Precyzyjna indukcja i rozróżnienie odruchów kaszlu i kichania u myszy

Podsumowanie

Badanie to ustanowiło modele kaszlu i kichania u myszy poprzez zastosowanie specyficznych bodźców do tchawicy i jamy nosowej oraz opracowało metodę opartą na dźwięku do rozróżniania kaszlu od kichania myszy poprzez analizę różnic w ich sygnałach akustycznych.

Streszczenie

Kaszel i kichanie, jako kluczowe odruchy obronne oddychające, były przedmiotem badań nad ich mechanizmami ograniczonymi przez niespecyficzną stymulację charakterystyczną dla tradycyjnych modeli. Istniejące metody, takie jak nebulizacja kapsaicyną lub kwasem cytrynowym, mogą jednocześnie aktywować kaszel (pośredniczony przez tchawicowe włókna C) oraz kichanie (pośredniczone przez nerwy nosowe trójdzielne), prowadząc do zaburzonych obserwacji behawioralnych. Chociaż wcześniejsze badania próbowały rozróżnić kaszel i kichanie poprzez analizę wzorców oddechowych lub sygnatur akustycznych, w tych badaniach brakuje modeli umożliwiających specyficzną stymulację tchawicy i jamy nosowej. Opracowaliśmy tutaj model myszy wykorzystujący specyficzną stymulację tchawicy (w celu wywołania kaszlu) oraz jamy nosowej (wywołującą kichanie). Korzystając z zsynchronizowanych nagrań multimodalnych, pletyzmografii całego ciała (WBP), szerokopasmowych mikrofonów ultradźwiękowych (0-250 kHz) oraz wideografii wysokiej prędkości (160 fps), zidentyfikowaliśmy wyraźne sygnatury fizjologiczne kaszlu i kichania. Nasze wyniki wykazały, że zarówno kaszel, jak i kichanie wykazują wzorce oddechowe z pojedynczym i podwójnym szczytem, z istotnymi różnicami w składzie widm częstotliwości audio. Tworząc układ współrzędnych oparty na cechach audio, udało nam się skutecznie rozróżnić kaszel i kichanie, przypisując je do różnych ćwiartków osi współrzędnych. Badanie to, dzięki stymulacji anatomicznie specyficznej i analizie cech akustycznych, ustanowiło model myszy zdolny ilościowo rozróżniać kaszel od kichania, zapewniając precyzyjną metodę eksperymentalną do badania odruchów obronnych dróg oddechowych oraz ukierunkowanego rozwoju terapeutycznego.

Wprowadzenie

Kaszel i kichanie to kluczowe odruchy obronne organizmu, aby usunąć obce substancje z dróg oddechowych, a nieprawidłowości w powiązanych szlakach nerwowych często wywołują choroby przewlekłe, takie jak przewlekły kaszel i nieżyt nosa. Oba odruchy obejmują fazę wdechową, fazę kompresyjną oraz fazę wydechową ^1,2. Odruch kaszlu jest głównie pośredniczony przez neurony czuciowe dróg oddechowych unerwione przez nerw błędny ^3,4,5. Neurony błędne odbierają bodźce mechaniczne, chemiczne lub elektryczne z dróg oddechowych i przekazują sygnały do jądra drocznego (NTS) w rdzeniu przedłużonym⁶. NTS integruje te informacje i następnie przesyła je do ośrodków oddechowych w rdzeniu przedłużowym i mostie⁷. Te ośrodki ostatecznie koordynują odpowiednie grupy mięśni oddechowych (takie jak przepona, mięśnie międzyżebrowe i mięśnie krtani), aby wykonać akcję kaszlu, wydalając potencjalnie szkodliwe drażniące substancje i śluz z dróg oddechowych przez jamę ustną ^8,9,10. Odruch kichania jest głównie pośredniczony przez neurony czuciowe nosa w zwojach trójdzielnych^11,12. Ich bodźce mechaniczne lub chemiczne są przekazywane do jądra trójdzielnego rdzenia kręgowego (SP5), które następnie przekazuje informacje do ośrodków oddechowych 13,14,15,16. Te ośrodki regulują odpowiednie mięśnie (takie jak mięśnie oddechowe, mięśnie podniebienia i twarzy), aby rozpocząć kichnięcie¹⁷. Silny wydechowy wydech kichania wypycha większość powietrza przez nos, by usunąć drażniące substancje ^9,18. Badania nad kaszlem i kichaniem nie tylko pomagają wyjaśnić mechanizmy neuronalne obrony oddechowej, ale także dostarczają terapeutycznych celów dla przewlekłego kaszlu i nieżytu nosa. W tym celu kluczowe jest opracowanie solidnego i wiarygodnego modelu zwierzęcego.

W ostatnich latach myszy stały się kluczowym organizmem modelowym do badania szlaków nerwowych kaszlu i kichania 19,20,21. Dominująca obecna metodologia nadal polega na wywoływaniu tych zachowań odruchowych poprzez wdychanie aerozoli związków stymulujących ^8,20,22. Istotnym ograniczeniem tego podejścia wdechowego jest to, że bodźce jednocześnie oddziałują zarówno na jamę nosową, jak i tchawicę, niespecyficznie aktywując odrębne systemy czuciowe pośredniczące kichanie (przez szlak trójdzielny) i kaszel (przez szlak błędny). Stanowi to poważne wyzwanie dla precyzyjnego rozróżnienia wywołanego typu zachowania w eksperymentach. Ta rozbieżność jest widoczna w literaturze: niektóre badania definiują odruchy oddechowe wywołane kapssaicyną u myszy jako kichanie²¹, podczas gdy inne informują, że odruchy te obejmują zarówno komponenty kaszlowe, jak i kichanie ^8,22.

Aby sprostać temu wyzwaniu, opracowano zaawansowane metody, w tym analizę wzorców i trajektorii oddechowych, aby klasyfikować odrębne zachowania odruchowe⁸. Inne badanie wykazuje, że kaszel i kichnięcie wykazują wyraźne różnice w cechach czasowych i spektralnych, takich jak czas trwania czy modulacja częstotliwości²². Ich prace podkreśliły, że kaszel wykazuje stężenie energii w niższych szczytowych zakresach częstotliwości (20-80 kHz), podczas gdy kichnięcia wykazują komponenty przekraczające 90^kHz22. Te akustyczne dywergencje oferują nowe, nieinwazyjne ramy do rozróżniania behawioralnego, uzupełniające tradycyjne analizy fal oddechowych. Pomimo tych innowacji pozostaje krytyczna luka: istniejące modele nie mają anatomicznej specyficzności w dostarczaniu bodźców, co często zakłóca szlaki tchawicy i odruch nosowy. To ograniczenie pokazuje, że potrzebujemy lepszych metod celowania i badania odruchów oddechowych.

Badania nad mechanizmami leżącymi u podstaw kaszlu i kichania wywołanych przez mechaniczną i chemiczną stymulację dróg oddechowych zostały szeroko przeprowadzone na dużych modelach zwierzęcych (np. kotach)¹⁷. Jednak w modelach małych zwierząt (np. świnki morskie, szczury i myszy) ograniczenia techniczne zazwyczaj wymagały polegania na związkach aerozoalizowanych (takich jak kapsaicyna czy kwas cytrynowy) w celu uzyskania stymulacji chemicznej.

Protokół ten proponuje nowatorską metodę wywoływania zachowań podobnych do kaszlu i kichania u myszy oraz ustanawia nowy zestaw metod ilościowego i charakteryzującego te odruchy oddechowe. Podejście to ustanawia strategię rozróżniania zachowań podobnych do kaszlu i kichania u myszy poprzez identyfikację charakterystycznych wokalizacji oraz analizę ich cech spektralnych i intensywności akustycznej. Ta nowatorska metodologia ma potencjał do ustandaryzowania ilościowego określania odruchów oddechowych u myszy, zwiększenia powtarzalności eksperymentów oraz pogłębienia mechanistycznego zrozumienia neurofizjologii kaszlu i kichania.

Protokół

Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Protokołu Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Laboratorium w Kantonie (GZLAB-AUCP-2024-04-A10). W badaniu wykorzystano samice i samce myszy C57BL/6 wolnych od specyficznych patogenów, w wieku 8-10 tygodni.

1. Przygotowanie eksperymentalne

1. Przygotowanie zwierząt doświadczalnych
   1. Myszy domowe w klatkach z darmowym dostępem do jedzenia i wody oraz utrzymywane w temperaturze 22 ± 1 °C w standardowym 12-godzinnym cyklu światła/ciemności.
2. Przygotowanie roztworu kapsaicyny
   1. Rozpuścić 30,5 mg proszku kapsaicyny w PBS zawierającym 10% etanolu i 10% Tween-80, aby przygotować roztwór zapasowy o pojemności 10 mM.
   2. Rozcieńcz roztwór w skali 1:100 w soli fizjologicznej, aby przygotować roztwór roboczy 100 μM.
3. Przygotowanie trybrometanolu (Avertin)
   1. Waż 0,5 g tribrometanolu do probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 mL. Dodaj 1 ml 2-metylo-2-butanolu.
   2. Inkubuj w temperaturze 55 °C z mieszaniem (400-600 obr./min) w ciemności, aż do całkowitego rozpuszczenia (~20 min).
   3. Włóż 40 ml soli fizjologicznej do zlewki. Podczas mieszania dodaj rozpuszczony roztwór tribrometanolu krople. Kontynuuj mieszanie, aż rozpuszczone kryształy całkowicie się rozproszą (~40 min).
   4. Reguluj pH do 7,0-7,3 używając NaOH.

2. Ustanowienie i rejestrowanie modelu zachowań podobnego do kaszlu

1. Przygotowanie kaniuli implantacyjnej
   1. Przetnij igłę o masie 28 g (średnica: 0,19 mm, średnica średnicy: 0,35 mm) na kaniulę o średnicy ~5 mm. Wygładz oba końce papierem ściernym za pomocą kleszczy. Przymocuj jeden koniec do rurki silikonowej (średnica: 0,3 mm, średnica średnicy: 0,8 mm). Podłącz do strzykawki o pojemności 1 mL i przepłucz kaniulę wodą, aby sprawdzić przechodność.
   2. Zgiąć kaniulę pod kątem 90° z proporcją ramion 2:3. Włóż dłuższe ramię do silikonowej rury (średnica: 0,3 mm, średnica średnicy: 0,8 mm, długość 5 cm; Rysunek 1A). Wyznacz zgięty koniec do implantacji tchawicy. Wysuń silikonową rurkę od tchawicy do czaszki w celu stabilizacji (Rysunek 1B).
2. Przygotowanie sprzętu do nagrywania
   1. Przygotuj system pletysmografii całego ciała (WBP), ultradźwiękowy rejestrator, kamerę o wysokiej prędkości, pompę mikrowtryskową.
3. Przypisanie grup myszy
   1. Losowo przypisać myszy do trzech grup (n = 6/grupa): i) Grupa kontrolna: Utrzymuj normalny, nieleczony status. ii) Grupa pozorowa: Wszczep kaniulę tchawicową bez stymulacji. iii) Grupa stymulująca: Wszczep kaniulę tchawicową i podaj kapsaicynę w celu wywołania kaszlu.
4. Zabieg chirurgiczny
   1. Podaj 0,5-1,0 mg/kg buprenorfiny ER podskórnie 30 minut przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego. Znieczulaj myszy przez intraperitonealne podanie trybrometanolu (125-250 mg/kg) i potwierdz całkowite znieczulenie przez brak reakcji na uszczypnięcie palca. Przed zabiegiem nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec suchości rogówki. Następnie połóż mysz na termoforze ustawionej na temperaturę 37 °C i przykryj ją sterylną gazą.
   2. Ogol włosy na czaszce i szyjce. Zabezpiecz znieczuloną mysz na plecach. Dezynfekuj jodoforem i alkoholem.
   3. Pod mikroskopem: Naciń skórę szyjki na około 1 cm. Bezpośrednio rozcinać tkanki i mięśnie, aby odsłonić tchawicę. Przekłucie tkankę miękką między chrząstką chrząstką chrząstki i tchawicy za pomocą igły 32 G. Stwórz minimalne otwór tchawicy nożyczkami okulistycznymi.
      UWAGA: Zachowaj rozmiar otworu na tyle duży, aby kaniula nie uszkodziła tkanek.
   4. Wkład metalową kaniulę (pokrytą silikonem) ~1 mm do lumenu tchawicy. Zabezpiecz połączenie kaniul-tchawica szwem 7-0.
      UWAGA: Ogranicz głębokość włożenia do 1 mm, aby uniknąć zaburzeń oddechowych.
   5. Nacinaj skórę głowy na odległość ~1 cm. Proste przekopywanie podskórnego tunelu od szyi do czaszki. Przeprowadź silikonową rurkę do czaszki i przymocuj ją cementem dentystycznym.
   6. Zszyj skórę szyi i czubka głowy. Połóż mysz na termoforze, aż się przytomi. Dom w klatce przez 5 dni.
   7. Codziennie płucz kaniulę/rurki tchawicy 1 ml strzykawką powietrzną.
      UWAGA: Pominąć spłukiwanie w ciągu 24 godzin przed wywołaniem kaszlu.
5. Nagranie kaszlu
   1. Zamontuj sondę ultradźwiękową z pierścieniem uszczelniającym kompatybilnym z portem. Włóż sondę do portu komory WBP, aby zapewnić szczelny kontakt.
   2. Podłącz komorę WBP, czujnik przepływu i przepływ polaryzacyjny. Kalibruj za pomocą oprogramowania.
   3. Przymocuj silikonową rurkę przymocowaną do czaszki do rurki przedłużającej o średnicy 30 cm. Umieść mysz w komorze WBP. Wysuń rurkę przez górny port. Uszczelnij port gliną modelarską. Sprawdź szczelność komory, potwierdzając, że szczyty przebiegu oddechowego mieścią się w granicach 4 ± 2.
   4. Załaduj 1 mL strzykawki 5 ml roztworu kapsaicyny. Eliminuj pęcherzyki powietrza. Podłącz do rurki przedłużającej. Zamontuj strzykawkę na pompie mikrowtryskowej i ustaw przepływ na 10 μL ^min-1.
      UWAGA: Nadmierny przepływ może przenosić kapsaicynę do jamy nosowej.
   5. Ustaw kamerę o dużej prędkości skierowaną na komorę. Dostosuj odległość i ostrość. Ustaw częstotliwość próbkowania na 160 fps (maksymalna).
   6. Jednocześnie uruchamiam WBP, ultradźwięki i oprogramowanie kamery; Uruchom pompę, by wprowadzić kapsaicynę. Rekordowe liczby kaszlów przez 10 minut.

3. Ustanowienie i zapisywanie modelu zachowań podobnego do kichania

1. Przygotowanie sprzętu eksperymentalnego
   1. Przygotuj jedną sterylną rurkę PE (średnica: 0,5 mm, przedalenie: 1 mm) do fiksacji jako kaniula stymulacyjna na kości nosowej myszy.
   2. Przygotuj jeden sterylizowany nylonowy filament o średnicy 0,25 mm do stymulacji nosa trans-kanniula. Korzystając z metody kalibracji Vonfreya, gdy 5 cm długi filament jest pionowo dociskany na balan, aż wyginie się pod kątem około 45°, mierzona siła wynosi 0,6 g.
2. Konfiguracja sprzętu nagraniowego
   1. Przygotuj jeden system pletyzmografii całego ciała (WBP), jeden rejestrator ultrasonograficzny oraz jedną kamerę szybkiej.
3. Przypisanie grup myszy
   1. Losowo przypisać myszy do trzech grup (n = 6/grupa): i) Grupa kontrolna: Utrzymuj nieleczony status wyjściowy. ii) Grupa pozorowa: Utrwala kaniula nosowa bez stymulacji. iii) Grupa stymulująca: Utrwalić kaniulę nosową + wywołać kichnięcie za pomocą stymulacji filamentem.
4. Zabieg chirurgiczny
   1. Podaj 0,5-1,0 mg/kg buprenorfiny ER podskórnie 30 minut przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego. Znieczulaj myszy przez intraperitonealne podanie trybrometanolu (125-250 mg/kg) i potwierdz całkowite znieczulenie przez brak reakcji na uszczypnięcie palca. Przed zabiegiem nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec suchości rogówki. Następnie umieść mysz na termoforze ustawionej na temperaturę 37 °C i przykryj zwierzę sterylną gazą.
   2. Ogol włosy na czaszce czaszki i grzbiecie nosa.
   3. Zabezpiecz mysz w stereotaksyjnej ramie. Dezynfekuj jodoforem i alkoholem. Nacinaj skórę nad czaszką i kością nosową. Odsłonić kość nosową.
   4. Wykonaj otwór o średnicy 0,5 mm w połączeniu między kością nosową a bocznym wyrostkiem chrząstki przegrody nosowej za pomocą mikrowiertła. Odsłonić błonę śluzową nosa.
      UWAGA: Ogranicz rozmiar otworu do 0,5 mm, aby zapobiec uszkodzeniom tkanek.
   5. Delikatnie unieś błonę śluzową nosa igłą 32 G. Odsłonić jamę nosową.
   6. Zamontuj lampę PE w ramieniu stereotaksyjnym. Ustaw końcówkę rury równo z otworem na żarno. Przymocuj rurkę do kości nosowej cementem dentystycznym i zszyj skórę.
   7. Połóż mysz na termoforze, aż odzyska świadomość.
5. Nagranie kichania
   1. Podłącz komorę WBP, czujnik przepływu i przepływ polaryzacyjny zgodnie z instrukcją. Kalibruj za pomocą oprogramowania.
   2. Zamontuj sondę ultradźwiękową z uszczelką dostosowaną do portu. Włóż sondę do komory. Sprawdź szczelność szczelną.
   3. Przenieś mysz do komory WBP. Wysuń rurkę PE przez górny port. Uszczelnij port gliną modelarską wokół rurki. Sprawdź szczelność komory, potwierdzając, że szczyty przebiegu oddechowego mieścią się w granicach 4 ± 2.
   4. Ustaw kamerę o dużej prędkości skierowaną na komorę. Dostosuj odległość i ostrość. Ustaw częstotliwość próbkowania na 160 fps (maksymalna).
   5. Przeprowadzić nylonowy filament o średnicy 0,25 mm przez miękką rurkę do jamy nosowej na głębokość 0-3 mm. Część filamentu wystająca z ręcznej rurki ma długość 5 cm. Podczas stymulacji naciśnij ten wolny końcówkę, aż zginie się pod kątem 45°, wywierając ~0,6 g siły na błonę śluzową nosa przez 1 s, powtarzaj raz na 30 s. Nagrywaj reakcje kichania przez 10 minut.

4. Kaszel i kichanie wywołane kapsaicyną u myszy

1. Przydział do grupy
   1. Podziel myszy na grupy pozorującej chirurgii i grupy chirurgiczne (n = 5/grupa). Grupa pozorowa: Odsłonięcie obustronnych nerwów przednich i podoczodołowych. Grupa chirurgiczna: Transtacja obustronnych nerwów naciennych i podoczodołowych.
2. Ultradźwiękowa nebulizacja
   1. Przygotuj komorę behawioralną (20 cm × 14 cm × 17 cm).
   2. Ustawij rejestrator ultradźwiękowy i kamerę dla optymalnego monitoringu.
   3. Załaduj nebulizator 100 μM roztworu kapsaicyny. Dostarczaj 30-sekundowe impulsy aerozolowe co 2 minuty przez 10 minut.
   4. Rejestruj zachowania nieprzerwanie za pomocą rejestratora ultradźwiękowego i aparatu.

5. Proces analizy danych

1. Analiza śledzenia oddechowego metodą pletyzmografii całego ciała (WBP)
   1. Zaimportuj nagrane pliki tekstowe WBP do oprogramowania Spike2 i zsynchronizuj je z sygnałami audio.
   2. Przeanalizuj sygnały audio odpowiadające wzorcom oddechu o pojedynczym i podwójnym szczytie oraz zapisz czas trwania fazy kompresji dla każdego wzorca.
   3. Wybierz najniższy punkt fazy wydechowej jako środek i pobierz dane z pół sekundy przed i po do obliczenia wartości średniej.
2. Analiza przebiegów audio
   1. Importuj pliki audio do oprogramowania Spike2, wybierz pojedynczy dźwięk kaszlu lub kichania i eksportuj je w formacie TXT (z częstotliwością próbkowania ustawioną na 100 kHz i czasem trwania 0,1 s).
   2. Zaimportuj pliki TXT do Excela i przekonwertuj je na wartości bezwzględne sygnałów audio.
   3. Użyj oprogramowania GraphPad Prism, aby wygładzić wartości bezwzględne przebiegów dźwięku za pomocą spline wygładzania z 50 punktami.
      UWAGA: Aby krzywa wiernie odpowiadała oryginalnym danym przy jednoczesnym uniknięciu nadmiernych punktów zwrotnych, optymalny jest wybór wygładzającej spline o 50 punktach; krzywe generowane o wartościach większych niż 50 punktów wykazują pomijalne odchylenia od krzywej 50-parametrowej.
   4. Na podstawie wygładzonych przebiegów audio oblicz nachylenie k od punktu startowego do najwyższego.
3. Analiza spektralna dźwięku
   1. Importuj pliki audio do oprogramowania Spike2.
   2. Wybierz punkty początkowe i końcowe pojedynczego kaszlu lub kichania do analizy spektralnej i eksportuj wyniki analizy spektralnej.
   3. Użyj GraphPad Prism do generowania krzywych analizy spektralnej i obliczania powierzchni pod krzywymi.
   4. Oblicz stosunek powierzchni pod krzywą między pasmami częstotliwości 30-60 kHz i 0-30 kHz, aby rozróżnić kaszel od kichania.
4. Obliczenie indeksu złożonego
   1. Wykonaj naturalną transformację logarytmiczną (ln) na nachyleniu k oraz stosunku powierzchni pod krzywą analizy spektralnej, aby zwiększyć rozróżnialność danych.

6. Analiza statystyczna

1. Dane przedstawiono jako średnią ± SEM. Porównania statystyczne między dwiema grupami przeprowadzono za pomocą testu t-test i dwukierunkowej ANOVA, przy czym P < 0,05 uznano za statystycznie istotne. Wszystkie analizy przeprowadzono za pomocą oprogramowania GraphPad Prism.

Wyniki

W tym badaniu przeprowadziliśmy szczegółową analizę wzorców oddechowych dotyczących kaszlu i kichania myszy, wykorzystując techniki pletyzmografii całego ciała (WBP) oraz rejestracji USG. Wyniki wykazały, że myszy poddane operacji tchawicy lub nosa wykazują porównywalną reakcję na kaszel i kichnięcie do osób kontrolnych z naiwnymi grupami kontrolnymi. Jednak kapsaicyna (chemiczna) i stymulacja mechaniczna skutecznie wywołują odruchy kaszlu i kichania u tych chirurgicznie przygotowanych zwierząt (rysunek 2A,B). Wyniki WBP wykazały, że oba zachowania wykazywały wzorce pojedynczych i podwójnych szczytów, a ich sygnały dźwiękowe pojawiały się podczas fazy wydalania wzorca oddechowego (Rysunek 3A,C,E,G). Dalsza analiza ultrasonograficzna wykazała wyraźne profile akustyczne: dźwięki kaszlu pojawiały się nagle, a szczytowa intensywność występowała natychmiast, głównie w zakresie częstotliwości 0-30 kHz, i krótsza (Rysunek 3B,D; Wideo wspierające S1). Dźwięki kichania wykazały stopniowe narastanie intensywności do maksymalnej amplitudy, szerokopasmowy rozkład częstotliwości (0-80 kHz) oraz wydłużony czas trwania (Rysunek 3F,H; Wspierający film S2). Analiza statystyczna wykazała, że średnia faza kompresji zachowania kaszlowego na poziomie pojedynczego szczytu wynosiła 32,39 ± 0,73 ms, co jest istotnie krótszą liczbą niż zachowanie kaszlu podwójnego szczytu – 53,17 ± 2,29 ms (rysunek 4A,B,C). Średnia faza kompresji zachowań kichania na poziomie pojedynczego szczytu wynosiła 44,03 ± 1,84 ms, co jest niższe niż średnia wartość zachowania kaszlu z podwójnym szczytem, podczas gdy średnia faza kompresji zachowania kichania na podwójnym szczycie wynosiła 74,24 ± 1,29 ms, co jest znacząco dłuższe niż zachowanie kichania na pojedynczym szczycie (Rysunek 4E,F,G). Dodatkowo, wskaźnik występowania wzorca pojedynczego szczytu w zachowaniach kaszlowych wynosił 77,55 ± 2,10% (rysunek 4D), podczas gdy w zachowaniach kichających wzorzec pojedynczego szczytu odpowiadał tylko za 32,42 ± 5,88%, a wzorzec podwójnego szczytu 67,58 ± 5,88% (Rysunek 4H). Analiza statystyczna długości dźwięku wykazała istotne różnice między czasami kaszlu i kichania, jednak występowało znaczne nakładanie się między tymi dwoma (Rysunek 5A). Na podstawie analizy spektralnej dźwięku ultradźwiękowego kaszlu i kichania stwierdziliśmy, że spektrum częstotliwości dźwięku kaszlu koncentrowało się głównie w zakresie 0-30 kHz, podczas gdy dźwięk kichania miał wyższy udział w zakresie 0-60 kHz (Rysunek 5B). Chociaż dźwięk kaszlących również miał częstotliwości w zakresie 30-120 kHz, udział niskich częstotliwości zawsze był wyższy niż wysokich. Dlatego użyliśmy nachylenia intensywności dźwięku od punktu początkowego do maksymalnego (rysunek 5C) jako współrzędną pionową oraz stosunku energii od 30-60 kHz do 0-30 kHz (rysunek 5D) jako współrzędnej poziomej, aby ustanowić układ współrzędnych, który skutecznie rozróżniał dźwięk kaszlu i kichania. Ponadto nie zaobserwowano istotnych różnic między kaszlem pojedynczym i podwójnym szczytem oraz kichaniem pojedynczym i podwójnym szczytem w tym układzie współrzędnych (Rysunek 5E).

Następnie zastosowaliśmy wspomniane metody klasyfikacji do kategoryzowania zachowań związanych z kaszlem i kichaniem wywołanych nebulizacją kapsaicyny u myszy. Stwierdziliśmy, że zachowania kaszlu i kichania wywołane nebulizacją kapsaicyną pokrywają się z tymi wywołanymi przez specyficzną stymulację na tych samych pozycjach współrzędnych (rysunek 5F,G). Po przecięciu nerwów czuciowych nosa (nerwy przednie i podoczodołowe) nebulizacja kapsaicyny znacząco zmniejszyła sygnały akustyczne związane z kichnięciem, podczas gdy profile dźwiękowe związane z kaszlem pozostały niezmienione (Rysunek 5H,I).

Rysunek 1: Schematyczny diagram operacji w modelu stymulowanej tchawicy i jamy nosowej. (A) Schematyczne przedstawienie cewnika wszczepionego do tchawicy. (B) Płaszczyzna czołowa (lewa) i koronalna (prawa) pokazują położenie cewnika wszczepionego w tchawicę myszy. (C) Płaszczyzna strzałkowa pokazuje położenie wszczepienia cewnika w jamie nosowej oraz pozycję stymulacji włóknem włókniennym. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Ilościowa analiza zachowań podobnych do kaszlu i kichania wywołanych przez stymulację specyficzną dla konkretnego miejsca. (A) Kwantyfikacja kichania dla grupy kontrolnej normalnej, pozorowanej i grupy stymulującej nos mechanicznie. Grupa pozorowana wykazywała porównywalną częstotliwość kichania do kontroli. Mechaniczna stymulacja nosa powodowała znaczny wzrost liczby zdarzeń kichania. (B) Ilościowa ilościowa grupa kontrolna z powodu kaszlu w normalnej fazie kontrolnej, grupy pozorowanej oraz grupy wyzwaniowej tchawicy kapsaicynowej. Grupa pozorowana nie wykazała istotnej różnicy w częstotliwości kaszlu w porównaniu z grupą kontrolną. Stymulacja tchawicy kapsaicyną znacząco zwiększyła liczbę kaszlu. Dane przedstawiane są jako średnia ± SEM, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Ślady oddechowe i oscylogram dźwiękowy kaszlu i kichania. (A) Reprezentatywne obrazy pokazujące pojedynczy szczyt śladu oddechowego oraz nagranie audio podczas kaszlu wywołanego kapsaicyną. (B) Oscylogram dźwiękowy (u góry) i spektrogram (na dole) nagrania audio kaszlu w A. (C) Reprezentatywne obrazy pokazujące podwójne piki, ślad oddechowy oraz nagrania audio podczas kaszlu wywołanego kapsaicyną. (D) Oscylogram dźwiękowy (u góry) i spektrogram (na dole) nagrania audio kaszlu w języku C. (E) Reprezentatywne obrazy pokazujące pojedynczy szczyt śladu oddechowego oraz nagranie audio podczas kichania wywołanego stymulacją mechaniczną. (F) Oscylogram dźwiękowy (u góry) i spektrogram (na dole) nagrania dźwiękowego kichnięcia w E. (G) Reprezentatywne obrazy pokazujące podwójne szczyty, ślad oddechowy oraz nagranie audio podczas kichania wywołanego stymulacją mechaniczną. (H) Oscylogram dźwiękowy (u góry) i spektrogram (na dole) nagrania dźwiękowego kichania w G. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Pojedyncze i podwójne szczyty śladów oddechowych zachowań podobnych do kaszlu i kichania. (A) Średnie (czerwone) i indywidualne (szare) i średnie (czerwone) ślady oddechowe zachowań podobnych do kaszlu z pojedynczym szczytem oddechowym (n = 52). (B) Średnie (czerwone) i indywidualne (szare) oraz średnie (czerwone) ślady zachowań kaszlu z podwójnymi szczytami oddechowymi (n = 29). (C) Czas trwania pojedynczych i podwójnych szczytów oddechowych – fazy kompresyjne dla kaszlu wywołanego kapsaicyną (pojedynczy szczyt n = 52, podwójne piki n = 29). (D) Średni stosunek pojedynczych i podwójnych szczytów oddechowych w kaszlu (n = 6 myszy). (E) Średnie (czerwone) i indywidualne (szare) oraz średnie (czerwone) ślady zachowań oddechowych przypominające kichanie z pojedynczymi szczytami oddechowymi (n = 40). (F) Średnie (czerwone) i indywidualne (szare) oraz średnie (czerwone) ślady zachowań przypominających kichanie z podwójnymi szczytami oddechowymi (n = 74). (G) Czas trwania pojedynczych i podwójnych pików oddechowych – fazy kompresyjne dla kichania wywołanego stymulacją mechaniczną (pojedynczy szczyt n = 40, podwójne piki n = 74). (H) Średni stosunek szczytowych śladów pojedynczego i podwójnego oddechu w kichaniu (n = 6 myszy). Dane są reprezentowane jako średnia ± SEM, ****P < 0,0001. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 5: Klasyfikacja częstotliwości i przebiegów fal oscylogramu dźwiękowego kaszlu i kichania. (A) Ilościowa charakterystyka długości kaszlu i kichania na sonogramie. (B) Średnia analiza spektrogramu kichnięć wywołanych stymulacją mechaniczną (n = 69,) oraz kaszlu wywołanego kapsaicyną (n = 140, czerwony). (C) Reprezentatywny schemat do obliczania nachylenia oscylogramu dźwiękowego. Analiza porównawcza wygładzania spline pokazuje, że przy 25 punktach nadmierne wygładzanie zasłania oryginalne cechy danych, podczas gdy wartości przekraczające 50 punktów (np. 75 punktów) wykazują znaczne nakładanie się z krzywą 50-spline, ale wprowadzają dodatkowe punkty zwrotne. (D) Reprezentatywny schematyczny diagram obliczania stosunku powierzchni, wykorzystujący wyniki analizy spektralnej do obliczenia powierzchni pod różnymi krzywymi częstotliwości w GraphPad Prism. Stosunek powierzchni jest równy powierzchni pod krzywą 30-60 kHz oraz powierzchni pod krzywą 0-30 kHz. (E) Klasyfikacja częstotliwości i przebiegów fal mechanicznie wywołanych kichnięciami oraz kaszlu wywołanych kapsaicyną brzmi oscylogram, gdzie oś y reprezentuje wykładnik nachylenia fali dźwiękowej od wartości bazowej do szczytu, a oś x jako wykładnik stosunku fal dźwiękowych w zakresie 30-60 kHz do 0-30 kHz. (F) Średnia analiza spektrogramu kichnięć wywołanych nebulizacją kapsaicyną (n = 36,) oraz kaszlu wywołanych nebulizacją kapsaicyną (n = 42, czerwony). (G) Klasyfikacja częstotliwości i przebiegu fal kichnięć wywołanych nebulizacją kapsaicyną (n = 36,) oraz kaszlu wywołanego nebulizacją kapsaicyną (n = 42, czerwony) oscylogram dźwiękowy, gdzie oś y reprezentuje wykładnik nachylenia fali dźwiękowej od linii bazowej do szczytu, a oś x jako wykładnik stosunku fal dźwiękowych między 30-60 kHz a 0-30 kHz. (H) Dane statystyczne dotyczące odruchu kichania wywołanego kapsaicyną w grupach z przeciętymi nerwami przednimi i podoczodołowymi w porównaniu do grupy poddawanej operacji chirurgicznej. (I) Dane statystyczne dotyczące odruchu kaszlu wywołanego kapsaicyną w grupach z przecięciami nerwów przednich i podoczodołowych w porównaniu do grupy poddawającej operację pozorowaną. Dane są reprezentowane jako średnia ± SEM, **P < 0,01, ****P < 0,0001. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Wideo uzupełniające 1: Wideo z zachowaniem przypominającym kaszel zsynchronizowane ze spektrogramem audio, wyświetlane z normalną prędkością i prędkością 0,1x. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo uzupełniające 2: Nagranie zachowania przypominającego kichanie, zsynchronizowane ze spektrogramem audio, wyświetlane z normalną prędkością i prędkością 0,1x. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W tym badaniu skutecznie wywołaliśmy zachowania kaszlu i kichania u myszy, stymulując tchawicę kapsaicyną oraz mechanicznie stymulując jamę nosową ^8,17. Synchronicznie zebraliśmy dane z pletyzmografii całego ciała (WBP), nagrań audio i wideo i odkryliśmy, że stosunki częstotliwości audio oraz nachylenia intensywności dźwięku mogą skutecznie rozróżniać zachowania kaszlące i kichające u myszy ^8,23.

Biorąc pod uwagę delikatny charakter procedur chirurgicznych, należy zwrócić szczególną uwagę na kilka kluczowych etapów. Po pierwsze, podczas operacji tchawicy wszczepiona kaniula śródtchawicowa musi być jak najcieńsza i umieszczona na niewielkiej głębokości, aby uniknąć niedrożności dróg oddechowych, która mogłaby prowadzić do niedotyków oddechowych, a nawet śmiertelności. Ponadto, ponieważ wydzieliny wewnątrz tchawicy mogą łatwo blokować cewnik, codzienne oczyszczanie cewnika jest kluczowe. Podczas podawania kapssaicyny prędkość wstrzyknięcia należy starannie kontrolować, aby zapobiec cofaniu się do jamy nosowej, co może wywołać odruch kichania. Po drugie, podczas operacji implantacji kości nosowej wielkość wywierconego otworu jest kluczowa, aby zapobiec nadmiernym uszkodzeniom myszy. Cewnik powinien być umieszczony na poziomie kości nosowej, nie wprowadzając go zbyt głęboko, aby zapobiec nadmiernemu podrażnieniu jamy nosowej lub zakłóceniom prawidłowego oddychania. Ostatecznie niezbędne jest wykonanie precyzyjnych procedur chirurgicznych dla eksperymentu. Minimalizując obrażenia myszy, nie tylko można przyspieszyć regenerację, ale także rejestrować dokładniejsze eksperymentalne reakcje behawioralne. Takie metody chirurgiczne pomagają zwiększyć wiarygodność modelu i zapewnić wysokiej jakości dane, zapewniając solidne podstawy eksperymentalne do badania zachowań odruchowych oddechowych, takich jak kaszel i kichanie.

Tradycyjnie modelowanie zachowań kaszlowych opierało się na nebulizacji związków takich jak kapsaicyna i kwas cytrynowy w celu wywołania kaszlu^24,25. Jednak takie podejście niesie ze sobą istotne ograniczenia: nie tylko wywołuje kaszel, ale może także jednocześnie wywoływać odruchy kichania ^8,22. Ponadto zaobserwowano istotną zmienność między osobami w wrażliwości na bodźce aerozolowe w²⁶ przypadkach, a podgrupa myszy nie wykazywała żadnej reakcji na kaszel. Dla porównania, nowy paradygmat stymulacji mechanicznej opracowany w tym badaniu pozwala na stabilne zachowania podobne do kaszlu, jednocześnie umożliwiając elastyczną personalizację bodźców za pomocą wymiennych siłowników. Podobnie konwencjonalne modele kichania wykorzystujące środki aerozolowe cierpią na słabą specyficzność behawioralną, ponieważ często wywołują kaszel uboczny²², co komplikuje rozróżnienie tych odrębnych odruchów oddechowych.

Poprzednie badania ustaliły modele kaszlu i kichania myszy z wykorzystaniem kapsaicyny oraz rozróżniły je na podstawie cech wzorców oddechowych (pojedyncze lub podwójne piki) rejestrowanych za pomocą pletysmografii całego ciała (WBP)⁸. Nasze dane badawcze wskazują, że w zachowaniach wywołanych kaszlem wzorzec oddechu w pojedynczym szczytowym okresie odpowiadał za 77,55 ± 2,10% przypadków, podczas gdy w zachowaniach kichania wzorzec pojedynczego szczytu odpowiadał za 32,42 ± 5,88%. Wyniki te potwierdzają, że metoda klasyfikacji oparta na wzorcach oddechowych WBP jest skuteczna w większości przypadków, ale wykazuje ograniczenia i nie pozwala na doskonałe rozróżnienie tych dwóch zachowań. Dodatkowo, niektóre badania próbowały odróżnić kaszel od kichania na podstawie charakterystyki długości i częstotliwości sygnałów audio²². Chociaż średni czas trwania sygnałów dźwiękowych dotyczących zachowań kichających jest zazwyczaj dłuższy niż dla kaszlu, istnieje znaczne nakładanie się między czasami trwania poszczególnych zdarzeń. Dlatego poleganie na długości dźwięku jako wskaźniku wyróżniającym może być niewystarczające dla dyskryminacji. Ponadto analiza spektralna kaszlu i kichania nie wykazała wyraźnej granicy: łagodne kaszlenie może objawiać się jedynie sygnałami niskiej częstotliwości, podczas gdy intensywny kaszel może wywoływać dźwięki zawierające istotne składniki o wysokiej częstotliwości, o cechach spektralnych podobnych do kichania. Co istotne, zdarzenia kaszlu konsekwentnie wykazują wyższy udział energii niskiej częstotliwości. Natomiast stosunek energii wysokiej częstotliwości do niskiej częstotliwości (wysoki do niskiej częstotliwości) może stanowić bardziej dyskryminującą cechę akustyczną do rozróżniania zachowań związanych z kaszlem a kichaniem.

Nasza innowacja odpowiada na te ograniczenia poprzez stymulację mechaniczną o ograniczonych czasach przestrzennych. Udoskonalony model behawioralny wykazuje podwójne zalety: (1) precyzję na poziomie milimetrów w zastosowaniu bodźców stabilizowanych sond oraz (2) zwiększoną specyficzność behawioralną. Ponadto nasza szeroko zakrojona analiza akustyki kaszlu i kichania ujawnia, że te zachowania wykazują różne profile intensywności dźwięku, ze statystycznie istotnymi różnicami w stosunku energii wysokich do niskich częstotliwości. Ponadto nasza kompleksowa analiza akustyczna zdarzeń kaszlu i kichania ujawnia charakterystyczne profile intensywności dźwięku między tymi zachowaniami, któremu towarzyszą statystycznie istotne różnice w stosunku energii wysokich do niskich częstotliwości. Ponadto ta metoda klasyfikacji jest również wykonalna w akustycznych zapisach zachowań kaszlowych i kichających wywołanych przez nebulizację kapsaicyny. Łącznie te parametry akustyczne umożliwiły stworzenie wielowymiarowej przestrzeni cech, która ustanawia obiektywny, mierzalny standard rozróżniania kaszlu i kichania. Wynik ten ustanawia dobre standardy do badania mechanizmów obrony dróg oddechowych z redukcją zakłóceń i poprawą powtarzalności. To nie tylko rozwiązuje długoletnie wyzwania w badaniach nad odruchem oddechowym, ale także otwiera możliwości precyzyjnych badań neuromodulacji obwodów nerwowych kaszlu i kichania.

Chociaż ta metoda skutecznie wywołuje u myszy zachowania związane z kaszlem i kichaniem, ma pewne ograniczenia. W porównaniu z indukcją nebulizacji, operacja może powodować pewien stopień urazu myszy, mimo że staramy się minimalizować uszkodzenia podczas zabiegu. Niemniej jednak operacja może stabilnie wywołać zachowania związane z kaszlem i kichaniem, co wskazuje, że sama operacja nie zmniejsza wrażliwości myszy na te bodźce. Pojawiły się także wyzwania techniczne w fenotypowaniu behawioralnym. Wierność sygnału akustycznemu wymagała precyzyjnej kalibracji ustawienia mikrofonu przez obiekt, aby zrównoważyć stosunki sygnału do szumu, jednocześnie unikając nasycenia amplitudy. Ponadto integracja cewników do dostarczania bodźców z komorami pletysmografii całego ciała (WBP) wymagała specjalistycznych projektów: cewnik musi wychodzić z góry komory, nie utrudniając naturalnych ruchów myszy ani dostarczania bodźca. Podsumowując, pomimo ograniczeń metody chirurgicznej, zapewnia ona skuteczny sposób na stabilne wywoływanie zachowań kaszlowych i kichających u myszy, a dzięki starannie zaprojektowanemu procesowi eksperymentalnemu można zminimalizować urazy myszy, aby zapewnić dokładne zbieranie danych behawioralnych.

Podsumowując, dzięki tym delikatnym manipulacjom chirurgicznym i rygorystycznemu projektowi eksperymentalnemu stworzyliśmy model, który stabilnie wywołuje zachowania kaszlu i kichania u myszy, zapewniając wiarygodną podstawę eksperymentalną do dalszych badań tych dwóch zachowań odruchowych oddechowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Filament nylonowy 0,25 mm			https://item.taobao.com/item.htm?app =Weiksin& bc_fl_src=share-1041234389 826863-2-1& bxsign=scdVy4Xlh07ZND yojKnPqZ8vQnR_0pjarQFoQH9h636l au-W1sONf-RPbGobT6VinB8J0CrFC xRXoB-tghl13JMFQh3DrBLpqflgMRg DY2repq1fcQGIoPm4AuDfQSUQXE p& cpp=1& h5_spm=a-tb-item.b-tb-ite m& id=595514372480& share_crt_ v=1& shareurl=true& short_name=h .hIi5xvPc8rHTjez& sp_tk=eDdVczR SSG1vODU%3D& SPM=A2159R.13 376460.0.0& tbSocialPopKey=shar eItem& tk=x7Us4RHmo85& un=b3 859eab62ef44248bd7bab98ffeb2 63& un_site=0& ut_sk=1.ZZv9EYy wWWkDAI%2FaThaoYLYt_2164 6297_1755074424775.TaoPassw ord-WeiXin.1& wxsign=tbwr_qqSc esj7OBC_MTN-urBRm3r6GFm9t SERXxmOXNfgDGI3usP8mgVRu QmtuQ3LRrt9OkMGFP3XV55Hpp DzZZUQ4jUaki80cL79BKkrc85YE 5VYZfdiqppGkhao6kzkKF& x-ssr=prawdziwość
Igła 28G			https://item.taobao.com/item.htm? app=weixin& bc_fl_src=share-1041 234389566731-2-1& bxsign=scdfvM o7l21o6H5xXAgtKjf4TGT54QtHpk ED6yQRvvPvkGUKWiNyteUooM8e 6wcMmSKQpRsUCHjVo1q6Cliyp61 S3Nr1VadjTYKEJ1_SxSFZln_zI-0U omdKkkegvM6O5Rr& cpp=1& h5_sp m=a-tb-item.b-tb-item& id=670272 286239& share_crt _v=1& shareurl=true& short_name= h.hIiUFWFOj35n1LJ& sp_tk=eHFJ QTRSSE9xZDc%3D& SPM=a2159 R.13376460.0.0& tbSocialPopKey= shareItem& tk=xqIA4RHOqd7& UN =b3859eab62ef44248bd7bab98ff eb263& un_site=0& ut_sk=1.ZZv9 EYywWWkDAI%2FaThaoYLYt_2 1646297_1755074424775.TaoPa ssword-WeiXin.1& wxsign=tbwwJc wF20yLPkLax6kR7BPCJ3uPXx_ KPLTBjHUIph1nmN96mu0vYRC 0-DQxpG6mWPKWPZwSElseb HTR6nMzL7zthSG_67CIodTi_3i bFk7SKNFmbLeg1MVSDl9YzKs axPI& x-ssr=prawdziwość
2-metylo-2-butanol	Sigma-Aldrich	240486-100ML
Avisoft RECORDER USGH	Avisoft		Do nagrywania ultradźwiękowego
Stereotaktyczny wtryskiwacz mózgu	Napęd na tylne koła	68801
Kapsaicyna	MCE	HY-10448
Elektroniczna waga	Szanghaj ZhuoJing	BSM-220.4
GraphPad Prism	GraphPadSoftware		Wykorzystywane do grafów i analizy danych
System kamer dużych prędkości	Filr	20102748
Jodofora	LIRCON		https://www.lircon.cn/products_details/218.html
Pompa mikrowtryskowa	XIMAINANOTECH	XMSP-C
Modelingowa glina			https://detail.tmall.com/item.htm? app=weixin& bc_fl_src=share-10 41234985980666-2-1& bxsign=s cdTRuE_YDJUf3ImFGBBqpft8S OgQqVocuYNmXEUcLyxiJX85R eVH8uZxdnVBKeXGONiCQ_Fc UDXoNcDga8mP3sClXi1CKRn R6SHFSitGVUGOFOA7eGoZT 38cLXHb8wUW-S& cpp=1& h5_ spm=a-tb-item.b-tb-item& id=61 1429671875& share _crt_v=1& shareurl=true& short _name=h.hs0LTq88ockDBN6& sp_tk=cldZNjRSREhKUDU%3 D& SPM=a2159r.13376460.0.0 & tbSocialPopKey=shareItem& tk=rWY64RDHJP5& un=b385 9eab62ef44248bd7bab98ffeb 263& un_site=0& ut_sk=1.ZZv9 EYywWWkDAI%2FaThaoYLYt _21646297_1755091386528.T aoPassword-WeiXin.1& wxsign =tbwPFmvLRyYmleaKSyVP7W t1XJnfAXUas_u1d5JJPUA91z9 4BTPKze3BbE2bNJHvC4-agGF ARD4JFW0c8hjdn7Z1Mfk1qgIZ VJ2SaGNFy8b809h3okigHQkp8 LhDopd5-VF& x-ssr=prawda
Nebulizator	YUWELL	M105	Do atomizacji kapsaicyny
PE Tubing	Napęd na tylne koła	62323
Rurki silikonowe			https://item.taobao.com/item.htm? id=618505617112& pisk=gFrice1c WPu1u5K6Stm15sEF8l7d5cijiSK xMmhV8XlBXSntDD-EBYH2ux8Z Ty27ifBf5cUniWPn_S2fCxl4gScY WwI8CRij0_Uc2ge6-dJRw5xZ3p Wqex8NpV5Fxrz-0_CR2epE51n 4Mg0bwy8EFXkZ3m8NK2krnmk< br/> Z7jWnTxDWuCPq09XnnYxw_xu qLMksIm8q7n-ULYH-QCuZ72W nhX8Z0mPqY9DjTjoq0b1J0bq4A k5cCgtoXJh0xA0iaJbW0nvrQQhu QN-D0k4n8bR-tn-4xA2cQfKHqZ hzPf3-MWSpjm2En5hLag-nY44 7HxVGjhoT8yZsXkCkMVmK_4z q-OSaKccirl3lD1igu5Zm5PvfFJo aOzGS7w1IKlE-obgHT1yLKfuuo5 CB0fUuLW08vBK-cWa4gxVesglW 8U8O0ngpWb8XlVkIKbKQBDHRe 4RzM9XHPNgZdACRK9YXlVkIKb BhKUOj7vMOw& SPM=a21xtw.291 78619.0.0
Oprogramowanie Spike2	Spike2		Wykorzystywane do analizy śladów oddechowych i dźwięku
SpinView	Filr		Wykorzystywane do nagrywania wideo o dużej prędkości
Tribrometanol	Sigma-Aldrich	T48402-100G
UltraSoundGate 116Hme	Avisoft	116Hme/63
Oprogramowanie WBP admiad	TOW-INT-TECH		Wykorzystywane do nagrywania WBP
System pletyzmografii ciała WBP	TOW-INT-TECH	2403-3204