Szybkie wykrywanie Staphylococcus aureus i Staphylococcus aureus opornego na metycylinę za pomocą Multiplex Real-Time Fluorescent PCR

Summary

Protokół ten wykorzystuje multipleksową reakcję PCR w czasie rzeczywistym ze starterami/sondami ukierunkowanymi na geny mecA nuc i MRSA specyficzne dla SA. Umożliwia szybkie (<1 h), jakościowe wykrywanie kwasów nukleinowych SA/MRSA w próbkach ludzkiej plwociny, pokonując ograniczenia metod opartych na hodowlach.

Abstract

Staphylococcus aureus (S.aureus) jest powszechnym ludzkim patogenem Gram-dodatnim, który powoduje zakażenia pozaszpitalne i szpitalne, z różnymi objawami klinicznymi, od miejscowych zmian powierzchownych i zatruć pokarmowych po śmiertelne infekcje ogólnoustrojowe. Odkrycie antybiotyków znacznie zmniejszyło śmiertelność, ale od tego czasu problem oporności na leki staje się coraz bardziej widoczny. Od czasu pierwszej identyfikacji MRSA w 1960 roku, szczep ten stał się globalnym zagrożeniem dla zdrowia publicznego. MRSA jest głównym patogenem zakażeń szpitalnych, zdolnym do wywoływania różnych poważnych chorób, takich jak zapalenie wsierdzia, przewlekłe zapalenie kości i szpiku, zapalenie płuc, ropotwórcze zapalenie stawów i bakteriemia. Dlatego szybkie i dokładne wykrycie S. aureus i jego lekooporności ma kluczowe znaczenie dla ukierunkowania leczenia klinicznego.

Obecne rutynowe metody wykrywania S.aureus i MRSA mają istotne ograniczenia. Tradycyjna metoda hodowli bakteryjnej, służąca jako "złoty standard" przez dziesięciolecia, może zapewnić ostateczną identyfikację gatunków i wyniki wrażliwości na leki, ale proces ten jest czasochłonny i trwa od 48 do 72 godzin. Ponadto metoda ta jest podatna na zanieczyszczenia i opiera się na specjalistycznym zapleczu laboratoryjnym i wykwalifikowanych technikach. Testy serologiczne pozwalają na nieinwazyjną diagnozę poprzez wykrycie przeciwciał S. aureus w surowicy pacjenta, ale nie są w stanie odróżnić aktywnych infekcji od przebytych infekcji, ani nie mogą zidentyfikować szczepów lekoopornych (takich jak MRSA).

Badanie to koncentruje się na opracowaniu nowatorskiej metody wykrywania fluorescencji PCR w czasie rzeczywistym w multipleksie w celu przezwyciężenia wyżej wymienionych ograniczeń. W ramach tej metody projektowane są specyficzne startery i sondy fluorescencyjne TaqMan ukierunkowane na specyficzny dla gatunku gen nuc S.aureus i gen mecA pośredniczący w oporności na metycylinę, umożliwiając jednoczesną amplifikację i detekcję S.aureus i MRSA w jednym układzie reakcyjnym. Technologia ta znacznie skraca czas wykrywania, zapewniając szybkie, dokładne i ekonomiczne rozwiązanie do wykrywania S.aureus i MRSA. To innowacyjne podejście znacznie poprawia kliniczną skuteczność diagnostyczną i ułatwia wczesne wdrożenie celowanej antybiotykoterapii, wnosząc istotny wkład w kontrolowanie lekoopornych zakażeń bakteryjnych.

Introduction

S. aureus jest szeroko rozpowszechnionym patogenem warunkowym Gram-dodatnim, który kolonizuje błonę śluzową nosa zdrowych osób ^1,2. Naruszenie odporności gospodarza może powodować miejscowe infekcje skóry, inwazję tkanek głębokich lub choroby ogólnoustrojowe (np. zapalenie płuc, zapalenie wsierdzia, zapalenie kości i szpiku oraz bakteriemię)³. Metycylina, półsyntetyczna penicylina, została klinicznie zastosowana w leczeniu zakażeń S. aureus w 1959 roku, a dwa lata później MRSA pojawił się w Wielkiej Brytanii, szybko rozprzestrzeniając się w krajach europejskich, w tym w Danii, Francji i^Szwajcarii. Oporność MRSA na antybiotyki β-laktamowe nie tylko komplikuje postępowanie kliniczne, ale także znacznie zwiększa ryzyko infekcji⁵. Wiele czynników – w tym niekontrolowana kolonizacja/rozprzestrzenianie się, wysokie koszty zapobiegania i nadużywanie antybiotyków – łącznie przyczyniło się do wzrostu liczby zakażeń MRSA⁶. Ze względu na szybkie przenoszenie i złożone mechanizmy oporności, zakażenia MRSA wiążą się z wysokimi wskaźnikami śmiertelności, z prawie 150 000 zgłoszonych przypadków i >7 000 zgonów rocznie w krajach UE⁷. Według danych z nadzoru CHINET, wskaźniki zakażeń MRSA w Chinach utrzymywały się na poziomie powyżej 30% w ciągu ostatnich pięciu lat⁸. Wysokie ryzyko zakażeń krzyżowych w szpitalach dodatkowo zwiększa obciążenia dla zdrowia publicznego i obciąża systemy opieki zdrowotnej ^9,10. W związku z tym opracowanie wydajnych i precyzyjnych technologii szybkiego wykrywania MRSA jest klinicznie pilne w celu uzyskania wczesnej diagnozy, spersonalizowanej terapii, zmniejszenia śmiertelności i przerwania łańcuchów transmisji.

Obecne technologie wykrywania S.aureus i MRSA obejmują wiele dziedzin, w tym wykrywanie fenotypowe, wykrywanie genomowe, wykrywanie transkryptomiczne, wykrywanie proteomiczne, technologię spektrometrii mas i analizy bioinformatyczne¹¹.

Metody wykrywania fenotypów, takie jak metoda dyfuzji krążkowej (metoda KB) i metoda minimalnego stężenia hamującego (metoda MIC), są zalecane jako "złote standardy" przez Instytut Standardów Klinicznych i Laboratoryjnych (CLSI) oraz Europejski Komitet ds. Oznaczania Wrażliwości Drobnoustrojów (EUCAST). Metody te mają tę zaletę, że nie wymagają specjalistycznych instrumentów, są szeroko stosowane do nadzoru widma oporności i badań epidemiologicznych. Jednak ich wady są również widoczne: długie okresy hodowli (ponad 24 godziny), a wyniki metody KB dla niektórych nowych antybiotyków wymagają walidacji za pomocą wartości MIC, przy czym wyniki dla szczepów granicznych są wrażliwe na czynniki ludzkie^12,13.

Wśród metod wykrywania na poziomie genomu, konwencjonalny PCR charakteryzuje się wysoką czułością i silną swoistością, umożliwiając wstępną ocenę oporności i skrócenie czasu eksperymentu, przy niskich kosztach i wysokiej wydajności. Jednak jego ograniczenia polegają na tym, że jest w stanie wykryć tylko znane geny oporności i polega na specjalistycznych instrumentach¹⁴. Mechanizm oporności drobnoustrojów jest bardzo złożony, co sprawia, że kluczowe znaczenie ma opracowanie metod technicznych, które mogą objąć nieznane oporne fenotypy i umożliwić szybką identyfikację. Rozwijająca się technologia GoPhAST-R (Combined genotypepic and phenotypic AST through RNA detection) określa fenotypy oporności poprzez wykrywanie poziomów ekspresji mRNA, umożliwiając jednoczesne wykrywanie różnych genów związanych z opornością w wielu patogenach, skracając czas realizacji eksperymentu i osiągając dokładność 94-99% w połączeniu z uczeniem maszynowym¹⁵.

Wśród metod wykrywania na poziomie proteomicznym metoda aglutynacji lateksowej PBP2a opiera się na specyficznym wiązaniu antygen-przeciwciało, z prostą obsługą i szybkimi wynikami, o wysokiej swoistości i czułości dla MRSA. Nie jest jednak w stanie rozróżnić różnych gatunków gronkowców, a czułość wykrywania zestawów komercyjnych ulega pewnemu zmniejszeniu, co wymaga ponownego badania po indukcji oksacyliną⁸.

Metody detekcji oparte na MALDI-TOF MS, takie jak metoda DOT-MGA (DNA Oligonucleotide Tag-Microarray Detection of Genomic Amplification), osiągają optymalną wydajność analityczną po 6-8 godzinach inkubacji, przy wskaźniku wykrywalności sięgającym 96,4%, a zarówno czułość, jak i swoistość wynoszą 100%. Koszt jest jednak wysoki, a ograniczone pozycje na tarczy utrudniają jednoczesne wykrycie setek próbek^16,17.

Wśród technologii analizy bioinformatycznej w połączeniu z danymi omicznymi do przewidywania oporności, technologia sekwencjonowania całego genomu wyróżnia się wysoką rozdzielczością i wszechstronnymi możliwościami analizy informacji. W połączeniu z bazami danych analizy genów oporności, takimi jak Resfinder, może analizować, czy szczepy przenoszą specyficzne geny oporności, przewidywać potencjał oporności, wykrywać polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP) i mutanty genów związanych z opornością, jednocześnie wspierając przechowywanie i ponowną analizę danych dotyczących całego genomu¹⁸. Metoda ta wymaga jednak stosowania przez specjalistów z wykształceniem bioinformatycznym, jest rzadko stosowana w codziennych testach i jest powszechnie stosowana do analizy epidemiologicznej lub nadzoru molekularnego patogenów¹⁹.

Wyżej wymienione metodologie są albo kosztowne, albo czasochłonne, albo wciąż znajdują się w fazie badań i rozwoju. Z klinicznego punktu widzenia istnieje pilna potrzeba znalezienia rozwiązania równoważącego "natychmiastowość" i "dokładność" - nowatorska technologia multipleksowego fluorescencyjnego PCR wypełnia tę lukę poprzez jednoczesną amplifikację genów nuc/mecA w jednej probówce, kompresując cykl wykrywania do 1 godziny. Precyzyjnie wypełnia lukę czasową w tradycyjnym procesie "awaryjnego badania przesiewowego - typowanie oporności", zapewniając bardziej efektywne czasowo narzędzie diagnostyki molekularnej do zapobiegania i kontroli zakażeń szpitalnych. Ten specyficzny test PCR jest wykorzystywany przede wszystkim do wykrywania próbek z dróg oddechowych, z próbkami plwociny jako typowym przykładem. Wykazuje czułość 500 kopii/ml i wysoką swoistość, pozostając jednocześnie niewrażliwym na działanie środków przeciwbakteryjnych. Ze względu na te korzystne właściwości użytkowe, ten test PCR ma istotną wartość aplikacyjną w diagnostyce infekcji dróg oddechowych i nadzorze zakażeń szpitalnych wywołanych przez MRSA.

Protocol

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Prowincjonalnego Szpitala Ludowego w Guangdong (nr etyki: KY2025-510-01). Szczegółowe informacje na temat materiałów użytych w tych badaniach (odczynniki, chemikalia, sprzęt i oprogramowanie) znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Protokół pobierania i przechowywania próbek

1. Kryteria włączenia: Z wyjątkiem materiałów do kontroli jakości, wszystkie pobrane próbki należy zidentyfikować jako próbki dodatnie przy użyciu metody złotego standardu (test oparty na hodowli).
2. Pobieranie plwociny ludzkiej
   1. Zbierz 1-3 ml plwociny z głębokim kaszlem z dolnych dróg oddechowych osób za pomocą sterylnych probówek do pobierania próbek. Natychmiast uszczelnić probówki i przetransportować do analizy. Natychmiast przetworzyć próbki do badań.
3. Przechowywanie próbek:
   1. Próbki pobrane za pomocą powyższej metody należy niezwłocznie przeanalizować. Przechowywanie krótkoterminowe jest dopuszczalne pod następującymi warunkami:
      2-8 °C: ≤7 dni
      -20 °C ± 5°C: ≤6 miesięcy
      -70 °C ± 5°C: ≤24 miesiące
      UWAGA: W tym badaniu próbki plwociny nie były traktowane konserwantami (takimi jak bulion BHI + glicerol itp.). Po zebraniu przechowywano je w warunkach opisanych powyżej, a wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie było bezwzględnie unikane. Unikaj powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. Maksymalne dopuszczalne cykle zamrażania i rozmrażania: ≤3.

2. Ekstrakcja kwasów nukleinowych

UWAGA: Wykonaj wszystkie procedury w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia.

1. W celu wstępnej obróbki próbki plwociny wymieszać próbkę z 4% roztworem NaOH w stosunku 1:4 (próbka plwociny: 4% roztwór NaOH) w celu upłynnienia lepkich próbek plwociny i wyeliminowania zanieczyszczeń zakłócających, a następnie dokładnie wirować (30 s) i inkubować w temperaturze pokojowej (22-25 °C) przez 30 minut w celu uzyskania upłynnienia.
2. Przygotowanie odczynników do ekstrakcji kwasów nukleinowych
   1. Wyjmij z zestawu wstępnie zapakowaną płytkę 96-dołkową. Lekko potrząśnij 96-dołkową płytką, aby skoncentrować odczynniki i kulki magnetyczne na dnie 96-dołkowej płytki.
   2. Ostrożnie oderwij folię uszczelniającą z folii aluminiowej, unikając wibrowania 96-dołkowej płytki, aby zapobiec rozpryskiwaniu się cieczy.
   3. W roztworach kolumny 1 i kolumny 7 płytki 96-dołkowej: Najpierw dodać 20 μl proteinazy K, a następnie dodać 200-300 μl próbki do ekstrakcji.
3. Automatyczna ekstrakcja kwasów nukleinowych (metoda oparta na kulkach magnetycznych)
   1. Umieść wstępnie zapakowaną 96-dołkową płytkę z dodanymi próbkami w odpowiednim gnieździe automatycznego przyrządu do ekstrakcji kwasów nukleinowych.
   2. Postępuj zgodnie z procesem ekstrakcji kwasów nukleinowych, jak opisano poniżej.
      1. Za pomocą patyczka magnetycznego na komorze laboratoryjnej przenieś kulki magnetyczne zaadsorbowane kwasem nukleinowym do różnych otworów na odczynniki.
      2. Użyj zestawu do mieszania, aby szybko i wielokrotnie wymieszać płyn, tak aby płyn i kulki magnetyczne mieszały się równomiernie.
      3. Gdy kulki cieczowe i magnetyczne harmonijnie się łączą, automatyczna maszyna do ekstrakcji kwasów nukleinowych przechodzi przez kolejne etapy lizy komórek, adsorpcji kwasów nukleinowych (70 °C, 15 min, 3 razy adsorpcji magnetycznej), mycia (3 razy, mieszać przez 2 minuty za każdym razem, a następnie dwukrotnie wykonać adsorpcję magnetyczną (po 15 s każdy) i elucji (2 razy, mieszać przez 5 minut za każdym razem, 3 razy adsorpcji magnetycznej), w końcu otrzymuje kwas nukleinowy o wysokiej czystości.
      4. Sprawdź stężenie i czystość kwasu nukleinowego za pomocą spektrofotometru. Objętość próbki kwasu nukleinowego wynosiła 50 μl, przy stężeniu od 50 do 100 ng/μL, a stosunek A260/A280 wynosił 1,8 ± 0,2.
   3. Po zakończeniu programu bezpośrednio zassać roztwór elucyjny zawierający kwas nukleinowy z kolumny 6 i kolumny 12 w celu przeprowadzenia dalszych testów. W razie potrzeby należy przechowywać pozostałe wyekstrahowane próbki kwasów nukleinowych w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania i wykorzystania w przyszłości.

3. qPCR Wykrywanie kwasów nukleinowych S. aureus i kwasów nukleinowych MRSA

1. Przygotowanie odczynników do amplifikacji
   1. Wyjąć z zestawu roztwór reakcyjny do amplifikacji kwasu nukleinowego i roztwór reakcyjny nuc/mecA (startery/sonda specyficzne dla genu nuc dla S. aureus i mecA dla MRSA). Po rozmrożeniu w temperaturze 22-25 °C całkowicie oscylować i równomiernie wymieszać, a następnie przeprowadzić natychmiastowe odwirowanie (~6000 g, 15 s, 22-25 °C).
   2. W zależności od liczby próbek, które mają być badane, N, przygotuj odczynniki na podstawie całkowitej ilości N + 2 (N to liczba próbek, a 2 to ujemne i pozytywne kontrole jakości). Poszczególne kroki są następujące:
      1. Przygotować mieszaninę układu reakcyjnego (16 μl roztworu reakcyjnego amplifikacji kwasu nukleinowego (bufor, dNTP, polimeraza DNA, enzym UDG) + 4 μl roztworu reakcyjnego nuc/mecA (startery i sondy dla docelowych genów wykrywania nuc, mecA i wewnętrznego odniesienia GAPDH).
      2. Dodaj go do odpowiedniej wielkości probówki wirówkowej, całkowicie oscyluj i równomiernie wymieszaj, a następnie wykonaj natychmiastowe wirowanie (~6000 g, 15 s, 22 °C-25 °C). Następnie dozować 20 μl na probówkę do probówek reakcyjnych PCR.
2. Dodaj kwas nukleinowy i próbki kontroli jakości:
   1. Do wyżej przygotowanych probówek reakcyjnych PCR (20 μL) dodać odpowiednio 5 μL kwasu nukleinowego z badanych próbek, kontrolę pozytywną i kontrolę ujemną, uzyskując końcową objętość 25 μL na probówkę.
   2. Szczelnie zakryj probówki i wykonaj natychmiastowe wirowanie (~6000 × g, 15 s, 22-25 °C), a następnie umieść probówki w przyrządzie do PCR.
3. Amplifikacja PCR:
   1. Ustaw program cykliczny w następujący sposób: Denaturacja wstępna: 97 °C, 90 s, 1 cykl; następujące 2 etapy przez 42 cykle: denaturacja w 97 °C przez 2 s i wyżarzanie w 55 °C przez 15 s.
   2. Ustaw parametry detekcji sygnału fluorescencji w następujący sposób: użyj znakowania fluorescencyjnego FAM genów nuc ; znakowanie fluorescencyjne VIC genów mecA ; oraz znakowanie fluorescencyjne genu GAPDH CY5 jako wewnętrzna kontrola zestawu. Zbierać dane w temperaturze 55 °C. Po zakończeniu reakcji upewnij się, że dane zostały zapisane do przyszłej analizy.
   3. Analizuj dane za pomocą oprogramowania specyficznego dla qPCR (SLAN 96P):
      1. Informacje o próbce: Na schemacie układu płytki studzienki w oprogramowaniu oznacz typy próbek (np. kontrola pozytywna, kontrola ujemna, nieznana próbka, wewnętrzny gen odniesienia itp.) odpowiadające pozycjom ładowania próbki.
      2. Umieszczanie probówek reakcyjnych: Otwórz pokrywę modułu grzewczego przyrządu, umieść szczelnie zapieczętowaną płytkę/probówki PCR w środku, upewnij się, że ściśle przylegają do modułu grzewczego i szczelnie zamknij pokrywę modułu (aby uniknąć nierówności temperatury)
      3. Rozpoczęcie reakcji: Po potwierdzeniu, że ustawienia programu w oprogramowaniu są poprawne, kliknij przycisk Start Run i zapisz identyfikator eksperymentu do wykorzystania w przyszłości.
      4. Zatrzymywanie pracy i wyjmowanie probówek: Po zakończeniu działania programu poczekaj, aż temperatura modułu grzewczego spadnie poniżej 50 °C, a następnie otwórz pokrywę, aby wyjąć płytkę/probówki do PCR i odpowiednio obchodź się z próbkami.
4. Analiza danych
   1. Przed analizą danych potwierdź trzy wyniki wizualne: 1) Krzywe amplifikacji wszystkich próbek (w tym kontrola wewnętrzna) wykazują typowy kształt litery S, bez płaskich lub nienormalnie opóźnionych krzywych narastania; 2) Linia progu fluorescencji przecina fazę wykładniczą krzywych, a wartości Ct kontroli wewnętrznej (np. GAPDH) mieszczą się ≤ 38 cyklach (współczynnik zmienności < 5%); 3) Kontrole negatywne/pozytywne są uwzględniane w całym eksperymencie w celu monitorowania możliwości zanieczyszczenia.
      1. Jeśli eksperyment wymknie się spod kontroli, ponownie sprawdź całą partię. Jeśli próbka wykazuje nieprawidłowe amplifikacje (takie jak nietypowa krzywa S lub wartość Ct w zakresie krytycznym), należy ponownie sprawdzić tę konkretną próbkę.
   2. Wywołaj dane eksperymentalne w oprogramowaniu, ustaw próg i linię bazową oraz oblicz wartości Ct automatycznie lub ręcznie, ponieważ przyrząd automatycznie wybiera próg linii bazowej. Ustawić końcową dodatnią wartość oznaczenia na poziomie Ct ≤ 36; zakres referencyjny dla wewnętrznego genu odniesienia wymaga Ct ≤ 38. Upewnij się, że ich krzywe wzmocnienia wykazują charakterystyczne profile w kształcie litery S.

Results

Wykrywanie S. aureus i MRSA za pomocą qPCR
Opierając się na specyficznym dla gatunku genie nuc S. aureus i genie oporności na leki mecA MRSA, zaprojektowaliśmy startery i sondy znakowane odrębnymi fluoroforami do wykrywania qPCR. Wszystkie wyniki kontroli jakości w eksperymentach qPCR konsekwentnie mieściły się w zalecanych progach, potwierdzając wiarygodność wyników wykrywania (Figura 1).

W t...

Discussion

Dokładne i wczesne wykrycie oporności na metycylinę ma kluczowe znaczenie dla rokowania w przypadku zakażeń wywołanych przez S. aureus. Wczesna identyfikacja S. aureus i MRSA może zmniejszyć nadużywanie antybiotyków o szerokim spektrum działania i zmniejszyć presję selekcyjną prowadzącą do pojawienia się i rozprzestrzeniania oporności bakterii.

Tradycyjne metody wykrywania fenotypów, takie jak dyfuzja krążkowa cefoksytyny, wymagają 18-24-godzinnego okresu hodowli i wykazują w...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatyczny ekstraktor kwasów nukleinowych	DAAN	Inteligentny 32	Do ekstrakcji DNA
Zobacz materiał BSC-1500IIA2-X	BAZA BIOLOGICZNA	SEDA 20143222263	Szafa bezpieczeństwa biologicznego
Wirówka elektroniczna	WEALTEC		Odwirować pozostałą ciecz ze ścianki probówki
Zestaw do wykrywania genów oporności na leki Staphylococcus aureus oporności na metycylinę	BOJIE	ZC-HX-38-2	Wykrywanie genów oporności Staphylococcus aureus opornych na metycylinę
Zestaw do ekstrakcji kwasów nukleinowych	BOJIE	TQ-BG-001-96B	Ekstrakcja kwasu nukleinowego
SLAN W pełni automatyczny system analizy medycznej PCR	HONGSHI (DZIELNICA HONGSHI)		Analiza danych
SLAN-96S Maszyna do PCR w czasie rzeczywistym	HONGSHI (DZIELNICA HONGSHI)	SLAN-96S	Fluorescencyjna ilościowa amplifikacja PCR
Thermo Scientific NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop One	Analiza ilościowa DNA, RNA i białek
Zamrażarki niskotemperaturowe (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 &stopni; C do przechowywania odczynników
Wir-5	Dzwonek Kylina		Do mieszania odczynnika