Artykuł metodologiczny

Produkcja wektorów wirusowych do badań i terapii oparta na rekombineringu

DOI:

10.3791/68988

⸱

26 września 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CEINGE Biotecnologie Avanzate Franco Salvatore S.C.aR.L., 2Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 3ImGen-T Srl

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinacja, metoda inżynierii genetycznej opartej na rekombinacji, umożliwia precyzyjne modyfikacje genomu wirusa bez polegania na trawieniu enzymatycznym. Podejście to ma kluczowe znaczenie dla badań podstawowych, takich jak celowane delecje, oraz dla rozwoju zmodyfikowanych wirusów stosowanych w terapiach onkolitycznych, terapii genowej i szczepionkach genetycznych, rozszerzając możliwości zarówno w zastosowaniach badawczych, jak i klinicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rosnące zapotrzebowanie na zmodyfikowane wektory wirusowe zarówno w badaniach podstawowych, jak i translacyjnych uwypukliło potrzebę elastycznych, szybkich i skalowalnych metod generowania rekombinowanych wirusów DNA. Strategie opierające się na trawieniu i ligacji enzymów restrykcyjnych są ograniczone przez ograniczenia zależne od sekwencji i czasochłonne etapy klonowania. W tym miejscu opisujemy metodę inżynierii genetycznej za pośrednictwem rekombinacji (rekombinering), która omija te ograniczenia, umożliwiając precyzyjne i bezproblemowe modyfikacje genomów wirusowych w bakteryjnych sztucznych chromosomach (BAC). Takie podejście pozwala na efektywną delecję, insercję lub podstawienie kodujących lub niekodujących elementów genetycznych, zapewniając potężną platformę do wysokoprzepustowego rozwoju wektorów wirusowych. Rekombinacja jest szczególnie cenna w podstawowych zastosowaniach badawczych, takich jak delecja lub mutacja genów wirusa w celu zbadania ich funkcji. Co ważniejsze, metodologia ta umożliwia równoległe generowanie dziesiątek rekombinowanych wirusów kodujących różne ładunki immunostymulujące lub terapeutyczne, dzięki czemu wyjątkowo dobrze nadaje się do szybkiej oceny przedklinicznej nowych konstruktów. Chociaż technologia ta może być potencjalnie wdrożona do dowolnego celu naukowego, niniejszy artykuł koncentruje się na zastosowaniu rekombinacji w dwóch konkretnych obszarach: generowaniu wirusów onkolitycznych opartych na wirusie opryszczki pospolitej oraz opracowywaniu niereplikacyjnych wektorów adenowirusowych do transferu genów. Podsumowując, rekombineryzacja oferuje wszechstronne podejście do inżynierii genomu wirusa, znacznie przyspieszając proces od projektu do testowania funkcjonalnego. Jego znaczenie rozciąga się od podstawowej wirusologii po medycynę translacyjną, aby sprostać zmieniającym się potrzebom badawczym i klinicznym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wektory wirusowe stały się potężnymi narzędziami w terapii genowej, wirusoterapii onkolitycznej i opracowywaniu szczepionek genetycznych ze względu na ich naturalną zdolność do dostarczania materiału genetycznego do komórek gospodarza. Wykorzystują one naturalne mechanizmy tropizmu i transdukcji wirusów, ułatwiając zarówno przejściową, jak i długoterminową ekspresję genów. Są w stanie przetrwać w środowisku zewnątrzkomórkowym, przyłączyć się do specyficznego receptora komórkowego (który definiuje tropizm wirusowy) i promować ich internalizację, przejąć kontrolę nad maszynerią ekspresji genów komórki gospodarza i kierować ekspresją własnych genów oraz wymknąć się czujnikom błonowym i wewnątrzkomórkowym wrodzonego ramienia odpornościowego 1,2. W ten sposób, po produktywnej infekcji wirusowej, wirusy przekształcają komórki w fabryki potomstwa wirusa, które rozprzestrzeniają nowe wirusy do organizmu, ostatecznie powodując chorobę.

Wirusy typu dzikiego mogą zostać przekształcone w narzędzie biotechnologiczne za pomocą inżynierii genetycznej: ich genomem można łatwo manipulować, aby zachować zdolność transdukcji i uzyskać wynik kliniczny. W zależności od ich zastosowania klinicznego, wektory wirusowe mogą być modyfikowane w taki sposób, aby zachowywały (przynajmniej częściowo) lub były ablowane w swojej zdolności replikacyjnej w celu wytworzenia wektorów kompetentnych lub niekompetentnych do replikacji 3,4.

Wirusy zdolne do replikacji są przeznaczone głównie do celów wirusów onkolitycznych. Komórki nowotworowe, często z niedoborem obrony przeciwwirusowej1, umożliwiają replikację atenuowanych rekombinowanych wirusów zmodyfikowanych przez delecję genów wirulencji. Wirusy te selektywnie replikują się w guzach, oszczędzając normalną tkankę. Wraz z postępem w zrozumieniu wirusologii, atenuowane wirusy zostały zastąpione bardziej precyzyjnymi modyfikacjami genomu mającymi na celu zwiększenie zarówno bezpieczeństwa, jak i skuteczności terapeutycznej.

Wśród obszarów zainteresowań wymagających chirurgicznej inżynierii molekularnej genomów wirusów są: i) Wirusy onkolityczne warunkowe replikacji, w których promotory wirusowe są zastępowane promotorami związanymi z nowotworem (promotory komórkowe nadmiernie transkrybowane w komórkach nowotworowych), ograniczając w ten sposób ekspresję genów wirusa do chorych komórek5. ii) Wirusy ze zmienionym tropizmem 6,7, w których glikoproteiny otoczkowe, które determinują infekcję, mogą być modyfikowane lub zastępowane fragmentami przeciwciał lub ligandami, które celują w białka ulegające nadekspresji na komórkach nowotworowych 8,9. iii) Uzbrojone wirusy onkolityczne. Śmierć komórek nowotworowych indukowana przez wirusy onkolityczne wyzwala immunogenną śmierć komórki (ICD), charakteryzującą się uwalnianiem mediatorów stanu zapalnego 1,10 i antygenów nowotworowych11. Sygnały te sprzyjają skutecznemu rozpoznawaniu antygenów nowotworowych przez układ odpornościowy, przywracając nadzór12i umożliwiając połączenie z inhibitorami immunologicznych punktów kontrolnych 13,14,15 i innymi terapiami immunologicznymi, takimi jak terapie oparte na RNA i szczepionki 16.

Na poparcie tego efektu immunoterapeutycznego, w genomie wirusa mogą być kodowane transgeny, które mogą być kodowane, wykorzystując w ten sposób wirusa nie tylko ze względu na jego aktywność onkolityczną, ale także do zwiększenia jego potencjału immunoterapeutycznego poprzez produkcję in situ odpowiednich ładunków 3,7,17,18,19. Ładunki te mogą zawierać cytokiny, chemokiny, przeciwciała, geny samobójcze i antygeny 3,20. Insercja wymaga precyzji, przy czym preferowane są międzygenowe regiony genomu wirusa, aby zminimalizować zakłócenia genów wirusa i zachować replikację i siłędziałania 7. Dlatego niezbędne są techniki, które umożliwiają badania przesiewowe zarówno optymalnych miejsc insercji, jak i transgenów będących przedmiotem zainteresowania.

Z drugiej strony, w kontekście wirusów niereplikatywnych, stosowanych w terapii genowej lub jako nośniki szczepionek genetycznych, ważne jest, aby wektor wirusowy dostarczał transgen (przejściowo lub długotrwały) bez replikacji do komórki gospodarza, aby uniknąć toksyczności21. Wektory adenowirusowe charakteryzują się wysoką wydajnością transdukcji, silną ekspresją transgenów oraz zdolnością do infekowania zarówno komórek dzielących się, jak i niedzielących się3. Właściwości te sprawiły, że stały się one pierwszymi w swojej klasie szczepionkami genetycznymi, w tym szczepionkami przeciwko nowo pojawiającym się chorobom zakaźnym, takim jak COVID-19, a także terapiom zastępczymgenów 22. Najbardziej znanym przykładem wektora adenowirusowego, który trafił na rynek, jest szczepionka Oxford-AstraZeneca COVID-19, znana pod nazwą handlową Covishield lub Vaxzevria, oparta na zmodyfikowanym adenowirusie szympansa, ChAdOx1, kodującym białko Spike SARS-CoV-2. Po wstrzyknięciu drogą domięśniową, Covishield jest w stanie przeniknąć do wnętrza komórek i indukować ekspresję białka Spike, przygotowując układ odpornościowy do wytworzenia odpowiedzi immunologicznejprzeciwko niemu.

Istnieje wyraźna potrzeba modyfikacji genomów wirusów bez ograniczania ich przez miejsca rozpoznawania enzymów restrykcyjnych. Wśród wirusów onkolitycznych wektory oparte na wirusie opryszczki pospolitej 1 (HSV-1) oferują wyjątkowe zalety, w tym zdolność lityczną, bezpieczeństwo i duży rozmiar genomu, umożliwiając wprowadzenie znacznych transgenów lub wielu elementów genetycznych23,24. Poza HSV, wiele innych wirusów wykazuje obiecujące właściwości terapeutyczne, jak niedawno omówiono w Sasso i wsp.3. Zamiast uniwersalnego wektora "najlepszego w swojej klasie", różne platformy wirusowe są dostosowane do różnych potrzeb terapeutycznych3. Obecnie systemy rekombinacji homologicznej w klonowaniu bakterii lub hybrydowych drożdży i bakterii pozostają najczęstszą alternatywą dla enzymów restrykcyjnych, ale są one pracochłonne, wieloetapowe i nieefektywne25.

Pojawiającą się alternatywą jest zastosowanie CRISPR/Cas9, niedawno zastosowanego do inżynierii genomów wirusów, w tym wirusa krowianki (VV), wirusa opryszczki pospolitej i wektorów adenowirusowych. Cas9 jest atrakcyjny dla inaktywacji genów poprzez mutacje indel, ale staje się mniej praktyczny, gdy wymagane są wielokrotne cięcia w celu usunięcia segmentów genomu lub wstawienia transgenu za pośrednictwem DNA dawcy. Co więcej, edycja jest ograniczona przez konstrukcję gRNA, efekty off-target zarówno w genomach wirusa, jak i gospodarza oraz zależność od sekwencji PAM w regionach będących przedmiotem zainteresowania25.

Mając to na uwadze oraz na dwóch przykładach opartych na HSV i adenowirusie, niniejszy artykuł ilustruje metodę rekombinacji, która może być szeroko stosowana - od wirusów po bakteriofagi, złożone plazmidy i różne systemy eksperymentalne. Rekombinacja (homologous RECOMBInation-mediated genetic engiNEERING) to technika inżynierii genetycznej in vivo , stosowana głównie w Escherichia coli, która wykorzystuje zależne od temperatury białka rekombinacji bakteriofagów do katalizowania homologicznej rekombinacji między elementami DNA przy zaledwie 30 pz homologii26. Takie podejście pozwala na precyzyjną insercję, delecję lub modyfikację sekwencji bez zależności od miejsc restrykcyjnych lub wielkości DNA. W tym manuskrypcie opisujemy wersję opartą na indukowanym ciepłem szczepie E. coli SW102, chociaż dostępne są również alternatywne szczepy ze specyficznymi systemami indukowalnymi27.

Rekombinacja rozpoczyna się od przygotowania elektrokompetentnych komórek bakteryjnych przez kontrolowany szok temperaturowy w celu aktywacji maszynerii rekombinacji fagów. Cząsteczki DNA niosące odpowiednie ramiona homologiczne są następnie elektroporowane. Mogą to być dwuniciowe DNA (dsDNA) generowane przez trawienie restrykcyjne lub PCR lub jednoniciowe DNA (ssDNA), takie jak oligonukleotydy. Obecność sekwencji homologicznych wraz z aktywnymi białkami rekombinacyjnymi umożliwia tworzenie nowych cząsteczek DNA o pożądanej modyfikacji.

Technologia rekombinowania klonowania molekularnego umożliwia precyzyjną inżynierię genetyczną i jest stosowana w różnych kontekstach, w tym we wprowadzaniu selektywnych lub nieselektywnych markerów do plazmidów, bakteryjnego chromosomalnego DNA i bakteryjnych sztucznych chromosomów (BAC). BAC są szczególnie cenne w klonowaniu dużych fragmentów genomu, w tym DNA adenowirusa i HSV, umożliwiając szybką produkcję wektorów wirusowych. Poza zastosowaniami translacyjnymi, rekombinacja wspiera również badania podstawowe, umożliwiając ukierunkowaną delecję, modyfikację lub wymianę genów wirusowych lub domen białkowych. Rekombinacja ma pewne ograniczenia: krótkie ramiona homologii utrudniają rekombinację w powtarzających się obszarach; Substraty amplifikowane PCR mogą czasami wprowadzać mutacje; a sekwencja regionu docelowego musi być znana.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako warunek wstępny do rekombinacji, musi być dostępny sprawny szczep bakteryjny (np. SW102) z genomem BAC będącym przedmiotem zainteresowania. Chociaż rekombinacja jest wysoce wydajną metodą wzbogacania kolonii, które przeszły pożądaną modyfikację, tutaj opisujemy dwuetapową strategię rekombinacji, określaną jako pierwszy i drugi krok (ryc. 1). W pierwszym kroku kaseta z wyrażeniem zawierająca zarówno pozytywne, jak i negatywne znaczniki selekcji jest wprowadzana do miejsca zainteresowania. W drugim kroku kaseta ta jest zastępowana właściwą modyfikacją genetyczną przeznaczoną dla końcowego genomu. Markery selekcyjne użyte w tym badaniu obejmują oporność na ampicylinę (AmpR), aktywność beta-galaktozydazy (β-gal) i gen sacB ; Można jednak zastosować dowolną kombinację markerów selekcji pozytywnej i negatywnej, w zależności od konkretnych potrzeb grupy badawczej.

1. Włóż kasetę wyboru do regionu docelowego

  1. Dzień 0
    1. Smuga komórek SW102 zawierających pożądany BAC na LB Agar + antybiotyk (którego gen oporności znajduje się w BAC (np. chloramfenikol 12,5 μg / ml). Hodować je przez noc w inkubatorze w temperaturze 32 °C.
      UWAGA: Unikaj temperatur > 32 °C, aby zapobiec indukcji genów rekombinujących podczas tej fazy.
  2. Dzień 1
    1. Wykonaj PCR, aby wzmocnić kasetę selekcyjną AmpR/LacZ/SacB. Użyj starterów do przodu i do tyłu zawierających na końcu 3' sekwencję do wyżarzania i amplifikacji kasety selekcyjnej, a na końcu 5' 30-80 pz, które reprezentują ramiona homologii do regionu genomu wirusa, który ma być zmodyfikowany (Tabela 1).
      UWAGA: Kasetę selekcyjną, jak również wkładkę, można łatwo zamówić jako konstrukcje syntetyczne u wyspecjalizowanych dostawców. Należy jednak zachować ostrożność, aby uniknąć obecności zduplikowanych promotorów, terminatorów lub innych elementów genetycznych w obrębie BAC (genów kontrolujących BAC) lub w genomie wirusa, aby zapobiec niepożądanym zdarzeniom rekombinacji.
    2. Upewnij się, że tożsamość i czystość fragmentu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (ponieważ kaseta AmpR/LacZ/SacB wynosi 3,400 pz, uruchom 1% żel agarozowy) oraz że wartości 260/230 i 260/280 są zgodne z czystym kwasem nukleinowym.
    3. Po południu zaszczepić pojedynczą kolonię SW102 w 5 ml LB i inkubować przez noc w temperaturze 32 °C.
  3. Dzień 2
    1. Zaszczepić 1-2 ml kultury przez noc w świeżych 100 ml LB. Wyhoduj bakterie do OD600 0,55-0,7, regularnie mierząc OD600 , aby nie przegapić fazy wykładniczej.
    2. Przygotować łaźnię wodną do temperatury 42 °C do indukcji i schłodzić do 4 °C ~ 250 ml sterylnego ddH2O do prania.
    3. Gdy hodowla osiągnie pożądaną średnicę zewnętrzną, przenieść 50 ml do czystej stożkowej probówki i inkubować w temperaturze 42 °C w łaźni wodnej przez 15 minut. Obejmują nieindukowaną kontrolę ujemną.
      UWAGA: Ten krok spowoduje indukcję czerwonych białek lambda.
    4. Pozostawić probówki w lodzie na 10 minut, a następnie odwirować przez 5 minut w temperaturze 3 200 × g w temperaturze 4 °C (zarówno w temperaturze 42 °C indukowanej, jak i nieindukowanej).
    5. Odrzucić supernatant, dodać 40 ml lodowatego, jałowego ddH2O i ponownie zawiesić osad (zarówno indukowany w temperaturze 42 °C, jak i nieindukowany).
    6. Ponownie odwirować przez 8 minut (patrz krok 1.3.4) i powtórzyć etap płukania (etap 1.3.5) i odwirowanie. Powtarzaj etap płukania, aż supernatant będzie czysty jak woda (bez zmętnień i zawiesin) (2-4 prania).
    7. Po ostatnim odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl lodowatego, jałowego ddH2O (zarówno indukowanego w temperaturze 42 °C, jak i nieindukowanego).
    8. Przenieść podwielokrotność zawieszonych osadów (50 μl HSV-1 i 25 μl Adeno) do wstępnie schłodzonych probówek o pojemności 1,5 ml (zarówno indukowanych w temperaturze 42 °C, jak i nieindukowanych). Dodać 50-400 ng oczyszczonego produktu PCR (nie przekraczać 5 μl). Zakręć probówkami i inkubuj na lodzie przez 5 minut.
    9. Przenieś mieszaninę z poprzedniego etapu do wstępnie schłodzonej kuwety i poddaj elektroporację przy napięciu 2,50 kV (2 500 V, kuweta 0,2 cm) (zarówno indukowana w temperaturze 42 °C, jak i nieindukowana).
    10. Po elektroporacji pozwól bakteriom zregenerować się w 1 ml LB przez 1,5 godziny w temperaturze 32 °C. Dodaj 1 ml LB do kuwety, aby ją wyczyścić i zebrać wszystko.
    11. Rozprowadź różne ilości bakterii (10, 50, 200 μL) na LB Agar + Ampicillin (100 μg/ml), X-Gal (20 μg/mL) i IPTG (0,5 mM) i pozwól im rosnąć przez noc (ON) w temperaturze 32 °C.
    12. Przygotować płytki z AMP/X-Gal (takie samo stężenie jak w kroku 1.3.11) i płytki z sacharozą5.
  4. Dzień 3
    UWAGA: W tym momencie oczekuje się, że kolonie wyrosły i że wydają się niebieskie, ale tylko na płytkach, na których bakterie zostały wywołane w temperaturze 42 °C i poddane elektroporacji za pomocą wkładki zawierającej kasetę selekcyjną. Po ustaleniu tego konieczne jest zweryfikowanie integralności kasety selekcyjnej w niektórych rodzinach.
    1. Zidentyfikuj płytki od ON, na których kolonie mają <50, aby uniknąć zbierania dwóch lub więcej kolonii. Wybierz kilka kolonii (zazwyczaj 8-10 wystarczy, aby zidentyfikować co najmniej jedną odpowiednią kolonię) i rozcieńcz je w około 50 μlH2O. Zaszczep pojedyncze, niebieskie kolonie w 50 μlH2Oi rozprowadź je na płytkach selektywnych zarówno ujemnych (LB Agar/Sacharoza/Chloramfenikol), jak i dodatnich (LB Agar/Ampicylina/Chloramfenikol/X-Gal/IPTG) (takie samo stężenie jak w krokach 1.1.2 i 1.3.11) (Rysunek 2).
      UWAGA: Oczekuje się, że na płytce znajdzie się 20-100 kolonii, w których rozrzucono 50 μL. Jeśli jednak liczba kolonii jest mniejsza, nie musi to oznaczać, że rekombinacja jest zagrożona.
    2. Zaszczepić wodę z etapu 1.4.1 w 5 ml LB i inkubować płytki i kulturę LB przez noc w temperaturze 32 °C (ryc. 2).
  5. Dzień 4
    1. Wybierz tylko niebieskie kolonie, które rosły na płytkach Amp / X-Gal i nie rosły na płytkach sacharozy (ryc. 3). Dla tych dodatnich klonów (Tabela 2) przenieść 500 μl podwielokrotności nocnej kultury do 50 ml świeżego LB.
  6. Dzień 5
    1. Dla każdego dodatniego klonu należy przygotować ukłucie glicerolem oraz wyekstrahować i wyizolować plazmid BAC (midiprep).
    2. Po ekstrakcji BAC należy przeprowadzić kontrolę jakości, aby sprawdzić, czy rekombinacja nastąpiła prawidłowo. Wykonaj sekwencjonowanie Sangera w miejscu wprowadzenia. Jeśli wszystko wygląda poprawnie, przejdź do drugiej sekcji.

2. Wymień kasetę selekcyjną na żądaną modyfikację

  1. Dzień 0
    1. Smugi dodatniego klonu na agarze LB. Inkubować przez noc w temperaturze 32 °C.
  2. Dzień 1
    1. Wykonaj PCR, aby wzmocnić insert/modyfikację. Użyj starterów do przodu i do tyłu zawierających na końcu 3' sekwencję do wyżarzania i amplifikacji kasety selekcyjnej, a na końcu 5' te same ramiona homologii 30-80 pz, które użyto w kroku 1.3.1 (Tabela 1).
    2. Upewnić się, że tożsamość i czystość fragmentu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym oraz że wartości 260/230 i 260/280 są zgodne z czystym kwasem nukleinowym.
    3. Zaszczepić pojedynczą kolonię w 5 ml LB i inkubować przez noc w temperaturze 32 °C.
  3. Dzień 2
    1. Przenieś 2 ml kultury przez noc do 100 ml LB i hoduj w temperaturze 32 °C, aż OD600 osiągnie 0,55-0,7 (w ciągu ~2,5-3 godzin). Przygotować łaźnię wodną do temperatury 42 °C do indukcji i schłodzić do 4 °C ~ 250 ml sterylnego ddH2O do prania.
    2. Po osiągnięciu pożądanego OD przenieść 50 ml kultury do stożkowej probówki i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 15 minut w celu indukcji białek rekombinacji λ-fagów. Kolejną probówkę o pojemności 50 ml należy przechowywać w temperaturze 32 °C jako kontrolę nieindukowaną.
    3. Po indukcji ciepła umieść rurki na lodzie na 10 minut.
    4. Wirować przez 8 minut w temperaturze 3 200 × g w temperaturze 4 °C (zarówno indukowanej w temperaturze 42 °C, jak i nieindukowanej).
      UWAGA: Od tego momentu pracuj na lodzie, aby utrzymać kompetencję ogniwa SW102.
    5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 40 ml wstępnie schłodzonej wody, delikatnie obracając.
    6. Wirować przez 5 minut w temperaturze 3 200 × g w temperaturze 0-4 °C.
    7. Powtórz krok prania (krok 2.3.5) jeden raz.
    8. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad w 100 μl wody.
    9. Przenieść podwielokrotność zawieszonych osadów (50 μl HSV-1 i 25 μl Adeno) do wstępnie schłodzonych probówek o pojemności 1,5 ml (zarówno indukowanych w temperaturze 42 °C, jak i nieindukowanych). Dodać 50-400 ng oczyszczonego produktu PCR (nie przekraczać 5 μl). Zakręć probówkami i inkubuj na lodzie przez 5 minut.
    10. Przenieść mieszaninę z poprzedniego etapu do wstępnie schłodzonej kuwety i poddać elektroporacji przy napięciu 2,50 kV (zarówno indukowanym w temperaturze 42 °C, jak i nieindukowanym).
    11. Pozostawić komórki do regeneracji w 5 ml pożywki LB przez 4-5 godzin w temperaturze 32 °C, wstrząsając.
      UWAGA: Czas rekonwalescencji jest dłuższy niż w pierwszym etapie rekombinacji, aby umożliwić degradację resztkowego białka SacB po wymianie kasety.
    12. Umieścić różne ilości (50, 200, 500 μl) kultury na szalkach Petriego z agaru LB zawierających sacharozę, X-Gal i IPTG (takie samo stężenie jak w krokach 1.1.2 i 1.3.11). Inkubować przez noc w temperaturze 32 °C.
  4. Dzień 3
    1. Przebadaj znaczną liczbę kolonii (20-100), aby zwiększyć prawdopodobieństwo identyfikacji pozytywnych klonów, które pomyślnie przeszły rekombinację z fragmentem przenoszącym pożądaną modyfikację i kasetą selekcyjną. Przeprowadź badanie przesiewowe pierwszego poziomu za pomocą PCR kolonii. Użyj szalki Petriego z siatką; wybierz kolonie z danego kwadrantu i oznacz je (Rysunek 4).
      UWAGA: Szczególnie skuteczne podejście polega na użyciu pary starterów, w których jeden starter wyżarza się poza regionem docelowym (w genomie wirusa), a drugi w rekombinowanym fragmencie (ryc. 5).
    2. Sprawdź obecność i wielkość amplikonu PCR za pomocą żelu agarozowego (1,5%).
    3. Wybrać z właściwej ćwiartki dodatnie klony i zaszczepić w 100 ml LB. Inkubować przez noc w temperaturze 32 °C.
  5. Dzień 4:
    1. Wykonaj midiprep, aby wyekstrahować plazmid z kultur bakteryjnych.
    2. Trawić plazmid za pomocą enzymów restrykcyjnych i uruchomić żel agarozowy, aby przeanalizować wzorzec trawienia.
    3. Jeśli wzorzec trawienia jest prawidłowy, przystąp do sekwencjonowania zmodyfikowanego regionu genomu wirusa.
    4. Po upewnieniu się o tożsamości molekularnej rekombinowanych klonów, przystąp do transfekcji i ratowania cząstek wirusa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wytwarzanie onkolitycznego wirusa opryszczki kodującego IL12
Jak podkreślono w części wprowadzającej niniejszej pracy, jednym z potencjalnych zastosowań rekombineracji jest wprowadzanie transgenów immunostymulujących do genomu wirusów onkolitycznych w celu zwiększenia ich potencjału immunoterapeutycznego. Poniżej przedstawiamy przykład takiego zastosowania z wykorzystaniem wektora onkolitycznego opartego na HSV-1. W szczególności badanie to bada wpływ insercji transgenu do locus międzygenowego w regio...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół "RECOMBINEERING" (homologous RECOMBInation-mediated genetic engiNEERING) wykorzystuje dwuetapową strategię: po pierwsze, integrację kasety selekcyjnej z interesującym nas locus genomowym, a po drugie, zastąpienie tej kasety pożądaną modyfikacją (ryc. 1).

Stosowane markery selekcyjne obejmują oporność na ampicylinę (AmpR), beta-galaktozydazę (β-gal) i sacB. AmpR umożliwia selekcję opartą na oporności na antybiotyki, β-gal umożliwia badanie przesiewowe ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych istotnych interesów finansowych ani niefinansowych, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez: PRIN 2022-MUR Włochy, Grant 20224NCSN5 (PreMeRetHOn). POR Campania: piattaforma per lo sviluppo di nuove tecnologie vaccinali. PNRR CN3 Narodowe Centrum Terapii Genowej i Leków w oparciu o technologię RNA. PNRR PE13 "Podstawowe i translacyjne działania badawcze w ramach programu "Jedno zdrowie" dotyczące niezaspokojonych potrzeb w zakresie pojawiających się chorób zakaźnych. Autorzy dziękują usłudze syntezy Geneart za dostarczenie niestandardowych DNA. Autorzy wyrażają również szczerą wdzięczność Michele Veneruso, która przyczyniła się do pomyślnego zakończenia tego badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AmpicylinyjakikolwiekjakikolwiekKlasa molekularna
Dla oligo do wzmocnienia Il-12: CTGGCTAGCGTTTAA
ACGGGCCCTCTAGACTCG
AGCGGCCGCACGCCACCA
TGTGTCCTCAGAAGCTAACC		jakikolwiekjakikolwiekOczyszczony HPLC
Dla oligo do amplofy AmpR/LacZ/SacB  Kaseta: CTGGCTAGCGTTTAAA
CGGGCCCTCTAGACTCGAG
CGGCCGCACGCCACCACC
CCTATTTGTTTATTTTTC		jakikolwiekjakikolwiekOczyszczony HPLC
Protokół IPTGjakikolwiekjakikolwiekKlasa molekularna
Agar LB
LB średni
Phusion Hot Start II Polimeraza DNA o wysokiej wierności Thermo ScientificZobacz materiał F549S
Rev oligo do amplifikacji Il12: GGCAACTAGAAGGCA
CAGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTTC
AGGCGGAGCTCAGATAG 		jakikolwiekjakikolwiekOczyszczony HPLC
Rev oligo do amplofy AmpR/LacZ/SacB  kaseta: GGCAACTAGAAGGCAC
AGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTT
TATTTGTTAACTGTTAATTG 		jakikolwiekjakikolwiekOczyszczony HPLC
Kaseta selekcyjna SacB/AmpR/LacZTen rękopis--
SacharozajakikolwiekjakikolwiekKlasa molekularna
SW102 z BAC-HSV-1 lub BAC-AdvTen rękopis--
TryptonjakikolwiekjakikolwiekKlasa molekularna
Żel Wizard SVPreparat PromegaNumer katalogowy A9281
Procesor X-galjakikolwiekjakikolwiekKlasa molekularna
Ekstrakt drożdżowyjakikolwiekjakikolwiekKlasa molekularna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers (Basel). 12 (11), 3407(2020).
  2. Froechlich, G., et al. The common H232 STING allele shows impaired activities in DNA sensing, susceptibility to viral infection, and in monocyte cell function, while the HAQ variant possesses wild-type properties. Sci Rep. 13 (1), 19541(2023).
  3. Sasso, E., et al. New viral vectors for infectious diseases and cancer. Semin Immunol. 50 (1), 101430(2020).
  4. Ma, C. C., Wang, Z. L., Xu, T., He, Z. Y., Wei, Y. Q. The approved gene therapy drugs worldwide: from 1998 to 2019. Biotechnol Adv. 40 (3-4), 107502(2020).
  5. Sasso, E., et al. Replicative conditioning of herpes simplex type 1 virus by survivin promoter, combined to ERBB2 retargeting, improves tumour cell-restricted oncolysis. Sci Rep. 10 (1), 4307(2020).
  6. Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. Int J Mol Sci. 22 (2), 477(2021).
  7. De Lucia, M., et al. Retargeted and multi-cytokine-armed herpes virus is a potent cancer endovaccine for local and systemic anti-tumor treatment. Mol Ther Oncolytics. 19 (1), 253-264 (2020).
  8. Sasso, E., et al. One-step recovery of scFv clones from high-throughput sequencing-based screening of phage display libraries challenged to cells expressing native claudin-1. Biomed Res Int. 2015 (1), 703213(2015).
  9. Rusciano, G., Sasso, E., Capaccio, A., Zambrano, N., Sasso, A. Revealing membrane alteration in cells overexpressing CA IX and EGFR by surface-enhanced Raman scattering. Sci Rep. 9 (1), 1832(2019).
  10. Lin, D., Shen, Y., Liang, T. Oncolytic virotherapy: basic principles, recent advances and future directions. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 156(2023).
  11. Troise, F., et al. Prime and pull of T cell responses against cancer-exogenous antigens is effective against CPI-resistant tumors. Mol Ther Oncolytics. 32 (1), 200760(2024).
  12. Shalhout, S. Z., Miller, D. M., Emerick, K. S., Kaufman, H. L. Therapy with oncolytic viruses: progress and challenges. Nat Rev Clin Oncol. 20 (3), 160-177 (2023).
  13. Sasso, E., et al. Massive parallel screening of phage libraries for the generation of repertoires of human immunomodulatory monoclonal antibodies. MAbs. 10 (7), 1060-1072 (2018).
  14. Vetrei, C., et al. Novel combinations of human immunomodulatory mAbs lacking cardiotoxic effects for therapy of TNBC. Cancers (Basel). 14 (1), 121(2021).
  15. Zambrano, N., et al. High-throughput monoclonal antibody discovery from phage libraries: challenging the current preclinical pipeline to keep the pace with the increasing mAb demand. Cancers (Basel). 14 (5), 1325(2022).
  16. Froechlich, G., Sasso, E. We ARE boosting translation: AU-rich elements for enhanced therapeutic mRNA translation. Mol Ther Nucleic Acids. 36 (2), 102531(2025).
  17. Gentile, C., et al. Generation of a retargeted oncolytic herpes virus encoding adenosine deaminase for tumor adenosine clearance. Int J Mol Sci. 22 (24), 13521(2021).
  18. Finizio, A., et al. Integrating system biology and intratumor gene therapy by trans-complementing the appropriate co-stimulatory molecule as payload in oncolytic herpes virus. Cancer Gene Ther. 31 (9), 1335-1343 (2024).
  19. Tripodi, L., et al. Systems biology approaches for the improvement of oncolytic virus-based immunotherapies. Cancers (Basel). 15 (4), 1297(2023).
  20. Wang, H., et al. Cytokine-armed oncolytic herpes simplex viruses: a game-changer in cancer immunotherapy. J Immunother Cancer. 12 (5), e008025(2024).
  21. D'Alise, A. M., et al. Adenovirus encoded adjuvant (AdEnA) anti-CTLA-4, a novel strategy to improve adenovirus based vaccines against infectious diseases and cancer. Front Immunol. 14 (1), 1156714(2023).
  22. Wold, W. S., Toth, K. Adenovirus vectors for gene therapy, vaccination and cancer gene therapy. Curr Gene Ther. 13 (6), 421-433 (2013).
  23. Goins, W. F., Huang, S., Cohen, J. B., Glorioso, J. C. Engineering HSV-1 vectors for gene therapy. Methods Mol Biol. 1144 (1), 63-79 (2014).
  24. De Chiara, A., et al. Peptide nucleic acid-mediated circularization of target RNA as tool to inhibit translation. Int J Biol Macromol. 308 (1), 142230(2025).
  25. Wang, L., Chen, Y., Liu, X., Li, Z., Dai, X. The application of CRISPR/Cas9 technology for cancer immunotherapy: current status and problems. Front Oncol. 11 (1), 704999(2022).
  26. Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nat Protoc. 4 (2), 206-223 (2009).
  27. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33 (4), e36(2005).
  28. Zhang, W., et al. High-throughput cloning and characterization of emerging adenovirus types 70, 73, 74, and 75. Int J Mol Sci. 21 (17), 6370(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

In ynieria genomu wirusowegobakteryjne sztuczne chromosomyrekombinowane wirusy DNAwirusy onkolitycznewirus opryszczki pospolitejwektory adenowirusowetransfer gen wwysokoprzepustowy rozw j wektor w

Powiązane artykuły