Białka wiążą się z aktyną filamentową (F-aktyną) poprzez odrębne moduły wiążące aktynę. W tym filmie prezentujemy procedurę współsedymentacji aktyny, która jest testem in vitro rutynowo stosowanym do analizy białek lub specyficznych domen wiążących F-aktynę.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test współwytrącania aktyny; do analizy wiązania białek z F-aktyną
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Cytoškielet aktynowy wewnątrz komórki to sieć filamentów aktynowych, która umożliwia ruch komórek oraz procesy komórkowe, a także generuje napięcie i pomaga utrzymać kształt komórki. Choć cytoškielet aktynowy jest strukturą sztywną, pozostaje on strukturą dynamiczną, która nieustannie ulega przebudowie. Liczne białka mogą wiązać się z cytoškieletem aktynowym. Wiązanie konkretnego białka z aktyną F jest często pożądane w celu wsparcia obserwacji biologii komórki lub lepszego zrozumienia procesów dynamicznych wynikających z przebudowy cytoškieletu aktynowego. Test kosedymentacji aktyny jest metodą in vitro rutynowo stosowaną do analizy wiązania specyficznych białek lub domen białkowych z aktyną F. Podstawowe zasady tego testu obejmują inkubację badanego białka (pełnej długości lub jego domeny) z aktyną F, etap ultrawirowania w celu osadzenia aktyny F oraz analizę białka kosedymentującego z aktyną F. Testy kosedymentacji aktyny mogą być odpowiednio zaprojektowane w celu pomiaru powinowactwa wiązania aktyny oraz w testach konkurencji.
Protokół
1. Przygotowanie aktyny
Źródłem aktyny użytej w tym teście były ludzkie płytki krwi pozamyśniowe (β-actin) otrzymane z firmy Cytoskeleton Inc. Alikwoty zapasu w stężeniu 10 mg/ml są przechowywane w zamrażarce w temperaturze -70ºC. Do analizy aktynę rozcieńcza się do stężenia 0,4 mg/ml w buforze zawierającym 5 mM Tris pH 8, 0,2 mM CaCl2, 0,2 mM ATP oraz 0,5 mM DTT, a następnie wiruje przy 20 000g przez 10 min w temperaturze 4ºC. Nadosad, stanowiący aktynę monomerową, jest gotowy do polimeryzacji. Polimeryzację aktyny indukuje dodanie 50 mM KCl, 1 mM ATP i 2 mM MgCl2. Polimeryzacja zachodzi w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
2. Przygotowanie białka
W tym teście wykorzystujemy koniec C-końcowy taliny, który został oczyszczony jako białko z tagiem GST. Białko przeznaczone do analizy poddaje się wirowaniu przy wysokiej prędkości w celu usunięcia agregatów przed inkubacją z F-aktyną.
Białko wirowano przy 100,000g w ultrawirowarce Beckman przez 20 mins w temperaturze 22ºC.
3. Inkubacja białka z aktyną
Ilość aktyny i białka w teście może się różnić. W tym przykładzie stosujemy nadmiar aktyny. Zazwyczaj oblicza się stosunek molowy, np. stosunek molowy aktyny do białka 4:1.
W poniższym teście końcowa objętość reakcji wynosi 150 µl. Bufor, w którym inkubuje się białko i F-aktynę, zależy od badanego białka oraz wymaganych warunków. W tym przykładzie stosujemy bufor zawierający 10 mM Tris pH 7.0, 1 mM ATP, 0.2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0.1 mM CaCl2 oraz 2 mM MgCl2. Białko i F-aktynę inkubuje się w buforze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
4. Sedymentacja F-aktyny
Po inkubacji próbki są wirowane z prędkością 100,000g w temperaturze 22ºC. W filmie wykorzystujemy ultrawirówkę Beckman. Rotor jest ostrożnie wyjmowany, aby nie naruszyć osadów.
5. Analiza współsedymentacji białka z F-aktyną
Nadnadatopie są ostrożnie usuwane za pomocą pipety do probówki typu Eppendorf, a następnie dodaje się 5 X bufor do próbek Laemmli SDS-PAGE. Do pozostałych osadów dodaje się odpowiednią objętość 1 X buforu do próbek Laemmli SDS-PAGE, miesza poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenosi do nowych probówek typu Eppendorf. Względne ilości białek w osadach i nadnadatopach analizuje się po ich rozdziale metodą SDS-PAGE i barwieniu żelu błękitem Coomassie lub metodą Western blotting.
W celu określenia swoistości oddziaływania białka z aktyną można przeprowadzić współsedymentacje zależne od stężenia aktyny. W tego rodzaju eksperymentach inkubuje się stałą ilość białka z serią zwiększających się ilości aktyny, a analizę przeprowadza się zgodnie z powyższym opisem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Współwytrącanie aktyny jest prostym testem in vitro służącym do analizy wiązania specyficznych białek z F-aktyną. W tym filmie prezentujemy przykład przeprowadzenia prostego współwytrącania aktyny. Pokazujemy, jak przygotować F-aktynę, jak przygotować białko do badania oraz opisujemy procedurę współwytrącania aktyny. Podczas przeprowadzania testów współwytrącania aktyny należy wziąć pod uwagę szereg kwestii. Na przykład składniki buforu do inkubacji mogą się różnić w zależności od badanego białka, a pH, temperatura i stę...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Podziękowania dla dr. Praveena Kumara z laboratorium Wittmana na UCSF za film przedstawiający aktynę w komórkach HaCAT.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Bibliografia
- Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin. Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).
- Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength. Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).
- Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain. J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
