Ocena bezpieczeństwa mikroorganizmów w mleczarstwach za pomocą profilowania bakteryjnego proteomicznego za pomocą podejścia MALDI

Podsumowanie

Protokół ten umożliwia szybką i opłacalną ocenę składu mikroorganizmów w produktach mlecznych poprzez połączenie kulturologii z MALDI-TOF MS. Dostarcza wyniki taksonomiczne porównywalne z sekwencjonowaniem 16S rRNA, z krótszym czasem realizacji niż tradycyjne metody hodowla.

Streszczenie

Przedstawiamy protokół wykorzystujący metodę identyfikacji laserowej desorpcji/jonizacji z zakresu czasu przelotu (MALDI-TOF MS, dalej "MS") do monitorowania obecności mikroorganizmów w różnych produktach mlecznych (masło, mozzarella, mleko, śmietana) z wykorzystaniem podejścia proteomicznego, nowoczesnych metod kulturomicznych oraz różnych procedur przygotowywania próbek, które można wprowadzić do laboratoriów kontroli jakości żywności jako post, niezawodne i solidne narzędzie do monitorowania bezpieczeństwa mikroorganizmów. Obejmuje etap izolacji mikroorganizmów, pobieranie rosnących kolonii, procedury przygotowywania próbek (komórki nienaruszone, pobieranie na miejscu i w tubie), ustawianie parametrów analizy MS, generowanie i zbieranie widm MS (odcisków palców białek), a na końcu taksonomię za pomocą platformy MS, a następnie interpretację i wizualizację danych. Ta metoda, potwierdzona licznymi badaniami, zapewnia bardziej wiarygodną i opłacalną identyfikację mikroorganizmów z mleka w porównaniu z komercyjnymi systemami testów biochemicznych. Wyróżnia się jako obiecujący postęp w mikrobiologii żywności, spełniając różnorodne wymagania laboratoriów dzięki prostym protokołom i znacznie skróconemu czasie analizy. Przedstawiony protokół odpowiada na potrzeby przemysłu spożywczego, zapewniając niezawodną identyfikację mikroorganizmów w odpowiednim czasie realizacji (TAT), który jest dobrze dostosowany do procesów produkcyjnych.

Wprowadzenie

Głównym celem tego protokołu jest zapewnienie kompleksowej metodologii monitorowania bezpieczeństwa mikroorganizmów różnych produktów mlecznych, w tym masła, sera, mleka i śmietanki, poprzez wykorzystanie MS do profilowania bakteryjnego proteomicznego. To podejście, łączące nowoczesną kulturologię z zoptymalizowanymi procedurami przygotowywania próbek, ma być szybkim, niezawodnym i solidnym narzędziem dla laboratoriów bezpieczeństwa żywności i kontroli jakości. Uzasadnienie stworzenia i zastosowania tej metodologii wynika z ograniczeń standardowych metod identyfikacji mikroorganizmów. Przez wiele lat laboratoria weterynaryjne i diagnostyczne żywności polegały na konwencjonalnych testach biochemicznych badających wzrost i metabolizm bakterii na nośnikach różnicowych hodowli, a następnie wykonywano różne testy enzymatyczne¹. Chociaż te metody, często oparte na standardowych wytycznych takich jak Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, są stosunkowo niedrogie i mogą dostarczać zarówno danych ilościowych, jak i jakościowych, są pracochłonne i czasochłonne, wymagają intensywnego przygotowania ośrodka, rozcieńczania próbki, powłokowania, inkubacji, liczenia kolonii, izolacji oraz szczegółowych kroków charakteryzacji ^2,3.

Wprowadzenie komercyjnych systemów półautomatycznych i zautomatyzowanych, takich jak Analytical Profile Index (API), BBL Crystal, Vitek i Biolog MicroPlates, usprawniło identyfikację mikroorganizmów za pomocą testów biochemicznych, zmniejszając tym samym koszty i czas realizacji. Jednak systemy te mają pewne wady, takie jak słaba powtarzalność, brak wpisów w odpowiednich bazach danych oraz trudności w określaniu zmienności fenotypowych między szczepami, szczególnie dla bakterii niefermentujących lub szczepów w obrębie gatunku o drobnych różnicach biochemicznych, co może prowadzić do błędnych wyników in vitro ⁴. W związku z tym SM rozwinęła się jako silna alternatywa, obecnie powszechna w mikrobiologii klinicznej i zyskująca na popularności w laboratoriach diagnostyki weterynaryjnej oraz kontroli jakości mleka. To podejście zostało uzupełnione przez szybkość, dokładność i opłacalność wykrywania kilku mikroorganizmów:¹. Liczne badania wykazały, że SM zapewnia bardziej wiarygodną identyfikację mikroorganizmów z mleka, dając szybsze i tańsze wyniki niż komercyjne systemy testów biochemicznych ^5,6,7. Podczas gdy testy biochemiczne mogą wystarczyć do identyfikacji na poziomie rodzaju lub grupy, diagnoza na poziomie gatunku często wymaga bardziej zaawansowanych metod, takich jak sekwencjonowanie RS (RS) lub 16S^{rRNA 8}. Rzeczywiście, MS jest uważany za obiecującą platformę do elastycznej i niezawodnej identyfikacji izolatów mikroorganizmów żywnościowych, spełniając różnorodne wymagania laboratoriów mikrobiologicznych żywności dzięki prostym protokołom i znacznie skróconemu czasie analizy, co zwiększa bezpieczeństwo żywności ^4,5. Koszty operacyjne są minimalne dzięki niskiemu zużyciu odczynników, a obsługa próbek pozwala na większą automatyzację i wysoką przepustowość⁸. Należy jednak zauważyć, że użyteczność tej metody zależy z natury od wybranych warunków wzrostu mikroorganizmów (w tym typu podłoża hodowlanego) oraz pokrycia gatunków w bazie referencyjnej, które są uznawane za kluczowe czynniki ograniczające jej użyteczność.

MS odgrywa istotną rolę w mikrobiologii żywności, identyfikując i rozróżniając patogenne bakterie kwasu mlekowego (LAB) przenoszone przez żywność oraz inne bakterie fermentujące⁹. Jego zastosowanie obejmuje współczesne gatunki kultururomiki, umożliwiając identyfikację wszystkich kolonii mikroorganizmów uprawianych na podłożu hodowlanym oraz ułatwiając pozyskiwanie informacji o jednostkach tworzących kolonie (CFU)⁷. To podejście zostało już skutecznie zastosowane do odkrywania tak złożonych społeczności mikroorganizmów, jak te występujące w jelitach ludzkich, zaangażowane w infekcje cukrzycowych stóp lub związane z drogami moczowymi, ożywiając metody zależne od kultury w praktykach mikrobiologicznych^10,11.

Protokół ten ma na celu poprowadzenie laboratoriów w skutecznym wdrażaniu MS do rutynowej oceny bezpieczeństwa mikroorganizmów w produktach mlecznych, odpowiadając na potrzeby branży dotyczące niezawodnej identyfikacji mikroorganizmów w praktycznym czasie realizacji (TAT) odpowiednim dla procesów produkcyjnych. Protokół określa kluczowe kroki, w tym (1) izolację mikroorganizmów z płynnych (mleko, śmietanka, serwatka) i stałych (masło, ser) produktów mlecznych przy użyciu wybranych odpowiednich podłoży hodowlanych (de Man, Rogosa i Sharpe agar - MRS agar, agar M-17, All-Purpose Tween 80 agar - APT agar, China Blue Lactose agar - CBL agar, Milk Plate Count Agar - MPCA, Tryptic Soy Agar - TSA) oraz dostosowane warunki inkubacji; (2) ustandaryzowane procedury przygotowywania próbek do analizy MS, oferujące opcje takie jak bezpośredni transfer kolonii, ekstracja kwasu mrówkowego na miejscu oraz ekstrakcja białek etanolu/kwasu mrówkowego w tubce, dostosowana do różnych typów bakterii i procesów laboratoryjnych; oraz (3) systematyczną analizę MS, w tym kalibrację instrumentów, definiowanie optymalnych parametrów pozyskiwania widm oraz wytyczne dotyczące interpretacji danych, w tym ocenę wartości wyników i sprawdzenie spójności dla pewnego przypisania taksonomicznego. Dzięki uporządkowanemu i zweryfikowanemu podejściu protokół ten ma na celu zwiększenie dokładności i efektywności monitorowania mikroorganizmów w przemyśle mleczarskim, co ostatecznie przyczynia się do poprawy jakości żywności i zdrowia publicznego.

Protokół

Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Izolacja bakterii związanych z nabiałem

1. Pozyskiwanie kultur bakteryjnych z płynnych lub stałych produktów mlecznych
   1. Wybór mediów kulturowych
      1. Do izolacji bakterii z próbek mlecznych należy wybrać podłoże hodowlane zgodnie z oczekiwanymi grupami mikroorganizmów, w tym ogólnym medium wzrostowym, podłożem dla bakterii Gram-ujemnych, bakterii kwasu mlekowego (LAB), bakterii tworzących zarodniki, a także wolno rosnących lub wybrednych mikroorganizmów.
         UWAGA: Aby zmaksymalizować odbudowę zarówno gatunków dominujących, jak i rzadkich, należy szczepić wiele ośrodków równolegle. Zestaw przykładowych podłoży do analizy mikrobiomu z próbek mlecznych przedstawiono w Tabeli 1.
   2. Inokulacja i powłoka
      1. Pobierz reprezentatywną próbkę produktu mlecznego i dokładnie wymieszaj.
      2. Aseptycznie przenieś 1 mL (próbki ciekłe: mleko, śmietanka, maślanka) lub 1 g (próbki stałe: ser, masło) próbki do stożkowej wirówki o pojemności 15 mL zawierającej 9 ml sterylnego płynnego medium (woda peptonowa / 0,85% roztwór NaCl). W przypadku próbek stałych podgrzej ciekłe medium do 40-42 °C przed dodaniem próbki.
      3. Homogenizuj próbkę, intensywnie wirując przez 30-60 sekund. W przypadku próbek tłuszczowych lub twardych kontynuuj homogenizację, aż uzyska się równomierną zawiesinę.
      4. Przygotuj serię dziesięciokrotnych rozcieńczeń, biorąc 1 mL zawiesiny i przelewając ją do kolejnych probówek zawierających 9 mL roztworu sterylnego. Dobrze wymieszaj każde rozcieńczenie.
         UWAGA: W zależności od rodzaju próbki i przewidywanego poziomu skażenia mikroorganizmów przygotuj rozcieńczenia w zakresie od ^10-1 do ^10-6. Dla większości próbek wystarczy rozcieńczenie do ^10-3 ; Jednak przy analizie świeżego mleka lub sera pleśniowego konieczne będzie przygotowanie dalszych rozcieńczeń. Aby zapewnić dokładną izolację i ułatwić wybór kolonii, optymalna rozcieńczenie inokulacji powinno dawać od 30 do 300 kolonii na płytce. Ten zakres pozwala na wyraźne zróżnicowanie poszczególnych kolonii i minimalizuje ryzyko nakładania się wzrostu, ułatwiając uzyskanie nieskażonych i jednorodnych kultur bakteryjnych do późniejszej analizy. W przypadku niektórych przetworzonych produktów mlecznych (np. maślanki) do bezpośredniego podawania może być użyta nierozcieńczona świeża próbka (np. 0,1 mL).
      5. Pobierz 0,1 mL próbki lub jej rozcieńczenia i przełóż na powierzchnię wcześniej przygotowanych szalek Petriego zawierających odpowiednie medium agarowe.
      6. Równomiernie rozprowadzaj inokulum na powierzchni agaru za pomocą sterylnego rozprowadzacza. Pozwól inokulum wchłonąć się do podłoża przez 15 minut, a potem odwróć płytki.
   3. Inkubacja
      1. Inkubacja tlenowa: dla wszystkich badanych próbek inokuluj płytki agarowe APT, M-17, CBL, MPCA i TSA, inkubuj w warunkach aerobowych w temperaturach 37 °C i 30 °C przez 24 godziny. Temperatury inkubacyjne były określane na podstawie optymalnych wymagań wzrostu różnych grup mikroorganizmów, kluczowych dla oceny zarówno jakości higienicznej (30 °C dla mezofilów ogólnych), jak i bezpieczeństwa zdrowia publicznego (37 °C dla patogenów powiązanych z człowiekiem i organizmów wskaźnikowych) produktów mlecznych.
         UWAGA: Jeśli spodziewany jest intensywny wzrost bakterii tworzących zarodniki, w przypadku TSA preferowany jest krótszy (~12 h) czas inkubacji.
      2. Inkubacja beztlenowa: dla wszystkich badanych próbek inokulować płytki MRS Agar, inkubować w warunkach beztlenowych w 37 °C i 30 °C przez 24-72 godziny, codziennie kontrolując wzrost mikroorganizmów. Temperatury inkubacji zostały określone zgodnie z krokiem 3.1.
         UWAGA: Warunki beztlenowej inkubacji można osiągnąć poprzez umieszczenie płytek w szczelnych pojemnikach z saszetkami generującymi atmosferę beztlenową, które eliminują tlen i zapewniają odpowiednią atmosferę dla wzrostu bakterii beztlenowych.
   4. Uzyskanie czystych kultur
      1. Po wysybaniu inspekcja płytek i wybieranie pojedynczych kolonii na podstawie ich cech morfologicznych (np. rozmiar, kształt, kolor, faktura).
      2. Oczyszcz wybrane kolonie poprzez subkulturę (rozmazywanie) na tym samym medium agarowym, używając pętli mikrobiologicznej o pojemności 1 μL i przy tych samych warunkach inkubacji.

Medium kulturowe	Aplikacja	Warunki hodowli
Tryptyczny agar sojowy (TSA)	Ogólne podłoże do hodowli szerokiego spektrum bakterii	30–37 °C, 24–48 h, aerobowe
Agar krwi (BLA; z 5% krwi owcy)	wzbogacone, różnicowanie hemolizy, przydatne dla Streptococcus, Listeria, Bacillus	30–37 °C, 24–48 h, aerobowe
MRS agar (de Man, Rogosa i Sharpe agar)	selektywne dla Lactobacillus i innych LAB Dodaj 1% Tween-80, aby wspierać wzrost L. casei, L. delbrueckii, L. helveticus lub L. acidophilus.	30 °C, 48–72 h, beztlenowe lub mikroaerofiliczne
Agar M17	selektywny dla Lactococcus, Streptococcus thermophilus	30 °C, 48–72 h, beztlenowe lub mikroaerofiliczne
APT agar (uniwersalny agar Tween 80)	selektywny dla LAB i niektórych Bifidobacteria	30 °C, 48–72 h, beztlenowe lub mikroaerofiliczne
Agar Scheadlera	selektywne i wzbogacające, izolacja anaerobów, w tym Bifidobacterium, Clostridium	30–37 °C, 48–72 h, beztlenowa
Agar CBL (Chiński niebieski agar laktozowy)	Nośnik różnicowy, dla bakterii koliformnych i innych bakterii fermentujących laktozę	37 °C, 24–48 h, aerobowe
Milk Plate Count Agar (MPCA)	uniwersalne, dla całkowitej liczby bakterii mezofilnych tlenowych	30–37 °C, 24–48 h, aerobowe

Tabela 1: Lista sugerowanych podłoży do analizy mikrobiomu próbek mlecznych przy określonych warunkach hodowli.

2. Przygotowanie próbek bakteryjnych do analizy MS

1. Przed rozpoczęciem przygotuj rozwiązanie macierzy MALDI
   UWAGA: Najczęściej stosowanym związkiem matrycowym jest HCCA, α-cyjano-4-hydroksycynaminowy kwas cynynowy. Ten związek jest fotoczuły, więc przygotuj i przechowuj matrycę w ciemnych pojemnikach lub z dala od światła.
   1. Przygotuj mieszankę rozpuszczalników w następujących proporcjach: 50% acetonitrylu (HPLC), 47,5% wody (HPLC) oraz 2,5% kwasu trifluoroctowego (TFA).
   2. Rozpuszcz matrycę w mieszance rozpuszczalnika do końcowego stężenia około 10 mg/mL (lub do nasycenia – aż nierozpuszczone kryształy pozostaną widoczne).
   3. Jeśli roztwór nie jest przezroczysty (kryształy pozostają), roztwór należy wirować lub filtrować (np. przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 μm), aby uzyskać przezroczystą ciecz.
      UWAGA: Przechowywanie w lodówce jest dozwolone przez krótki czas, pod warunkiem ograniczonej liczby cykli odmrażania.
2. Aby zidentyfikować bakterie za pomocą SM, należy użyć jednej z trzech procedur przygotowania próbek:
   1. Bezpośredni transfer kolonii – Stosuj tę najprostszą i najszybszą metodę w przypadku dobrze rosnących, nieopornych na lizę bakterii, takich jak większość bakterii Gram-ujemnych.
      1. Za pomocą sterylnej pętli lub wykałaczki przenieś niewielką ilość (~1 μL) wyhodowanej kolonii na miejsce na płytce MALDI.
      2. Rozsmaruj materiał bakteryjny bezpośrednio na wyznaczonym miejscu na tarczy docelowej MALDI, aby uzyskać cienką, równą warstwę.
      3. Po wyschnięciu nałóż na miejsce 1 μL roztworu matrycy HCCA i pozwól wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej.
   2. Ekstracja kwasem mrówkowym na celu – Zastosowanie dla trudno zidentyfikowanych bakterii (np. Gram-dodatnie, drożdże), których ściany komórkowe utrudniają uwalnianie białek bez dodatkowego przetwarzania.
      1. Pobierz niewielką ilość biomasy bakteryjnej z jednej kolonii bakterii za pomocą jednorazowej pętli mikrobiologicznej lub sterylnej wykałaczki.
      2. Rozsmaruj materiał bakteryjny bezpośrednio na wyznaczonym miejscu na tarczy docelowej MALDI, aby uzyskać cienką, równą warstwę.
      3. Nałóż na rozmazany materiał bakteryjny 1 μL roztworu 70% kwasu mrówkowego i wysusz na powietrzu w temperaturze pokojowej.
      4. Po wyschnięciu nałóż na miejsce 1 μL roztworu matrycy HCCA i pozwól wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej.
   3. Ekstrakcja białka w tubce (metoda etanolowo-mrówkowa) – Stosuj tę metodę dla trudnych do zidentyfikowania mikroorganizmów, w tym niektórych bakterii Gram-dodatnich, drożdży i mykobakterii.
      1. Za pomocą sterylnej pętli lub wymazu przenieś 1-3 kompletne kolonie z płytki hodowli agarowej do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL zawierającej 300 μL sterylnej wody.
      2. Dodaj 900 μL etanolu absolutnego, aby dostosować końcowe stężenie etanolu do około 75%. Wymieszaj lub zacznij przez kilka sekund.
      3. Wiruj próbkę przez 2 minuty w temperaturze 15 000 x g (temperatura pokojowa).
      4. Ostrożnie odrzucaj supernatant, nie naruszając granulki komórkowej.
         UWAGA: W przypadku szczepów śluzowych zaleca się dodatkowe wirowanie w temperaturze 4 °C.
      5. Zostaw rurkę z pelletem otwartą, aż cały resztkowy etanol wyparuje (5-10 minut, temperatura pokojowa).
      6. Dodaj 20-50 μL 70% kwasu mrówkowego (FA) do suszonego pelletu komórkowego. Mieszaj przez pipetowanie lub wirowanie, aż granulat zostanie całkowicie ponownie zawiesowany.
         UWAGA: Objętość powinna być proporcjonalna do ilości materiału biologicznego.
      7. Dodaj równą objętość acetonitrylu (ACN) do zawiesiny kwasu mrówkowego. Mieszaj ostrożnie.
      8. Wiruj w 15 000 x g przez 2 minuty (temperatura pokojowa).
      9. Przelej 1 μL supernatantu na wyznaczone miejsce na tarczy MALDI.
      10. Pozwól miejsca całkowicie wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej.
      11. Nałóż na wysuszone miejsce próbki 1 μL roztworu matrycy α-cyjano-4-hydroksycynamonowego (HCCA).
      12. Pozwól matrycy całkowicie wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej przed analizą MS (Rysunek 1).
          UWAGA: 70% kwasu mrówkowego:; powoduje oparzenia. Uchwyt w okapie spalinowym. Acetonitryl: łatwopalny i toksyczny. Trzymaj się z dala od płomieni i unikaj wdychania/kontaktu. Kwas trójfluorooctowy (TFA): Silny, i lotny; Unikaj kontaktu skórnego/wzrokowego i wdechu. Zawsze noś fartuch laboratoryjny, rękawice odporne na chemikalia i okulary ochronne. Obchodz się wszystkimi odczynnikami w okapu, aby uniknąć wdychania. Unikaj kontaktu ze skórą i wzrokami; Pracuj z dala od otwartych ogniów. Zbieraj kwaśne i organiczne odpady rozpuszczalne w wyraźnie oznakowanych, kompatybilnych pojemnikach, aby prawidłowo się utylizować.

Rysunek 1: Drzewo decyzyjne wizualizujące proces wyboru odpowiedniej procedury przygotowania próbki do identyfikacji izolatów bakteryjnych za pomocą techniki MS. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

3. Pozyskiwanie widm i identyfikacja mikroorganizmów z wykorzystaniem techniki MS

1. Wzorcowanie
   UWAGA: Aby precyzyjnie wyznaczyć masę w MS, przed analizą nieznanych próbek należy skalibrować instrument według odpowiednich standardów. Prawidłowa kalibracja instrumentów jest kluczowa dla wiarygodnej identyfikacji.
   1. Przygotować punkty kalibracyjne na płycie docelowej MALDI zawierające 1 μL: (a) Standardu Bakteryjnego (BTS), zawierającego ekstrakt Escherichia coli DH5 alfa, obejmującego zakres masowy od 3,6 do 17 kDa (dla MBT Biotyper); (b) Mikrobiologiczny kalibrator zawierający ekstrakt białkowy E. coli ATCC 25922, rybonukleazę i mioglobinę, obejmujący zakres masowy od 3,6 do 17 kDa (dla EXS2600 układu). Pozwól wyschnąć na powietrzu i nałożyć na wysuszone plamy kalibratora 1 μL roztworu matrycy HCCA, podobnie jak w przypadku przygotowania próbki.
   2. Załaduj do instrumentu płytę docelową MALDI zawierającą przygotowane próbki i punkty kalibrowe. Przeprowadź analizę plam kalibracji w trybie kalibracyjnym (automatycznym).
   3. Sprawdź kalibrację, aby upewnić się, że dokładność masy mieszczy się w akceptowalnych granicach w zakresie (100 ppm) w określonym zakresie mas (2-20 kDa).
2. Pozyskiwanie widm
   UWAGA: Podczas kalibracji instrumentu pobierane są widma masowe z każdego przygotowanego miejsca próbki.
   1. Ogólne parametry akwizycji
      1. Spektrometr mas należy obsługiwać w liniowym trybie dodatnim jonów.
      2. Ustaw zakres detekcji masy od 2 000 do 20 000 m/z (2-20 kDa).
   2. Używaj następujących ustawień specyficznych dla instrumentów
      1. Napięcia źródła jonowego: źródło jonowe 1 (IS1) przy 20 kV, źródło jonowe 2 (IS2) przy 18 kV, napięcie obiektywu 9 kV. Napięcie przyspieszające może wynosić do 25 kV.
      2. Napięcie detektora: Ustawione na około 2,65 kV.
      3. Ustawienia ekstrakcji impulsowych jonów: 100 ns, opóźniony czas ekstrakcji stały na 230 ns.
      4. Ustawienia mocy lasera: dostosowywanie ręcznie, aby uzyskać najlepszą jakość widma (biorąc pod uwagę liczbę sygnałów i natężenie sygnału), zazwyczaj w zakresie od 40% do 65% minimalnej wymaganej mocy.
      5. Liczba strzałów na widmo: uzyskanie wystarczającej liczby strzałów laserowych z różnych obszarów każdego punktu, aby uzyskać sumę widma o dobrym stosunku sygnału do szumu (S/N)→ (a) średnio 200 strzałów, wykonanych w 50 krokach z 4 różnych obszarów każdego miejsca lub (b) akwizycja w 500 krokach strzału – 50 strzałów z dziesięciu różnych pozycji punktu docelowego w trybie AutoXecute.
   3. Strategia pomiaru próbki
      1. Mierz kilka punktów na izolat (co najmniej 2 punkty na izolat).
      2. Pobieraj widma w replikacji dla każdego miejsca, aby zapewnić spójność i dokładność wyników → pomiaru w duplikacie, dążąc do określonej liczby łącznych widm na próbkę (co najmniej 4 widma na próbkę co najmniej → replikacjach technicznych).
         UWAGA: Próbki biologiczne (co najmniej 3) poddane w celu uzyskania replikacji biologicznych.

4. Identyfikacja mikroorganizmów i analiza danych

UWAGA: Identyfikacja organizmu odbywa się poprzez porównanie uzyskanego profilu białka (specyficznego białkowego "odcisku palca" mikroorganizmu) z bazą danych referencyjną, a uzyskana korelacja pozycji sygnału i intensywności służy do wygenerowania wartości dopasowania, która opisuje poziom pewności, z jakim badany organizm został dopasowany do odpowiadającego mu mikroorganizmu referencyjnego. Identyfikacja mikroorganizmów, porównując przetworzone widma z bazami referencyjnymi.

1. Przetwarzanie widm
   1. Używaj odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania widm: (a) flexAnalysis dla systemów biotypowych MALDI lub (b) EX-Accuspec dla systemów EXS2600.
   2. Zastosuj metodę Savitzky'ego-Golaya jako algorytm wygładzania (szerokość 2 m/z, 10 cykli).
   3. Wykonaj korekcję bazową, aby usunąć szum tła za pomocą algorytmu TopHat (próg S/N = 2, szerokość filtra TopHat 0,2 Da ).
   4. Użyj trybu centroidu jako algorytmu wykrywania pików (próg S/N = 2).
2. Porównanie baz danych i interpretacja wyników
   1. Przeładowanie przetworzonych widm mas nieznanych izolatów na platformę identyfikacji mikroorganizmów MALDI. Następnie sprawdź dokumenty.
      UWAGA: W tych badaniach użyto następującego oprogramowania: Biotyper wersja 4.1.100, Ex-Accuspec wersja V1. W przypadku oprogramowania MALDI Biotyper zaleca się tworzenie głównych widm (MSP) na podstawie surowych widm, aby zapewnić najlepszą niezawodność dopasowania.
   2. Oceń wyniki identyfikacji zgodnie z progami standardowymi producenta.
      UWAGA: Dla MALDI Biotyper i EXS2600 wartości punktowe to:
      2,300-3,000: wysoce prawdopodobna identyfikacja gatunku;
      2.000-2.299: pewna identyfikacja rodzaju, prawdopodobna identyfikacja gatunku;
      1,700-1,999: prawdopodobna identyfikacja rodzaju;
      0,000-1,699: niewiarygodna identyfikacja.
      Podczas oceny wyników identyfikacji uzyskanych z platformy wsparcia MALDI Biotyper wykorzystują Kategorie Spójności: A- Gatunek Spójny → najlepsze dopasowanie, a wszystkie pozostałe dopasowania o równie wysokiej wartości (>1,999) wskazują na ten sam gatunek; B - Zgodny rodzaj → najlepsze dopasowanie oraz inne dopasowania o podobnych wartościach (1,700 - 1,999) wskazują na ten sam rodzaj, ale mogą się różnić na poziomie gatunkowym; C- Brak spójności → wymagania dotyczące spójności gatunkowej lub rodzajowej nie zostały spełnione.

Wyniki

Podejście kulturowe
Podejście kulturowe to strategia mająca na celu maksymalne zróżnicowanie warunków uprawy mikroorganizmów, aby zwiększyć szanse na izolowanie m.in. rzadkich, trudnych do uprawy lub wcześniej nieopisanych gatunków¹². Pozwala to uzyskać znacznie szerszy obraz bioróżnorodności mikroflory obecnej w różnych próbkach, np. próbkach żywności. Zwiększona różnorodność mikroorganizmów można zaobserwować już na etapie wizualnej oceny kolonii, które różnią się morfologi...

Dyskusja

Protokół poświęcony identyfikacji mikroorganizmów w produktach mlecznych stanowi istotny postęp w stosunku do tradycyjnych metod, zapewniając optymalny konsensus co do szybkości, niezawodności i opłacalności. Niemniej jednak niektóre kluczowe kroki w ramach protokołu wymagają szczególnej uwagi. Po pierwsze, faza izolacji i hodowli jest fundamentem. Podłoże hodowlane i warunki inkubacji muszą odpowiadać oczekiwanej różnorodności mikroorganizmów i obciążeniu. Uzyskanie czystych hodowli jest kluczowe, często wymagając subku...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
70% kwasu mrówkowego	Chempur	115676307
Acetonitrylu	Merck KGaA	1.00014.1011
APT agar	Merck KGaA	1.10453.0500
Standard testów bakteryjnych	Bruker Daltonik GmbH	8255343
CBL Agar (chiński niebieski agar laktozowy)	Merck KGaA	1.02348.0500
Columbia Blood Agar	Oksoid	CM0331B
Agar M17
Milk Plate Count Agar (MPCA)	Oksoid	CM0681
MRS Agar (de Man, Rogosa i Sharpe Agar)	Merck KGaA	1.10660.0500
MSP 96 celuje w polerowaną stal BC	Bruker Daltonik GmbH	8280800
Woda Peptone	Sigma-Aldrich	70179
Agar Scheadlera	Sigma-Aldrich	91019
Owcza krew	Biomaksima	SL0160-100
Kwas trifluorooctowy	Sigma-Aldrich	T6508
Tryptyczny agar sojowy (TSA)	Sigma-Aldrich	22091
Woda	Merck KGaA	1.15333.2500
&alfa;-Cyjano-4-hydroksycynamowa	Bruker Daltonik GmbH	8201344