Elastyczna procedura wykonywania telomerów FISH i immunofluorescencji w komórkach wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych

Podsumowanie

Protokół ten opisuje metodę łączenia telomerów FISH (natywnych lub denaturujących) z immunofluorescencją i/lub wizualizacją białka fluorescencyjnego.

Streszczenie

Wizualizacja telomerów za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (TelFISH) od dawna jest niezbędnym narzędziem w eksperymentach biologii telomerów. Połączenie TelFISH z immunofluorescencją (IF) jest również dobrze znaną metodą (IF-TelFISH), na przykład w identyfikacji ognisk wywołanych dysfunkcją telomerów, w których telomery kolokalizują się z 53BP1. Ostatnio natywne telomery FISH (nTelFISH) stały się ważnym narzędziem do oznaczania alternatywnego wydłużania telomerów, mechanizmu utrzymania telomerów stosowanego w niektórych komórkach nowotworowych. Ekspresja białek fluorescencyjnych jest również niezbędnym narzędziem w biologii komórki, umożliwiającym wizualizację białek i struktur, które mogą pozostać niewykrywalne innymi metodami. Ponieważ FISH denaturują białka, przeprowadzenie testu w komórkach z ekspresją białka fluorescencyjnego (FP) powoduje utratę sygnału FP. Opisano tutaj metodę integracji IF i telomerów FISH w komórkach z ekspresyjnym białkiem fluorescencyjnym, które zachowuje sygnał FP nawet po FISH. Przewidziano alternatywy dla denaturacji i natywnych telomerów FISH w połączeniu z kilkoma scenariuszami IF i FP. Podsumowując, protokół ten oferuje elastyczne ramy do badania biologii telomerów zarówno w komórkach normalnych, jak i nowotworowych.

Wprowadzenie

Organizmy z liniowymi chromosomami muszą zmagać się z dwoma problemami. Po pierwsze, ze względu na problem replikacji końcowej, końce chromosomów nieznacznie ulegają erozji za każdym razem, gdy DNA jest replikowane. Po drugie, komórki muszą być w stanie odróżnić naturalne końce DNA od pęknięć DNA. Telomery wyewoluowały jako rozwiązanie tych problemów. Poprzez działanie telomerazy rybonukleoproteinowej chromosomy są wydłużane przez dodanie krótkich powtórzeń tandemowych - TTAGGG u ludzi. Powtórzenia te są wiązane przez kompleks schronienia, który ukrywa koniec chromosomu przed maszynerią naprawy uszkodzeń DNA^{komórkowego 1}. Krótkie lub dysfunkcyjne telomery prowadzą do starzenia się komórek i starzenia się fenotypów², podczas gdy ucieczka przed kryzysem telomerowym jest głównym kamieniem milowym w nowotworzeniu³. Z tych powodów biologia telomerów jest szczególnie interesująca w zrozumieniu ludzkiego zdrowia i chorób.

Fluorescencyjna hybrydyzacja telomerów in situ (FISH) od dawna jest ważną metodą wizualizacji telomerów w komórkach interfazowych lub rozprzestrzenianiu się metafazy⁴. Przez dziesięciolecia telomery FISH były sprzężone z barwieniem immunofluorescencyjnym 53BP1 (IF) w celu identyfikacji ognisk wywołanych dysfunkcją telomerów (TIF), markera dysfunkcyjnych, nieograniczonych telomerów ^5,6. Podobnie, cechą charakterystyczną nowotworów, które wykorzystują alternatywne wydłużanie telomerów (ALT) do utrzymania telomerów, jest powiązanie telomerów z jądrowymi ciałami PML w celu utworzenia ciał PML związanych z ALT lub APB⁷. APB można oznaczyć, łącząc telomery FISH z barwieniem PML IF. W związku z tym projekt IF-FISH jest uznanym narzędziem w biologii telomerów.

W tym przypadku zastosowanie IF-FISH zostało rozszerzone na dwa sposoby. W pierwszej kolejności badanie IF-FISH przeprowadza się na komórkach z ekspresją białek fluorescencyjnych (FP). Ekspresja białek znakowanych fluorescencyjnie stała się wszechobecnym narzędziem w biologii komórki. Ekspresja znakowanego białka może być jedyną opcją wizualizacji białka, dla którego nie istnieją dobre przeciwciała. Na przykład wyrażone chromociało aktyny jądrowej znakowane GFP (nAC-GFP) ujawnia dynamikę aktyny jądrowej⁸. Odczynnik ten otworzył nowe możliwości w eksploracji jądrowej f-aktyny, która kiedyś była uważana za kontrowersyjny temat. Podczas gdy FP, takie jak GFP i mCherry, zazwyczaj utrzymują aktywność fluorescencyjną po utrwaleniu, formamid w hybrydyzacyjnych FISH sprawi, że będą one ciemne⁹. Aby obejść ten problem, protokół ten oferuje innowację w postaci znakowanego fluoroforem "wzmacniacza" anty-FP w drugim etapie barwienia IF. Formamid nie ma wpływu na jasność fluoroforu, co pozwala na IF-FP-FISH.

Po drugie, IF jest wykonywany w połączeniu z Native Telomere FISH (nTelFISH), co jest ważną diagnostyką statusu ALT. W denaturacji FISH należy użyć jakiejś metody, aby stopić nici DNA¹⁰ (np. ciepło lub zasada), umożliwiając dostęp sondy do DNA, które normalnie jest dwuniciowe. W przeciwieństwie do tego, natywny FISH nie obejmuje etapu denaturacji, więc sonda może uzyskać dostęp tylko do DNA, które jest już jednoniciowe. Natywny telomer FISH specyficznie wykrywa jednoniciowe powtórzenia telomerów nici C, kolejną cechę charakterystyczną ALT w komórkach nowotworowych^11,12. Sprzężenie tego testu z barwieniem IF-FP pozwala nam odpowiedzieć na nowe pytania w zrozumieniu mechanizmu ALT, który jest obecnie uważany za silnego kandydata do celowanych terapii nowotworowych.

Opisany tutaj protokół może być używany w stylu "wybierz własną przygodę" do barwienia dowolnej kombinacji IF, FP oraz natywnych lub denaturujących telomerów FISH. Ponieważ protokół jest wysoce konfigurowalny, czas może się znacznie różnić. Ogólnie rzecz biorąc, czas praktyczny jest wymagany przez cztery dni, ale te dni mogą nie być sekwencyjne. Szacunkowy czas potrzebny na wykonanie typowego procesu denaturacji FISH przedstawiono na rysunku 1. Rodzime FISH nie muszą być hybrydyzowane z dnia na dzień, więc można potencjalnie wyeliminować etap nocny (łączący Dzień 2 i Dzień 3), jeśli możliwy jest długi dzień na ławce.

Typowy mikroskop konfokalny umożliwia obrazowanie czterech kanałów kolorów: z grubsza rzecz biorąc, niebieskiego, zielonego, czerwonego i dalekiej czerwieni. Pokazano cztery przykłady potencjalnych kombinacji czterech kolorów, ale potencjalne permutacje są nieskończone. Możliwe jest użycie dwóch przeciwciał IF lub dwóch wyrażonych FP z równym powodzeniem. Protokół jest prosty i solidny. Odpowiednie jest każde przeciwciało, które samo w sobie daje dobre wyniki IF. Chociaż uwzględniono tutaj tylko sondy telomerowe dla FISH, denaturacja FISH za pomocą sondy centromerowej również daje dobre wyniki. W związku z tym protokół ten oferuje szeroki stopień elastyczności w udzielaniu odpowiedzi na ważne pytania w biologii jądrowej.

Protokół

Zanim zaczniesz, weź pod uwagę mikroskop, linię komórkową z ekspresją FP oraz dostępne sondy i przeciwciała. Niebieski jest zwykle używany do barwienia DNA, takiego jak DAPI, ponieważ niebieskie fluorofory na ogół nie są jasne. W razie potrzeby można użyć niebieskich przeciwciał drugorzędowych. Jeśli komórki wykazują ekspresję GFP, można użyć sondy FISH oznaczonej czerwonym fluoroforem wraz z drugorzędowym przeciwciałem dla IF oznaczonym AF-647. Alternatywnie, do obrazowania komórek wykazujących ekspresję mCherry, można wybrać przeciwciało drugorzędowe IF oznaczone AF-488 i sondę FISH znakowaną AF-647. Przykłady czterech możliwych kombinacji IF-FP-FISH przedstawiono na rysunku 2 i mają one służyć jako przewodnik zachęcający do elastyczności projektowania eksperymentalnego. Ważne jest, aby wybrać RYBY rodzime lub denaturacyjne, ponieważ tych metod nie można łączyć. Zawarto tutaj niezawodną metodę mycia kwasem szkiełek nakrywkowych, która umożliwia przyleganie komórek. Można to zrobić w dowolnym momencie przed użyciem, a sterylne szkiełka nakrywkowe można przechowywać przez czas nieokreślony. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Mycie kwasem szkiełek nakrywkowych

UWAGA: Szkiełka nakrywkowe należy oczyścić i umyć kwasem, aby umożliwić przyleganie hodowanych komórek. Do wzrostu w płytkach 12-dołkowych idealne są okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm. Skonsultuj się z centrum mikroskopii, aby ustalić, czy preferowane są szkiełka nakrywkowe #1 czy #1.5. Podany czas czyszczenia szkiełek nakrywkowych nie jest krytyczny, ale nie należy oszczędzać na myciu kwasem.

1. Użyj kleszczyków do szkiełek nakrywkowych (Rysunek 3A), aby umieścić szkiełka nakrywkowe w stojakach tak, aby ich powierzchnie się nie stykały. Umieść dodatkowe szkiełka nakrywkowe po przekątnej, aby w razie potrzeby zwiększyć pojemność (Rysunek 3B). Wygodnie zmieścić kilka stojaków w naczyniu do barwienia (Rysunek 3C).
2. Napełnij naczynie do barwienia wodą i niewielką ilością detergentu. Delikatnie opuść ruszty z szkiełkami nakrywkowymi do naczynia.
3. Mieszaj szkiełka nakrywkowe w wodzie z mydłem przez 30 minut za pomocą kołyski lub nutatora.
4. Wyjmij stojaki na szkiełka nakrywkowe z naczynia do barwienia. Wylej wodę z mydłem.
5. Opłucz naczynie do barwienia i napełnij wodą dejonizowaną. Włóż stojaki szkiełek nakrywkowych do czystej wody i umieść na bujaku, aby delikatnie mieszały przez 5 minut.
6. Powtórz płukanie z dwiema dodatkowymi podmianami czystej wody dejonizowanej, w sumie trzy płukania.
7. Wyjmij stojaki na szkiełka nakrywkowe z naczynia do barwienia. Dodaj 1 N HCl do naczynia.
   UWAGA: HCl jest. Przechowywać pod wyciągiem i używać środków ochrony osobistej. Ostrożnie opuść szkiełka nakrywkowe do roztworu kwasu. Upewnij się, że 1 N HCl całkowicie zakrywa szkiełka nakrywkowe. Umieść pokrywkę na naczyniu do barwienia.
8. Umieścić naczynie barwiące zawierające szkiełka nakrywkowe i roztwór kwasu w zbiorniku sonografu do kąpieli. Sonikować przez 15 minut w temperaturze 55 °C.
9. Pozostaw szkiełka nakrywkowe na noc w kąpieli kwasowej.
10. Następnego dnia ostrożnie wyjmij stojaki na szkiełka nakrywkowe z naczynia do barwienia. Utylizować 1 N HCl zgodnie z instytucjonalnymi protokołami bezpieczeństwa.
11. Opłucz naczynie do barwienia i napełnij je wodą dejonizowaną. Włóż stojaki szkiełek nakrywkowych do czystej wody i umieść na bujaku, aby delikatnie mieszały przez 5 minut.
12. Powtórz płukanie z dwiema kolejnymi podmianami czystej wody dejonizowanej, w sumie trzy płukania.
13. Wyjmij stojaki na szkiełka nakrywkowe z naczynia do barwienia. Opróżnij naczynie i napełnij je 70% etanolem. Włóż ruszty szkiełek nakrywkowych do naczynia i delikatnie mieszaj przez 5 minut.
14. Wyjmij stojaki na szkiełka nakrywkowe z naczynia do barwienia. Opróżnij naczynie i napełnij je 100% etanolem. Włóż ruszty szkiełek nakrywkowych do naczynia i delikatnie mieszaj przez 5 minut.
15. Zabierz naczynie ze 100% etanolem i szkiełka nakrywkowe do okapu do hodowli tkankowych. W okapie wyjmij stojaki na szkiełka nakrywkowe z naczynia i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu.
16. Opróżnij naczynie i włóż do niego stojaki z szkiełkami nakrywkowymi. Przechowywać pod pokrywką, aby zachować sterylność. Naczynie do barwienia nie jest szczelne; Jeśli szkiełka nakrywkowe zostaną pozostawione w etanolu, w końcu wyparują. Szkiełka nakrywkowe pozostaną zdatne do użytku.

2. Komórki galwaniczne na szkiełkach nakrywkowych

UWAGA: Obchodzenie się ze szkiełkami nakrywkowymi wymaga praktyki. Łatwiej jest zacząć od płytki 6-dołkowej, dopóki nie nabierzesz pewności. W przypadku korzystania z płytki 6-dołkowej należy podwoić objętość prania podaną dla płytek 12-dołkowych.

1. Hoduj zdrowe, rosnące komórki wykazujące ekspresję interesującego białka oznaczonego GFP lub mCherry (odpowiednich jest kilka czerwonych lub zielonych FP; patrz uwagi w Tabeli Materiałów). W pokazanych przykładach zastosowano komórki kostniakomięsaka U2OS, które wykorzystują ALT do utrzymania telomerów.
   1. Użyj przejściowo transfekowanych komórek lub linii komórkowych o stabilnej ekspresji FP. Jeśli eksperyment wymaga leczenia farmakologicznego lub transfekcji, należy wziąć pod uwagę pożądaną konfluencję podczas utrwalania (zwykle 70%-80%), czas trwania leczenia i szybkość wzrostu komórek, aby obliczyć odpowiednią liczbę komórek do płytki na szkiełko nakrywkowe.
2. Przygotuj szkiełka nakrywkowe w kapturze do hodowli tkankowych, aby zachować sterylność. Do każdego dołka na 12-dołkowej płytce dodać 1 ml sterylnego PBS. Za pomocą kleszczyków nakrywkowych umieść po jednym czystym, umytym kwasem szkiełku nakrywkowym w każdym dołku. Delikatnie mieszaj ręcznie przez kilka sekund.
3. Zasysać PBS. Dodać 1 ml świeżego sterylnego PBS do dołka. Odłóż talerz na bok.
4. (Opcjonalnie) Pokryj szkiełka nakrywkowe fibronektyną, aby poprawić adhezję komórek. Wiele przylegających linii komórkowych będzie dobrze przylegać do szkiełek nakrywkowych przemytych kwasem, gdy będą powlekane przez co najmniej 18 godzin przed utrwaleniem. Jeśli komórki nie przylegają dobrze lub wymagają utrwalenia wkrótce po posiewaniu, należy pokryć szkiełka nakrywkowe, aby zwiększyć przyczepność.
   1. Przygotować roztwór fibronektyny o stężeniu 5 μg/ml w sterylnym PBS.
   2. Odessać PBS ze szkiełek nakrywkowych. Delikatnie nałóż około 300 μl roztworu fibronektyny na każde szkiełko nakrywkowe, tworząc kroplę utrzymywaną przez napięcie powierzchniowe.
   3. Inkubować przez kilka godzin w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C.
   4. Spłukać kilkakrotnie PBS, przytrzymując szkiełka nakrywkowe w końcowej zmianie PBS. Odłóż talerz na bok na czas przygotowywania komórek.
   5. Jeśli fibronektyna nie jest odpowiednia, rozważ poli-L-lizynę, kolagen lub żelatynę jako alternatywę.
5. Trypsynizować komórki i rozcieńczyć odpowiednią liczbę w 12 ml pożywki hodowlanej w oparciu o projekt doświadczalny i pożądaną gęstość komórek przy utrwalaniu.
6. Odessać PBS ze szkiełek nakrywkowych i dodać 1 ml zawiesiny komórek do dołka.
7. Umieść komórki w inkubatorze.
8. Traktuj komórki zgodnie z wymaganiami lekami, siRNA lub innymi odczynnikami zgodnie z projektem eksperymentalnym. Dorastaj do pożądanego zbiegu.

3. Barwienie IF-FP

UWAGA: Przez cały czas trwania protokołu nie należy dopuścić do wyschnięcia szkiełek nakrywkowych. Zaleca się pipetowanie jedną ręką i odsysanie roztworów drugą tak, aby szkiełka nakrywkowe znajdowały się poza roztworem tak krótko, jak to możliwe. Roztwory pipetować delikatnie do ścianki studzienki, nie bezpośrednio na szkiełko nakrywkowe. Z szkiełkami nakrywkowymi należy obchodzić się mocno, ale delikatnie, za pomocą kleszczy. Szkiełko nakrywkowe łatwo jest złamać, chwytając je ze zbyt dużą siłą. Na początku zaplanuj zduplikowane szkiełka nakrywkowe na wypadek pęknięcia. Z biegiem czasu złamane szkiełka nakrywkowe stają się rzadkim zjawiskiem. Szkiełek nakrywkowych nie można zbierać z suchej studni. Szkiełka nakrywkowe muszą być pokryte buforem do odbioru.

1. Usuń pożywkę i napraw komórki za pomocą wybranego utrwalacza. Płukanie komórek przed utrwaleniem nie jest konieczne. Użyj 1 ml na dołek w płytce 12-dołkowej lub 2 ml na dołek w płytce 6-dołkowej.
   1. Opcja 1: Użyj 4% formaldehydu w PBS.
      UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny. Obchodź się w rękawiczkach i odpowiednio zutylizuj. Przygotuj świeże, używając 16% formaldehydu bez metanolu i 10x bulionu PBS. Utrwal na 15 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Opcja 2: Użyj 4% formaldehydu w buforze cytoszkieletu z sacharozą (CBS).
      UWAGA: Ten bufor jest preferowany do zachowania struktury cytoszkieletu¹³. CBS ma końcowe stężenie 10 mM MES pH 6,1, 138 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 2 mM EGTA i 0,32 M sacharozy. Aby przygotować utrwalacz, przygotuj 2x CBS z 20 mM MES pH 6,1, 276 mM KCl, 6 mM MgCl₂, 4 mM EGTA. Przygotować oddzielny zapas 1,28 M sacharozy. Przechowywać oba zapasy w temperaturze 4 °C. Aby uzyskać świeży utrwalacz roboczy, wymieszaj 1 objętość 16% formaldehydu wolnego od metanolu, 1 objętość sacharozy i 2 objętości 2x bulion CBS. Utrwal na 15 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Opcja 3: Napraw za pomocą metanolu o temperaturze -20 °C. Zalecany do docelowych przeciwciał przeciwko kwasom nukleinowym (np. ssDNA, G-kwadrupleksy, hybrydy RNA-DNA). Utrwalać przez 5 minut w temperaturze -20 °C.
2. Aspiruj utrwalacz i zutylizuj zgodnie z zasadami instytucji.
3. Spłucz szkiełka nakrywkowe kilka razy PBS.
   1. PUNKT ZATRZYMANIA: Szkiełka nakrywkowe mogą być przechowywane w PBS w temperaturze 4 °C przez kilka dni przy minimalnych stratach sygnału. W przypadku dłuższego przechowywania należy odwodnić do 100% etanolu (2 minuty w 70% etanolu, 2 minuty w 90% etanolu, przechowywać w 100% etanolu), uszczelnić płytkę folią laboratoryjną i przechowywać w temperaturze -20 °C. Szkiełka nakrywkowe można przechowywać w ten sposób przez tygodnie lub miesiące. Gdy będą gotowe do barwienia, ponownie nawodnij szkiełka nakrywkowe (2 min w 90% etanolu, 2 min w 70% etanolu, 15 min w PBS) i przejdź do następnego kroku.
4. Szkiełka nakrywkowe należy przepuszczać w 0,5% Triton X-100 w PBS przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wykonać ten krok w płytce.
5. Spłucz szkiełka nakrywkowe kilka razy PBS.
6. Przygotuj nawilżoną komorę (Rysunek 3D). Umieść wilgotne ręczniki papierowe na dnie komory. Aby stworzyć podporę do barwienia, oznacz górną część wieczka z płytki 12-dołkowej tak, aby odpowiadała szkiełkom nakrywkowym.
   1. Przykryj pokrywkę folią laboratoryjną, aby etykiety pozostały widoczne. Upewnij się, że komora jest światłoszczelna ze ściśle przylegającą pokrywą. W razie potrzeby przykryj folią (Rysunek 3E).
7. Odpipetować 75 μl kropli 100 μg/ml RNazy A w PBS na oznakowany nośnik. Delikatnie podnieś każde szkiełko nakrywkowe i przetrzyj krawędź tkanką laboratoryjną, aby usunąć nadmiar buforu. Odwróć szkiełka nakrywkowe na krople RNazy A (komórką do dołu). Umieść podporę w nawilżonej komorze i zamknij pokrywę. Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C.
8. Dodaj świeży PBS do 12-dołkowej płytki. Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytce, komórką do góry. Spłucz kilka razy PBS.
9. Blokuj przez 30 minut lub dłużej w temperaturze pokojowej. Zetrzyj roztwór RNazy z pokrytego folią podłoża. Odpipetować 75 μl kropli 20% surowicy osła w PBS na folię. Odwróć szkiełka nakrywkowe na bufor blokujący (komórką do dołu).
10. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe.
    1. Użyj 75 μl na szkiełko nakrywkowe. Przygotuj dodatkowe 10%, aby zapobiec błędowi pipetowania.
    2. Rozcieńczyć przeciwciało w 5% surowicy osła. Empirycznie określić rozcieńczenia przeciwciał. Rozcieńczenie 1:100 jest rozsądnym punktem wyjścia.
    3. Podczas blokowania przygotuj drugi znakowany nośnik do inkubacji przeciwciał pierwotnych. Przykryj pokrywkę folią i nałóż 75 μl kropli rozcieńczonego przeciwciała w wyznaczone miejsca.
11. Na końcu etapu blokowania przenieś szkiełka nakrywkowe na kropelki przeciwciała (komórką do dołu). Umieścić podporę w wilgotnej komorze, zamknąć pokrywę i inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
12. Dodaj świeży PBS do 12-dołkowej płytki. Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytce, komórką do góry. Prać w PBS trzy razy po 5 minut w temperaturze pokojowej z bujaniem.
13. Podczas końcowego mycia przygotuj przeciwciała drugorzędowe.
    1. Użyj 75 μl na szkiełko nakrywkowe. Przygotuj dodatkowe 10%, aby zapobiec błędowi pipetowania.
    2. Rozcieńczenie 1:400 jest zalecane dla fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych i przeciwciał wzmacniających GFP/RFP. Dostosuj w razie potrzeby w oparciu o doświadczenie z celem.
    3. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w 5% surowicy osła. Nanieś krople o pojemności 75 μl w odpowiednie miejsca na oznaczonym podporze.
14. Po umyciu przenieś szkiełka nakrywkowe na drugorzędowe kropelki przeciwciał (komórką do dołu). Inkubować przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej w szczelnie zamkniętej wilgotnej komorze.
15. Dodaj świeży PBS do 12-dołkowej płytki. Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytce, komórką do góry. Prać w PBS trzy razy po 5 minut w temperaturze pokojowej z bujaniem.

4. Ponowne utrwalanie i odwadnianie

1. Przygotuj 4% formaldehydu w PBS w temperaturze pokojowej do ponownego utrwalenia. Na tym etapie należy użyć formaldehydu, nawet jeśli do początkowego utrwalenia użyto metanolu. Usuń ostatnie płukanie PBS i ponownie napraw komórki na 15 minut, delikatnie kołysząc.
2. Odessać utrwalacz i zutylizować go zgodnie z zasadami instytucji.
3. Spłucz szkiełka nakrywkowe kilka razy za pomocą PBS.
4. Odwodnić szkiełka nakrywkowe i wysuszyć na powietrzu, aby przygotować się do hybrydyzacji:
   1. Inkubować w 70% etanolu przez 2 min.
   2. Inkubować w 90% etanolu przez 2 min.
   3. Inkubować w 100% etanolu przez 2 min.
   4. Po 100% etanolu umieść szkiełka nakrywkowe komórką do góry na oznakowanej bibule filtracyjnej, aby zachować orientację. Pozwól im całkowicie wyschnąć na powietrzu podczas przygotowywania sondy FISH.

5. RYBY (OPCJA 1): DENATURYZACJA RYB

1. Przygotuj dwie podpory foliowe (patrz rysunek 3F).
   1. Złóż kawałek folii aluminiowej na ćwiartki, aby utworzyć cztery warstwy. Upewnij się, że matowa strona jest skierowana na zewnątrz.
   2. Przytnij złożoną folię tak, aby zmieściła się w pokrywce płytki 12-dołkowej. Za pomocą chusteczki laboratoryjnej przetrzyj folię o wewnętrzną stronę pokrywki, tak aby grzbiety wieczka wytłoczyły wzór na folii. Spowoduje to powstanie grzbietów, które zapobiegną przesuwaniu się szkiełek nakrywkowych względem siebie podczas kolejnych kroków.
   3. Przygotuj dwie takie podpory. Mogą one zostać wyczyszczone i ponownie wykorzystane w późniejszych eksperymentach.
2. Rozcieńczyć sondę 10 μM w stosunku 1:50 w buforze hybrydyzacyjnym (70% dejonizowany formamid, 10 mM Tris, pH 7,4, 0,5% 10× roztwór blokujący Roche). Użyj 75 μl tej rozcieńczonej sondy na szkiełko nakrywkowe i przygotuj 10% więcej, aby skompensować straty pipetowania. Końcowe stężenie sondy powinno wynosić 200 nM.
3. Podgrzej blok grzewczy do 90 °C, a termocykler do 85 °C.
4. Dedenaturacja szkiełek nakrywkowych: Wysuszone na powietrzu szkiełka nakrywkowe ułożyć komórką do góry na jednym z przygotowanych nośników foliowych. Delikatnie umieść folię na bloku termocyklera i zamknij pokrywę. Inkubuj przez 5 minut w celu denaturacji.
5. Jednocześnie podgrzewać rozcieńczoną sondę w bloku grzewczym w temperaturze 90 °C przez 5 minut.
6. Odpipetować 75 μl kropli zdenaturowanej sondy na drugi przygotowany nośnik foliowy. Upewnij się, że matowa strona folii jest skierowana do góry, aby umożliwić dobrze uformowane kropelki. Jeśli błyszcząca strona jest skierowana do góry, sonda rozprzestrzeni się i straci napięcie powierzchniowe.
7. Odwróć zdenaturowane szkiełka nakrywkowe na krople sondy, umieszczając je komórką do dołu.
8. Przenieść podłoże foliowe z sondą i szkiełkami nakrywkowymi do bloku termocyklera ustawionego na 85 °C i inkubować przez 5 minut. Użyj szpatułki, aby pomóc w przenoszeniu. Poruszaj się ostrożnie, aby uniknąć uderzenia lub przesunięcia szkiełek nakrywkowych.
9. Przenieś folię ze szkiełkami nakrywkowymi i sondę do nawilżonej komory. Przykryj pokrywką i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej.

6. RYBA (OPCJA 2): Rodzima RYBA

1. Rozcieńczyć sondę 10 μM w stosunku 1:200 w buforze hybrydyzacyjnym (70% dejonizowany formamid, 10 mM Tris, pH 7,4, 0,5% 10× roztwór blokujący Roche). Końcowe stężenie sondy wynosi 50 nM. Użyj 75 μl na szkiełko nakrywkowe i przygotuj 10% więcej, aby zapobiec błędowi pipetowania.
2. Nanieś 75 μl kropli rozcieńczonej sondy na wyznaczone miejsca na pokrytym folią podłożu.
3. Odwróć zdenaturowane szkiełka nakrywkowe na krople sondy o pojemności 75 μl, umieszczając je komórką do dołu.
4. Umieść podporę w wilgotnej komorze i zamknij pokrywę. Inkubować przez co najmniej 45 minut w temperaturze pokojowej. Jeśli jest to preferowane, inkubacja może zostać przedłużona do nocy.

7. Mycie i montaż

UWAGA: Optymalny środek montażowy zależy od apertury numerycznej obiektywu mikroskopu. Skonsultuj się z lokalną placówką zajmującą się mikroskopią w celu uzyskania zaleceń. Odpowiednim wyborem może być ProLong Glass z NucBlue, który ma współczynnik załamania światła 1,52. Jednak alternatywne medium montażowe może być bardziej odpowiednie w zależności od posiadanego mikroskopu.

1. Szkiełka nakrywkowe należy umieścić z powrotem na płytce 12-dołkowej w celu umycia. Odwróć je tak, aby były komórką do góry.
2. Prać 3× 10 min w 70% formamidzie/10 mM Tris, pH 7,5.
   UWAGA: Formamid jest toksyczny; Pozbądź się go zgodnie z polityką instytucjonalną.
3. Myć 3× 5 min w TNT (0,05 M Tris/0,15 M NaCl/0,05% Tween-20, pH 7,5).
4. Spłucz kilka razy w PBS. Jeśli barwnik DNA nie jest zawarty w podłożu montażowym, rozważ dodanie DAPI w końcowym praniu. Aby zabarwić DAPI, dodaj 300 nM DAPI do PBS, nałóż na szkiełka nakrywkowe i inkubuj przez 5 minut. Roztwór DAPI należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucji.
5. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach za pomocą kropli medium montażowego. Odwróć szkiełka nakrywkowe na spadek: komórką do dołu.
6. Poczekaj, aż podłoże montażowe utwardzi się przez noc przed obrazowaniem.

Wyniki

Typowe wyniki tego protokołu przedstawiono na rysunku 4. Jeśli zostanie prawidłowo wykonany, morfologia komórek będzie dobrze zachowana, a sygnały fluorescencyjne będą jasne. Denaturacja telomerów FISH powinna ujawnić wzór kilkudziesięciu punktów w każdym jądrze reprezentujących każdy telomer (patrz Rysunek 4, Przykłady 1 i 2). Ogniska telomerów powinny być obecne prawie wyłącznie w jądrze, chociaż czasami występuje cytoplazmatyczne barwienie telomerów, zwłaszcza w liniach komórkowych ALT. Powstałe sygnały telomerowe są zwykle niezwykle jasne, do tego stopnia, że należy zachować ostrożność, aby zapobiec przedostawaniu się sygnału telomerowego do innych kanałów detekcji. W liniach komórkowych ALT telomery często grupują się w ciałach PML¹⁴, co skutkuje mniejszą liczbą ognisk, niż można by się normalnie spodziewać. To grupowanie można zaobserwować na rysunku 4, przykład 2.

W liniach komórkowych, które używają ALT do utrzymania telomerów, natywny telomer FISH wykrywa telomerowe ssDNA, które jest cechą charakterystyczną ALT^11,12. Nie oczekuje się, że każde jądro będzie miało telomerowe ssDNA, ani że więcej niż niewielka liczba punktów będzie obecna w pojedynczym jądrze (patrz Rysunek 4, Przykłady 3 i 4). Natywny sygnał telomerowy FISH nie będzie tak jasny jak denaturujący telomer FISH. Linia komórkowa kostniakomięsaka U2OS jest dobrą kontrolą pozytywną dla rodzimych FISH. Nie oczekuje się, aby telomery ssDNA były obserwowane w liniach komórkowych z telomerami utrzymywanymi przez telomerazę.

Zarówno w przypadku denaturacji, jak i rodzimych FISH, silna fluorescencja jąderkowa jest sztuczna. Jeśli zaobserwuje się nadmierny sygnał jąderkowy, spróbuj użyć świeżego roztworu RNazy A lub przedłużyć leczenie RNazą A¹⁵ (krok protokołu 3.8). W przypadku eksperymentów z natywnymi telomerami FISH przy użyciu komórek o nieznanym statusie ALT, do kalibracji ustawień wykrywania używa się dodatniej linii komórkowej ALT, takiej jak U2OS.

Obserwacje FP w eksperymentach IF-FP-FISH mogą być łatwo porównane z eksperymentami obrazowania żywych komórek w celu walidacji. Jeśli zauważysz rozbieżności, spróbuj zmienić warunki mocowania. Utrwalenie w buforze CSB (Krok 3.1.2 Protokołu) może być korzystne dla zachowania struktur komórkowych, ujawniając dokładniejszą lokalizację FP¹³.

Barwienie immunofluorescencyjne różni się znacznie w zależności od interesującego białka. Wyniki IF należy porównać z próbkami przygotowanymi bez FISH, aby ocenić wpływ protokołu FISH na lokalizację i intensywność białka będącego przedmiotem zainteresowania. Ogólnie rzecz biorąc, doświadczenia IF-FP-FISH są odpowiednie do liczenia ognisk, ale intensywności mogą nie być ilościowe⁶.

Rysunek 1: Przykładowy przepływ pracy z szacowanym czasem trwania. Może być wymagany dodatkowy dzień, jeśli inkubacja przeciwciał pierwotnych jest wykonywana przez noc. W przypadku rodzimych FISH dni 2 i 3 są czasami łączone, chociaż skutkuje to wydłużeniem czasu spędzonego na ławce. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykłady udanych kombinacji eksperymentalnych stosowanych w obrazowaniu czterokolorowym. Przykłady 1 i 2 pokazują denaturację telomerów FISH, podczas gdy 3 i 4 wykorzystują natywne FISH. Należy zauważyć, że protokół ten jest przydatny niezależnie od tego, czy chodzi o barwienie immunologiczne dwóch białek docelowych (przykład 1), połączenie jednego barwnika FP i jednego IF (przykłady 2 i 4), czy dwóch FP (przykład 3). Reprezentatywne wyniki tych eksperymentów przedstawiono na rysunku 4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Sprzęt używany w tym protokole. (A) Kleszcze do szkiełek nakrywkowych. Podczas gdy proste kleszcze mogą być używane do obsługi szkiełek nakrywkowych, kątowe kleszcze nakrywkowe znacznie ułatwiają zadanie. (B) Szkiełka nakrywkowe przeznaczone do prania. Należy pamiętać, że oprócz układania w poprzek szkiełek nakrywkowych są również ustawiane pod kątem między sąsiednimi rowkami, aby zwiększyć pojemność. (C) Cztery stojaki szkiełek nakrywkowych w naczyniu do barwienia. Szklane naczynie do barwienia zawiera dziesiątki szkiełek nakrywkowych i jest odporne na mycie kwasem HCl. (D) Przygotowana wilgotna komora. Zewnętrzna strona jest pokryta folią, aby stworzyć ciemne środowisko, zachowując fluorofory. Wilgotne ręczniki papierowe na dole zapewniają wilgoć. (E) Szczelnie zamknięta komora nawilżana. Szczelnie przylegająca pokrywka jest niezbędna, aby zapobiec wysuszeniu. (F) Wykonanie wspornika z folii aluminiowej. Wytłoczone grzbiety na przyciętej folii zapobiegają przesuwaniu się szkiełek nakrywkowych na siebie podczas denaturacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki czterokanałowych eksperymentów obrazowania, w tym IF, FISH i wyrażonych FPs. Panele przedstawiają rzeczywiste wyniki eksperymentów opisanych na rysunku 2. DAPI barwi DNA, nAC-GFP podkreśla jądrową f-aktynę, TelFISH i TRF2-mCherry oznaczają telomery, barwienie immunologiczne PML oznacza jądrowe ciała PML, a nTelFISH ujawnia telomerowe ssDNA. Wszystkie komórki są komórkami kostniakomięsaka U2OS. Obrazy uzyskano pod mikroskopem konfokalnym z możliwością uzyskania superrozdzielczości. Przykład 1 Obrazy uzyskano za pomocą laserowo-skaningowej mikroskopii konfokalnej; wszystkie inne obrazy uzyskano za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego. Wszystkie paski skali reprezentują 5 μM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Eksperymenty z wykorzystaniem IF-FISH od dawna stanowią podstawę w dziedzinie telomerów jako test stresu telomerowego lub wykrywania ALT ^5,6,16. W tym przypadku protokół zostaje rozszerzony o białko fluorescencyjne. Dodatkowo opcja natywnego telomeru FISH jest oferowana jako ortogonalny test ALT¹¹. Protokół ten jest prosty do wykonania i niezawodnie daje zadowalające wyniki.

Operując na szkiełkach nakrywkowych z kropelkami przeciwciał lub sondami PNA, protokół ten został zaprojektowany tak, aby był oszczędny. Używanie kropelek pozwala zaoszczędzić cenne odczynniki. Natomiast alternatywy, takie jak prowadnice komorowe, są drogie i oferują mniejszą elastyczność. Podczas gdy obsługa szkiełek nakrywkowych wymaga praktyki, aby rozwinąć biegłość, oszczędność kosztów sprawia, że inwestycja czasu jest opłacalna. Należy zauważyć, że kropelki odczynnika większe niż 75 μL nie są zalecane. Większe kropelki po prostu powodują ślizganie się szkiełek nakrywkowych i nie poprawiają wyników.

Ekspresja nAC-GFP jest niezbędnym narzędziem do wizualizacji jądrowej f-aktyny⁸, jak pokazano na rysunku 4. Istnieje wiele innych oznakowanych odczynników, które mogą pomóc w znalezieniu odpowiedzi na ważne pytania biologiczne. Na przykład system plazmidowy FUCCI może być używany do wizualizacji cyklu komórkowego, a przy użyciu tego protokołu może być połączony z telomerem FISH¹⁷. Inne podejście do oznaczania cyklu komórkowego może wykorzystywać chromociało PCNA do uzyskania informacji o cyklu komórkowym¹⁸. W zależności od zadawanego pytania, na rynku dostępnych jest wiele odczynników oznaczonych FP.

W tym przypadku protokół ten został zademonstrowany w przypadku telomeru FISH, ale pomyślne wyniki osiągnięto również w przypadku centromeru FISH, przy użyciu sondy PNA o tym samym stężeniu. Możliwe jest na przykład multipleksowanie sondy centromerowej znakowanej FAM za pomocą sondy telomerowej znakowanej Cy3. Należy podkreślić, że jest mało prawdopodobne, aby protokół działał w przypadku FISH DNA z jednym locusem. Do sondowania pojedynczego locus konieczne jest trawienie próbki proteazą, a trawienie to jest wyraźnie niezgodne z wykrywaniem IF lub FP¹⁹. Udało się jednak połączyć IF i mRNA FISH przy podobnym podejściu; oczywiście w tym scenariuszu należy pominąć etap leczenia RNazą.

Wreszcie, oczywiste jest, że natywne telomery FISH szybko stają się niezbędnym testem dla statusu ALT^20,21 . W przeciwieństwie do testu C-circle dla ALT, który jest oparty na populacji²², natywne telomery FISH zapewniają odczyt ALT na poziomie komórkowym, umożliwiając czułe wykrywanie zmian w dynamice ALT. Łącząc natywne telomery FISH z ekspresją IF i FP, można uzyskać ważne informacje na temat mechanizmu ALT. Mamy nadzieję, że z czasem te spostrzeżenia doprowadzą do ukierunkowanych terapii nowotworów, które opierają się na ALT w celu utrzymania telomerów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10 % Tween-20	Bio-Rad	1610781	Odrzuć, jeśli roztwór jest mętny.
10 kanałów PBS	Gibco (firma Gibco)	70011044	Do przygotowania utrwalających i innych należy stosować po utrwaleniu
12-dołkowe płytki do hodowli komórkowych	Nunc	150628
16% formaldehydu bez metanolu	Thermo Scientifc	28908
5 M chlorek sodu	Millipore Sigma	Zobacz materiał S6546
Komórki adhezyjne, np. komórki kostniakomięsaka U2OS	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał HTB-96
Hermetyczne pudełko do komory nawilżanej	Działka	106415032500	Każde odpowiednie hermetyczne pudełko będzie działać, ale uważaj na pudełka z nierównym dnem.
Preparat Alconox	Millipore Sigma	Z742914
folia aluminiowa	Fisher Naukowy	01-213-100
Odpowiednia pożywka do hodowli komórkowych, np. McCoy's 5A	Gibco (firma Gibco)	16600082	dla U2OS dodaj 15% FBS
Sonda centromerowa (FAM)	Życiorys PNA	Zobacz materiał F3001	Dostępnych jest kilka fluoroforów
ChromoTek Plazmid jądrowy aktyna-chromociało (TagGFP)	Technologia białkowa	ACG-N
Forcery do szkiełek nakrywkowych	Narzędzia naukowe	11251-33
Stojaki na szkiełka nakrywkowe	Millipore Sigma	Z688568
DAPI (interfejs DAPI)	Invitrogen	Zobacz materiał D21490	Opcjonalnie, w przypadku, gdy podłoże montażowe nie zawiera barwnika DNA
Serum osła	Jackson Immunoresearch	017-000-121
EGTA (EGTA)	Bio-Świat	40520008	0,5 M roztwór pH 8,0
etanol	Warnera-Grahama	200 Dowód
Surowica bydlęca płodu	Gibco (firma Gibco)	A5670801
Fibronektyna	Millipore Sigma	F0635 powiedział:	Do opcjonalnego powlekania szkiełek nakrywkowych
Formamid	Millipore Sigma	47671-250ML-F
Niemieckie szkiełka nakrywkowe	Wytwórnie Warner	64-0714	CS-18R15 (#1,5 grubości, potwierdź, że jest odpowiedni dla twojego mikroskopu)
Wzmacniacz GFP	Technologia białkowa	gb2AF488 powiedział:	rozpoznaje GFP/mClover/YFP/Venus i inne.  Zobacz informacje o produkcie, aby uzyskać pełną listę
Szklane naczynie do witrażu z pokrywką	Millipore Sigma	900203
Podgrzewana myjka ultradźwiękowa z cyfrowym timerem	Branson	CPX-952-218R	Ten model sonikatora do kąpieli zawiera ciepło, ale nie ma konfigurowalnej mocy ani intensywności.
Kwas solny	Millipore Sigma	258148	Skoncentrowany HCl wynosi 12 N.  Dodaj 20 ml stężonego HCl do 220 ml wody dejonizowanej, aby uzyskać 1 N HCl
Roztwór chlorku magnezu	Millipore Sigma	63069	Rozwiązanie 1 M
MES	Millipore Sigma	475893
metanol	Millipore Sigma	179337
Parafilm	USA Naukowe	3023-4526
Chlorek potasu	Millipore Sigma	Zobacz materiał P9541 powiedział:
przeciwciało pierwotne  mysz anty-PML	Santa Cruz	SC-377390
przeciwciało pierwotne  królik anty-53BP1	Novus	NB100-904
przeciwciało pierwotne  królik anty-PML	ABklonalny	Nr kat. A1184
Przedłuż szklankę z NucBlue	Invitrogen	Zobacz materiał P36981
Wzmacniacz zapytania ofertowego	Technologia białkowa	Zobacz materiał rb2AF568 powiedział:	rozpoznaje mRFP/mCherry/mKate2/mPlum.  Zobacz informacje o produkcie, aby uzyskać pełną listę
RNAza A	Millipore Sigma	RNASEA-RO
Rozwiązanie blokujące Roche	Millipore Sigma	11096176001
przeciwciało drugorzędowe, np. AF488 anty-mysie	Invitrogen	A-11001	Lub podobne
przeciwciało wtórne, np. AF594 anty-królik	Invitrogen	A-11012	Lub podobne
przeciwciało drugorzędowe, np. AF647 przeciwko myszom	Invitrogen	A-21235	Lub podobne
łopatka	Fisher Naukowy	10257402
Sterylny PBS	Gibco (firma Gibco)	14190144	Do przygotowania szkiełek nakrywkowych
sacharoza	Millipore Sigma	S0389 powiedział:
Sonda TelC (Cy3)	Życiorys PNA	Zobacz materiał F1002	Dostępnych jest kilka fluoroforów
Sonda TelG (AF647)	Życiorys PNA	Zobacz materiał F1014	Dostępnych jest kilka fluoroforów
Baza Tris	Millipore Sigma	648311	Przygotować 1 M roztwór w wodzie, dostosować pH za pomocą HCl
tryton X-100	Millipore Sigma	Silnik X100
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa	Gibco (firma Gibco)	25200072
Mikroskop Zeiss Elyra	Zeiss		Lub podobne