Test współwytrącania aktyny; do analizy wiązania białek z F-aktyną

Podsumowanie

Białka wiążą się z aktyną filamentową (F-aktyną) poprzez odrębne moduły wiążące aktynę. W tym filmie prezentujemy procedurę współsedymentacji aktyny, która jest testem in vitro rutynowo stosowanym do analizy białek lub specyficznych domen wiążących F-aktynę.

Streszczenie

Cytoškielet aktynowy wewnątrz komórki to sieć filamentów aktynowych, która umożliwia ruch komórek oraz procesy komórkowe, a także generuje napięcie i pomaga utrzymać kształt komórki. Choć cytoškielet aktynowy jest strukturą sztywną, pozostaje on strukturą dynamiczną, która nieustannie ulega przebudowie. Liczne białka mogą wiązać się z cytoškieletem aktynowym. Wiązanie konkretnego białka z aktyną F jest często pożądane w celu wsparcia obserwacji biologii komórki lub lepszego zrozumienia procesów dynamicznych wynikających z przebudowy cytoškieletu aktynowego. Test kosedymentacji aktyny jest metodą in vitro rutynowo stosowaną do analizy wiązania specyficznych białek lub domen białkowych z aktyną F. Podstawowe zasady tego testu obejmują inkubację badanego białka (pełnej długości lub jego domeny) z aktyną F, etap ultrawirowania w celu osadzenia aktyny F oraz analizę białka kosedymentującego z aktyną F. Testy kosedymentacji aktyny mogą być odpowiednio zaprojektowane w celu pomiaru powinowactwa wiązania aktyny oraz w testach konkurencji.

Protokół

1. Przygotowanie aktyny

Źródłem aktyny użytej w tym teście były ludzkie płytki krwi pozamyśniowe (β-actin) otrzymane z firmy Cytoskeleton Inc. Alikwoty zapasu w stężeniu 10 mg/ml są przechowywane w zamrażarce w temperaturze -70ºC. Do analizy aktynę rozcieńcza się do stężenia 0,4 mg/ml w buforze zawierającym 5 mM Tris pH 8, 0,2 mM CaCl₂, 0,2 mM ATP oraz 0,5 mM DTT, a następnie wiruje przy 20 000g przez 10 min w temperaturze 4ºC. Nadosad, stanowiący aktynę monomerową, jest gotowy do polimeryzacji. Polimeryzację aktyny indukuje dodanie 50 mM KCl, 1 mM ATP i 2 mM MgCl₂. Polimeryzacja zachodzi w temperaturze pokojowej przez 1 ....

Dyskusja

Współwytrącanie aktyny jest prostym testem in vitro służącym do analizy wiązania specyficznych białek z F-aktyną. W tym filmie prezentujemy przykład przeprowadzenia prostego współwytrącania aktyny. Pokazujemy, jak przygotować F-aktynę, jak przygotować białko do badania oraz opisujemy procedurę współwytrącania aktyny. Podczas przeprowadzania testów współwytrącania aktyny należy wziąć pod uwagę szereg kwestii. Na przykład składniki buforu do inkubacji mogą się różnić w zależności od badanego białka, a pH, temperatura i stę.......