Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i ocena modelu przedwczesnej niewydolności jajników u myszy

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69000

⸱

19 września 2025

 , 
1The First Hospital of Anhui University of Science and Technology'

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten określa metodę konstruowania mysiego modelu przedwczesnej niewydolności jajników poprzez wstrzyknięcie cyklofosfamidu. Model ten skutecznie, łatwo i elastycznie odwzorowuje patologiczny postęp przedwczesnej niewydolności jajników u ludzi, wykazując się wysoką niezawodnością i opłacalnością.

Streszczenie

Przedwczesna niewydolność jajników (POI) jest krytycznym stanem prowadzącym do niepłodności kobiet, wymagającym wiarygodnych modeli zwierzęcych do badań mechanistycznych i terapeutycznych. W tym miejscu przedstawiamy ustandaryzowany protokół tworzenia i oceny mysiego modelu POI indukowanego cyklofosfamidem (CTX). Sześcio- do ośmiotygodniowych samic myszy z regularnymi cyklami rujowymi wybrano i poddano dootrzewnowym wstrzyknięciom CTX: dawkę początkową 100 mg/kg w pierwszym dniu, a następnie dawki dzienne 20 mg/kg przez kolejne 14 dni. Dynamiczne zmiany w cyklach rujowych monitorowano za pomocą cytologii wymazu z pochwy z barwieniem Wrighta. Poziomy estradiolu (E2), hormonu folikulotropowego (FSH) i hormonu anty-Müllerowskiego (AMH) w surowicy określono ilościowo za pomocą testu ELISA w celu oceny zmian endokrynologicznych. Histopatologię jajników oceniano za pomocą barwienia hematoksyliną-eozyną (H&E) skrawków zatopionych w parafinie w celu ilościowego określenia atrezji pęcherzykowej, podczas gdy analizę immunohistochemiczną rozszczepionej kaspazy-3 przeprowadzono w celu wykrycia apoptozy komórek ziarnistych. Wyniki wykazały zakłóconą cykliczność rujową, znacznie obniżone poziomy E2 i AMH, podwyższone stężenia FSH, zwiększoną atrezję mieszków włosowych i zwiększoną apoptozę komórek ziarnistych u myszy leczonych CTX, potwierdzając udane modelowanie POI. Ta metoda budowania modeli może w dużym stopniu naśladować mechanizm uszkodzenia jajników wywołanego chemioterapią, prezentując typowe cechy patologiczne, takie jak wyczerpanie rezerwy pęcherzykowej i zaburzenia hormonów płciowych. Stanowi niezawodną platformę eksperymentalną do odkrywania mechanizmu toksycznego wpływu chemioterapii na rozrodczość, badań przesiewowych leków chroniących jajniki i optymalizacji strategii zachowania płodności. Co więcej, model ten jest stosunkowo prosty w obsłudze, tani i ma krótki cykl produkcyjny, dzięki czemu jest łatwy do przeprowadzenia i popularyzacji. Metodologia jest zgodna z wymaganiami JoVE w zakresie wizualizowalnych demonstracji eksperymentalnych krok po kroku.

Wprowadzenie

Przedwczesna niewydolność jajników (POI), najczęstsza forma zaburzenia starzenia się reprodukcyjnego kobiet, nie tylko poważnie zagraża zdrowiu fizycznemu i psychicznemu pacjentek poprzez objawy niedoboru estrogenów i dysfunkcji rozrodczych, ale także zwiększa ryzyko rozwoju chorób współistniejących, w tym złamań, zaburzeń autoimmunologicznych, chorób sercowo-naczyniowych, cukrzycy itp.1. Opracowanie skutecznych i bezpiecznych strategii terapeutycznych stało się zatem niezwykle pilnym priorytetem współczesnej medycyny. Biorąc pod uwagę ograniczoną dostępność próbek klinicznych, wieloczynnikową etiologię i wysokie ryzyko etyczne związane z badaniami POI, niezbędne stało się ustanowienie wiarygodnych modeli zwierzęcych, które umożliwiają systematyczne badania mechanistyczne i walidację bezpieczeństwa.

Obecnie modele uszkodzeń jajników wywołanych chemioterapią są szeroko stosowane w badaniach POI. Cyklofosfamid (CTX), środek alkilujący o właściwościach immunosupresyjnych, został zidentyfikowany jako silny związek gonadotoksyczny. Jego mechanizm polega na uszkodzeniu sieciowania DNA w celu zahamowania proliferacji komórkowej2, co prowadzi do apoptozy komórek rezerwowych jajników 3,4. Modele oparte na CTX skutecznie podsumowują kliniczne cechy charakterystyczne POI, w tym pierwotne wyczerpanie pęcherzyków, hipoestrogenemię i podwyższony poziom hormonu folikulotropowego (FSH). Dootrzewnowe wstrzyknięcie CTX u myszy oferuje wyraźne korzyści: wysoką biodostępność dzięki szybkiemu wchłanianiu otrzewnowemu, standaryzowaną operatywność przy minimalnej zmienności technicznej oraz opłacalność w badaniach na dużą skalę. Warto zauważyć, że budowa jajników myszy jest bardzo podobna do ludzkiej, co ułatwia dynamiczną obserwację wyczerpania mieszków włosowych i zmian hormonalnych. Co więcej, myszy są tanie i mają szybki wskaźnik reprodukcji, spełniając wymagania dotyczące badań próbek na dużą skalę.

Pomimo tych zalet, niejednorodność schematów dawkowania CTX (np. wstrzyknięcia pojedyncze bolus kontra wstrzyknięcia frakcjonowane) i czasowe okna podawania doprowadziły do niespójnych wyników modelowania w różnych badaniach. Aby wypełnić tę lukę, przedstawiamy systematyczny protokół optymalizujący dawkowanie CTX i częstotliwość podawania w celu indukcji POI u myszy. Badanie to ma na celu ustanowienie powtarzalnego modelu poprzez ilościową ocenę wyczerpania rezerwy jajnikowej, dysregulacji hormonalnej i korelatów histopatologicznych, zapewniając w ten sposób solidną platformę do badań mechanistycznych i terapeutycznych badań przesiewowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół ten został sprawdzony i zatwierdzony przez Komitet ds. Etyki Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd. (numer etyki: SDLL202502281). Badanie to jest zgodne z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i wykorzystania gryzoni laboratoryjnych we wszystkich procedurach eksperymentalnych na zwierzętach. Samice myszy C57BL/6 użyte w tym eksperymencie miały 6-8 tygodni i były utrzymywane w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF). Jako szczep wsobny i podszczep linii C57, myszy C57BL/6 charakteryzują się czarną sierścią. Przed eksperymentami myszy aklimatyzowano przez tydzień w laboratorium zwierzęcym w kontrolowanych warunkach temperatury i wilgotności, z 12-godzinnym cyklem światło/ciemność, aby naśladować naturalne rytmy okołodobowe. Przez cały okres aklimatyzacji myszy miały zapewniony ad libitum dostęp do pożywienia i wody.

1. Przygotowanie zwierząt

UWAGA: Wybierz 24 samice myszy C57BL/6 klasy SPF w wieku 6-8 tygodni z normalnymi cyklami rujowymi. Pobieraj płyn z płukania pochwy od myszy o godzinie 9:00 rano przez 10 kolejnych dni, aby przygotować rozmazy złuszczonych komórek pochwy. Obserwuj cykle rujowe i wybierz myszy, które mają co najmniej jeden ciągły i pełny cykl.

  1. Pozwól myszom zaaklimatyzować się w środowisku przez 1 tydzień przed eksperymentami. Oznacz myszy za pomocą dziurkacza do uszu po okresie adaptacji. Zapisuj pomiary masy ciała natychmiast po oznaczeniu.
  2. Chwyć bezpiecznie myszy, aż nastąpi naturalne oddawanie moczu wywołane stresem. Unieruchomić poprzez uszczypnięcie skóry grzbietowej szyi między kciukiem a palcem wskazującym lewej ręki. Ustaw głowę myszy w dół, aby całkowicie odsłonić obszar brzucha.
  3. Załadować sterylną końcówkę pipety na mikropipetę. Odessać 10 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Wykonaj trzy sekwencyjne cykle płukania kanału pochwy. Zatrzymać płyn z płukania w końcówce pipety.
  4. Równomiernie rozprowadzić płyn z płukania na szklanym szkiełku mikroskopowym. Całkowicie wysusza się na powietrzu w temperaturze pokojowej. Napraw komórki, zanurzając je w 95% etanolu w celu konserwacji. Kompleksowo etykietuj szkiełka z parametrami eksperymentalnymi i przechowuj je w bezpiecznych pojemnikach na szkiełka w temperaturze 4 °C, gdy nie są przetwarzane.
  5. Protokół barwienia Wrighta
    1. Zanurz szkiełka w 95% etanolu (na 3-10 min). Dokładnie spłucz pod strumieniem wody destylowanej.
    2. Transfer przepuszcza się przez kąpiel etanolową 95% (czas trwania 1 min).
    3. Zeskrobać utleniony film z powierzchni roztworu hematoksyliny za pomocą czystej bibuły filtracyjnej. Zanurz szkiełka w przefiltrowanej hematoksylinie (na 5 minut).
    4. Opłucz szkiełka wodą destylowaną. Zanurzyć na krótko (<1 s) w 1% roztworze HCl. W komplecie z przedłużonym płukaniem wodą destylowaną.
    5. Przygotuj mieszaną bejcę przy użyciu roztworów Orange G i EA50. Bejca wsuwa się w mieszaninę (przez 3 min).
    6. Przeprowadź szkiełka przez trzy sekwencyjne kąpiele w 95% etanolu (odstępy 5 sekund).
    7. Traktuj ksylenem w dwóch etapach (po 2 minuty każdy).
      UWAGA: Pracuj w dygestorium, aby uniknąć wdychania oparów ksylenu. Zamknij pojemniki natychmiast po użyciu.
    8. Trwała konserwacja próbek za pomocą neutralnego podłoża do mocowania żywicy
  6. Czytając szkiełko pod mikroskopem, zidentyfikuj komórki z jasnoróżową cytoplazmą i ciemnofioletowymi jądrami jako jądrzastymi komórkami nabłonka, nieregularnymi, łuskowatymi, niejądrowymi bladoróżowymi komórkami jako zrogowaciałymi komórkami nabłonka i małymi okrągłymi niebieskimi komórkami jako białymi krwinkami.
    UWAGA: Określić etap cyklu rujowego na podstawie następujących cech cytologicznych: (1) Faza proestrus: Dominujące jądrzaste komórki nabłonkowe. Są wyświetlane zarówno jako pojedyncze komórki, jak i zgrupowane arkusze. Niewielka obecność leukocytów (<5% pola widzenia); (2) Faza rui: Obfite bezjądrzaste zrogowaciałe komórki nabłonkowe. Charakterystyka: duża spłaszczona morfologia z nieregularnymi granicami. Prawie brak leukocytów i komórek jądrzastych (<2% łącznie); (3) Faza Metestrus: Zmniejszenie populacji zrogowaciałych komórek. Pojawiająca się infiltracja leukocytów. Pojawiające się ponownie jądrzaste komórki nabłonkowe (20%-40% składu); (4) Faza diestrus: dominujące leukocyty i komórki jądrzaste (>80%). Praktycznie brak zrogowaciałych komórek (<1%)5. Zapoznaj się ze znormalizowanym atlasem cytologicznym na rysunku 1 w celu weryfikacji wzorca.
  7. Uporządkuj i przeanalizuj dane, a następnie wybierz 24 myszy z normalnymi cyklami rujowymi.

2. Przygotowanie cyklofosfamidu do wstrzykiwań

UWAGA: Cyklofosfamid jest niestabilny w świetle i powinien być obsługiwany w ciemności przez cały proces. Cyklofosfamid jest toksyczny, dlatego podczas operacji należy nosić odzież ochronną, dwuwarstwowe rękawice nitrylowe i maski.

  1. Dodać 200 mg sterylnego proszku cyklofosfamidu klasy farmaceutycznej do 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Dokładnie wymieszać, aby uzyskać roztwór cyklofosfamidu o stężeniu 20 mg/ml. Zarezerwuj jedną porcję do natychmiastowego wykorzystania; Przygotować dodatkowe stężenia z pozostałą częścią.
  2. Przenieś 200 μl bulionu o stężeniu 20 mg/ml do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml owiniętej folią aluminiową. Dodać 800 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby uzyskać 1 ml całkowitej objętości. Mieszaj wirowo przez 30 s, aby uzyskać 4 mg/ml roztworu. Przygotować 14 identycznych porcji (po 1 ml każdy). Przechowywać wszystkie porcje w temperaturze -20 °C w pionowym stojaku.

3. Wstrzykiwanie roztworu cyklofosfamidu

UWAGA: Losowo podziel 24 myszy na trzy kohorty za pomocą systemu komputerowego: (1) PUSTE: Brak leczenia (n = 8); (2) NS: Kontrole soli fizjologicznej (n = 8); (3) POI: grupa cyklofosfamidów (n = 8). Wstrzyknij myszy codziennie rano o 9:00. W przypadku grupy POI należy wstrzyknąć dootrzewnowo 100 mg/kg roztworu cyklofosfamidu pierwszego dnia, a następnie wstrzykiwać w sposób ciągły 20 mg/kg roztworu cyklofosfamidu przez następne 14 dni. Dootrzewnowo wstrzyknąć równą objętość soli fizjologicznej do grupy NS i pozostawić grupę BALNK bez leczenia. Zważ wszystkie myszy przed każdym wstrzyknięciem, każdego dnia, i zbierz złuszczone komórki pochwy do rozmazania po wstrzyknięciu.

  1. Umieść wacik nasączony izofluranem z kleszkami w zamykanym pojemniku. Umieść mysz w pojemniku na 10-sekundowe znieczulenie wziewne.
    UWAGA: Izofluran jest lotnym środkiem znieczulającym o pewnej toksyczności i podrażnieniu. Operacje powinny być przeprowadzane w dobrze wentylowanym środowisku zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami.
  2. Oblicz objętość wstrzyknięcia: Masa ciała (g) × 5 = μL. Zdezynfekuj prawy dolny kwadrant wacikiem o stężeniu 75% etanolu. Wprowadzić igłę 26 G pod kątem 30-45° (orientacja skośna do góry). Przesuń 5 mm przez ścianę brzucha, aż do odczucia "trzasku". Dostarczaj roztwór z szybkością 50 μl/s.
  3. Resztki płynów i zanieczyszczony sprzęt należy umieścić w odpornych na światło pojemnikach na odpady oznaczonych "ODPADY ŚWIATŁOCZUŁE". Wyrzuć waciki nasączone izofluranem do wyznaczonych szczelnych pojemników opatrzonych przezroczystymi etykietami ODPADY NIEBEZPIECZNE.
  4. Rozmrozić zamrożone porcje 4 mg/ml w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C (3 min). Przelicz dawkę dobową: Masa ciała (g) × 5 = μl. Przed załadowaniem strzykawki należy sprawdzić klarowność roztworu.

4. Zbieranie serum

UWAGA: Po 15 dniach od wstrzyknięcia roztworu cyklofosfamidu należy pobrać krew z wierzchołka serca wszystkich myszy. Odwirować w celu uzyskania surowicy. Próbki od myszy w grupie kontrolnej i grupie NS należy pobrać w fazie diestrus. Myszy z grupy POI poddano dopasowanemu w czasie próbkowaniu w parze z myszami z grupy kontrolnej/NS, u których potwierdzono, że znajdują się w diestrus.

  1. Znieczulenie myszy
    1. Umieść mysz w przezroczystej, hermetycznej komorze zawierającej wacik nasycony izofluranem.
    2. Obserwuj zachowanie myszy. Utrata odruchu prostującego (brak samokorekty postawy po delikatnym skręceniu na wznak) wskazuje na odpowiednią indukcję znieczulenia. Ten proces trwa zwykle 2-3 minuty.
    3. Wyjmij mysz z pojemnika. Przymocuj jego głowę lewą ręką i delikatnie naciśnij górną powiekę palcem wskazującym. W prawej ręce trzymaj sterylny bawełniany wacik, zanurz go w maści do oczu z erytromycyną, aby zebrać ilość o średnicy 1-2 mm.
      1. Równomiernie nałóż maść na powierzchnię gałki ocznej i wewnętrzną stronę powieki. Zamknij powiekę, a następnie delikatnie masuj opuszkiem palca przez 10 sekund, aby równomiernie rozprowadzić maść. Zetrzyj nadmiar maści wokół oka za pomocą suchego wacika.
  2. Ustaw mysz w pozycji leżącej na piankowej desce. Przytnij włosy na klatce piersiowej za pomocą nożyczek chirurgicznych. Zdezynfekuj okolice klatki piersiowej i brzucha 75% etanolem.
    1. Naciąć skórę i tkankę podskórną wzdłuż linii środkowej. Przeciąć mięśnie międzyżebrowe wzdłużnie wzdłuż lewej strony mostka. Odsłoń serce.
  3. Wprowadzić strzykawkę (ze skosem igły skierowanym do góry) do wierzchołka serca pod kątem około 30°. Przesuwać igłę powoli i delikatnie aspirować. Uzyskaną krew wstrzyknąć do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  4. Uzyskaną krew należy umieścić w wirówce. Ustawić wirówkę na 850 × g na 10 minut w temperaturze 4 °C. Za pomocą pipety wyjmij surowicę z górnej warstwy i umieść ją w probówce wirówkowej o pojemności 0,5 ml. Przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Wykrywanie estrogenów, FSH i AMH w surowicy

  1. Zamrożone serum wstaw na noc do lodówki o temperaturze 4 °C, aby powoli je rozmrażało.
  2. Wyjmij zestaw ELISA z lodówki 30 minut wcześniej, aby odczynniki w nim zawarte powróciły do temperatury pokojowej.
  3. Zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu, należy wykonywać seryjne rozcieńczalania wzorca za pomocą standardowego rozcieńczalnika. Ogólnie rzecz biorąc, ustaw wiele gradientów stężeń, takich jak 0, 10, 20, 40, 80, 160 pg/ml itp.
  4. Dodać rozcieńczony wzorzec i próbki surowicy do badania do odpowiednich studzienek płytki ELISA, po 100 μl na studzienkę. W tym samym czasie ustawić ślepe studzienki kontrolne i dodać 100 μl rozcieńczalnika do próbek.
  5. Umieścić płytkę ELISA w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1-2 godziny, aby umożliwić pełne związanie antygenu i przeciwciała.
  6. Po zakończeniu inkubacji ostrożnie zassać ciecz do studzienek. Umyj płytkę ELISA roztworem myjącym 3-5 razy. Po każdym myciu delikatnie osusz płytkę ELISA, aby usunąć resztki roztworu myjącego.
  7. Dodać roztwór roboczy przeciwciała znakowanego enzymem, 100 μl na dołek. Kontynuować inkubację w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  8. Powtórz powyższe kroki mycia, umyj 3-5 razy i osusz płytkę ELISA.
  9. Do każdej studzienki dodać 100 μl roztworu substratu. Delikatnie wymieszaj, wstrząsając. Inkubować w ciemności w temperaturze 37 °C przez 15-30 minut, aż do uzyskania wyraźnego niebieskiego koloru.
  10. Dodaj 100 μl roztworu terminacyjnego do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję. Obserwuj zmianę koloru z niebieskiego na żółty.
  11. Za pomocą czytnika mikropłytek odczytać wartości absorbancji (wartości A) każdej studzienki przy długości fali 450 nm i zapisać dane.
  12. Przyjąć stężenie wzorca jako odciętą i odpowiadającą jej wartość absorbancji jako rzędną, aby narysować krzywą wzorcową. Ogólnie rzecz biorąc, należy użyć dopasowania wielomianowego, aby upewnić się, że współczynnik korelacji r² krzywej standardowej jest większy niż 0,99.
    1. Zgodnie z krzywą standardową, zastąp wartość absorbancji próbki surowicy, która ma być poddana badaniu, równaniu krzywej standardowej, aby obliczyć stężenie hormonu w próbce.

6. Pobranie tkanki jajnikowej

  1. Poddaj eutanazji wciąż znieczuloną mysz przez zwichnięcie szyjki macicy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami), a następnie użyj nożyczek chirurgicznych, aby otworzyć brzuch myszy.
  2. Jajniki znajdują się poniżej nerek i są owinięte białymi poduszeczkami tłuszczowymi. Delikatnie unieś poduszeczki tłuszczowe za pomocą kleszczy, aby odsłonić jajniki i jajowody. Użyj nożyczek, aby oddzielić jajniki od otaczających tkanek łącznych.
  3. Umieść usunięte tkanki jajnika w 4% paraformaldehydzie w celu utrwalenia przez 24 godziny.

7. Przygotowanie skrawków parafinowych

  1. Odwodnienie: Wyjmij jajniki i przepuść je kolejno przez roztwory etanolu o różnych stężeniach (75%, 85%, 95%, 100%), przy czym każdy etap trwa 1 godzinę.
  2. Leczenie przezroczystością: Najpierw należy leczyć jajniki w mieszaninie ksylenu i etanolu przez 15 minut. Następnie zanurz je w ksylenie I i ksylenie II na 15 minut każdy.
  3. Impregnacja woskiem: Zanurz jajniki w mieszaninie ksylenu i parafiny. Następnie przenieś je do parafiny I, parafiny II i parafiny III na 0,5 godziny każdy.
  4. Osadzanie: Umieść nasączone woskiem jajniki w formie do zatapiania. Dostosuj orientację tkanek (powierzchnią cięcia skierowaną w dół). Wlej stopioną parafinę do formy i pozwól jej ostygnąć i zastygnąć.
  5. Cięcie: Pokrój blok parafiny na odcinki o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu. Wykonaj cięcie szeregowe i delikatnie przenieś wstążkę za pomocą pędzla, upewniając się, że tworzy jednolitą, półprzezroczystą taśmę, która leży płasko bez zniekształceń, gdy unosi się na kąpieli wodnej

8. Barwienie H&E

  1. Odparafinowanie: Zanurzyć skrawki zatopione w parafinie w ksylenie I na 10 minut. Następnie przenieś skrawki do ksylenu II i moczyć przez kolejne 10 minut.
  2. Rehydratacja: Przepuść sekcje przez szereg roztworów etanolu o różnych stężeniach w sekwencji: 100% etanolu, 95% etanolu, 85% etanolu i 75% etanolu, z czasem zanurzenia 5 minut dla każdego. Na koniec spłucz sekcje wodą destylowaną przez 1 minutę.
  3. Barwienie hematoksyliną: Zanurz skrawki w roztworze barwiącym hematoksylinę na 5 minut. Opłucz sekcje pod bieżącą wodą przez 30 sekund.
  4. Różnicowanie: Zanurzyć sekcje w 1% roztworze kwasu solnego i etanolu na 1-3 s. Opłucz sekcje pod bieżącą wodą przez 1-2 min.
  5. Barwienie cytoplazmatyczne: Zanurzyć w roztworze eozyny Y (1 min). Zetrzyj nadmiar plamy bibułą filtracyjną.
  6. Odwodnienie: Przepuść sekcje przez szereg roztworów etanolu: 85% etanolu, 95% etanolu i 100% etanolu (dwukrotnie), z czasem zanurzenia 5 s na każdy.
  7. Oczyszczanie: Zanurz sekcje w ksylenie I na 5 minut. Następnie przenieś skrawki do ksylenu II i moczyć przez kolejne 5 minut.
  8. Montaż: Upuść neutralną żywicę na poplamioną sekcję. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na sekcji.
  9. Liczenie mieszków włosowych: Obserwuj poplamione skrawki pod mikroskopem. Policz i zapisz liczbę mieszków włosowych na różnych etapach rozwoju.

9. Immunohistochemia kaspazy-3 w tkance jajnikowej

  1. Pobieranie antygenu: Umieść odparafinowane i ponownie uwodnione skrawki w buforze cytrynianu sodu (pH 6,0). Podgrzej sekcje w kuchence mikrofalowej na dużej mocy przez 5 minut. Następnie wyjmij je i pozwól im ostygnąć.
    1. Powtórz proces ogrzewania jeszcze 2 razy, w sumie 3 cykle ogrzewania. Po naturalnym schłodzeniu należy przemyć sekcje PBS 3 razy, za każdym razem przez 5 min.
  2. Eliminacja endogennej peroksydazy: Dodaj kroplami 3% H₂O₂ na sekcje. Inkubować skrawki w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 minut. Umyj sekcje PBS 3 razy, za każdym razem przez 3 minuty.
  3. Blokowanie surowicy i inkubacja przeciwciał: Kroplami dodawać do sekcji pierwszorzędowe przeciwciało królicze anty-kaspazy-3. Inkubować sekcje w mokrym pojemniku w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia pozwól sekcjom powrócić do temperatury pokojowej na 30 minut. Umyj skrawki PBS 3 razy, za każdym razem przez 5 minut.
  4. Wywoływanie kolorów, przeciwbarwienie i montaż: Użyj DAB do wywoływania kolorów, co zwykle zajmuje około 1-5 minut. Przeciwbarwić skrawki hematoksyliną przez 2 minuty. Po barwieniu przeciwstawnym myć sekcje przez 5 minut.
    1. Następnie umieść sekcje w wodzie amoniakalnej na 1 minutę, aby zmieniły kolor na niebieski. Na koniec wykonaj odwodnienie przez gradient etanolu, oczyść sekcje i zamontuj je.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Proces tworzenia mysiego modelu POI zilustrowano na rysunku 2. Masę ciała i cykl rujowy myszy rejestrowano począwszy od pierwszego dnia wstrzyknięcia leku. Po 15 dniach od wstrzyknięcia CTX średni wskaźnik spadku masy ciała myszy w grupie POI (3,717% ± 1,463%) był znacznie wyższy niż w grupie BLANK (0,2526% ± 0,1469%) i grupie NS (0,4305% ± 0,2494%) (p < 0,0001). Nie stwierdzono istotnej statystycznie różnicy w masie ciała pomiędzy grupą NS a grupą ŚLEPEJ PRÓBY (p > 0...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedwczesna niewydolność jajników (POI) poważnie wpływa na zdrowie fizyczne i jakość życia kobiet, a jej globalne rozpowszechnienie rośnie z roku na rok. Jednak obecnie nadal brakuje bezpiecznych i skutecznych metod leczenia POI. Stworzenie wiarygodnego i powtarzalnego modelu zwierzęcego ma kluczowe znaczenie dla postępu w badaniach nad POI. Klinicznie przyczyny POI są różnorodne, a leki stosowane w chemioterapii są ważnymi znanymi czynnikami chorobotwórczymi8. Jako środek alkilujący stosowany w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy wyrażają wdzięczność za wsparcie finansowe otrzymane od Fundacji Medycznej Wu Jieping w ramach Specjalnego Programu Finansowania Badań Klinicznych (grant nr 320.6750.17067). Wyrażamy również wdzięczność za platformę badawczą i wsparcie techniczne, które zapewniła firma Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4% paraformaldehyduSangon Bioinżynieria Co., Sp. z o.o.A500684-0500
75% alkoholuShandong Dexinkang Technologia Medyczna Co., Ltd200603
Etanol bezwodnyFabryka odczynników chemicznych Bengbu
Probówki wirówkoweOstrze biologiczneZobacz materiał BS-15-M
Zimny stółQuanlin MedycznyQL-LT20230003
WacikiShandong Brilliance Co., Sp. z o.o.20241008
Szkiełka nakrywkoweJiangsu Shitai Sprzęt eksperymentalny Co., Ltd80312-3412
CyklofosfamidBaxter Oncology GmbHZobacz materiał 3K645A
OdwadniaczHubei Xiaogan Haikuo Technologia Medyczna Co., LtdKH-TS
Maszyna do farbowaniaHubei Xiaogan Haikuo Technologia Medyczna Co., LtdKH-S101 
Roztwór do barwienia EA50Hubei Taikang Sprzęt Medyczny Co., LtdZobacz materiał J7EC20
Szczypce do kolczykówShenzhen Ruiwode Nauki przyrodnicze i technologiaZobacz materiał C22002-10
Efektywne cięcie parafinyTongxiang Hualing Wax Industry Co., Ltd20241018
Elektryczny piec do suszenia strumieniowego (piekarnik)Szanghaj Yuejin Sprzęt medyczny Co., LtdZobacz materiał HCZF-11
Elektrycznie podgrzewany termostatyczny inkubator wodySzanghaj Yuejin Sprzęt medyczny Co., LtdZobacz materiał HSW-600
Maszyna do zatapianiaPrisstar Changzhou Urządzenie medyczne Co., LtdPMB-A
Plama eozynySewell Biotechnology Co., Sp. z o.o.G1005-2
Roztwór różnicowania hematoksylinySewell Biotechnology Co., Sp. z o.o.G1039-500ML
Roztwór do barwienia hematoksylinySewell Biotechnology Co., Sp. z o.o.G1005-1
IzofluranShandong Ante Technologia Hodowli Zwierząt Co., Ltd2024101501
mikroskopAnhui Jiashang Biotechnology Co., Sp. z o.o.SQS-12P
Zestaw ELISA mysiego hormonu anty-Mullera (AMH)Biotechnologia HengyuanHB1334-MU
Zestaw do testów immunologicznych sprzężonych z enzymem estradiolu (E2) u myszyBiotechnologia HengyuanHB975-MU
Zestaw ELISA z mysim hormonem folikulotropowym (FSH)Biotechnologia HengyuanHB967-MU
Neutralna gumaNanchang Yulu Sprzęt eksperymentalny Co., Ltd240504
Patologiczny aparat do wybielania tkanekPrisstar Changzhou Urządzenie medyczne Co., LtdPHY-III
Bufor PBSOstrze biologiczneBL302A
Końcówki do pipetOstrze biologiczneZobacz materiał BS-10-T
PipetyDalong Sprzęt medyczny Co., LtdYE213AT0257922
Szybki odwadniacz tkanekHubei Xiaogan Haikuo Technologia Medyczna Co., LtdKH-TS
krajalnicaGheddy powiedział:YD-315
SlajdówJiangsu Shitai Sprzęt eksperymentalny Co., Ltd80312-3161
Maszyna do smarowaniaHubei Taikang Sprzęt Medyczny Co., Ltd131001305
Wstrzykiwanie chlorku soduWuhan Binhu Shuanghe Pharmaceutical Co., LtdNumer katalogowy: 240525K04
strzykawkaJiangsu Zhiyu Urządzenie medyczne Co., Ltd
Krajalnica wibracyjnaSzanghaj Zhixin Instrument Co., LtdZobacz materiał ZQP-86
KsylenTianjin Kaitong Odczynnik chemiczny Co., Ltd20240102

Bibliografia

  1. Federici, S., et al. Primary ovarian insufficiency: update on clinical and genetic findings. Front Endocrinol. 15, 1464803(2024).
  2. Soleimani, R., Heytens, E., Darzynkiewicz, Z., Oktay, K. Mechanisms of chemotherapy-induced human ovarian aging: Double-strand DNA breaks and microvascular compromise. Aging (Albany NY). 3 (8), 782-793 (2011).
  3. Bellusci, G., et al. Kinase-independent inhibition of cyclophosphamide-induced pathways protects the ovarian reserve and prolongs fertility. Cell Death Dis. 10 (10), 726(2019).
  4. Yuksel, A., et al. The magnitude of gonadotoxicity of chemotherapy drugs on ovarian follicles and granulosa cells varies depending upon the category of the drugs and the type of granulosa cells. Hum Reprod. 30 (12), 2926-2935 (2015).
  5. Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertil Re Pract. 6, 5(2020).
  6. Wang, Z., Wang, Y., Yang, T., Li, J., Yang, X. Study of the reparative effects of menstrual-derived stem cells on premature ovarian failure in mice. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 11(2017).
  7. Shen, J., et al. Transplantation of the LRP1(high) subpopulation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells improves ovarian function in mice with premature ovarian failure and aged mice. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 64(2024).
  8. Letourneau, J. M., et al. Acute ovarian failure underestimates age-specific reproductive impairment for young women undergoing chemotherapy for cancer. Cancer. 118 (7), 1933-1939 (2012).
  9. Nynca, A., et al. Tamoxifen decreases ovarian toxicity without compromising cancer treatment in a rat model of mammary cancer. BMC Genomics. 24 (1), 325(2023).
  10. Feng, Y., et al. Protective effect of Luffa cylindrica fermentation liquid on cyclophosphamide-induced premature ovarian failure in female mice by attenuating oxidative stress, inflammation and apoptosis. J Ovarian Res. 17 (1), 24(2024).
  11. Huang, Y., et al. Bushen Huoxue recipe ameliorates ovarian function via promoting BMSCs proliferation and homing to ovaries in POI mice. Phytomedicine. 129, 155630(2024).
  12. Ai, G., et al. Adipose-derived stem cells promote the repair of chemotherapy-induced premature ovarian failure by inhibiting granulosa cells apoptosis and senescence. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 75(2023).
  13. Anderson, R. A., et al. Anti-Müllerian hormone as a marker of ovarian reserve and premature ovarian insufficiency in children and women with cancer: A systematic review. Hum Reprod Update. 28 (3), 417-434 (2022).
  14. Jiao, X., et al. Ovarian reserve markers in premature ovarian insufficiency: within different clinical stages and different etiologies. Front Endocrinol. 12, 601752(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mysi model POIindukcja cyklofosfamidemmonitorowanie cyklu rujowegocytologia rozmaz w pochwowychbarwienie metod Wrightaanaliza hormon w w surowicyhistopatologia jajnik watrezja p cherzyk wapoptoza kom rek ziarnistych

Powiązane artykuły