystą linią komórkową. Niniejszy raport szczegółowo opisuje procedurę generowania linii komórkowej opornej na paklitaksel (DU145-TxR) z ludzkiej linii komórkowej raka prostaty DU145, przy użyciu metody krokowej z przerywaną ekspozycją na lek.

Protokół

1. Hodowla komórkowa i testy żywotności komórek

UWAGA: Paklitaksel jest lekiem przeciwnowotworowym i jest cytotoksyczny. Podczas obchodzenia się z nim noś fartuch, okulary i rękawice oraz pracuj w szafie bezpieczeństwa, aby zapobiec wdychaniu do organizmu. DMSO nie jest wysoce cytotoksyczny, ale gdy dochodzi do kontaktu ze skórą lub błonami śluzowymi, przepuszczalność rozpuszczonych leków wzrasta, więc podczas obchodzenia się z nim należy nosić fartuch, okulary i rękawice.

1. Hodowla komórek DU-145 w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej przy użyciu kompletnej pożywki (RPMI-1640 + 1% penicylina-streptomycyna [pen-strep] + 10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS]) w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ aż do 80% zlewu.
2. Odessać pożywkę hodowlaną, przemyć DPBS, dodać 0,05% trypsyny i pozostawić w inkubatorze na 5 minut.
3. Po stuknięciu i potwierdzeniu pod mikroskopem, że komórki są odłączone od płytki i pływają, dodaj 1 ml kompletnej pożywki, aby zatrzymać działanie trypsyny.
4. Policz liczbę komórek i zasiaj je w gęstości 1,0 ×^{10 4}/99 μl na studzienkę w kompletnym podłożu w każdym dołku na 96-dołkowej płytce. Inkubować przez 2 godziny, aby komórki przylgnęły do dna płytki. Komórki należy posiać w trzech lub czterech powtórzeniach dla każdej grupy badanej.
5. Dostosuj paklitaksel i DMSO, które mają być dodane do każdej studzienki. Upewnij się, że ilość DMSO dodawana do każdej studzienki jest taka sama, a końcowe stężenie DMSO nie przekracza 1%.
   1. Aby to zrobić i postępować zgodnie z naszym protokołem, zacznij od 10 mM paklitakselu w DMSO i dodaj 87,2 μl DMSO do 12,8 μl tego leku w probówce, aby uzyskać 100 μl paklitakselu w 1,280 μM.
   2. Przenieść 50 μl tego roztworu do innej probówki i rozcieńczyć go do połowy objętości za pomocą 50 μl DMSO (640 μM).
   3. Powtórzyć tę procedurę, aby przeprowadzić seryjne rozcieńczanie i przygotować roztwory paklitakselu w stężeniach 0 (tylko DMSO), 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 i 1,280 μM.
      UWAGA: Paklitaksel rozcieńczony DMSO powinien być przechowywany w stanie zamrożonym do ponownego użycia w kolejnych eksperymentach (w celu zminimalizowania cykli zamrażania i rozmrażania, przechowywać w porcjach).
6. Rozcieńczyć 1 μl przygotowanego wcześniej roztworu paklitakselu 9 μl kompletnej pożywki w oddzielnej probówce i dodać 1 μl tego roztworu do każdej studzienki 2 godziny po wysianiu komórek. Stężenia paklitakselu w każdym studzience wynoszą 0, 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 i 1280 nM, przy czym każda studzienka zawiera 100 μl pożywki.
   UWAGA: Podczas ustawiania stężenia leków stosowanych w testach żywotności komórek, sprawdź wartości IC₅₀ opublikowane w poprzednich pracach i upewnij się, że stężenie mieści się w zakresie³. Stężenie DMSO w każdym dołku wynosiło 0,1% w całym odwiercie (mniej niż 1% jest pożądane).
7. Inkubować przez 48 godzin. Dodać 10 μl odczynnika do proliferacji komórek WST-1 do każdego dołka (100 μl pożywki hodowlanej) i inkubować przez dodatkowe 0,5 do 4,0 h.
   UWAGA: Optymalny czas inkubacji zależy od linii komórkowej i gęstości komórek. W tym badaniu hodowaliśmy komórki przez około 1,5 godziny. Jeśli czas inkubacji jest zbyt krótki lub zbyt długi, absorbancja każdej studzienki będzie zbyt niska lub zbyt wysoka w następnym kroku. W rezultacie nie będzie możliwe potwierdzenie różnicy w żywotności komórek. Tak więc, do wstępnych testów, należy przetestować kilka czasów inkubacji, aby potwierdzić odpowiedni czas inkubacji.
8. Zmierzyć absorbancję WST-1 za pomocą czytnika mikropłytek.
   UWAGA: Docelowa absorbancja wynosi 450 nm (zalecane jest 420-480 nm), a absorbancja tła wynosi 650 nm (zalecana jest 600 nm lub wyższa).

2. Obliczanie żywotności komórek i wartości połowy maksymalnego stężenia hamującego (IC₅₀)

1. Oblicz żywotność komórek na podstawie absorbancji. Absorbancja: (A450nm-A650nm).
   Żywotność komórki (%) = [(As-Ab)/(Ac-Ab)] × 100
   Jako: absorbancja próbki (komórki poddane działaniu leku)
   Ab: absorbancja ślepej próby (tylko pożywka, bez komórek)
   Ac: kontroluj absorbancję (komórki nieleczone lekiem)
2. Podsumuj żywotność komórki obliczoną w poprzedniej sekcji w oprogramowaniu arkusza kalkulacyjnego.
3. Oblicz i zapisz IC₅₀ dla komórek rodzicielskich za pomocą analizy regresji nieliniowej.
   UWAGA: Czteroparametrowy model logistyczny (4PL) jest często odpowiednią metodą obliczeniową. Dostępne są narzędzia obliczeniowe IC₅₀ online⁷. Jednak model 4PL nie powinien być stosowany, gdy skuteczność związku wykracza poza zakres stężeń, a dane nie mogą w pełni reprezentować dolnej i górnej asymptoty krzywej esicy.
   1. Aby uniknąć takiego wzrostu, zmierz żywotność komórek w jak największej liczbie punktów stężenia. Jeśli nie można uzyskać krzywej sigmoidalnej, należy użyć trybu dwu- lub trzyparametrowego ze stałymi wartościami minimalnymi i maksymalnymi⁷.
   2. Jeśli nie korzystasz z oprogramowania obliczeniowego lub statystycznego, w tym tych dostępnych w Internecie, użyj następującego wzoru:
      IC₅₀=((50-C)(B-A) + A(D-C))/(D-C)
      A: Najniższa wartość spośród stężeń leku mierzonych przy żywotności komórek ≤50%
      B: Najwyższa wartość spośród stężeń leków mierzonych przy żywotności komórek >50%
      C: Żywotność komórek w B
      D: Żywotność komórek w A
      UWAGA: Ta formuła zakłada, że wykres między dwoma punktami mieszczącymi wartość IC₅₀ jest linią prostą.

3. Ekspozycja na narkotyki

UWAGA: Przegląd procedur opisanych w tej sekcji jest pokazany w Rysunek 1.

1. Nasiona komórek rodzicielskich na płytkach do hodowli komórkowych (2,0 × 10⁶ komórek/szalkę na szalki 100 mm).
2. Dodaj paklitaksel w stężeniu hamującym żywotność komórek ~10-20% (IC_10-20, w tym przypadku ~0,5 nM) do pożywki i hoduj w inkubatorze przez 2 dni.
3. Zastąp pożywką wolną od paklitakselu i inkubuj przez kilka dni.
4. Gdy komórki wyrosną i staną się w 80% zlewne, przejdź je do nowej płytki do hodowli komórkowej. Kriokonserwacja pozostałych komórek.
5. Dodać paklitaksel do przepuszczonych komórek w stężeniu ~1,5-2,0-krotność stężenia początkowego (0,75-1 nM). Inkubować w inkubatorze przez 2 dni.
6. Zastąp pożywką wolną od paklitakselu i inkubuj przez kilka dni.
7. Jeśli komórki rosną podobnie, powtórz kroki 3.4-3.6, zwiększając stężenie ekspozycji na paklitaksel krok po kroku.
   UWAGA: Wzrost stężenia leku (1,5-2,0-krotnie) może być dowolnie ustawiony przez eksperymentatora i eksperyment należy powtórzyć przy tym stężeniu. Zalecamy zamrażanie i przechowywanie komórek za każdym razem, gdy stężenie leku wzrasta. Jeśli stężenie paklitakselu będzie nadal rosło, proliferacja komórek może nie zostać przywrócona, a komórki mogą umrzeć. W takich przypadkach należy rozmrozić komórki, które namnażały się w stężeniu przed śmiercią, zmniejszyć wzrost paklitakselu do 1,1-1,5 razy (zaleca się 1,2 razy) i powtórzyć hodowlę.
8. Stopniowo zwiększaj oporność linii komórkowej na lek, a następnie oblicz i zapisz IC₅₀ za pomocą WST-1 i oprogramowania, jak opisano w sekcji 2.
   UWAGA: Jeśli zaobserwuje się wzrost IC₅₀ co najmniej 3-5-krotny, można stwierdzić, że szczep jest lekooporną linią komórkową.

4. Utrzymanie oporności na leki

1. Aby utrzymać oporny fenotyp lekoopornej linii komórkowej, inkubuj ze stężeniem leku IC_10-20,
   UWAGA: Zaleca się, aby IC₅₀ w teście przeżycia komórki był mierzony okresowo, ponieważ oporność na leki może ulec zmianie.

Wyniki

Stosując tę metodę, poświęciliśmy wcześniej 9 miesięcy na pomyślne wygenerowanie opornych na paklitaksel komórek DU145 (DU145-TxR). Wyniki analizy żywotności komórek wykazały, że wartość IC₅₀ paklitakselu dla rodzimej linii komórkowej DU145 wynosiła 1,1 nM, podczas gdy wartość IC₅₀ dla DU145-TxR była 149,6x wyższa niż w przypadku linii rodzimej (IC₅₀: 164,6 nM) (Tabela 1 i Rycina 2). Wynik ten wskazuje, że linia DU145-TxR nabyła bardzo wysoką...

Dyskusja

Rozwój lekoopornych linii komórek nowotworowych jest uznaną metodą badania toksyczności leków i mechanizmów oporności, ale pierwszym wyzwaniem, przed którym stoją naukowcy, jest wybór odpowiedniego modelu wyrażania oporności. Powszechną metodą tworzenia lekoopornych linii komórkowych in vitro jest wystawienie linii komórkowej na działanie leku docelowego, ale konieczne jest rozważenie, w jaki sposób ustawić stężenie ekspozycji (krok lub wszystkie naraz) i czy ustawić okres wolny od leku (pulsacyjny czy ciągły).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,05% Trypsyna-EDTA	Gibco	25300-054
10 ml Jednorazowa pipeta serologiczna	Fisher scientific	13-678-11E
Miska 100 mm	Corning	353003
15 ml rurka stożkowa	Corning	352097
2,0 ml Fiolki kriogeniczne	Corning	431386
96-dołkowa płytka	do hodowli komórkowychCorning	353072
Szkiełko komory do liczenia komórek	Invitrogen	C10228
Odczynnik do proliferacji komórek WST-1	Sigma	5015944001
Wirówka 5702 R	eppendorf
niezliczone II	Invitrogen		Licznik komórek
Dimetylosulfotlenek	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	D4W2J
DU145	ATCC	HTB-81	Linia komórkowa raka prostaty
EVOS FLc	Thermo Fisher Naukowy		cyfrowy mikroskop odwrócony
FBS	Gibco	A5670701
Paclitaxel	Selleck	S1150
Penicylina– streptomycyna	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-093
Synergy H1	BioTek Microplate		Reader
Trypan Blue roztwór 0,4%	Invitrogen	15250061