Artykuł metodologiczny

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

DOI:

10.3791/68995

⸱

16 września 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, 2Department of Biochemistry and Physiology, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten ma na celu zachowanie metabolitów komórkowych dla jednokomórkowej spektrometrii mas (SCMS) poprzez połączenie płukania lotnego roztworu soli, szybkiego hartowania ciekłym azotem, liofilizacji i przechowywania w temperaturze -8 °C. Wykazano, że hartowanie ciekłym azotem jest niezbędne do utrzymania profili metabolitów, podczas gdy długotrwałe przechowywanie w chłodni powinno być zminimalizowane, aby zapobiec zmianom metabolicznym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednokomórkowa spektrometria mas (SCMS) stała się nieodzownym narzędziem do badania metabolizmu komórkowego. Dzięki postępowi w nowoczesnych technikach spektrometrii mas (MS) i zapotrzebowaniu na badania nad heterogenicznością komórek w podstawowych naukach biologicznych i chorobach człowieka, w badaniach laboratoryjnych opracowano i zastosowano wiele różnych technik SCMS. Ponieważ metabolity mogą dokładnie odzwierciedlać stan komórek, analiza metabolomiczna SCMS żywych komórek jest uważana za potężne narzędzie do dostarczania informacji molekularnych o komórkach. Jednak głównym wyzwaniem w analizie SCMS żywych komórek jest zachowanie endogennych profili metabolitów podczas przygotowywania, transportu i pomiaru próbki. Metabolity komórkowe ulegają szybkiemu obrotowi i są bardzo wrażliwe na zmiany środowiskowe, co czyni je podatnymi na degradację lub transformację przed analizą. Aby rozwiązać ten problem, przedstawiamy solidny i powtarzalny protokół przygotowania komórek, zaprojektowany w celu zachowania integralności metabolitów komórkowych dla SCMS. Protokół obejmuje mycie komórek lotnym roztworem mrówczanu amonu (AF), szybkie hartowanie ciekłym azotem (LN2), liofilizację próżniową i przechowywanie w temperaturze -80 °C. Takie podejście minimalizuje uszkodzenia błon komórkowych, jednocześnie skutecznie zatrzymując aktywność metaboliczną. Wyniki wskazują, że szybkie wygaszanie komórek jest niezbędne; jednak ograniczenie czasu przechowywania w temperaturze -80 °C jest konieczne w celu zachowania metabolitów komórkowych. Proponowany protokół może być potencjalnie wykorzystany w innych istniejących technikach SCMS do szerokich zastosowań.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Heterogeniczność między komórkami stała się fundamentalną zasadą systemów biologicznych, zwłaszcza w kontekście progresji choroby, oporności na leki i różnicowania komórkowego 1,2. W organizmach wielokomórkowych nawet genetycznie identyczne komórki w tym samym mikrośrodowisku mogą wykazywać różne fenotypy, wynikające z różnic na poziomie transkryptomicznym3, proteomicznym4 i, co najważniejsze, metabolomicznym5. Podczas gdy genomika i transkryptomika pojedynczych komórek zyskały znaczną popularność w ciągu ostatniej dekady, metabolomika pojedynczych komórek pozostaje stosunkowo słabo rozwinięta ze względu na nieodłączną złożoność i szybką dynamikę metabolitów6. Metabolity są bardzo wrażliwe na sygnały środowiskowe, mają zróżnicowaną strukturę chemiczną i polarność7 oraz występują w niskich stężeniach w objętościach małych komórek8. Właściwości te sprawiają, że ich wiarygodny pomiar z pojedynczych komórek jest wyzwaniem analitycznym. Ponieważ metabolomika oferuje najbliższy obraz stanu funkcjonalnego komórki w czasie rzeczywistym, postęp w metodach solidnego badania metabolomu w rozdzielczości pojedynczej komórki jest niezbędny do głębszego zrozumienia fizjologii i patologii komórkowej7.

Tradycyjne techniki metabolomiki masowej uśredniają sygnały w dużych populacjach komórek, maskując niejednorodność komórkową i potencjalnie ukrywając rzadkie, ale znaczące sygnatury metaboliczne. W przeciwieństwie do tego, metabolomika pojedynczej komórki ujawnia unikalne profile biochemiczne na poziomie poszczególnych komórek, co czyni ją nieocenioną w badaniu procesów takich jak różnicowanie komórek macierzystych, odpowiedzi na leki i mechanizmy chorobowe 6,9,10,11,12,13 . Metody oparte na spektrometrii mas (MS), takie jak desorpcja laserowa wspomagana matrycą i jonizacja (MALDI) MS i jony wtórne (SI) MS, posunęły naprzód tę dziedzinę, ale stoją przed wyzwaniami, takimi jak złożone przygotowanie, wymagania dotyczące próżni i destrukcyjna jonizacja, które ograniczają analizę żywych komórek 9,14. W szczególności ostatnie osiągnięcia w oprzyrządowaniu zaowocowały najnowocześniejszymi technikami, w tym transmisyjnym trybem MALDI sprzężonym z pozycyjną jonizacją indukowaną laserem (t-MALDI-215) i spektrometrią mas jonów wtórnych Orbitrap (OrbiSIMS)16,17, umożliwiły bezznacznikowe, wysokorozdzielcze obrazowanie metaboliczne 3D na poziomie pojedynczej komórki i subkomórki, oferując wyjątkową dokładność masy i rozdzielczość przestrzenną.

Jonizacja otoczenia MS rozwiązuje te problemy. Reprezentatywne techniki SCMS w otoczeniu obejmują jednokomórkową spektrometrię mas wideo na żywo (Video-MS)18, DESI19 i nano-DESI20. Wśród nich SCMS z pojedynczą sondą jest jedną z technik, która wyróżnia się zdolnością do bezpośredniego pobierania próbek i jonizacji żywych komórek w czasie rzeczywistym przy użyciu systemu podwójnej kapilary 21,22,23,24. Technika ta minimalizuje zakłócenia próbki, umożliwiając jednocześnie profilowanie metaboliczne in situ w wysokiej rozdzielczości i została z powodzeniem zastosowana w badaniach nad wchłanianiem leków i ich wpływem na metabolizm komórkowy 22,25,26,27,28,29,30, reakcje środowiskowe 31,32 i heterogeniczność metaboliczną33. 34,35,36 wśród pojedynczych komórek.

Podczas gdy wiele metod SCMS w otoczeniu umożliwia analizę żywych komórek, zazwyczaj mają one niską przepustowość ze względu na ręczną obsługę wymaganą do indywidualnego wyboru komórek 23,37,38. Ponieważ metabolizm komórkowy jest bardzo dynamiczny, przedłużone przygotowanie próbki może zmienić profile metabolitów. Aby temu zaradzić, naukowcy stosują techniki hartowania natychmiast po wyizolowaniu komórek 39,40. Wygaszanie zatrzymuje aktywność metaboliczną poprzez szybkie chłodzenie 41,42,43,44 lub denaturację enzymatyczną 43,45,46,47, zachowując stan biochemiczny komórek w określonym momencie. Ten krok ma zasadnicze znaczenie dla zapewnienia dokładnych i istotnych czasowo danych metabolomicznych. Skuteczny protokół gaszenia musi szybko i dokładnie zatrzymać wewnątrzkomórkową aktywność metaboliczną. Oceniano różne metody, w tym zimną izotoniczną sól fizjologiczną48, schłodzony acetonitryl46, zimny metanol 44,47,48,49, lodowaty roztwór buforowy fosforanu (PBS)43,50, LN2 43,44,51, a nawet zabiegi gorącym powietrzem 52. Podczas gdy wiele z nich zostało pierwotnie opracowanych do metabolomiki komórek masowych, niektóre, takie jak zimny metanol i acetonitryl, zostały zaadaptowane do technik jednokomórkowych, takich jak Pico-ESI-MS39 i MALDI-MS46. Pomimo swojej skuteczności, każda metoda ma wady: rozpuszczalniki organiczne mogą powodować wyciek metabolitów i uszkodzenie błon komórkowych48,53, a nielotne roztwory soli mogą zakłócać MS, powodując supresję jonów54, zmniejszając czułość i pogarszając dokładność danych47,55.

Szybkie zamrażanie LN2 jest powszechnie stosowane w badaniach biologicznych56, ponieważ szybko zatrzymuje metabolizm komórkowy bez pozostawiania nielotnych soli, dzięki czemu dobrze nadaje się do SCMS. Może jednak uszkadzać błony komórkowe, co jest problematyczne w przypadku SCMS57,58. Aby zmniejszyć to uszkodzenie, w niektórych badaniach zastosowano metodę obejmującą szybką filtrację, płukanie NaCl na zimno i zamrażanie LN2, co pomaga zatrzymać szybko obracające się metabolity53,59. Mimo to ta metoda nie jest idealna dla SCMS ze względu na trudności w izolowaniu pojedynczych komórek i potencjalne efekty macierzy z pozostałości soli. Przechowywanie w temperaturze -80 °C jest kolejną powszechną metodą konserwacji, ale jej wpływ na profile metabolitów jednokomórkowych pozostaje niejasny. Wcześniej informowaliśmy o badaniach mających na celu rozwiązanie tych ograniczeń poprzez połączenie wielu kluczowych etapów: komórki są najpierw myte lotnym, kompatybilnym z MS roztworem AF, a następnie hartowane LN2, liofilizowane próżniowo i przechowywane w niskiej temperaturze (-80 °C)60. Obecne podejście minimalizuje uszkodzenia komórek i degradację metabolitów, umożliwiając dokładniejsze pomiary SCMS. Prace te koncentrują się na szczegółach eksperymentalnych, mając na celu promowanie przyjęcia tej metody przygotowania komórek do solidnych technik SCMS.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadź każdy krok w certyfikowanym laboratorium bezpieczeństwa biologicznego klasy II i w sterylnych warunkach. W tym badaniu linię komórkową HCT-116 wykorzystano jako system modelowy, a komórki hodowano w kompletnej pożywce hodowlanej. Regenci i używany sprzęt są wymienieni w Tabeli Materiałów.

1. Hodowla komórkowa

  1. Przygotować kompletne podłoże. Uzupełnij pożywkę McCoy's 5A 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny. Podgrzej do 37 °C.
  2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 . Monitoruj konfluencję codziennie i przejście, gdy kultury osiągną ~80% konfluencji.
  3. Przejście komórek (co ~2 dni).
    1. Zassać pożywkę i spłukać raz 5 ml 1x PBS.
    2. Dodać 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA do szalki hodowlanej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty, aby ułatwić oddzielenie komórek.
    3. Zneutralizuj trypsynę, dodając 8 ml wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki i delikatnie pipetując w celu rozproszenia komórek.
    4. Przenieść 1 ml zawiesiny do 9 ml świeżej kompletnej pożywki.
    5. Policz komórki.
      UWAGA: Komórki zostały zliczone za pomocą automatycznego licznika komórek TC20 zgodnie z instrukcjami producenta. Nie stosowano błękitu trypanowego ani innych środków barwiących.
  4. Komórki nasienne na szkiełkach nakrywkowych.
    1. Rozcieńczyć komórki do końcowego stężenia ~1 × 106 komórek/ml.
    2. Umieścić pojedyncze szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm w dołkach na płytce 12-dołkowej.
      UWAGA: Szklane szkiełka nakrywkowe muszą być sterylizowane w autoklawie przed użyciem do hodowli komórkowej.
    3. Dodać 2 ml kompletnej pożywki i 200 μl zawiesiny komórek (~2 × 105 komórek/dołek).
    4. Inkubuj komórki przez noc, aby umożliwić przyczepienie komórek.
      UWAGA: Aby upewnić się, że komórki są w normalnym stanie wzrostu, rutynowo sprawdzaj morfologię komórek i ich status wzrostu (za pomocą mikroskopu), a także badaj potencjalne zanieczyszczenie mykoplazmą (za pomocą zestawu do wykrywania mykoplazmy).

2. Mycie komórek roztworem mrówczanu amonu (AF)

UWAGA: Za każdym razem przygotuj świeży roztwór AF.

  1. Przygotuj bufor do płukania AF. Odważyć 0,45 g mrówczanu amonu i rozpuścić w 50 ml wody klasy LC/MS. Końcowe stężenie mrówczanu amonu wynosi 0,14 M (0,9% w/w).
    UWAGA: Utrzymuj roztwór w lodowatym chłodzie (0-4 °C) do momentu użycia.
  2. Dodać 2 ml zimnego roztworu AF do każdego dołka płytki 12-dołkowej.
  3. Opłucz szkiełka nakrywkowe. Używając pary sterylnych kleszczyków, delikatnie wyjmij każde szkiełko nakrywkowe zawierające przylegające komórki z dołka, a następnie na krótko (przez 2-3 s) umieść je w oddzielnym dołku wstępnie wypełnionym 2 ml zimnego 0,9% roztworu mrówczanu amonu (AF). Powtórz proces płukania.
    UWAGA: Aby uniknąć naruszenia komórek na etapie mycia, płukanie komórek należy wykonywać bardzo delikatnie.

3. Hartowanie komórek ciekłym azotem (LN2)

  1. Umieść każde przepłukane AF szkiełko nakrywkowe (komórki skierowane do góry) na szalce Petriego wewnątrz pojemnika z folii aluminiowej.
    UWAGA: Nosić rękawice kriogeniczne, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny. Całą obsługę LN2 należy wykonywać w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. Folia aluminiowa może być używana do składania pojemnika do hartowania LN2 .
  2. Powoli wlej 10-20 ml ciekłego azotu na szkiełka nakrywkowe, zapewniając całkowite pokrycie.
  3. Natychmiast przechyl szalkę Petriego za pomocą pęsety, aby zdekantować pozostały ciekły azot.
    UWAGA: Wykonaj tę czynność w ciągu kilku sekund, aby zapobiec tworzeniu się dużych kryształków lodu z resztkowej wilgoci po praniu.

4. Liofilizacja komórek w próżni

  1. Liofilizować natychmiast po hartowaniu LN2 , aby zapobiec rozmrożeniu.
    UWAGA: Zdejmij wirnik SpeedVac, aby utworzyć płaską platformę, na której znajduje się szalka Petriego o średnicy 100 mm.
  2. Używając rękawic kriogenicznych i izolowanej pęsety, umieść szalkę Petriego zawierającą schłodzone szkiełka nakrywkowe LN2 w komorze koncentratora próżniowego.
  3. Przetwarzaj przy użyciu standardowych ustawień próżni i kontynuuj przez 5-7 minut, aż widoczny LN2 wyparuje, a szkiełka nakrywkowe wyschną. Wysuszone szkiełka nakrywkowe nie powinny zawierać żadnych pozostałości LN2 i kryształków lodu.

5. Przechowywanie komórek w zamrażarce w temperaturze -80 °C

  1. Owiń pojemnik ręcznikiem papierowym i przenieś do zamrażarki w temperaturze -80 °C na 48 godzin.
  2. Po przechowywaniu należy natychmiast przenieść szkiełka nakrywkowe zawierające płytkę Petriego do eksykatora o temperaturze pokojowej na ~10 minut. Upewnij się, że skondensowany szron lub woda na szkiełkach nakrywkowych całkowicie zniknie przed wyjęciem ich z eksykatora.
    UWAGA: Szybkie przenoszenie szkiełek nakrywkowych do eksykatora minimalizuje kondensację; Nawet niewielkie zwilżenie powierzchni może spowodować rozpuszczenie wysuszonych metabolitów.
  3. Po umyciu AF należy podzielić próbki na dwie grupy (grupa 1 i grupa 2). Zastosuj następujące protokoły przetwarzania.
    Grupa 1: LN2 hartowanie → liofilizacji → analizie SCMS (bez przechowywania).
    Grupa 2: LN2 hartowanie → liofilizowanie → przechowywanie w temperaturze −80 °C 48 godzin → analizą SCMS.
  4. Kontynuuj analizę SCMS zgodnie z poniższym opisem.
    UWAGA: Można przygotować więcej grup komórek przy użyciu różnych warunków. Grupa 1 i Grupa 2 służą do zilustrowania ogólnych protokołów.

6. Produkcja z jedną sondą i konfiguracja SCMS

UWAGA: Pojedyncza sonda jest wytwarzana zgodnie z ustalonymi procedurami 21,24,60,61 i znajdują się tutaj tylko krótkie protokoły.

  1. Pociągnij igłę kwarcową z podwójnym otworem za pomocą ściągacza laserowego i wygeneruj końcówkę o średnicy ~10 μm. Zamontuj pojedynczą sondę, wkładając kapilarę ze stopionej krzemionki i emiter nano-ESI do igły kwarcowej z podwójnym otworem. Przymocuj wszystkie elementy do szkiełka za pomocą szybkowiążącej żywicy epoksydowej.
  2. Zamontuj pojedynczą sondę na stoliku XYZ. Przymocuj pojedynczą sondę do zmotoryzowanego manipulatora XYZ umieszczonego pod mikroskopem cyfrowym.
  3. Połącz konfigurację ze spektrometrem mas w celu analizy SCMS.
  4. Użyć acetonitrylu (≥99,9%) zawierającego 0,1 % kwasu mrówkowego jako rozpuszczalnika ekstrakcyjnego o natężeniu przepływu 150 nL/min dostarczanego przez pompę strzykawkową.
  5. Ustaw parametry MS.
    Tryb jonów dodatnich: m/z 200-1500, +2,9 kV, rozdzielczość masowa 120 k (przy m/z 200).
    Tryb jonów ujemnych: m/z 70-900, −2,1 kV, rozdzielczość masowa 120 k (przy m/z 200).
    UWAGA: Ponieważ jony ujemne są na ogół wykrywane w zakresie m/z niższym niż jony dodatnie, dla tych dwóch trybów jonów można stosować różne zakresy m/z. Dodatkowe ustawienia MS obejmują maksymalny czas wstrzykiwania 100 ms, jeden mikroskop, standardową automatyczną kontrolę wzmocnienia (AGC), tryb pełnego skanowania (do analizy MS), dysocjację kolizyjną o wyższej energii (HCD) (do analizy MS/MS) ze znormalizowaną energią zderzenia 10-35 (NCE) i 320 °C dla temperatury rurki transferowej jonów. Chromatogram jonów całkowitych (TIC) został wygenerowany w każdym punkcie skanowania/czasu w celu monitorowania stabilności sygnału i wykrywania pojedynczych komórek.

7. Eksperymenty SCMS z pojedynczą sondą

  1. Umieść dwa szkiełka nakrywkowe (Grupa 1 i Grupa 2) razem na zmotoryzowanym stoliku XYZ konfiguracji SCMS z pojedynczą sondą 21,24,61.
  2. Aby zminimalizować efekty wsadowe, wybierz losowo komórki pod mikroskopem.
  3. Uzyskaj widma masowe w trybie jonów dodatnich i ujemnych. Analizuj wiele (np. ~30) komórek na grupę z tą samą pojedynczą sondą, natężeniem przepływu rozpuszczalnika i napięciem jonizacji.
    UWAGA: Używaj tej samej pojedynczej sondy, natężenia przepływu rozpuszczalnika i napięcia jonizacji dla każdego eksperymentu, aby zapewnić porównywalność danych. Kalibruj Orbitrap codziennie przed akwizycją. Zarówno analizy MS, jak i MS/MS mogą być wykonywane na poziomie pojedynczej komórki. Gromadzenie danych dotyczących stwardnienia rozsianego w celu uzyskania dokładnych wartości m/z do badań profili metabolitów i wstępnych znaczników w analizie niecelowanej. Przeprowadzanie analizy MS/MS wybranych jonów w celu identyfikacji molekularnej w analizie celowanej. Dane pozyskano za pomocą kompatybilnego oprogramowania do gromadzenia i interpretacji danych.

8. Analiza danych

  1. Wstępnie przetwarzaj nieprzetworzone dane SCMS przy użyciu niestandardowego skryptu języka R. Etapy przetwarzania wstępnego obejmują usuwanie tła i szumów oraz normalizację intensywności jonów do TIC 11,12,23.
  2. Deizotopuj dane SCMS przy użyciu pakietu języka Python ms_deisotope.
  3. Wykonaj wyrównanie pików przy użyciu wewnętrznego skryptu języka Python60. Do kategorowania należy użyć pojemnika o szerokości 0,01 m/z. Użyj tolerancji masy 0,01 m/z lub 5 ppm do wyrównania pików.
  4. Wykonuj statystyczną analizę danych za pomocą MetaboAnalyst 6.062. Przeprowadzić test t i wygenerować mapę cieplną (dla względnych poziomów metabolitów). Wybierz opcję Użyj 100 pierwszych w teście T/ANOVA, aby wygenerować 100 pierwszych metabolitów, uszeregowanych według wartości p od niskiej do wysokiej, ze znaczną różnicą (p < 0,05) od porównania. Narysuj mapę cieplną, korzystając z tych 100 pierwszych metabolitów.
  5. Przeszukaj dokładne wartości m/z i widma MS/MS w bazie danych ludzkiego metabolomu (HMDB63). Użyj tolerancji masy 10 ppm podczas przeszukiwania baz danych MS.
    UWAGA: Inne bazy danych, takie jak LipidMaps64, mogą być używane do przeszukiwania baz danych.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym raporcie opisano metodologię, która obejmuje mycie komórek, szybkie wygaszanie komórek, suszenie próżniowe i przechowywanie w temperaturze -80 °C (rysunek 1). W szczególności podejście to ma na celu zachowanie stanu metabolomicznego komórek przed analizą SCMS. Skuteczność tego protokołu przetestowano poprzez przygotowanie komórek w dwóch różnych warunkach: świeżo wygaszonych i wysuszonych komórek (grupa 1, służąca jako kontrola) oraz komórek wygaszonych, wysuszonych i przechowywanych w temperaturze -80 °�C (grupa 2). Każda grupa była analizowana przy użyciu metody SCMS z pojedynczą sondą zarówno w trybie jonów dodatnich, jak i ujemnych. Analiza głównych składowych (PCA) i wizualizacja mapy ciepła zostały wykorzystane do oceny różnic w profilach metabolomicznych między grupami.

Wyniki PCA w trybie jonów dodatnich (ryc. 2A) ujawniły, że grupy 1 i grupa 2 miały podobne ogólne profile metabolitów. Prawie identyczne profile Grupy 1 i Grupy 2 pokazują, że przechowywanie w temperaturze -80 °C przez 48 godzin nie zmienia znacząco metabolomu, jeśli komórki są odpowiednio schładzane przed suszeniem. W trybie jonów ujemnych (ryc. 2B) obserwuje się porównywalny wzór, chociaż grupa 2 wydaje się nieco bardziej wyraźna - potencjalnie ze względu na różnice w jonizacji między określonymi klasami metabolitów, na przykład fosfatydylocholiny są lepiej wykrywane w trybie dodatnim, podczas gdy kwasy tłuszczowe jonizują się bardziej efektywnie w trybie ujemnym60. Pomimo tej zmienności, konsekwentne grupowanie między grupami 1 i 2 w obu trybach potwierdza wniosek, że zintegrowany protokół hartowania, suszenia i przechowywania utrzymuje integralność metaboliczną.

Analiza mapy cieplnej dodatkowo potwierdziła wyniki PCA, przedstawiając względną obfitość 100 najważniejszych metabolitów w dwóch grupach. Jak pokazano na rysunku 3, 100 największych metabolitów wykazuje wysoce spójne wzorce obfitości między grupą 1 a grupą 2 w obu trybach jonów. Nie obserwuje się większych przesunięć ani grupowania specyficznego dla grupy, chociaż niewielkie zmiany w kilku klastrach metabolitów mogą odzwierciedlać różnice w wydajności jonizacji lub stabilności metabolitów. Wyniki te pokazują, że proces harcowania, suszenia i przechowywania zachowuje komórkowe profile metabolomiczne z wysoką wiernością, dzięki czemu doskonale nadaje się do zastosowań SCMS w otoczeniu.

figure-results-1
Rysunek 1: Ogólny przebieg pracy w analizie spektrometrii mas jednokomórkowych (SCMS) badający, w jaki sposób wygaszanie LN2 i 48-godzinne przechowywanie w temperaturze -80 °C wpływają na profile metabolitów w pojedynczych komórkach. (A) Komórki wysiewano, inkubowano i płukano roztworem formatu amonowego (AF). (B) Przygotowano dwie grupy komórek - Grupa 1: komórki zostały umyte, schładzone i liofilizowane do natychmiastowych eksperymentów SCMS bez przechowywania; Grupa 2: komórki zostały umyte, schodzone, liofilizowane i przechowywane w temperaturze -80 °C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Analiza głównych składowych (PCA) danych SCMS z komórek HCT-116 w grupach eksperymentalnych w trybie (A) jonów dodatnich i (B) trybie jonów ujemnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Mapy cieplne przedstawiające względne poziomy 100 najważniejszych metabolitów wykrytych w pojedynczych komórkach HCT-116 przygotowanych w różnych warunkach, przedstawione dla (A) trybu jonów dodatnich i (B) trybu jonów ujemnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowym krokiem w tym protokole jest natychmiastowe wygaszanie żywych komórek za pomocą LN2 po umyciu AF, co znacznie zmniejsza aktywność enzymatyczną i zatrzymuje trwające procesy metaboliczne. Dodatkowo, mycie komórek za pomocą AF przed wygaszaniem zwiększyło intensywność jonów i zmniejszyło efekty matrycy, wspierając jego włączenie jako krok przygotowawczy do poprawy czułości SCMS. W obecnych badaniach komórki w różnych grupach (tj. Grupie 1 i Grupie 2) były hodowane przy użyciu tej samej początkowej partii, aby zminimalizować ich zmienność biologiczną. Wybrano 48-godzinny czas przechowywania, ponieważ komórki z dodatkowym czasem wzrostu (grupa 1) mogą nadal utrzymywać odpowiednią gęstość komórek (np. w celu uniknięcia agregacji komórek) do porównawczej analizy SCMS z przechowywanymi komórkami (grupa 2). Należy jednak zachować ostrożność w przypadku przechowywania w chłodni, nawet przez 48 godzin, ponieważ nadal obserwowano znaczące zmiany metaboliczne w porównaniach między próbkami świeżo wysuszonymi i przechowywanymi (grupa 1 vs. Grupa 2). Chociaż w rzeczywistych badaniach próbki komórek i tkanek są zwykle przechowywane przez dłuższy czas (np. przez tygodnie i miesiące) w zamrażarce o temperaturze -80 °C, sugeruje się skrócenie czasu przechowywania w celu zminimalizowania zmian metabolitów.

Rozwiązywanie problemów powinno zatem koncentrować się na zminimalizowaniu czasu między suszeniem a analizą SCMS, zapewniając, że warunki rozmrażania nie będą kondensować lub częściowego ponownego nawodnienia. Resztkowa zawartość wody i kondensacja wody podczas przemian próbek mogą częściowo nawodnić komórki i umożliwić reakcje enzymatyczne i chemiczne, takie jak hydroliza, utlenianie i proteoliza, które rozkładają metabolity65, prowadząc do sztucznych zmian w składzie metabolitów. Dokładnie wysuszone próbki skutecznie zatrzymują te procesy i zachowują integralność molekularną66. Zapewnienie środowiska osuszania wolnego od wilgoci i szybkie przejście na SCMS jest kluczem do uniknięcia tych pułapek.

Pomimo sukcesu tej metody w zachowaniu profili metabolitów, nadal istnieją pewne ograniczenia. Metoda wymaga dostępu do systemu suszenia próżniowego i zamrażarki w temperaturze -80 °C i nie jest w pełni skuteczna w przypadku długotrwałego przechowywania. Ponadto, chociaż szybkie suszenie w temperaturze pokojowej tymczasowo zachowuje metabolity, nie zastępuje ono hartowania LN2 . Zmiany związane z przechowywaniem mogą nadal występować z powodu niepełnego usunięcia wody i ryzyka ponownego nawodnienia podczas obchodzenia się z próbką. Te ograniczenia podkreślają potrzebę uściślenia metody, jeśli pożądany jest dłuższy magazyn lub wyższa przepływność.

Protokoły opisane w tej pracy oferują uproszczone i skuteczne podejście do zachowania metabolomu pojedynczej komórki dla SCMS w otoczeniu. W przeciwieństwie do metod wymagających skomplikowanych krioprotektantów lub zamrażania in situ, nasz przepływ pracy jest łatwo kompatybilny z istniejącymi technikami jonizacji otoczenia i pozwala na elastyczne terminy pobierania próbek i analizy. Integracja mycia, hartowania, suszenia i krótkotrwałego przechowywania komórek bez znacznej utraty wierności metabolomicznej stanowi praktyczne rozwiązanie dla laboratoriów, które nie mają dostępu do spektrometrów masowych na żądanie. Podejście to ma duży potencjał w zakresie postępu badań nad biologią systemów jednokomórkowych, metabolizmem nowotworów, heterogenicznością odpowiedzi na leki i fenotypowaniem metabolicznym rzadkich populacji komórek. Szerokie zastosowanie tych protokołów, szczególnie w przypadku platform SCMS opartych na jonizacji otoczenia, sprawia, że stanowią one ważny wkład w dziedzinę technik analitycznych pojedynczych komórek. W przyszłych badaniach protokoły te mogą być dostosowywane i udoskonalane, aby dostosować je do szerszej gamy typów komórek. Dzięki dodatkowym etapom przygotowania próbki (np. aplikacji matrycy) przetworzone komórki mogą być potencjalnie analizowane za pomocą innych technik SCMS (np. MALDI i SIMS), oferując wyższą rozdzielczość przestrzenną i przepustowość do analizy większej liczby komórek (np. komórek o wysokim stopniu konfluencji). Wyniki sugerują również, że te protokoły hartowania, suszenia i przechowywania mogą być potencjalnie wykorzystane do przygotowania komórek do wysyłki (np. w pojemnikach na suchy lód), umożliwiając wspólne badania SCMS w różnych lokalizacjach.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to było wspierane przez National Science Foundation (2305182), National Institutes of Health (1R01AI177469) i Chan Zuckerberg Initiative. Rysunek 1 został stworzony w BioRender (https://BioRender.com/yqn5isk).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
-80 stopni Celsjusza; Zamrażarka CEppendorf Nowy BrunszwikU700Przygotowanie próbki
ACETONTRYLThermoFisher Naukowy240744Konfiguracja eksperymentu SCMS
Mrówczan amonu ThermoFisher Naukowy401152500Przygotowanie próbki
Szkiełko nakrywkowe 18 mmSzkło nakrywkowe VMR micro48380046Hodowla komórkowa
Cyfrowy mikroskop stereoskopowyShenzhen D& F Co.Supereyes T004Analiza
Rurki kwarcowe z podwójnym otworem, 1.120 "x0,005" x12 "Friedrich & Dimmock, Inc.MBT-005-020-2QProdukcja z pojedynczą sondą
Żywica epoksydowaKonferencja DevconNr kat. 20945Produkcja z pojedynczą sondą
Kwas mrówkowyNauka Warda 470301-120 500 mlKonfiguracja eksperymentu SCMS
Kapilara z topionej krzemionki, ID: 40 &mikro; m, OD: 100 i mikro; mTechnologie PolymicroTSP040105Produkcja z pojedynczą sondą
Kapilara z topionej krzemionki, ID: 50 &mikro; m, OD: 150 i mikro; mTechnologie Polymicro1068150015Konfiguracja eksperymentu SCMS
Szkiełka nakrywkowe, 18mmFirma VWR 48380046Hodowla komórkowa
HyClone Syntetyczne serum (FBS)KlonSH3006603Hodowla komórkowa
Inkubator HeraCell (Heraeus)Hodowla komórkowa
Ściągacz laserowySutter Instrument Co.modelu P-2000Produkcja z pojedynczą sondą
Lampa UV LEDSprzęt dentystyczny Foshan Liang YaLY-C240Produkcja z pojedynczą sondą
McCoy's 5A Gibco (firma Gibco) 2537128Hodowla komórkowa
MikrouniaIDEX Zdrowie & Nauka Sp. z o.o.Zobacz materiał M-539Konfiguracja eksperymentu SCMS
Zmodyfikowany interfejs FAIMS pro Rybak termiczny 98100-20046Analiza
Zestaw do wykrywania MycoAlert PLUS MycoplasmaLonzaLT07-703Hodowla komórkowa
Tablica optyczna Thorlabs Inc., NewtonAnaliza
Woda klasy Optima LC/MS (Fisher Chemical, USA)ThermoFisher NaukowyZobacz materiał W6500Przygotowanie próbki
Spektrometr masowy Orbitrap Exploris 240 ThermoFisher NaukowyKonfiguracja eksperymentu SCMS
Penicylina/StreptomycynaGibco (firma Gibco)15140-122Hodowla komórkowa
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Firma VWRNumer katalogowy: 0780-50LHodowla komórkowa
Koncentrator SpeedVac (Savant)ThermoFisher Naukowy SPD111 VPrzygotowanie próbki
Pompa strzykawkowa (SKE10)Chemyx Sp. z o.o.80561Konfiguracja eksperymentu SCMS
Strzykawka, 250 i mikro; LHamilton1725LTN250ULKonfiguracja eksperymentu SCMS
Automatyczny licznik komórek TC20Laboratoria Bio-Rad 1450102EDULiczba komórek
Naczynie do hodowli tkankowych, 100 mmFisher naukowy FB012924Hodowla komórkowa
Trypsyna-EDTAThermoFisher Naukowy25200-072Hodowla komórkowa
Mikroskop cyfrowy USB ("Skorpion" 500 Zoom)Chinavasion, hurtownia Sp. z o.o.Analiza
Żywica utwardzana promieniami UVPierwszorzędny stomatologiaNumer artykułu 006.030Produkcja z pojedynczą sondą
Oprogramowanie XcaliburThermoFisher Naukowy
Stolik XYZ (CONEX-MFACC)Newport Corp.Analiza

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Advances in mass spectrometry-based single cell analysis. Biology (Basel). 12 (3), 393(2023).">Lee, S., Vu, H. M., Lee, J. H., Lim, H., Kim, M. S. Advances in mass spectrometry-based single cell analysis. Biology (Basel). 12 (3), 393(2023).
  2. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat Methods. 8 (4 Suppl), S20-S29 (2011).">Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat Methods. 8 (4 Suppl), S20-S29 (2011).
  3. Single cell transcriptomics: Methods and applications. Front Oncol. 5, 53(2015).">Kanter, I., Kalisky, T. Single cell transcriptomics: Methods and applications. Front Oncol. 5, 53(2015).
  4. Single-cell proteomic analysis of s. Cerevisiae reveals the architecture of biological noise. Nature. 441 (7095), 840-846 (2006).">Newman, J. R., et al. Single-cell proteomic analysis of s. Cerevisiae reveals the architecture of biological noise. Nature. 441 (7095), 840-846 (2006).
  5. Progress toward single cell metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).">Rubakhin, S. S., Lanni, E. J., Sweedler, J. V. Progress toward single cell metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).
  6. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 14-26 (2017).">Yang, Y., et al. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 14-26 (2017).
  7. Challenges and opportunities of metabolomics. J Cell Physiol. 227 (8), 2975-2981 (2012).">Johnson, C. H., Gonzalez, F. J. Challenges and opportunities of metabolomics. J Cell Physiol. 227 (8), 2975-2981 (2012).
  8. Molecular biology of cell. 1361, Garland Publishing. (1994).">By B Alberts, D. B., Lewis, J., Raft, M., Roberts, K., Watson, J. D. Molecular biology of cell. 1361, Garland Publishing. (1994).
  9. Single-cell mass spectrometry approaches to explore cellular heterogeneity. Angew Chem Int Ed Engl. 57 (17), 4466-4477 (2018).">Zhang, L., Vertes, A. Single-cell mass spectrometry approaches to explore cellular heterogeneity. Angew Chem Int Ed Engl. 57 (17), 4466-4477 (2018).
  10. Advances in mass spectrometry-based single-cell metabolomics. Analyst. 144 (3), 782-793 (2019).">Duncan, K. D., Fyrestam, J., Lanekoff, I. Advances in mass spectrometry-based single-cell metabolomics. Analyst. 144 (3), 782-793 (2019).
  11. Single cell mass spectrometry: Towards quantification of small molecules in individual cells. TrAC Trends Anal Chem. 174, 117657(2024).">Lan, Y., Zou, Z., Yang, Z. Single cell mass spectrometry: Towards quantification of small molecules in individual cells. TrAC Trends Anal Chem. 174, 117657(2024).
  12. Single cell metabolomics using mass spectrometry- techniques and data analysis. Analytica Chimica Acta. 1143, 11(2021).">Renmeng Liu, Z. Y. Single cell metabolomics using mass spectrometry- techniques and data analysis. Analytica Chimica Acta. 1143, 11(2021).
  13. Metabolomics studies of cell-cell interactions using single-cell mass spectrometry combined with fluorescence microscopy. Chem Sci. 13, 6687-6695 (2022).">Chen, Z. Y., et al. Metabolomics studies of cell-cell interactions using single-cell mass spectrometry combined with fluorescence microscopy. Chem Sci. 13, 6687-6695 (2022).
  14. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8790-8794 (2013).">Ibanez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  15. Transmission-mode MALDI-2 mass spectrometry imaging of cells and tissues at subcellular resolution. Nat Methods. 16 (9), 925-931 (2019).">Niehaus, M., Soltwisch, J., Belov, M. E., Dreisewerd, K. Transmission-mode MALDI-2 mass spectrometry imaging of cells and tissues at subcellular resolution. Nat Methods. 16 (9), 925-931 (2019).
  16. The 3D orbisims-label-free metabolic imaging with subcellular lateral resolution and high mass-resolving power. Nat Methods. 14 (12), 1175-1183 (2017).">Passarelli, M. K., et al. The 3D orbisims-label-free metabolic imaging with subcellular lateral resolution and high mass-resolving power. Nat Methods. 14 (12), 1175-1183 (2017).
  17. Single-cell metabolic profiling of macrophages using 3D orbisims: Correlations with phenotype. Anal Chem. 94 (26), 9389-9398 (2022).">Suvannapruk, W., et al. Single-cell metabolic profiling of macrophages using 3D orbisims: Correlations with phenotype. Anal Chem. 94 (26), 9389-9398 (2022).
  18. Live single-cell molecular analysis by video-mass spectrometry. Anal Sci. 24 (5), 559-561 (2008).">Tsuyama, N., Mizuno, H., Tokunaga, E., Masujima, T. Live single-cell molecular analysis by video-mass spectrometry. Anal Sci. 24 (5), 559-561 (2008).
  19. Delineation of subcellular molecular heterogeneity in single cells via ultralow-flow-rate desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Anal Chem. 97 (18), 9985-9991 (2025).">Zhang, H., Shi, X., Lu, H., Li, L. Delineation of subcellular molecular heterogeneity in single cells via ultralow-flow-rate desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Anal Chem. 97 (18), 9985-9991 (2025).
  20. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-desi ms. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).">Bergman, H. -M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-desi ms. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  21. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).">Pan, N., et al. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  22. Towards rapid prediction of drug-resistant cancer cell phenotypes: Single cell mass spectrometry combined with machine learning. Chem Commun (Camb). 55 (5), 616-619 (2019).">Liu, R., Zhang, G., Yang, Z. Towards rapid prediction of drug-resistant cancer cell phenotypes: Single cell mass spectrometry combined with machine learning. Chem Commun (Camb). 55 (5), 616-619 (2019).
  23. Exploring single-probe single-cell mass spectrometry: Current trends and future directions. Anal Chem. 97 (9), 4750-4762 (2025).">Bhusal, D., Wije Munige, S., Peng, Z., Yang, Z. Exploring single-probe single-cell mass spectrometry: Current trends and future directions. Anal Chem. 97 (9), 4750-4762 (2025).
  24. Applications of the single-probe: Mass spectrometry imaging and single cell analysis under ambient conditions. J Vis Exp. (112), e53911(2016).">Rao, W., Pan, N., Yang, Z. Applications of the single-probe: Mass spectrometry imaging and single cell analysis under ambient conditions. J Vis Exp. (112), e53911(2016).
  25. Quantification of drug molecules in live single cells using the single-probe mass spectrometry technique. Anal Chem. 91 (14), 9018-9024 (2019).">Pan, N., et al. Quantification of drug molecules in live single cells using the single-probe mass spectrometry technique. Anal Chem. 91 (14), 9018-9024 (2019).
  26. Metabolomic studies of live single cancer stem cells using mass spectrometry. Anal Chem. 91 (3), 2384-2391 (2019).">Sun, M., Yang, Z. Metabolomic studies of live single cancer stem cells using mass spectrometry. Anal Chem. 91 (3), 2384-2391 (2019).
  27. Quantification of nitric oxide in single cells using the single-probe mass spectrometry technique. Anal Chem. 95 (51), 18871-18879 (2023).">Lan, Y., Chen, X., Yang, Z. Quantification of nitric oxide in single cells using the single-probe mass spectrometry technique. Anal Chem. 95 (51), 18871-18879 (2023).
  28. Single cell mass spectrometry analysis of drug-resistant cancer cells: Metabolomics studies of synergetic effect of combinational treatment. Anal Chim Acta. 1201, 339621(2022).">Chen, X., Sun, M., Yang, Z. Single cell mass spectrometry analysis of drug-resistant cancer cells: Metabolomics studies of synergetic effect of combinational treatment. Anal Chim Acta. 1201, 339621(2022).
  29. Single cell mass spectrometry studies reveal metabolomic features and potential mechanisms of drug-resistant cancer cell lines. Anal Chim Acta. 1206, 339761(2022).">Sun, M., Chen, X., Yang, Z. Single cell mass spectrometry studies reveal metabolomic features and potential mechanisms of drug-resistant cancer cell lines. Anal Chim Acta. 1206, 339761(2022).
  30. Single-cell mass spectrometry quantification of anticancer drugs: Proof of concept in cancer patients. ACS Pharmacol Transl Sci. 4 (1), 96-100 (2021).">Bensen, R. C., et al. Single-cell mass spectrometry quantification of anticancer drugs: Proof of concept in cancer patients. ACS Pharmacol Transl Sci. 4 (1), 96-100 (2021).
  31. Integrating a generalized data analysis workflow with the single-probe mass spectrometry experiment for single cell metabolomics. Anal Chim Acta. 1064, 71-79 (2019).">Liu, R., Zhang, G., Sun, M., Pan, X., Yang, Z. Integrating a generalized data analysis workflow with the single-probe mass spectrometry experiment for single cell metabolomics. Anal Chim Acta. 1064, 71-79 (2019).
  32. Single-cell mass spectrometry enables insight into heterogeneity in infectious disease. Anal Chem. 94 (30), 10567-10572 (2022).">Nguyen, T. D., et al. Single-cell mass spectrometry enables insight into heterogeneity in infectious disease. Anal Chem. 94 (30), 10567-10572 (2022).
  33. Quantifying cell heterogeneity and subpopulations using single cell metabolomics. Anal Chem. 95 (18), 7127-7133 (2023).">Liu, R., et al. Quantifying cell heterogeneity and subpopulations using single cell metabolomics. Anal Chem. 95 (18), 7127-7133 (2023).
  34. Using dicationic ion-pairing compounds to enhance the single cell mass spectrometry analysis using the single-probe: A microscale sampling and ionization device. Anal Chem. 88 (13), 6812-6819 (2016).">Pan, N., Rao, W., Standke, S. J., Yang, Z. Using dicationic ion-pairing compounds to enhance the single cell mass spectrometry analysis using the single-probe: A microscale sampling and ionization device. Anal Chem. 88 (13), 6812-6819 (2016).
  35. Mass spectrometry measurement of single suspended cells using a combined cell manipulation system and a single-probe device. Anal Chem. 91 (3), 1738-1742 (2019).">Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Mass spectrometry measurement of single suspended cells using a combined cell manipulation system and a single-probe device. Anal Chem. 91 (3), 1738-1742 (2019).
  36. Metabolomics studies of cell-cell interactions using single cell mass spectrometry combined with fluorescence microscopy. Chem Sci. 13 (22), 6687-6695 (2022).">Chen, X., Peng, Z., Yang, Z. Metabolomics studies of cell-cell interactions using single cell mass spectrometry combined with fluorescence microscopy. Chem Sci. 13 (22), 6687-6695 (2022).
  37. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-desi ms. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).">Bergman, H. M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-desi ms. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  38. Dual cationic-anionic profiling of metabolites in a single identified cell in a live Xenopus laevis embryo by microprobe CE-ESI-MS. Analyst. 144 (3), 892-900 (2019).">Portero, E. P., Nemes, P. Dual cationic-anionic profiling of metabolites in a single identified cell in a live Xenopus laevis embryo by microprobe CE-ESI-MS. Analyst. 144 (3), 892-900 (2019).
  39. Combination of droplet extraction and pico-ESI-MS allows the identification of metabolites from single cancer cells. Anal Chem. 90 (16), 9897-9903 (2018).">Zhang, X. C., et al. Combination of droplet extraction and pico-ESI-MS allows the identification of metabolites from single cancer cells. Anal Chem. 90 (16), 9897-9903 (2018).
  40. The limitless applications of single-cell metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 71, 115-122 (2021).">Guo, S., Zhang, C., Le, A. The limitless applications of single-cell metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 71, 115-122 (2021).
  41. New bioreactor-coupled rapid stopped-flow sampling technique for measurements of metabolite dynamics on a subsecond time scale. Biotechnol Bioeng. 80 (6), 632-636 (2002).">Buziol, S., et al. New bioreactor-coupled rapid stopped-flow sampling technique for measurements of metabolite dynamics on a subsecond time scale. Biotechnol Bioeng. 80 (6), 632-636 (2002).
  42. Evaluation of quenching methods for metabolite recovery in photoautotrophic Synechococcus sp. Pcc 7002. Biotechnol Prog. 36 (5), e3015(2020).">Sake, C. L., Newman, D. M., Boyle, N. R. Evaluation of quenching methods for metabolite recovery in photoautotrophic Synechococcus sp. Pcc 7002. Biotechnol Prog. 36 (5), e3015(2020).
  43. A systematic evaluation of quenching and extraction procedures for quantitative metabolome profiling of HeLa carcinoma cell under 2D and 3D cell culture conditions. Biotechnol J. 18 (5), e2200444(2023).">Wang, T. X. Y. G., Zhuang, Y., Wang, G. A systematic evaluation of quenching and extraction procedures for quantitative metabolome profiling of HeLa carcinoma cell under 2D and 3D cell culture conditions. Biotechnol J. 18 (5), e2200444(2023).
  44. Reduced quenching and extraction time for mammalian cells using filtration and syringe extraction. J Biotechnol. 182 - 183 (100), 97-103 (2014).">Hernandez Bort, J. A., et al. Reduced quenching and extraction time for mammalian cells using filtration and syringe extraction. J Biotechnol. 182 - 183 (100), 97-103 (2014).
  45. A diverse proteome is present and enzymatically active in metabolite extracts. Nat Commun. 15 (1), 5796(2024).">House, R. R. J., et al. A diverse proteome is present and enzymatically active in metabolite extracts. Nat Commun. 15 (1), 5796(2024).
  46. Single-cell MALDI-MS as an analytical tool for studying intrapopulation metabolic heterogeneity of unicellular organisms. Anal. Chem. 82, 6(2010).">Amantonico, A., Urban, P. L., Fagerer, S. R., Balabin, R. M., Zenobi, R. Single-cell MALDI-MS as an analytical tool for studying intrapopulation metabolic heterogeneity of unicellular organisms. Anal. Chem. 82, 6(2010).
  47. Effective quenching processes for physiologically valid metabolite profiling of suspension cultured mammalian cells. Anal Chem. 81 (1), 174-183 (2008).">Sellick, C. A., et al. Effective quenching processes for physiologically valid metabolite profiling of suspension cultured mammalian cells. Anal Chem. 81 (1), 174-183 (2008).
  48. Towards quantitative metabolomics of mammalian cells: Development of a metabolite extraction protocol. Anal Biochem. 404 (2), 155-164 (2010).">Dietmair, S., Timmins, N. E., Gray, P. P., Nielsen, L. K., Kromer, J. O. Towards quantitative metabolomics of mammalian cells: Development of a metabolite extraction protocol. Anal Biochem. 404 (2), 155-164 (2010).
  49. Comparison of quenching and extraction methodologies for metabolome analysis of Lactobacillus plantarum. Microb Cell Fact. 6, 27(2007).">Faijes, M., Mars, A. E., Smid, E. J. Comparison of quenching and extraction methodologies for metabolome analysis of Lactobacillus plantarum. Microb Cell Fact. 6, 27(2007).
  50. Nucleotide and nucleotide sugar analysis by liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry on surface-conditioned porous graphitic carbon. Anal. Chem. 82 (23), 6(2010).">Pabst, M. G. J., et al. Nucleotide and nucleotide sugar analysis by liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry on surface-conditioned porous graphitic carbon. Anal. Chem. 82 (23), 6(2010).
  51. Reducing time and increasing sensitivity in sample preparation for adherent mammalian cell metabolomics. Anal Chem. 83 (9), 3406-3414 (2011).">Lorenz, M. A., Burant, C. F., Kennedy, R. T. Reducing time and increasing sensitivity in sample preparation for adherent mammalian cell metabolomics. Anal Chem. 83 (9), 3406-3414 (2011).
  52. Quenching methods for the analysis of intracellular metabolites. Methods Mol Biol. 1104, 211-221 (2014).">Wahrheit, J., Heinzle, E. Quenching methods for the analysis of intracellular metabolites. Methods Mol Biol. 1104, 211-221 (2014).
  53. A method for metabolomic sampling of suspended animal cells using fast filtration. BMC Proc. 5 (Suppl 8), P93(2011).">Volmer, M., Gettmann, J., Scholz, S., Buntemeyer, H., Noll, T. A method for metabolomic sampling of suspended animal cells using fast filtration. BMC Proc. 5 (Suppl 8), P93(2011).
  54. Mechanistic investigation of ionization suppression in electrospray ionization. J Am Soc Mass Spectrom. 11, 8(2000).">Richard King, R. B., Fernandez-Metzler, C., Cynthia Miller-Stein, A. T. O. Mechanistic investigation of ionization suppression in electrospray ionization. J Am Soc Mass Spectrom. 11, 8(2000).
  55. Current trends and future requirements for the mass spectrometric investigation of microbial, mammalian and plant metabolomes. Phys Biol. 5 (1), 011001(2008).">Dunn, W. B. Current trends and future requirements for the mass spectrometric investigation of microbial, mammalian and plant metabolomes. Phys Biol. 5 (1), 011001(2008).
  56. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: Quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), 53(2017).">Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: Quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), 53(2017).
  57. Screening of Chlamydomonas reinhardtii populations with single-cell resolution by using a high-throughput microscale sample preparation for matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Appl Environ Microbiol. 81 (16), 5546-5551 (2015).">Krismer, J., et al. Screening of Chlamydomonas reinhardtii populations with single-cell resolution by using a high-throughput microscale sample preparation for matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Appl Environ Microbiol. 81 (16), 5546-5551 (2015).
  58. Improved sample preparation for untargeted metabolomics profiling of Escherichia coli. Microbiol Spectr. 9 (2), e0062521(2021).">Ye, D., et al. Improved sample preparation for untargeted metabolomics profiling of Escherichia coli. Microbiol Spectr. 9 (2), e0062521(2021).
  59. Fast filtration for metabolome sampling of suspended animal cells. Biotechnol Lett. 33 (3), 495-502 (2011).">Volmer, M., et al. Fast filtration for metabolome sampling of suspended animal cells. Biotechnol Lett. 33 (3), 495-502 (2011).
  60. Developing a cell quenching method to facilitate single cell mass spectrometry metabolomics studies. JACS Au. 5 (5), 2379-2387 (2025).">Wije Munige, S., Bhusal, D., Peng, Z., Chen, D., Yang, Z. Developing a cell quenching method to facilitate single cell mass spectrometry metabolomics studies. JACS Au. 5 (5), 2379-2387 (2025).
  61. Integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells. J Vis Exp. (148), e59875(2019).">Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells. J Vis Exp. (148), e59875(2019).
  62. Metaboanalyst 6.0: Towards a unified platform for metabolomics data processing, analysis and interpretation. Nucleic Acids Res. 52 (W1), W398-W406 (2024).">Pang, Z., et al. Metaboanalyst 6.0: Towards a unified platform for metabolomics data processing, analysis and interpretation. Nucleic Acids Res. 52 (W1), W398-W406 (2024).
  63. Hmdb 5.0: The human metabolome database for 2022. Nucleic Acids Research. 50 (D1), D622-D631 (2022).">Wishart, D. S., et al. Hmdb 5.0: The human metabolome database for 2022. Nucleic Acids Research. 50 (D1), D622-D631 (2022).
  64. Lipid maps: Update to databases and tools for the lipidomics community. Nucleic Acids Res. 52 (D1), D1677-D1682 (2024).">Conroy, M. J., et al. Lipid maps: Update to databases and tools for the lipidomics community. Nucleic Acids Res. 52 (D1), D1677-D1682 (2024).
  65. Extracellular microbial metabolomics: The state of the art. Metabolites. 7 (3), 43(2017).">Pinu, F., Villas-Boas, S. Extracellular microbial metabolomics: The state of the art. Metabolites. 7 (3), 43(2017).
  66. Current approaches of preservation of cells during (freeze-) drying. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (8), 2873-2893 (2021).">Rockinger, U., Funk, M., Winter, G. Current approaches of preservation of cells during (freeze-) drying. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (8), 2873-2893 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metabolity kom rkowequenching kom rekprzemywanie mr czanem amonuliofilizacja pr niowaanaliza spektrometri maskonserwacja metabolit wstatystyczna analiza danych

Powiązane artykuły