Zoptymalizowana ekstrakcja RNA z prątków z wykorzystaniem gorącego fenolu: solidne podejście zapewniające wiarygodną analizę ekspresji genów

Podsumowanie

Niniejsza praca optymalizuje metodę ekstrakcji RNA opartą na gorącym fenolu dla Mycobacterium, pozwalającą na uzyskanie wysokiej jakości RNA odpowiedniego do analiz transkryptomicznych. W porównaniu z TRIzol i RNeasy w identycznych warunkach, metoda ta zapewniła wyższą wydajność, porównywalną integralność oraz lepszą efektywność kosztową, stanowiąc praktyczną alternatywę dla wielkoskalowych badań ekspresji genów.

Streszczenie

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) pozostaje poważnym zagrożeniem dla zdrowia publicznego na świecie, co podkreśla potrzebę prowadzenia wiarygodnych badań transkrypcyjnych w celu zrozumienia jego biologii oraz mechanizmów oporności na leki. Analizy te zależą od uzyskania wysokiej jakości RNA o wysokiej wydajności. Chociaż dostępnych jest kilka metod ekstrakcji RNA, wiele z nich wymaga drogich odczynników, dużych objętości hodowli lub specjalistycznego sprzętu, co ogranicza ich przydatność w badaniach na szeroką skalę, szczególnie w warunkach ograniczonych zasobów. W niniejszej pracy przedstawiono zoptymalizowaną metodę ekstrakcji RNA opartą na gorącym fenolu, dostosowaną specjalnie do prątków. Metoda ta wykorzystuje minimalną objętość hodowli i powszechnie dostępne odczynniki, aby konsekwentnie uzyskiwać wysokiej jakości RNA nadającego się do wysokoprzepustowych zastosowań transkrypcyjnych. Ilość i integralność RNA oceniono za pomocą elektroforezy żelowej oraz analizy integralności RNA (RIN), a przydatność do dalszych zastosowań potwierdzono za pomocą qPCR i Qubit 4. Aby ocenić skuteczność zoptymalizowanej metody, przeprowadzono równoległą ekstrakcję RNA przy użyciu TRIzol i RNeasy w identycznych warunkach eksperymentalnych, obejmujących ten sam gatunek Mycobacterium, objętość hodowli, fazę wzrostu (logarytmiczną i stacjonarną) oraz warunki lizy. Pozwoliło to na bezpośrednie porównanie wydajności, jakości, wykonalności i kosztów. Zoptymalizowana metoda z użyciem gorącego fenolu wykazała porównywalną lub lepszą wydajność i jakość RNA, znacząco redukując koszty odczynników i zależność od specjalistycznego sprzętu. Ze względu na swoją efektywność, powtarzalność i przystępność, protokół ten stanowi praktyczną alternatywę dla szeroko zakrojonych badań ekspresji genów i transkrypcyjnych u Mtb oraz innych gatunków prątków.

Wprowadzenie

M. tuberculosis (Mtb), czynnik etiologiczny gruźlicy (TB), pozostaje główną przyczyną zgonów wywołanych przez pojedynczy patogen zakaźny, przewyższając HIV/AIDS. W 2024 roku gruźlica odpowiadała za około 1,3 miliona zgonów na całym świecie¹. Obciążenie to jest potęgowane przez rosnącą rozpowszechnioną szczepów wielolekoopornych (MDR) i ekstensywnie lekoopornych (XDR). W związku z tym istnieje pilna potrzeba zrozumienia molekularnych podstaw patogenezy gruźlicy oraz zidentyfikowania nowych celów terapeutycznych².

Profilowanie transkrypcyjne Mtb stało się ważnym narzędziem w wyjaśnianiu elementów funkcjonalnych zaangażowanych w interakcje gospodarz-patogen³, adaptację do stresu środowiskowego⁴ oraz mechanizmy leżące u podstaw oporności na leki⁵. Zaawansowane metodologie, takie jak PCR w czasie rzeczywistym, mikromacierze oraz sekwencjonowanie RNA (RNA-seq), znacznie zwiększyły możliwość analizy transkryptomu prątków⁶. Jednak sukces tych metod w dużej mierze zależy od dostępności wysokiej jakości RNA, co z kolei zależy od efektywnej lizy komórek podczas ekstrakcji. Złożona ściana komórkowa Mtb, składająca się z mykolylo-arabinogalaktanu i peptydoglikanu, sprawia, że ekstrakcja RNA jest szczególnie trudna⁷. Istniejące techniki lizy, w tym hydroliza enzymatyczna⁸, sonikacja⁹ oraz rozbijanie kuleczkami (bead-beating)¹⁰, często wymagają kosztownego sprzętu i dużych objętości hodowli, co ogranicza ich praktyczność w wielu laboratoriach BSL-3. Ponadto powolny wzrost Mtb wymusza wydłużenie czasu hodowli w celu uzyskania wystarczającej biomasy¹¹.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano zoptymalizowaną, szybką i ekonomiczną metodę ekstrakcji RNA opartą na gorącym fenolu. Przy użyciu zaledwie 3 mL hodowli w średniej fazie logarytmicznej, metoda ta pozwala uzyskać 45–60 µg wysokiej jakości RNA, nadającego się do późniejszych analiz transkryptomicznych. Lizę komórek przeprowadza się za pomocą kompaktowego ręcznego homogenizatora do tkanek oraz łatwo dostępnych odczynników, co eliminuje potrzebę stosowania kosztownych urządzeń. Chociaż metoda gorącego fenolu była opisywana wcześniej^11,12, zoptymalizowana wersja poprawia wygodę użytkowania, efektywność kosztową oraz wydajność RNA. Optymalizacja została przeprowadzona z wykorzystaniem M. smegmatis mc²155 (Msmeg) i pomyślnie zwalidowana przy użyciu Mtb H37Rv.

Protokół

Odczynniki i sprzęt wykorzystane w procedurze zostały wymienione w Tabeli materiałów.

1. Hodowla Mycobacterium

1. Zaszczepić 1 mL z zapasu glicerolowego Msmeg lub Mtb do 10 mL pożywki Middlebrook 7H9 uzupełnionej o 0,2% glicerolu, 0,05% Tween 80 i 10% ADC, inkubując w 37 °C przy wytrząsaniu 150 rpm do momentu osiągnięcia OD 1–1,5.
2. Wyhodować kulturę wtórną, dodając 1% kultury pierwotnej do 10 mL pożywki 7H9, aż do osiągnięcia środkowej fazy logarytmicznej, OD_600nm = 0,6–0,7.
3. Rozdzielić kulturę na aliquoty po 3 mL i odwirować w 2000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej (23–25 °C).
4. Przechowywać osady w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA.
   UWAGA: W przypadku kultur Mtb należy przestrzegać wytycznych BSL3 i inaktywować termicznie osad w 95 ˚C przez 20–25 min.
   UWAGA: Rycina 1 przedstawia schemat blokowy podstawowych etapów ekstrakcji RNA metodą gorącego fenolu.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie metody gorącego fenolu oraz analizy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Izolacja RNA

1. Metoda z gorącym fenolem (metoda HP)
   1. Do osadu komórkowego dodać 200 µL buforu TES (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 5 mM EDTA, pH 8,0; 0,1 M NaCl; % SDS; 1% β-merkaptoetanolu) i resuspender osad za pomocą vortexu.
   2. Do próbki dodać około 0,1 g kulek krzemionkowych o średnicy 0,1 mm. Użyć ręcznego homogenizatora tkankowego przez 10–15 s, aż osad zostanie całkowicie rozmrożony na lodzie. Powtórzyć ten krok w dwóch kolejnych cyklach, a po każdym powtórzeniu przeprowadzić szybkie zamrażanie w ciekłym azocie.
   3. LUB użyć szybkoobrotowego laboratoryjnego homogenizatora kulkowego przez 1 min z ustawieniem prędkości na 5 (5,0 m/s) w temperaturze pokojowej. Powtórzyć ten krok przez 3 cykle i inkubować próbkę na lodzie po każdym cyklu, aby zapobiec nagrzewaniu.
      UWAGA: Lizę komórek Mtb powtórzyć przez 6–8 cykli (każdy cykl przez 1 min) przy użyciu ręcznego homogenizatora tkankowego lub homogenizatora kulkowego, okresowo chłodząc na lodzie po każdym cyklu. Do przygotowania wszystkich buforów i odczynników potrzebnych do ekstrakcji RNA należy użyć wody traktowanej DEPC (dietylopirokarbonianem).
   4. Do każdej próbki dodać dodatkowe 200 µL buforu TES (wstępnie podgrzanego do 65 °C), aby uzupełnić objętość do 400 µL. Do każdej próbki dodać 200 µL fenolu kwaśnego (fenol równoważony buforem cytrynianowym 100 mM, pH 4,5) oraz 200 µL chloroformu (wymieszać fenol kwaśny i chloroform w równym stosunku przed dodaniem do próbki).
   5. Inkubować próbkę w temperaturze 65 °C w bloku grzejnym z wytrząsaniem przy 900 rpm przez 30 min, a następnie wirować przy 12000 x g przez 15 min w temperaturze pokojowej. Upewnić się, że po wirowaniu nastąpiło prawidłowe rozdzielenie faz (powinna być widoczna klarowna górna faza wodna zawierająca RNA, wyraźna interfaza z DNA oraz dolna faza organiczna zawierająca białka i lipidy).
   6. Zdjąć górną warstwę fazy wodnej i przenieść ją do nowej probówki mikrocentryfugowej 1,5 mL. Ponownie dodać taką samą objętość fenolu kwaśnego i chloroformu. Wirować przy 12 000 x g przez 15 min w temperaturze pokojowej. Upewnić się, że nastąpiło prawidłowe rozdzielenie faz.
   7. Przenieść górną warstwę wodną do nowej probówki mikrocentryfugowej 1,5 mL, następnie dodać 30 µL buforu octanu sodu 3 M, pH 5,3 oraz 240 µL schłodzonego izopropanolu. Inkubować w temperaturze −80 °C od 30 min do 1 h.
      UWAGA: Na tym etapie probówkę mikrocentryfugową można przechowywać przez noc w temperaturze -80 °C. Uszczelnić probówkę mikrocentryfugową wieloma warstwami parafilmu, aby zapobiec jej otwarciu w temperaturze 65 °C podczas inkubacji.
      OSTROŻNIE: Fenol i chloroform są substancjami niebezpiecznymi; dlatego należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (PPE), zabezpieczenia techniczne, takie jak dygestoria, oraz przestrzegać procedur utylizacji odpadów.
   8. Wirować przy 12 000 x g przez 1 h w temperaturze pokojowej. Upewnić się, że powstał osad i ostrożnie usunąć nadsącz, nie naruszając osadu.
   9. Resuspender osad w 1 mL 75% etanolu i wirować przy 12 000 x g przez 1 min w temperaturze pokojowej. Wykonać ten krok dwukrotnie, a następnie wysuszyć osad na powietrzu.
   10. Resuspender osad w 50 µL wody wolnej od nukleaz.
       ​UWAGA: Aby rozpuścić RNA, inkubować je w wodzie wolnej od RNaz przez 10–30 min w temperaturze pokojowej.
2. Metoda z użyciem TRIzol
   1. Do osadu komórkowego dodać 200 µL odczynnika TRIzol.
      OSTROŻNIE: TRIzol jest substancją niebezpieczną; dlatego należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (PPE), zabezpieczenia techniczne, takie jak dygestoria, oraz przestrzegać procedur utylizacji odpadów.
   2. Postępować zgodnie z metodą lizy komórek opisaną w krokach 2.1.2 - 2.1.3.
   3. Dodać dodatkowe 200 µL odczynnika TRIzol, następnie 200 µL chloroformu i mieszać na vortexie przez 1 min. Wirować przy 13 400 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Upewnić się, że po wirowaniu nastąpiło prawidłowe rozdzielenie faz.
   4. Ostrożnie przenieść fazę wodną do nowej probówki mikrocentryfugowej 1,5 mL.
   5. Wytrącić RNA poprzez dodanie 500 µL izopropanolu do fazy wodnej i inkubowanie w temperaturze −80 °C od 30 min do 1 h.
   6. Osadzić RNA poprzez wirowanie przy 15 000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C. Uważnie obserwować osad i usunąć nadsącz, nie naruszając osadu.
   7. Resuspender osad w 1 mL 75% etanolu i wirować przy 13 400 x g przez 1 min w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten krok dwukrotnie, wysuszyć osad na powietrzu przez 30 min w temperaturze pokojowej i resuspender w 50 µL wody wolnej od nukleaz.
3. Metoda z użyciem komercyjnego zestawu do ekstrakcji RNA
   1. Resuspender osad komórkowy w 200 µL buforu do resuspensji (dołączonego do zestawu).
   2. Postępować zgodnie z metodą lizy komórek opisaną w krokach 2.1.2 - 2.1.3.
   3. Przeprowadzić dalsze etapy eksperymentu zgodnie z instrukcjami producenta.

3. Traktowanie DNazą, kwantyfikacja i wizualizacja

1. Aby usunąć zanieczyszczenia DNA genomowym, do każdej próbki RNA dodać 1 µL DNase I (10units) oraz 5 µL buforu RDD (1x) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
2. Ilość RNA w próbce oznaczyć spektrofotometrycznie przy użyciu Nanodrop, a integralność RNA za pomocą Qubit4. Akceptowalna wartość RIN mieści się w przedziale 7,5–10. Akceptowalne wartości A₂₆₀/A₂₈₀ oraz A₂₆₀/A₂₃₀ wynoszą odpowiednio od 1,8 do 2,0 oraz od 2,0 do 2,2.
3. RNA zwizualizować na 1% żelu agarozowym, stosując 1X RNA loading dye.

4. Synteza cDNA i ilościowa PCR w czasie rzeczywistym

1. Przygotować 20 µL reakcji do syntezy cDNA z wykorzystaniem zestawu cDNA Reverse Transcription oraz 1 µg RNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta w termocyklerze.
2. Przygotować 10 µL reakcji real-time PCR, wykorzystując 50 ng cDNA, 0,4 µM każdego startera oraz SYBR, zgodnie z instrukcjami producenta. Próbkę poddać analizie w termocyklerze Real-Time PCR.
   UWAGA: Do analizy qPCR wykorzystano następujące startery:
   Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3'
   Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3'
   Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3'
   Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3'
   Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3'
   Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'

5. Analiza statystyczna

1. Przeprowadź test t Studenta test t-Studenta z wykorzystaniem wszystkich powtórzeń biologicznych w programie GraphPad Prism, P Wartość p ≤ 0,05 uznano za statystycznie istotną. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy z co najmniej trzech powtórzeń biologicznych.

Wyniki

Jakość i wydajność RNA

Jakość i ilość RNA oceniono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (Rycina 2). We wszystkich metodach ekstrakcji zaobserwowano wyraźne, ostre prążki odpowiadające 23S i 16S rRNA, co potwierdziło pomyślną izolację całkowitego RNA. Metody Hot Phenol i TRIzol wykazały trzy wyraźne prążki reprezentujące 23S (~2900 bp), 16S (~1500 bp) i 5S rRNA (~120 bp), co wskazuje na nieuszkodzone RNA wysokiej jakości. W pr...

Dyskusja

W celu opracowania prostej i niezawodnej metody ekstrakcji RNA z Mycobacterium zoptymalizowano metodę gorącego fenolu (Hot Phenol). Następnie wyekstrahowane RNA porównano z dwiema powszechnie stosowanymi podejściami: TRIzol oraz metodą z wykorzystaniem zestawu kolumienkowego^12,13. Techniki te porównano pod kątem wydajności RNA, czystości, integralności, kosztów i czasu przetwarzania, aby ocenić ich praktyczność w dalszych zastosowaniach molekularnych. Za...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
kuleczki krzemionkowe 0,1 mm	MP Biomedicals	Przeprowadzenie analizy korelacji Pearsona i korelacji Spearmana w programie SPSS W statystyce korelacja służy do mierzenia siły i kierunku liniowego związku między dwiema zmiennymi. Dwie najczęściej stosowane metody obliczania korelacji to współczynnik korelacji Pearsona oraz współczynnik korelacji Spearmana. Współczynnik korelacji Pearsona, znany również jako korelacja produktowo-momentowa, mierzy siłę i kierunek liniowej zależności między dwiema zmiennymi ilościowymi. Wymaga on, aby obie zmienne miały rozkład normalny i żeby zależność między nimi była liniowa. Współczynnik korelacji Spearmana jest nieparametryczną miarą siły i kierunku związku monotonicznego między dwiema zmiennymi. Jest on stosowany, gdy dane nie mają rozkładu normalnego, gdy zmienne są mierzone na skali porządkowej lub gdy zależność między zmiennymi nie jest liniowa. W tym filmie dowiesz się, jak przeprowadzać oba te testy korelacji przy użyciu oprogramowania SPSS. Słowa kluczowe: korelacja, korelacja Pearsona, korelacja Spearmana, SPSS, analiza statystyczna, współczynnik korelacji, analiza danych
2-propanol	Sigma	278475
Bead Ruptor 4	revvity
Chloroform	Sigma	288306
Wirówka chłodząca	ThermoScientific	42541217
DNaza I	Qiagen	79254
EDTA	sigma	E02SS
HCl	SRL	62889
Blok grzewczy	MIULAB	MU-E02-1049
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o wysokiej wydajności	Thermo Fisher Scientific	4368814
Zmotoryzowany homogenizator do tkanek G10	Korona	G22616008
NaCl	sigma	S5886
Nanofotometr N50	IMPLEMENTACJA	T51601
fenol nasycony buforem cytrytowym 0,1 M o pH 4,5	Sigma	P4682
PowerUP SYBR	Applied Biosystems	A25742
fluorometr Qubit 4	Invitrogen	2,32262E+12
Termocykler do PCR w czasie rzeczywistym	Analytik Jena AG	844-00503-2
Zestaw RNeasy	Qiagen	74104
SDS	Sigma	S9888
Octan sodu	Sigma	S2889
termocykler	Bio-Rad	621BR29739
TRI Reagent	Sigma	T9424
Tris (zasada)	Himedia	MB029
β-merkaptoetanol	Sigma	516732