Method Article

Masowo równoległy test splicingu w celu zbadania błędów splicingu spowodowanych wariantami intronowymi związanymi z chorobą

DOI:

10.3791/68984

⸱

September 9th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 2Genome and Systems Biology Degree Program, Academia Sinica and National Taiwan University, 3Institute of Statistical Science, Academia Sinica

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wykonywania masowo równoległych testów splicingu (MaPSy), które wykorzystują konstrukty minigenowe do systematycznej oceny wariantów intronowych w ilościach hurtowych. Podejście to umożliwia wysokoprzepustową analizę zmian splicingu indukowanych wariantami w komórkach poprzez sekwencjonowanie amplikonów, zapewniając funkcjonalną ocenę ich wpływu na splicing pre-mRNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Błędy splicingu stanowią 10-30% patogennych mutacji odpowiedzialnych za rzadkie choroby genetyczne. Splicing RNA zapewnia prawidłową ekspresję genów poprzez selektywne łączenie eksonów i usuwanie intronów, przy czym kluczowe sekwencje regulatorowe znajdują się w obrębie intronów. Miejsce splicingu 5' i miejsce rozgałęzienia oddziałują z małymi jądrowymi RNA, tworząc kompleks rozpoznawania spliceosomu, podczas gdy elementy takie jak szlak polipirymidynowy i wzmacniacze / tłumiki splicingu rekrutują białka do regulacji składania spliceosomów. Przewidywanie zakłóceń splicingu spowodowanych wariantami intronowymi jest trudne ze względu na złożoność tych interakcji.

Warianty intronowe, zawierające 90% naturalnych wariantów genów ludzkich, mogą zakłócać splicing kanoniczny i powodować choroby. Aby zbadać tę możliwość, opracowaliśmy masowo równoległy test splicingu (MaPSy) do oceny zidentyfikowanych przez pacjenta wariantów intronowych. Zsyntetyzowane oligonukleotydy z sekwencjami referencyjnymi lub wariantowymi ligowano w minigeny splicingowe zawierające sygnały promotora i poliadenylacji. Każdy konstrukt zawierał dwa stałe eksony flankujące środkowy ekson, który zawierał interesującą nas sekwencję połączeń intron-ekson. Wydajność splicingu komórkowego sekwencji wariantów porównano z referencyjnymi odpowiednikami, co pozwoliło nam zidentyfikować znaczące zakłócenia jako warianty splicingu.

Wyniki projektu MaPSy można zweryfikować za pomocą dodatkowych podejść, takich jak testy minigenowe lub edycja genomu in vivo za pośrednictwem CRISPR. Co więcej, zagregowana analiza przerwanych połączeń może dostarczyć głębszego wglądu w mechanizmy splicingu i molekularne podstawy chorób związanych z błędami splicingu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Splicing RNA jest kluczowym procesem, który łączy egzony w celu translacji i usuwa introny, ułatwiając eksport RNA i utrzymując homeostazę kwasów nukleinowych. Ten ściśle regulowany mechanizm działa w sposób czasowy i przestrzenny, przyczyniając się do różnorodności i złożoności transkryptomu1. Splicing jest kierowany przez kluczowe sygnały, w tym miejsce splicingu 5' (5'ss), miejsce rozgałęzienia i miejsce splicingu 3' (3'ss), wraz z dodatkowymi elementami regulatorowymi, takimi jak szlak polipirymidynowy za miejscem odgałęzienia i strefa wykluczenia dinukleotydów AG, które pomagają w rozpoznawaniu 3'ss2. Mechanistycznie małe jądrowe RNA U1 (snRNA) łączy się z 5'ss, podczas gdy miejsce rozgałęzienia oddziałuje z U2 snRNA3. Skoordynowana aktywność miejsca rozgałęzienia, przewodu polipirymidynowego i 3 s ułatwia wiązanie małych nukleoprotein U2 (snRNP) i czynników pomocniczych U2, stabilizując spliceosom i pozycjonując punkt rozgałęzienia do ataku nukleofilowego na 5'ss, inicjując w ten sposób splicing.

Wraz z szybkim postępem technologii sekwencjonowania, koszt sekwencjonowania całego genomu nadal spada, co prowadzi do stale powiększającego się katalogu wariantów genetycznych człowieka. Szacuje się, że 10-30% mutacji związanych z chorobą w rzadkich chorobach genetycznych wpływa na splicing RNA 4,5,6, często wytwarzając nieprawidłowe produkty genowe, które mogą służyć jako cele terapeutyczne. Jednak ocena wpływu funkcjonalnego wariantów intronicznych pozostaje trudna ze względu na złożoność sygnałów splicingowych, które często są nadmiarowe i zdegenerowane. Podczas gdy miejsca splicingu 5' i 3' są stosunkowo dobrze scharakteryzowane, miejsca rozgałęzień, trakty polipirymidynowe i inne elementy regulatorowe splicingu wykazują znaczną zmienność sekwencji i pozycji u wyższych eukariontów. Zakrojone na szeroką skalę badania mapowania wykazały ponadto, że w obrębie jednego intronu 7,8,9,10 może istnieć wiele miejsc rozgałęzień, co komplikuje interpretację zmian granic intron-ekson.

Głębokie uczenie zostało wykorzystane do oceny, w jaki sposób sekwencje pierwotne przyczyniają się do rozpoznawania miejsc splicingu 4,11,12, ujawniając, że warianty splicingu grupują się w kanonicznych miejscach splicingu, jednocześnie rozciągając się słabo do eksonu i regionu 3' intronów. Wzorzec ten jest zgodny z ustalonym zrozumieniem, że wybór miejsca splicingu 5' jest przede wszystkim podyktowany sekwencjami konsensusu, podczas gdy rozpoznawanie miejsca splicingu 3' zależy od dodatkowych elementów intronicznych, takich jak miejsca rozgałęzień i odcinki polipirymidynowe. Jednak istniejące modele zostały przeszkolone w zakresie odróżniania konstytutywnych miejsc splicingu od alternatywnych lub sztucznych, zamiast skupiać się konkretnie na wariantach intronowych. W rezultacie, te narzędzia obliczeniowe wykazują tylko umiarkowaną dokładność predykcyjną, przede wszystkim identyfikując miejsca splicingu i warianty splicingu egzonicznego 13,14,15,16. Oprócz modeli predykcyjnych, eksperymentalny system zdolny do masowej walidacji wariantów splicingu znacznie usprawniłby identyfikację i charakterystykę defektów splicingu.

Kompleksowe dane dotyczące sekwencjonowania RNA łączące warianty intronowe związane z chorobą z fenotypami splicingu pozostają rzadkie ze względu na ich niską częstotliwość i trudność w przewidywaniu wyników splicingu na podstawie istniejących zestawów danych. Aby wypełnić tę lukę, opracowano wysokoprzepustowe testy splicingu i modele obliczeniowe do systematycznej analizy wariantów splicingu. Testy reporterowe masowo równoległego splicingu (MaPSy) zostały zaprojektowane w celu oceny wpływu zmiennych sekwencji na wybór miejsca splicingu. Poprzez włączenie zmian sekwencji w pobliżu miejsc splicingu 5' i 3' lub obejmujących całe regiony intron-ekson w stałych szkieletach minigenu, MaPSy umożliwia funkcjonalną ocenę zmian splicingu. Jednak ze względu na ograniczenia masowej syntezy oligonukleotydów, głębokie warianty intronowe i aktywacja pseudo-eksonów nie są wychwytywane w tym podejściu.

Solidność MaPSy została potwierdzona przy użyciu 70 niezależnych minigenów splicingu, co dało korelację Pearsona wynoszącą 0,8917. Warto zauważyć, że około 90% wariantów dawcy splicingu (+1 i +2) wykazywało wady splicingu, co podkreśla dokładność testu. Dodatkowo, MaPSy z randomizowanymi sekwencjami miejsc rozgałęzień odkrył zdegenerowaną naturę rozpoznawania miejsc rozgałęzień i ich zależność od białek rdzeniowych U218. Co więcej, projekt MaPSy z podziałem GFP w połączeniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS) został wykorzystany do zbadania zdarzeń pomijania egzonów spowodowanych zmianami genetycznymi. Podejście to ujawniło, że 54% wariantów zakłócających splicing znajduje się w regionach intronicznych, w tym w kanonicznych miejscach splicingu13, co podkreśla istotną rolę elementów intronowych w regulacji splicingu. Podsumowując, odkrycia te wzmacniają znaczenie sekwencji intronowych w kontroli splicingu i pokazują użyteczność MaPSy w identyfikacji defektów splicingu związanych z chorobą (Figura 1).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Projekt eksperymentalny masowo równoległego testu splicingu (MaPSy) mutacji intronowych w pobliżu eksonu. Warianty udokumentowane w bazach danych chorób człowieka zebrano i zsyntetyzowano jako 5307 par oligonukleotydów. Każda para oligonukleotydów zawiera allel odniesienia i wariant w regionach intronowych 78-nukleotydowych (nt) i egzonicznych 35-nt. Oligonukleotydy są otoczone wspólnymi miejscami primingu do amplifikacji i ligacji do minigenów splicingu 3-eksonowego. W związku z tym zsyntetyzowany region składa się z 3 s drugiego eksonu minigenu. Po złożeniu minigenów, połączone minigeny zostały połączone z ludzkimi embrionalnymi komórkami nerki (HEK293T). Powstałe splicingowane izoformy zebrano i rozdzielono za pomocą sekwencjonowania amplikonów. Rysunek ten został zaadaptowany za zgodą Chiang et al.17. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza biblioteki oligonukleotydów (oligo) MaPSy

  1. Podstawowa struktura oligo: Zaprojektuj każdy oligo w puli 155-nuncleotydów (nt) tak, aby zawierał sekwencję egzoniczną 35-nt i sekwencję intronową 80-nt, tworząc region specyficzny dla genu 115-nt otoczony przez 20-nt wspólne sekwencje primingowe na każdym końcu (Figura 2A).
  2. Kolekcja wariantów: Aby zachować integralność motywu i skupić się na regionach regulacyjnych wpływających na splatanie, zbierz warianty intronowe, które są:
    Od -78 do +10 NT od 3
    -3 do +30 NT od 5
    UWAGA: Warianty kliniczne można uzyskać z ClinVar19, wpisów o niskiej częstotliwości w dbSNP20, odpowiednich publikacji i dodatkowych klinicznych baz danych. Współrzędne genomu mogą być używane do przecinania wariantów z pożądanymi regionami genomu (np. za pomocą BEDTools21). Należy wybierać tylko polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) i małe insercje/delecje (indele) poniżej 15 nt, aby zminimalizować zmienność wielkości w puli oligonukleotydów do syntezy masowej.
  3. Podstawowa struktura minigenu: Aby zachować strukturę połączenia splicingowego, każdy szkielet minigenu zawiera trzy eksony: dwa stałe zewnętrzne eksony kodujące fragmenty EGFP (z pGint, Addgene Plasmid #24217) i środkowy ekson pochodzący z eksonu 15 ludzkiego CAMTA2 (Figura 2B). Trawić zarówno fragment CAMTA2 , jak i pGint za pomocą enzymów restrykcyjnych BamHI i SalI i liżować fragment CAMTA2 do pGint między eksonami EGFP, tworząc minigeny trójeksonowe pGint-CAMTA2 (plik uzupełniający 1).
    UWAGA: Środkowy ekson, tj. CAMTA2 ekson 15, powinien wykazywać pośrednią wydajność splicingu, gdy ulega ekspresji w komórkach docelowych. Ta cecha jest niezbędna, ponieważ zapewnia zrównoważoną linię bazową, pozwalającą na wykrycie zarówno wzrostów, jak i spadków wydajności łączenia ze względu na efekty wariantowe.
  4. Projekt miejsca gruntowania: Dołącz sekwencję miejsca insercji na obu końcach biblioteki, tak aby każdy oligo zawierał ~20-nt sekwencje flankujące, które nakładają się na zamierzone miejsce insercji w środkowym eksonie/intronie (Rysunek 2A).
    UWAGA: Jeśli pula oligonukleotydów jest zaprojektowana dla wielu konstruktów minigenowych, można włączyć wiele miejsc primingu.
  5. Projektowanie kodów kreskowych: W przypadku wariantów intronicznych egzoniczne kody kreskowe są niezbędne do odróżnienia genotypów od produktów splicingowych, ponieważ sekwencje intronowe są tracone po splicingu. Aby uniknąć zmian splicingu spowodowanych sekwencjami kodów kreskowych (tj. efektem kodu kreskowego), kody kreskowe należy umieścić dystalnie w eksonach, z dala od miejsc splicingu (tj. tuż obok egzonicznego miejsca zalewania).
    UWAGA: Tam, gdzie to możliwe, zaleca się używanie wielu kodów kreskowych na wariant. Wymagana długość kodu kreskowego zależy od złożoności biblioteki. Na przykład:
    Kod kreskowy 1-nt jest wystarczający, jeśli allel referencyjny łączy się tylko z jednym wariantem.
    Kod kreskowy 2-nt jest preferowany, jeśli allel referencyjny łączy się z sześcioma różnymi wariantami.
    Biblioteki z wieloma wariantami ściśle związanymi z pojedynczym allelem referencyjnym (np. różniącymi się tylko jednym nukleotydem) mogą zwiększyć złożoność analizy.
  6. Porządkowanie oligonukleotydów: Uporządkuj oligonukleotydy w formacie pliku FASTA, w którym każde złącze wariantu jest sparowane z allelem referencyjnym.
    UWAGA: W przypadku połączeń z wieloma wariantami potrzebny jest tylko jeden allel referencyjny na złącze. Usługi syntezy sekwencji zbiorczych są dostępne w takich firmach jak GeneScript (https://www.genscript.com/gentitan-oligo-pools.html), Twist Bioscience (https://www.twistbioscience.com/products/oligopools), IDT (https://sg.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/dna-oligos/custom-dna-oligos/opools-oligo-pools) i Agilent (https://www.agilent.com/en/product/oligo-pools-oligo-gmp-manufacturing/pooled-oligo-synthesis). Długość syntezy, pojemność biblioteki i koszty mogą się różnić w zależności od dostawcy i regionu.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Projektowanie minigenów oligo i splicingu dla MaPSy. (A) Projekt zbiorczej syntezy oligonukleotydatycznych końca 3' lub 5' intronów. Diagramy ilustrują podstawową strukturę oligonukleotydów 155-nt. Rzeczywista zdolność syntezy oligonukleotyda zależy od firmy wybranej do produkcji. (B) Konstrukcja minigenów MaPSy. Minigen trójeksonowy (ii) został zmodyfikowany z plazmidu pGint (i), a miejsca splicingu zostały zastąpione przez połączone oligonukleotydy w celu wprowadzenia zmian sygnału splicingu (iii). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Budowa szablonów DNA biblioteki MaPSy

  1. Początkowe wzmocnienie po otrzymaniu puli oligonukleotydów
    1. Po otrzymaniu puli oligonugolaków amplifikuj 10-50 ng biblioteki oligo z zaprojektowanymi flankującymi miejscami torowania za pomocą 100 μl reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności w celu przekształcenia oligonukleotydów w podwójne nici (startery LibF i LibR w tabeli 1, ustawienia termocyklera w tabeli 2).
    2. Oczyść produkty PCR za pomocą kolumn oczyszczających. Szczegółowo zwiąż produkt PCR z membraną kolumny, a następnie przemyj zawierającymi 70% etanolu, aby usunąć resztki starterów, soli i polimerazy. Na koniec wymyj oczyszczony produkt PCR za pomocą buforu o niskiej zawartości soli lub wody wolnej od nukleaz.
    3. Sprawdź amplifikowany rozmiar oligonugolitacji za pomocą elektroforezy żelowej. Załadować 5 μl oczyszczonego produktu PCR na 1,5% żel agarozowy przygotowany w 1× buforze TAE (40 mM zasady Tris, 20 mM kwasu octowego, 1 mM EDTA, pH 8,0).
      UWAGA: Ogranicz cykle amplifikacji PCR do 15, aby zapobiec nadmiernemu amplifikacji i stronniczości PCR. Wtórne pasmo rozmyte, zwykle większe niż produkt docelowy, może wskazywać na nadmierne wzmocnienie i niepełne wyżarzanie w puli oligonukleów. Zapisz część produktów PCR i zsekwencjonuj pulę oligonugo, aby ocenić jakość i wskaźniki błędów przed kontynuowaniem (punkt zatrzymania).
  2. Budowa minigenów splicingowych MaPSy - Initial PCR.
    1. Fragmenty szkieletu: Użyj 0,5 ng szkieletu plazmidowego pGint-CAMTA2 jako źródła dla dwóch głównych fragmentów PCR
      1. Produkt PCR 1: Amplifikować promotor CMV, pierwszy ekson (N-końcowy EGFP) i część pierwszego intronu (Tabela 1 i Tabela 2).
      2. Produkt PCR 3: Amplifikować część środkowego eksonu (CAMTA2 ekson 15), drugi intron, trzeci ekson (C-końcowy EGFP) i sygnał poliadenylacji SV40 (Figura 3, Tabela 1 i Tabela 2).
    2. Amplikon biblioteczny: PCR Produkt 2: W przypadku biblioteki 3 ss amplifikuj amplikony biblioteczne nakładającymi się sekwencjami na każdym końcu, aby dopasować wewnętrzne końce produktu PCR 1 i produktu PCR 3, co pozwala na efektywną integrację na 3 ss eksonu 15 CAMTA2 (Rysunek 3, Tabela 1 i Tabela 2).
      UWAGA: W przypadku biblioteki 5'ss zastąp koniec 5' środkowego złącza eksonowego sekwencją biblioteczną.
  3. Po PCR oczyść wszystkie produkty za pomocą kolumn oczyszczających, jak w kroku 2.1.2. Aby zapobiec zanieczyszczeniu wektorem matrycowym, należy oczyścić pożądane produkty z PCR1 i PCR3 przez ekstrakcję żelem agarozowym. W szczególności po elektroforezie należy wyciąć ~ 100 mg żelu agarozowego zawierającego docelowy produkt PCR i rozpuścić go w buforze wiążącym. Zwiąż rozpuszczony roztwór żelu z membraną kolumny, a następnie postępuj zgodnie ze standardowym protokołem oczyszczania PCR.
  4. Budowa minigenów splicingu MaPSy - Rozszerzenie nakładania się PCR: Wykonaj jedną lub sekwencyjną rundę nakładającego się PCR, aby związać trzy główne fragmenty (produkt PCR 1, amplikon biblioteczny i produkt PCR 3; użyj ~ 20 ng każdy jako matrycę) w minigen splicingu o pełnej długości (użyj największej liczby zewnętrznych starterów CAMGFPF i CMVGFPR w tabeli 1 oraz ustawień termocyklera w tabeli 2).
    UWAGA: Produkt końcowy zawiera promotor CMV i trzy eksony z pierwszymi 3 pochodzącymi z biblioteki oligonukleotydów i jest gotowy do transfekcji do eksperymentów komórkowych.
  5. Po złożeniu oczyść pełnowymiarowe matryce DNA za pomocą kolumn oczyszczających PCR. Jeśli w żelu zaobserwuje się niespecyficzne prążki, należy przeprowadzić ekstrakcję żelu, aby dokładnie wyizolować pożądany produkt o pełnej długości zgodnie z krokiem 2.3.
    UWAGA: Bardzo podobne sekwencje w bibliotece mogą prowadzić do niekompletnego montażu. Jeśli pełny montaż w pojedynczej reakcji PCR jest trudny, można podjąć próbę sekwencyjnego nakładania się PCR (zaczynając od dwóch fragmentów, a następnie dodając trzeci). Aby poprawić specyficzność PCR, rozważ dostosowanie temperatury wyżarzania lub wdrożenie PCR z przyłożeniem w celu zwiększenia specyficzności wiązania dla złożonych matryc. Przygotuj wystarczającą ilość konstruktów MaPSy, aby przeprowadzić co najmniej cztery niezależne eksperymenty. Zapisz małą porcję każdego konstruktu do sekwencjonowania nowej generacji w celu zweryfikowania integralności sekwencji, ponieważ niektóre oligonukleotydy mogą nie amplifikować się wydajnie i powodować niekompletne zespoły (punkt zatrzymania).

figure-protocol-2
Rysunek 3: Przebieg budowy biblioteki. (A) Startery stosowane w nakładającym się PCR (zob. również Tabela 1). (B) Procedura nakładania się PCR. Krótko mówiąc, pule oligo i inne części minigenów splicingu zostały amplifikowane przez 25 cykli PCR. Fragment zawierający promotor i pierwszy ekson (produkt PCR 1) zszywano z pulą oligonukleotydów (produkt PCR 2) przez nakładanie się PCR przy użyciu 20 cykli amplifikacji. Następnie zszyty produkt (produkt PCR 1 + 2) został następnie zszyty z fragmentem zawierającym3 ekson i sygnał poliadenylacji (produkt PCR 3) przy użyciu 20 cykli amplifikacji w celu uzyskania końcowego konstruktu (produkt PCR 1 + 2 + 3). Rysunek ten został zaadaptowany za zgodą Chiang et al.17. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Budowa elementarza MaPSy-librarynuta
CMVGFPF powiedział:CCGCCATGCATTAGTTATTAATAG powiedział:Produkt PCR 1
LibR2 powiedział:CAGGTCTTCAGGCCCCAGCC powiedział:Produkt PCR 1
Biblioteka LibFGGCTGGGGCCTGAAGACCTG powiedział:Produkt PCR 2
LibR (Biblioteka LibR)AAGGCGCACATGACCCCGGG powiedział:Produkt PCR 2
LibF2 powiedział:CCCGGGGTCATGTGCGCCTT powiedział:Produkt PCR 3
CMVGFPR powiedział:GGACAAACCACAACTAGAATGC powiedział:Produkt PCR 3
Starter PCR biblioteki MaPSy do sekwencjonowania amplikonów
P7-Lib0FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib1FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib2FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGAGNNAAGTTCAGCGTGTCCGGGGCGA
P7-Lib3FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P5-LIB0RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib1RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib2RI powiedział:TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGAGAGNNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib3RI powiedział:TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGNNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
Elementarz walidacji
Lib0F (walidacja biblioteki)AAGTTCAGCGTGTCCGGCGA powiedział:
Lib0R (walidacja biblioteki)CAGCTTGCCGTAGGTGGCAT

Tabela 1: Startery stosowane w tym protokole.

Mieszanina reakcyjna PCR
SkładnikiGłośność
ddH2O13,4 μL
5x bufor HF4 μl
10 mM dNTP0,4 μl
Podkład do przodu 10 μM0,5 μL
Podkład odwrotny 10 μM0,5 μL
Zawartość cDNA1 μL
Polimeraza DNA o wysokiej wierności0,2 μl
Uruchom program PCR (reakcja 20 μL)
Najwyższa tempGodzinaCykli
Początkowa denaturacja98°C1 min1
Denaturacja98°C30 sekund10–20
Wyżarzanie65°C30 sekund
Rozszerzenie72°C30 sekundPowrót do denaturacji
Końcowe przedłużenie72°CCzas trwania: 5 min1
Trzymać4°CTrzymaćTrzymać

Tabela 2: Ustawienia termocyklera.

3. Ekspresja i odzysk minigenów splicingu z komórek ssaków

  1. Hodowla komórkowa: Utrzymuj HEK293T komórek w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 jednostkami/ml penicyliny i streptomycyny oraz 2 mM L-glutaminy w 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  2. Transfekcja minigenów spawów:
    1. Płytka 5 × 105 HEK293T komórek w 2 ml pożywki na płytkach 6-dołkowych 24 godziny przed transfekcją.
    2. Komórki transfekcyjne z 1-2 μg konstruktów MaPSy, wstępnie inkubowane przez 5 minut z 3,75 μl odczynnika do transfekcji, zgodnie z protokołem producenta. O udanej transfekcji świadczy obecność sygnałów EGFP z biblioteki spawów.
    3. Poddać komórki lizie za pomocą 250 μl Trizolu (lub równoważnego) 24 godziny po transfekcji.
  3. Ekstrakcja RNA: Ekstrakcja całkowitego RNA za pomocą zestawu do miniprzygotowania RNA, zgodnie z protokołem producenta. W szczególności zwiąż RNA w Trizol z membranami kolumny, przemyj zawierającymi 70% etanolu w celu usunięcia soli, białek i innych zanieczyszczeń, a następnie wymyj oczyszczone RNA za pomocą buforu o niskiej zawartości soli lub wody wolnej od nukleaz.
    UWAGA: Trizol (lub jego odpowiednik) jest silnie i toksyczny. Narażenie może prowadzić do poważnych oparzeń chemicznych, trwałych blizn i niewydolności nerek.
    UWAGA: RNA może być przechowywane w Trizol (lub równoważnym odczynniku na bazie Trizolu, takim jak ekstraktor RNA TOOLSmart firmy TOOLS) w temperaturze -80 °C przez okres do jednego roku (punkt zatrzymania). Oczyszczone RNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C przez okres do dwóch lat, jeśli zminimalizowane zostaną cykle zamrażania i rozmrażania (punkt zatrzymania).
  4. Odwrotna transkrypcja: Przygotuj cDNA z 2 μg całkowitego RNA za pomocą odwrotnej transkryptazy z losowymi heksamerami, zgodnie z protokołem producenta. W szczególności inkubować RNA z losowymi heksamerami 50 μM w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić wyżarzanie, a następnie przeprowadzić odwrotną transkrypcję w temperaturze 55 °C przez 10 minut.
    UWAGA: cDNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do jednego roku (punkt zatrzymania).
  5. Amplifikacja splingowanych minigenów: Przeprowadzić PCR przy użyciu specyficznych sekwencji primingowych dla splingowanych minigenów (Tabela 2). Użyj minimalnej liczby cykli niezbędnych do wizualizacji produktu na żelu agarozowym.
    UWAGA: Na żelu powinny być widoczne wymieszane pasma produktów niesplecionych i splecionych. Pasma mogą wydawać się rozproszone ze względu na mieszaną populację gatunków DNA (ryc. 4A).
  6. Oczyść produkt PCR za pomocą kolumn oczyszczających zgodnie z krokiem 2.1.2.
  7. Mocowanie adapterów do sekwencjonowania: Wykonaj ostatnią rundę PCR, aby przymocować sekwencje adapterów do sekwencjonowania do końców amplikonu. Uwzględnij 0-3 losowe nukleotydy na końcu amplikonów, aby zapewnić zrównoważoną detekcję fluorescencji na platformie NextSeq (Tabela 1).
  8. Oczyść produkt PCR za pomocą kolumn oczyszczających zgodnie z krokiem 2.1.2.

4. Sekwencjonowanie i analiza amplikonów

  1. Sekwencjonowanie z krótkim odczytem: Poddaj amplikony PCR 150 sekwencjonowaniu sparowanym końcom przy użyciu Illumina Miseq, Novaseq lub odpowiednika, za pośrednictwem podstawowej placówki lub usługi komercyjnej.
  2. Wyrównanie:
    1. Utwórz genom referencyjny: Utwórz syntetyczny "genom referencyjny", oznaczając każdy unikalny genotyp jako oddzielny chromosom. Genom referencyjny obejmuje syntetyczne eksony i introny zawarte w amplikonach.
    2. Dopasuj odczyty sekwencjonowania: Dopasuj odczyty sparowanych końców do genomu referencyjnego za pomocą HISAT222,23, dostosowując parametry do kontroli elementów specyficznych dla splicingu (patrz Plik uzupełniający 2, aby uzyskać szczegółowe informacje w wierszu polecenia).
    3. Wybierz odczyty wysokiej jakości: Konwertuj SAM na format BAM, filtruj pod kątem odczytów o wysokiej jakości (jakość odwzorowania ≥60), a następnie sortuj i indeksuj pliki BAM24 (zobacz Plik uzupełniający 2 , aby uzyskać szczegółowe informacje w wierszu polecenia).
    4. Zidentyfikuj połączenia spawów i oblicz odczyty złączy: Określ ilościowo użycie złącza spawów, wyodrębniając zdarzenia pomijania eksonów z ciągów CIGAR w wyrównanym pliku BAM. Zidentyfikuj odczyty obejmujące skrzyżowania na podstawie operacji "N" i zagreguj liczbę odczytów na współrzędne i pasmo skrzyżowania, aby ocenić wzorce łączenia (zobacz Plik uzupełniający 2 , aby uzyskać szczegółowe informacje w wierszu polecenia).
    5. Klasyfikuj kanoniczne miejsca spawów: Klasyfikuj miejsca łączenia jako kanoniczne, jeśli pasują do węzłów GT-AG z adnotacjami.
      UWAGA: W rzadkich przypadkach allele referencyjne w MaPSy mogą wykorzystywać niekanoniczne miejsca splicingu. Odczyty, które nie mają skrzyżowań obejmujących wyznaczone położenie miejsca łączenia, są zachowywane jako odczyty bez spawania.
  3. Analiza statystyczna w celu zidentyfikowania wariantów splicingu: Kategoryzuj odczyty w trzech grupach:
    (1) odczyty ze złączkami i bez nich;
    (2) kanoniczne i niekanoniczne spośród wszystkich łączonych odczytów;
    (3) Odczyty kanoniczne kontra niekanoniczne plus niepołączone.
    Przeprowadź dwustronny dokładny test Fishera, a następnie poprawkę współczynnika fałszywych wykryć (FDR) (Tabela 3), aby ocenić wpływ wariantów na wydajność i dokładność spawania.
  4. Filtruj pod kątem wariantów łączenia o wysokim poziomie ufności: Sklasyfikuj obie pary odwołania/wariantu przekraczające 100 liczb odczytów z wartością q mniejszą niż 0,05 w czterech powtórzeniach jako znaczące. Następnie rozważ kandydatów z 2-krotną zmianą ilorazu szans z allelem referencyjnym lub wariantowym mającym >5% odczytów niesplicingowych i niekanonicznych, warianty splicingu o wysokim poziomie ufności (Figura 4B).
OdczytujeŁączonejNiesklejone i/lub niekanoniczne
Odniesienieab
Wariantcd 

Tabela 3: Tabela dwa na dwa dla dokładnego testu Fishera.

5. Walidacja

  1. Minigene splicing do walidacji:
    1. Synteza i amplifikacja oligonukleotydów: Synteza oligonukleotydów wybranych sekwencji kandydujących na MaPSy indywidualnie (np. za pomocą zintegrowanych technologii DNA). Następnie amplifikuj oligonukleotydy za pomocą zaprojektowanych sekwencji flankujących do podwójnych nici za pomocą PCR przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności (Tabela 2).
    2. Klonowanie minigenowe: Trawić zarówno powstałe produkty PCR, jak i pGint-CAMTA2 przez BbsI i SmaI oraz licytować strawiony produkt za pomocą ligaz DNA.
    3. Transfekcja: Transfekcja powstałych konstruktów do komórek HEK293T użyciu odczynnika do transfekcji zgodnie z etapem 3.2.2.
    4. Ekstrakcja RNA: Ekstrakcja RNA z transfekowanych komórek, zgodnie z opisem w kroku 3.3.
    5. Odwrotna transkrypcja: Przeprowadź reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) przy użyciu losowych heksamerów.
    6. Amplifikacja izoform splicingu: Amplifikuj izoformy splicingu za pomocą starterów ukierunkowanych na pierwsze dwa eksony minigenu (Lib0F i Lib0Rl, Tabela 1, ustawienia termocyklera w Tabeli 2). Rozpuścić amplifikowane produkty za pomocą elektroforezy i wizualizować za pomocą systemu Gel Doc.
    7. Kwantyfikacja: Określ ilościowo intensywność sygnału każdej izoformy splicingu za pomocą ImageJ (National Institutes of Health, USA)25,26. Alternatywnie można użyć zestawu do badań przesiewowych DNA przy użyciu wysokowydajnego analizatora kwasów nukleinowych eGENE HDA-GT12 w celu ilościowego określenia intensywności i masy cząsteczkowej produktów PCR.
    8. Ekstrakcja i potwierdzenie izoformy: Wyizoluj każdą izoformę przez ekstrakcję żelu agarozowego w kroku 2.3 i potwierdź wynik splicingu przez sekwencjonowanie Sangera produktów PCR za pośrednictwem głównego obiektu lub usługi komercyjnej, oceniając pod kątem normalnego splicingu, inkluzji intronów i pomijania eksonów.
  2. Minigeny splicingu wieloeksonowego:
    1. Po walidacji wyników MaPSy wybierz wariant będący przedmiotem zainteresowania i sklonuj od trzech do pięciu eksonów z genomowego DNA (gDNA), aby zapewnić bardziej genomiczny kontekst dla obserwowanego defektu splicingu.
    2. Przeprowadź mutagenezę ukierunkowaną na miejsce przy użyciu starterów mutagenizujących i nakładającego się PCR w celu złożenia konstruktów minigenowych zawierających pożądaną zmianę sekwencji w miejscu docelowym.
      UWAGA: Jeśli flankujące introny są zbyt długie, aby można je było sklonować, zachowaj około 300 nt sekwencji intronowej dla każdego miejsca splicingu, aby zapewnić odpowiedni kontekst splicingu.
    3. Przeprowadzić test splicingu oparty na komórkach, jak opisano powyżej w ppkt 5.1.
  3. Walidacja komórkowa: Aby zweryfikować efekt splicingu w komórkach, użyj edycji CRISPR opartej na szablonach, aby zmienić sekwencję wybranych wariantów w odpowiednim modelu komórkowym.
    UWAGA: Jeśli to możliwe, należy użyć próbek ludzkich zawierających określony wariant, aby bezpośrednio ocenić wzór łączenia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po splicing komórkowym konstruktów MaPSy, zarówno produkty splicingowane, jak i niesplicowane są obecne jako mieszanina. Ze względu na różnorodność rozmiarów biblioteki i potencjał do niekanonicznego łączenia, oba rodzaje produktów mogą wydawać się nieco rozproszone na żelu. W konstruktach ukierunkowanych na koniec 3', drugi intron, zawierający częściowe sekwencje adenowirusowe, ma tendencję do bardzo silnego splicingu (ryc. 4A).

W eksperymentach MaPSy około 10-30...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wewnętrzny sygnał EGFP w konstrukcji MaPSy umożliwia wykrywanie przeskakiwania eksonów w oparciu o fluorescencję. Jeśli sekwencja w środkowym eksonie lub intronach sprzyja przeskakiwaniu eksonów, ligacja pierwszego i trzeciego eksonu wytwarza sygnał EGFP wykrywalny przez FACS, co czyni ją cenną metodą identyfikacji wariantów wpływających na pomijanie eksonów i ułatwiającą wizualizację wariantów splicingu opartą na mikroskopii13. Jednak opisane w niniejszym dokumencie podejście sekwencjonowania amp...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wsparcie finansowe dla tych prac zostało zapewnione przez Career Development Award, Multidisciplinary Health Cloud Research Program, Grand Challenge Seed Grant of Academia Sinica (AS-CDA-108-M03, AS-PH-109-01-3 i AS-GCS-113-L03), Nagrodę Rozwoju Kariery Narodowych Instytutów Badań nad Zdrowiem na Tajwanie (NHRI-EX112-10908BC) oraz Excellent Young Scholar Research Grants i Ta-You Wu Memorial Award Narodowej Rady Nauki i Technologii. Tajwan (MOST 112-2628-B-001-009-MY3 i 108-2118-M-001-013-MY5).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zestaw MiniPrep Plus z bezpośrednim zolem RNABadania ZymoCzynnik R2072
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni (DMEM)Thermo Fisher Naukowy11965084
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Thermo Fisher Naukowy26140079
L-glutaminaThermo Fisher NaukowyA2916801 
Lipofektamina 3000 Thermo Fisher NaukowyL3000015
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Naukowy15140122
Plazmid pGintAddgene powiedział:24217
Polimeraza DNA o wysokiej wierności PhusionThermo Fisher NaukowyF530L
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquickQiagen powiedział:28706
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR Qiagen powiedział:28106
Zestaw do badań przesiewowych DNA QIAxcel (2400)Qiagen powiedział:929004
Odwrotna transkryptaza SuperScript IVThermo Fisher Naukowy18090010

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baralle, F. E., Giudice, J. Alternative splicing as a regulator of development and tissue identity. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (7), 437-451 (2017).
  2. Gooding, C., et al. A class of human exons with predicted distant branch points revealed by analysis of AG dinucleotide exclusion zones. Genome Biol. 7 (1), R1(2006).
  3. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annu Rev Biochem. 89, 359-388 (2020).
  4. Jaganathan, K., et al. Predicting splicing from primary sequence with deep learning. Cell. 176 (3), 535-548.e24 (2019).
  5. Lim, K. H., Ferraris, L., Filloux, M. E., Raphael, B. J., Fairbrother, W. G. Using positional distribution to identify splicing elements and predict pre-mRNA processing defects in human genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 11093-11098 (2011).
  6. Calabrese, C., et al. Genomic basis for RNA alterations in cancer. Nature. 578 (7793), 129-136 (2020).
  7. Mercer, T. R., et al. Genome-wide discovery of human splicing branchpoints. Genome Res. 25 (2), 290-303 (2015).
  8. Taggart, A. J., et al. Large-scale analysis of branchpoint usage across species and cell lines. Genome Res. 27 (4), 639-649 (2017).
  9. Pineda, J. M. B., Bradley, R. K. Most human introns are recognized via multiple and tissue-specific branchpoints. Genes Dev. 32 (7-8), 577-591 (2018).
  10. Zeng, Y., et al. Profiling lariat intermediates reveals genetic determinants of early and late co-transcriptional splicing. Mol Cell. 82 (24), 4681-4699 (2022).
  11. Xiong, H. Y., et al. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347 (6218), 1254806(2015).
  12. Cheng, J., et al. MMSplice: modular modeling improves the predictions of genetic variant effects on splicing. Genome Biol. 20 (1), 48(2019).
  13. Chong, R., et al. A multiplexed assay for exon recognition reveals that an unappreciated fraction of rare genetic variants cause large-effect splicing disruptions. Mol Cell. 73 (1), 183-194.e8 (2019).
  14. Rosenberg, A. B., Patwardhan, R. P., Shendure, J., Seelig, G. Learning the sequence determinants of alternative splicing from millions of random sequences. Cell. 163 (3), 698-711 (2015).
  15. Jian, X. Q., Boerwinkle, E., Liu, X. M. In silico tools for splicing defect prediction: a survey from the viewpoint of end users. Genet Med. 16 (7), 497-503 (2014).
  16. Riepe, T. V., Khan, M., Roosing, S., Cremers, F. P. M., 't Hoen, P. A. C. Benchmarking deep learning splice prediction tools using functional splice assays. Hum Mutat. 42 (7), 799-810 (2021).
  17. Chiang, H. L., et al. Mechanism and modeling of human disease-associated near-exon intronic variants that perturb RNA splicing. Nat Struct Mol Biol. 29 (11), 1043-1055 (2022).
  18. Gupta, A. K., et al. Degenerate minigene library analysis enables identification of altered branch point utilization by mutant splicing factor 3B1 (SF3B1). Nucleic Acids Res. 47 (2), 970-980 (2019).
  19. Landrum, M. J., et al. ClinVar: public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D862-D868 (2016).
  20. Sherry, S. T., Ward, M. H., Sirotkin, K. dbSNP-database for single nucleotide polymorphisms and other classes of minor genetic variation. Genome Res. 9 (8), 677-679 (1999).
  21. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  22. Kim, D., Landmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nat Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
  23. Kim, D., Paggi, J. M., Park, C., Bennett, C., Salzberg, S. L. Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype. Nat Biotechnol. 37 (8), 907-915 (2019).
  24. Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), giab008(2021).
  25. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  26. Lind, R. Open Source Software for Image Processing and Analysis: Picture this with ImageJ. Open Source Software in Life Science Research. , Woodhead Publishing. Cambridge. (2012).
  27. Huang, A. C., et al. SpliceAPP: an interactive web server to predict splicing errors arising from human mutations. BMC Genomics. 25 (1), 600(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Splicing ErrorsIntronic VariantsRNA SplicingMassively Parallel AssaySplicing MinigenesExon JunctionSpliceosome AssemblyGenome EditingSplicing EfficiencyDisease Mutations

Related Articles