Uzyskanie wysokiej jakości zbierania danych tomograficznych za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego 200 kV z systemem soczewek z podwójnym kondensatorem

Summary

Tomografia elektronowa umożliwia obrazowanie organelli, komórek i makrocząsteczek na poziomie atomowym w tkankach w próbkach kriobiologicznych. Osiągnięcie takiej rozdzielczości wymaga ściśle kontrolowanych warunków obrazowania. Tutaj, używając transmisyjnego mikroskopu elektronowego 200 kV z dwustopniowym systemem soczewki kondensacyjnej jako przykład, opisujemy, jak przeprowadzić wysokiej jakości zbieranie danych z tomografii elektronowej.

Abstract

Krio-elektronowa tomografia (cryo-ET) stała się potężną techniką wyjaśniania struktur organelli komórkowych i dużych kompleksów białkowych w ich naturalnych środowiskach. W przeciwieństwie do konwencjonalnej mikroskopii elektronowej w temperaturze pokojowej, kriogeniczna elektrotechnika minimalizuje uszkodzenia struktur wewnętrznych wywołane promieniowaniem i przygotowaniem. Ponadto, w przeciwieństwie do analizy pojedynczych cząstek (SPA), kriogeni-ET zmniejsza potrzebę powtarzalnego oczyszczania, zachowując tym samym najbardziej autentyczne informacje strukturalne o próbkach. Aby osiągnąć obrazowanie o wysokiej rozdzielczości, krio-ET nakłada również rygorystyczne wymagania dotyczące warunków obrazowania TEM. Pomimo ciągłego doskonalenia efektywności pozyskiwania danych krio-ET oraz pojawiania się licznych platform programistycznych, większość rozwiązań jest zastrzeżona, specyficzna dla dostawców i ściśle powiązana z niektórymi modelami mikroskopu elektronowego, co prowadzi do wysokich kosztów wdrożenia. W tym badaniu zainstalowaliśmy otwartoźródłowe oprogramowanie SerialEM na mikroskopie elektronowym 200 kV (Glacios 2 cryo-TEM) z systemem soczewek z podwójnym kondensatorem i przeprowadziliśmy kompleksowe kalibracje, aby umożliwić wysokiej jakości akwizycję danych tomograficznych. Wykorzystując apoferrytynę jako próbkę modelową, opisujemy cały proces pracy – od przygotowania próbki krio-kriogenicznej po automatyczne zbieranie danych krio-ET, a następnie rekonstrukcję tomogramu i analizę subtomogramów. Ta metoda oferuje opłacalne i dostępne rozwiązanie do zbierania danych krio-ET, szczególnie dla laboratoriów korzystających z mikroskopów Glacios bez dostępu do oprogramowania własnościowego.

Introduction

Krio-elektronowa tomografia (cryo-ET) stała się potężną techniką badania rodzimych struktur makrocząsteczkowych kompleksów i organelli komórkowych in situ. Główną zaletą krio-ET w porównaniu z analizą pojedynczych cząstek (SPA) jest jego zdolność do unikania nadmiernych etapów oczyszczania, zachowując tym samym natywny stan docelowych biomolekuł w ich kontekście biologicznym. Obecnie za pomocą krio-ET można badać szerokie spektrum próbek – w tym oczyszczone organelle ^1,2,3,4, arkusze błon komórkowych, kompleksy makrocząsteczkowe⁵, wirusy 6, lamele komórkowe⁷ oraz przekroje tkanek ^8,9,10. Biorąc pod uwagę różnorodność typów próbek i celów eksperymentalnych, strategie zbierania danych znacznie się różnią i muszą być starannie dostosowane zarówno do okazu, jak i do konkretnej konfiguracji instrumentu.

Zbieranie danych jest kluczowym etapem w procesie krio-ET, ponieważ zarówno jakość danych, jak i efektywność akwizycji bezpośrednio wpływają na dalsze procesy oraz ogólny sukces eksperymentalny eksperymentu. Aby sprostać zmieniającym się wymaganiom eksperymentalnym, opracowano kilka platform do zbierania danych. Do najczęściej stosowanych należą komercyjna tomografia oraz oprogramowanie open-source SerialEM 11,12,13. Tomografia oferuje wysoce zintegrowany i przyjazny dla użytkownika interfejs z niską krzywą uczenia się, ale jest mniej elastyczna i wymaga licencji komercyjnej. Dla porównania, SerialEM to darmowy, otwartoźródłowy pakiet wspierający zarówno workflow oparty na graficznym interfejsie użytkownika (GUI), jak i skryptów, zapewniając większą elastyczność i rozszerzalność.

Zbieranie danych tomograficznych z kriogenii stwarza wyjątkowe wyzwania. Wysokiej jakości lamele są trudne do przygotowania, a ich niestabilność mechaniczna i wysoka wrażliwość na napromieniowanie elektronowe dodatkowo komplikują zbieranie danych. Aby sprostać tym wyzwaniom, Fabian Eisenstein opracował workflow PACEtomo¹⁴, ulepszenie SerialEM, które wprowadza przesunięcie wiązki i obrazu w celu uzyskania wielu tomogramów na serię nachylenia, co zmniejsza częstotliwość regulacji ostrości i śledzenia. Ta strategia maksymalizuje ilość użytecznych danych z każdej sekcji, minimalizując jednocześnie niepotrzebną ekspozycję na elektrony. Podobna funkcjonalność jest również dostępna w komercyjnym oprogramowaniu Tomography5.

Natomiast zbieranie danych z organelli lub arkuszy błon związanych z kriogenią jest zazwyczaj prostsze, ponieważ próbki te są zazwyczaj przygotowywane na dziurowych siatkach węglowych, zapewniając dużą przestrzeń do skupienia i śledzenia^15,16. W takich przypadkach wbudowane procesy akwizycji cryo-ET w SerialEM — dostępne bezpośrednio przez interfejs graficzny — oferują wygodną, wolną od skryptów opcję, szczególnie odpowiednią dla początkujących lub mniejszych laboratoriów. Niemniej jednak, z punktu widzenia efektywności, nadal zalecamy strategie oparte na przesunięciu obrazu wiązki, gdy tylko jest to możliwe.

Biorąc pod uwagę wysokie koszty mikroskopów krioelektronowych, optymalizacja strategii zbierania danych w celu maksymalizacji wykorzystania instrumentów jest niezbędna. TEM 200 kV wyposażony w dwustopniowy system soczewek kondensatora oferuje nieco niższe przenikanie elektronów dla grubych próbek niż instrument 300 kV, ale pozostaje w pełni funkcjonalny do krio-ET przy prawidłowej kalibracji. Jednak stosunkowo wąski zakres równoległych warunków wiązki oraz stały rozmiar plamki na powiększeniach sprawiają, że jest on zazwyczaj mniej odpowiedni do krio-ET o wysokiej rozdzielczości, chyba że system jest precyzyjnie optymalizowany.

Nasz zestaw mikroskopii elektronowej wyposażony jest w kamerę Falcon 4i do bezpośredniego wykrywania elektronów, co zapewnia znaczące korzyści w zakresie liczenia pojedynczych elektronów oraz szybkiego ciągłego obrazowania. Aby w pełni wykorzystać wydajność tego detektora, TEM musi być używany w dobrze zoptymalizowanych warunkach obrazowania. Dla TEM wykorzystujących dwustopniowy system kondensatora precyzyjna kalibracja warunków oświetlenia dla światła równoległego jest istotnym czynnikiem poprawiającym jakość obrazowania^17,18. W nowoczesnych systemach dwustopniowych kondensatorów punkt ogniskowy soczewki drugiego stopnia musi pokrywać się z przednią płaszczyzną ogniskowej górnej soczewki obiektywu, aby zapewnić równoległą ścieżkę optyczną przecinającą płaszczyznę próbki. Dokładnie określone warunki równoległego światła są kluczowe dla zapewnienia, że wartości niedoostrości i powiększenie pozostają spójne w lokalnych pozycjach na zebranych obrazach.

W tym badaniu skupiliśmy się na ustanowieniu wysokiej jakości przepływu pracy kriogenicznej ET, wykorzystując apoferrytynę jako próbkę modelową. Ponieważ system transmisyjnego mikroskopu elektronowego 200 kV nie jest licencjonowany na komercyjne oprogramowanie tomografyjne, zainstalowaliśmy i skalibrowaliśmy otwartoźródłową platformę SerialEM. Dzięki starannej optymalizacji parametrów wiązki równoległej dla dwustopniowego systemu soczewek kondensatorowych mikroskopu, osiągnęliśmy automatyczne zbieranie danych tomograficznych za pomocą graficznego interfejsu SerialEM – bez potrzeby stosowania skryptów w Pythonie czy skomplikowanej konfiguracji. Takie podejście zapewnia przyjazne użytkownikowi i opłacalne rozwiązanie do efektywnego pozyskiwania danych krio-ET na instrumentach 200 kV, takich jak Glacios.

Protocol

1. Przygotowanie i załadunek próbek kriogenicznych

1. Aby przygotować Vitrobota, włącz go i ustaw temperaturę na 10 °C. Ustaw wilgotność na 100%. Wymień papier filtracyjny.
2. Umieść siatkę z otworami węglowymi R1.2/1.3 o średnicy 300 otworów węglowych typu quantifoil Cu w systemie wyładowania żarowego. Ustaw warunki wyładowania żaru na 15 mA przez 60 sekund przy ciśnieniu próżniowym 0,39 mBar, ładunek ujemny. Wykonaj wyładowanie świecące, aby hydrofilizować powierzchnię siatki.
3. Ustaw parametry Vitrobota następująco: Czas blot: 3 s, Czas oczekiwania: 0 s, Siła Blot: 2, Temperatura: 8 °C, Wilgotność: 90%.
4. Przygotuj etan, ciekły w kubku etanowym owiniętym ciekłym azotem, chłodząc się ciekłym azotem.
5. Nałóż 3 μL próbki apoferrytyny na siatkę rozładowaną przez świecenie. Natychmiast witrifikuj próbkę w ciekłym etanie
6. Przenieś próbkę z etanu do skrzynki magazynowej schłodzonej ciekłym azotem. Przygotowanie próbki kriogenicznej jest już zakończone.
   UWAGA: Następujące protokoły bezpieczeństwa muszą być ściśle przestrzegane podczas obsługi ciekłego azotu i etanu: Potrzebne są środki ochrony osobistej (np. rękawice kriogeniczne i okulary ochronne), aby zapobiec odmrożeniom podczas operacji; przed kondensacją etanu upewnij się, że kubek odbierający jest wolny od ciekłego azotu, aby uniknąć rozprysku spowodowanego szybkim wrzeniem; Po użyciu należy szczelnie zamknąć główne i regulacyjne zawory systemu gazu etanowego, aby zapobiec wyciekom; resztki etanu i ciekłego azotu muszą być utylizowane w wyznaczonym sprzęcie wentylacyjnym w pomieszczeniu przygotowawczym po przygotowaniu próbki.

2. Określanie równoległych warunków świetlnych dla mikroskopii elektronowej

1. Przed wykonaniem równoległego ustawienia wiązki, najpierw wyreguluj następujące parametry lunety: poziom na wysokości eucentrycznej, obiektyw w ostrości, nachylenie wiązki nP ppX/ppY, punkt obrotu X/Y wolny od śpiączki, śpiączka i stygmatyzacja.
2. Za pomocą siatki krzyżowej potwierdź, że próbka znajduje się na wysokości eucentrycznej i prawidłowo ostra przy powiększeniu SA 73 000× (bez filtra energetycznego) w trybie sondy nano.
3. Przełącz się na tryb dyfrakcyjny (długość aparatu: D750 mm) i włóż przysłonę obiektywu 100 μm (rysunek 1A, 1B).
4. Kliknij zakładkę Adjust dla przysłony obiektywu i użyj wielofunkcyjnych pokręteł X i Y, aby przesunąć przysłonę obiektywu poza środek tak, aby krawędź przysłony zachodziła na złote pierścienie dyfrakcyjne i częściowo zasłaniała centralny punkt (Rysunek 1C).
5. Ustawij tylną płaszczyznę ogniskowej obiektywu, regulując ostrość dyfrakcyjną za pomocą pokrętła Focus, aż krawędź przysłony obiektywu będzie jak najbardziej ostra (Rysunek 1D).
6. Dostosuj natężenie wiązki (siła C2), aż szerokość złotych pierścieni dyfrakcyjnych zostanie zminimalizowana.
7. Wycentruj przysłonę obiektywu. Zwiększ długość kamery dyfrakcyjnej tak, aby widoczna była tylko centralna plamka (rysunek 1E).
8. Kliknij zakładkę Dyfrakcja w panelu Stygmator i użyj wielofunkcyjnych pokręteł X i Y, aby regulować kształt centralnego punktu, jednocześnie przełączając się powyżej i poniżej punktu przejścia, aby wiązka stała się okrągła (rysunek 1F).
9. Dostosuj intensywność wiązki, aż centralny punkt zostanie zminimalizowany. To ustanowi warunki równoległego oświetlenia. Ponieważ warunki równoległego oświetlenia mogą się różnić przy różnych rozmiarach plamek, dokumentuj odpowiednie ustawienia C2 dla każdego często używanego rozmiaru plamki, aby ułatwić szybkie konfigurowanie podczas przyszłych eksperymentów.
   UWAGA: Konkretny rozmiar punktu używany podczas akwizycji zależy od powiększenia i ustawienia przysłony C2; Musimy zadbać o to, by obrazowanie było wykonywane z optymalną dawką dla kamery.

3. Wysokiej jakości zbieranie danych z tomografii elektronowej dla próbek apoferrytyny

UWAGA: Ta sekcja przedstawia ustandaryzowaną procedurę wysokoprzepustowego pozyskiwania danych tomograficznych, odpowiednią zarówno dla doświadczonych użytkowników, jak i nowych badaczy.

1. Aby przyciąć siatkę i załadować przygotowaną próbkę kriogeniczną do mikroskopu elektronowego, umieść pierścień O w narzędziu do wyrównania, a przygotowaną siatkę umieścić w centrum uszczelki O. Użyj sprężynowego pióra, aby przypiąć pierścień C do uszczelki O, mocując próbkę między nimi.
2. Włóż Autogrid pionowo do szczeliny kasety, przenieś go do nanokubka przez stanowisko robocze, a następnie załaduj do mikroskopu elektronowego.
3. Aby uchwycić pełny montaż całej siatki za pomocą SerialEM, uruchom oprogramowanie SerialEM. Włącz tryb niskiej dawki. Zdefiniuj tryb wyszukiwania przy 115× powiększeniu.
   UWAGA: Powiększenie wyszukiwania jest zazwyczaj używane do pozyskiwania map o dużym obszarze. Powiększenie to jest ustawiane na jak najniższym poziomie, aby przyspieszyć proces mapowania, jednocześnie zapewniając dokładność łączenia obrazów.
4. Otwórz plik Nawigatora. Przejdź do Navigatora > montaż i siatki > skonfiguruj pełny montaż. W oknie dialogowym ustaw Użyj trybu wyszukiwania; Zapisz obrazy w formacie Bin4. Kliknij Start w Kontrolach montażu.
5. Aby skalibrować pola wyszukiwania i widoku, w trybie wyszukiwania zlokalizuj wysoce rozpoznawalny punkt orientacyjny (Rysunek 2A). Kliknij Dodaj znacznik w Nawigatorze. Kliknij Przejdź do znacznika , aby przejść do lokalizacji znacznika.
6. Przełącz się w tryb View (2600×) i znajdź ten sam punkt orientacyjny. Kliknij na Landmark. Przejdź do Nawigatora, kliknij Przesuń do znacznika , aby wyrównać pola (Rysunek 2B). Zgodnie z instrukcjami w oknie dialogowym, przesunięcia wiązki z obu powiększeń są przypisywane wszystkim znacznikom na mapie wyszukiwania, a wartości przesunięcia są zapisywane (Rysunek 2C).
   UWAGA: Powiększenie widoku jest zazwyczaj ustawione na najniższe powiększenie wybranego obszaru (SA), aby zapewnić, że zarówno widok, jak i Rejestr są w tym samym trybie, co ułatwia wyśrodkowanie podczas przełączania powiększeń.
7. Do kalibracji pól widoku i zapisu (Rysunek 3). W trybie View znajdź bardzo rozpoznawalny punkt orientacyjny. Przełącz się na tryb Nagrywania (120k×). Użyj myszy, aby wycentrować punkt orientacyjny w trybie Nagrywaj.
   UWAGA: Ustawienie powiększenia Record zależy od szacowanej rozdzielczości docelowej (gdzie rozdzielczość docelowa jest dwukrotnie większa od rozmiaru piksela) oraz rozmiaru próbki.
8. Wróć do trybu View i zrób zdjęcie. Przeciągnij obiekt docelowy pod powiększeniem widoku do krzyża symbolizującego środek pola widzenia za pomocą prawego przycisku myszy.
9. Kliknij Ustaw obok Shift w sekcji Defocus, aby wyrównać pola.
10. Aby wybrać docelowy kwadrat i uchwycić mapę o średnim powiększeniu, 5.1 w pełnym montażu, kliknij Dodaj wielokąt , aby zarysować obszar do uchwycenia. Po zarysowaniu obszaru kliknij Stop Added , aby sfinalizować wybór.
11. Powtórz krok 3.10 dla wszystkich pożądanych obszarów. Dla każdego wielokąta w Nawigatorze sprawdź opcje Zdobyć (A) i Nowy Plik w opcjach Przedmiot.
12. W oknie dialogowym, które pojawi się po zaznaczeniu Nowy Plik w Element, wybierz następujące: Obrazy montażowe; Dopasowywanie montażu do wielokąta; Zamykaj plik, gdy ma zostać otwarty kolejny plik. Kliknij OK.
13. W nowym oknie dialogowym wybierz następującą opcję: Przesuń etap zamiast przesuwać obraz; Używaj parametrów View w trybie niskiej dawki. Zapisz obraz w podanej lokalizacji.
14. Aby uchwycić mapę o średnim powiększeniu, w menu Nawigator kliknij Zdobądź przedmioty. Sprawdź następujące opcje: Pobierz i zapisz obraz lub montaż; Zrób mapę w Nawigatorze.
15. W sekcji Główne Akcje zaznacz tryb Użyj Widoku do robienia zdjęć. W sekcji Zadania przed lub po Podstawowej sprawdź Rough Eucentryczność. Kliknij GO, aby rozpocząć rejestrowanie mapy o średnim powiększeniu.
16. Aby wybrać punkty na mapie średniego powiększenia. Otwórz mapę średniego powiększenia w interfejsie Nawigatora. Kliknij Dodaj punkt i kliknij lewym na obiekty docelowe na mapie.
17. Powtarzaj dla wszystkich pożądanych punktów. Po wybraniu wszystkich punktów kliknij Stop Dodaj (Stop) dodaj , aby sfinalizować wybór.
18. Do wyrównania przysłony użyj bezpośredniego ustawienia w interfejsie mikroskopu, aby dostosować nachylenie wiązki npP ppX/ppY oraz punkt obrotu X/Y bez śpiączki, minimalizując drganie w polu widzenia.
19. Wykonaj tuning scope za pomocą skryptu z biblioteki skryptów SerialEM (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).
20. Aby rozpocząć zbieranie danych tomograficznych, w interfejsie Nawigatora zlokalizuj zwrot z inwestycji i sprawdź serię Tilt. W oknie dialogowym wybierz Klatki Obrazy; Wybierz miejsce przechowywania danych.
21. W oknie ustawień ustaw zakres stopni od -50° do 50°. Ustaw przyrost bazowy na 2,5°, kąt startowy na 0° i włącz schemat symetryczny dawki.
    UWAGA: Ustawienia dawki na pochylenie, zakresu kąta przechylenia i kroku przechylenia zazwyczaj opierają się na zasadach opisanych poniżej: Całkowita dawka utrzymuje się na poziomie około 100 e⁻/Ų. Zakres nachylenia jest wybierany tak, aby nawet przy najwyższym kącie próbka pozostawała w dużej mierze niezakłócona i umożliwiała odpowiednią transmisję i obrazowanie elektronów. Jeśli zakres nachylenia jest stosunkowo duży (np. powyżej ±60°), można ustawić krok nachylenia na 3°. Dla mniejszego zakresu nachylenia (np. około ±50°) krok pochylenia można zmniejszyć do 2,5° lub 2°, aby całkowita dawka pozostawała w okolicach 100 e⁻/Ų. Jest to szczególnie istotne w przypadku mikroskopów 200 kV, gdzie uszkodzenia promieniowania są bardziej widoczne niż w mikroskopach 300 kV, dlatego konieczne jest unikanie nadmiernej całkowitej dawki.
22. W sekcji Intensywność wiązki lub Kontrola ekspozycji zaznacz Zachowaj intensywność wiązki. Ustaw cel Defokus na -3 μm, a częstotliwość autofokusu na raz na pochylenie.
23. Sprawdź Stop, jeśli Autoalign przesuwa się o więcej niż 60% rozmiaru obrazu, ustaw Track Before i after.
24. Aby rozpocząć zbieranie danych, w Navigatorze kliknij Pobierz w Przedmiotach. W akcji głównej sprawdź Cycle defocus target w autofocus, drift wait i TS.
25. Ustaw zakres defokusacji od -3,5 do -4,5 μm, w 4 krokach. W trybie General włącz zawory kolumnowe Zamknij na końcu. W sekcji Zadania przed lub po Głównym włącz Realalignment do pozycji oraz Fine Eucentryczność przed Podstawą.

4. Uśrednianie apoferrytyny subtomogramem

1. Wykonaj korekcję ruchu i estymację CTF przy użyciu Warp¹⁹. Wykonaj tomograficzne wyrównanie serii przechyleń za pomocą AreTomo3²⁰.
2. Wykonaj rekonstrukcję tomograficzną i dekonwolucję za pomocą Warp. Wykonaj pobieranie cząstek na podstawie szablonów za pomocą PyTom²¹.
3. Wykonaj wstępne dopracowanie przy użyciu RELION 5²². Przeprowadzaj dopracowywanie w wysokiej rozdzielczości przy użyciu M²³.
4. Określ ostateczną strukturę poprzez przetwarzanie ośmiu szeregów nachylenia, następnie wybór 5 939 cząstek i iteracyjne dorafinowanie, osiągając ostateczną rozdzielczość 2,8 Å (Rysunek 4).

Results

Po precyzyjnym wyrównaniu wiązki równoległej przeprowadziliśmy zbieranie danych tomograficznych dla apoferrytyny, wykorzystując graficzną funkcję interfejsu SerialEM. Kolejne przetwarzanie z użyciem Warp, AreTomo, PyTom, RELION i innych odpowiednich programów dało ostateczną strukturę o rozdzielczości 2,8 Å. Ta rozdzielczość wystarczająco dobrze pokazuje wysoką jakość naszych danych, osiągając poziom obecnie osiągalny dzięki uśrednianiu subtomogramów w stosunkowo wysokiej rozdzielczości. Jak pokazano na Rysunku 4, wyrównane i zrekonstruowane wyniki (Rysunek 4A) wyraźnie pokazują ogólną architekturę i przestrzenny rozkład apoferrytyny. Uśrednianie subtomogramów wykonano na cząstkach wyodrębnionych z ośmiu wyrównanych i zrekonstruowanych szeregów nachylenia, co dało strukturę o rozdzielczości 2,8 Å (Rysunek 4B). Odpowiadająca krzywa korelacji powłoki Fouriera (FSC) przedstawiona jest na Rysunku 4C.

Rysunek 1: Określenie warunków równoległego oświetlenia przy użyciu drugiego układu soczewek kondensatorowych. (A) Wzór dyfrakcyjny w trybie dyfrakcyjnym bez apertury. (B) Wzór dyfrakcyjny po włożeniu apertury obiektywu 100 μm. (C) Przesunięcie przysłony względem centrum dyfrakcyjnego, aby lepiej wizualizować ostrość krawędzi. (D) Ostrość krawędzi przysłony i zoptymalizowane pierścienie dyfrakcyjne poprzez regulację prądów obiektywu i obiektywu C2. (E) Eliptyczna centralna plamka dyfrakcyjna wymagająca korekty za pomocą panelu stygmatora. (F) Okrągła i zminimalizowana centralna plamka dyfrakcyjna wskazująca optymalne oświetlenie równoległe. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Proces wyrównania z wysokim do niskiego powiększenia od wyszukiwania (115×) do widoku (2600×). (A) Obraz w trybie wyszukiwania z markerem (czerwona strzałka) umieszczonym na krawędzi otworu. (B) Obraz w trybie podglądania z markerem (czerwona strzałka) umieszczonym w tym samym miejscu obiektu co w (A). Opcja Przesuń na Znacznik jest klikana w nawigatorze. (C) W oknie wyskakującym przesunięcia wiązki z obu powiększeń są przypisywane wszystkim znacznikom na mapie wyszukiwania, a wartości przesunięcia są zapisywane. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Proces wyrównywania z wysokim do niskiego powiększenia od widoku (2600×) do zapisu (120k×). (A) W trybie Nagrywaj obiekt docelowy znajduje się w centrum pola widzenia (czerwony przerywany okrąg podkreśla obiekt docelowy). (B) Obraz rejestrowany w trybie widoku, gdzie obiekt docelowy nie jest wyrównany z czerwonym celownikiem (czerwone przerywane koło podkreśla obiekt docelowy i czerwony celownik). (C) Obiekt docelowy jest przeciągany do środka czerwonego celownika przez kliknięcie prawym przyciskiem i przesunięcie, a następnie naciśnięcie przycisku Set znajdującego się obok przycisku Shift (czerwony przerywany ramka podkreśla ten przycisk). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Określenie struktury apoferrytyny. (A) Obrazowanie strukturalne. Lokalna rozdzielczość końcowej średniej subtomogramu. Faktura wydaje się jednolita, z gęsto ułożonymi, powtarzającymi się nanoskalowymi cechami na całym polu widzenia. (B) Przestrzennie rozdzielone mapowanie ilościowe. Fałszywa, okrągła mapa tego samego lub powiązanego obszaru nanostrukturalnego. Kolory wahają się od niebieskiego/zielonego do żółtego/czerwonego, odpowiadając wartościom liczbowym pokazanym na poniższej skali kolorów (około 2,5 do 3,5 w dowolnych jednostkach). Niejednorodny rozkład kolorów wskazuje na zmienność przestrzenną mierzonej właściwości (na przykład wysokość, grubość, współczynnik załamania lub reakcję mechaniczną/optyczną) w całej próbce. (C) Charakterystyka widmowa lub funkcjonalna globalna. Krzywa korelacji powłoki Fouriera (FSC) używana do estymacji rozdzielczości. Ostateczna rozdzielczość 2,8 Å jest oznaczana przez przerywaną linię w FSC = 0,143. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Discussion

Procedury przygotowania próbek kriogenicznych oraz zbierania danych z tomografii elektronowej muszą być dostosowane do konkretnego typu próbki. Opisana tutaj strategia eksperymentalna jest dobrze dostosowana do makrocząsteczek biologicznych, kompleksów białkowych oraz małych organelli. Te próbki mogą być bezpośrednio witryfikowane na siatkach elektromagnetycznych, a ich stosunkowo niewielka grubość zapewnia efektywną transmisję elektronów i pozyskiwanie obrazów o wysokim kontraście. Idealnie grubość próbki nie powinna przekraczać 200 nm.

W przypadku próbek zamrożeniowych zazwyczaj preferuje się boczny wymiar mniejszy niż 10 μm, aby zminimalizować powstawanie krystalicznego lodu, które może naruszać integralność strukturalną. W przypadku większych próbek zamrożenie pod wysokim ciśnieniem lub włączenie krioprotektantów, takich jak glicerol, do buforu może opóźnić nukleację lodu²³. Jednak aby spełnić wymagania dotyczące grubości TEM, często konieczne jest dalsze przecieńczanie. Spośród dostępnych metod przerzedzania, frezowanie wiązką jonów skupionych (FIB)²⁴jest najszerzej stosowane ze względu na precyzję i minimalne uszkodzenia, co pozwala uzyskać lamele odpowiednie do wysokorozdzielczego krio-ET.

Podczas zbierania danych o lamelli kluczowe jest maksymalizowanie jej wykorzystania. Wdrożenie akwizycji przesunięcia wiązki i obrazu może zmniejszyć potrzebę powtarzalnego ostrzenia i śledzenia etapów, zwiększając tym samym przepustowość zbierania danych. Chociaż technika ta nie została tu szczegółowo opisana, została szeroko opisana w metodologii PACEtomo.

Obecnie popularne opcje programowe do zbierania danych tomograficznych to Tomografia (Thermo Fisher Scientific) oraz SerialEM. Tomografia to rozwiązanie komercyjne o ograniczonej elastyczności personalizacji, podczas gdy SerialEM, opracowany przez Davida Mastronarde z University of Colorado Boulder, to oprogramowanie open-source wspierające automatyzację opartą na skryptach. Jednak pełne wykorzystanie możliwości SerialEM wymaga znacznej krzywej uczenia się. W tym badaniu przedstawiamy uprościony workflow, który wykorzystuje GUI SerialEM, eliminując potrzebę skryptowania lub konfiguracji opartych na Pythonie, a jednocześnie umożliwiając bezekranizowane nocne pozyskiwanie danych.

Częstym wyzwaniem podczas pozyskiwania danych tomograficznych tą metodą jest niedokładne śledzenie, które może prowadzić do niepełnego szeregu nachylenia z brakującymi kątami lub utrudniać późniejsze wyrównanie. Aby złagodzić te problemy, parametry śledzenia muszą być optymalizowane pod kątem kontrastu próbki oraz stabilności etapu pochylenia. Skuteczne strategie obejmują regulację czasu ekspozycji na pozycjach śledzenia w celu zapewnienia klarowności obrazu, fizyczne oddzielenie pozycji śledzenia i ostrości w celu zmniejszenia kumulatywnych uszkodzeń promieniowania oraz zmniejszenie powiększenia śledzenia, gdy stabilność etapu jest słaba, aby umożliwić niezawodne dopasowanie wzorców. Łącznie te korekty są niezbędne do osiągnięcia solidnej wydajności śledzenia w różnych warunkach eksperymentalnych. W tej pracy używamy apoferrytyny jako wzorca wzorcowego. Na założeniu testowania i korekcji światła równoległego wykorzystujemy wbudowane funkcje SerialEM do zbierania wysokiej jakości danych dla krio-ET oraz wykonywania obliczeń subtomogramów na próbkach ferrytyny, ostatecznie uzyskując ostateczną strukturę na 2,8 Å.

Metoda ta została opracowana, aby rozszerzyć zastosowanie mikroskopów elektronowych 200 kV dla wysokorozdzielczych krio-ET. Osiągnięcie takiej rozdzielczości zasadniczo zależy od uzyskania wysokiej jakości danych obrazowych, co z kolei wymaga precyzyjnych warunków oświetlenia. W tym celu przeprowadziliśmy precyzyjne wyrównanie równoległego oświetlenia jako kluczowy krok przygotowawczy. Procedura wyrównania opisana tutaj została specjalnie zaprojektowana dla TEM wyposażonych w system soczewek z dwoma skraplaczami, takich jak Thermo Fisher Scientific Talos Arctica i Glacios. W przeciwieństwie do instrumentów z trzecią soczewką kondensatorową (C3), systemy te ograniczają warunek równoległego oświetlenia do jednej, specyficznej wartości wzbudzenia soczewki C2. To wrodzone ograniczenie wymaga wyjątkowo precyzyjnego wyrównania wiązki elektronów, aby umieścić obraz źródłowy w przedniej płaszczyźnie ogniskowej górnej soczewki obiektywu – co jest warunkiem koniecznym dla optymalnej wydajności obrazowania. Nasze późniejsze wyniki przetwarzania danych pokazują, że po tym wyrównaniu jakość pozyskiwania danych osiągnięta tym mikroskopem 200 kV dla testowanych próbek jest niemal porównywalna z tym, czego zwykle oczekuje się od instrumentu 300 kV.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTCryoTM niti grid	Najingdingxin	M04240922A	Wykorzystywane do przygotowania próbek kriogenicznych
apoferrytyna	Biortus	BP17854-00A	Wykorzystywane do przygotowania próbek kriogenicznych
Siatka krzyżowa	Agar Scientific	AGS106	Wykorzystywane do określania równoległych warunków świetlnych
Glacios2	Thermo Fisher	9959084	Wykorzystywane do zbierania danych Tomo
Papier filtracyjny numer 2, 55 mm	Co, człowieku	10311807	Papier do przeciskania
PELCO easiGLOW	TED PELLA	91000-01020	Wykorzystywane do wyładowania żarowego
Siatka Quantifoil Cu	quantifoil	N1-C14nCu30-01	Wykorzystywane do przygotowania próbek kriogenicznych
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher	230101164	Wykorzystywane do przygotowania próbek kriogenicznych