Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowana ekstrakcja RNA z prątków z wykorzystaniem gorącego fenolu: solidne podejście zapewniające wiarygodną analizę ekspresji genów

176 wyświetleń

⸱

11 września 2026

 ,  ,  , 
1Amity Institute of Molecular Medicine and Stem Cell Research, Amity University Uttar Pradesh, 2Amity Institute of Genome Engineering, Amity University Uttar Pradesh

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejsza praca optymalizuje metodę ekstrakcji RNA opartą na gorącym fenolu dla Mycobacterium, pozwalającą na uzyskanie wysokiej jakości RNA odpowiedniego do analiz transkryptomicznych. W porównaniu z TRIzol i RNeasy w identycznych warunkach, metoda ta zapewniła wyższą wydajność, porównywalną integralność oraz lepszą efektywność kosztową, stanowiąc praktyczną alternatywę dla wielkoskalowych badań ekspresji genów.

Streszczenie

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) pozostaje poważnym zagrożeniem dla zdrowia publicznego na świecie, co podkreśla potrzebę prowadzenia wiarygodnych badań transkrypcyjnych w celu zrozumienia jego biologii oraz mechanizmów oporności na leki. Analizy te zależą od uzyskania wysokiej jakości RNA o wysokiej wydajności. Chociaż dostępnych jest kilka metod ekstrakcji RNA, wiele z nich wymaga drogich odczynników, dużych objętości hodowli lub specjalistycznego sprzętu, co ogranicza ich przydatność w badaniach na szeroką skalę, szczególnie w warunkach ograniczonych zasobów. W niniejszej pracy przedstawiono zoptymalizowaną metodę ekstrakcji RNA opartą na gorącym fenolu, dostosowaną specjalnie do prątków. Metoda ta wykorzystuje minimalną objętość hodowli i powszechnie dostępne odczynniki, aby konsekwentnie uzyskiwać wysokiej jakości RNA nadającego się do wysokoprzepustowych zastosowań transkrypcyjnych. Ilość i integralność RNA oceniono za pomocą elektroforezy żelowej oraz analizy integralności RNA (RIN), a przydatność do dalszych zastosowań potwierdzono za pomocą qPCR i Qubit 4. Aby ocenić skuteczność zoptymalizowanej metody, przeprowadzono równoległą ekstrakcję RNA przy użyciu TRIzol i RNeasy w identycznych warunkach eksperymentalnych, obejmujących ten sam gatunek Mycobacterium, objętość hodowli, fazę wzrostu (logarytmiczną i stacjonarną) oraz warunki lizy. Pozwoliło to na bezpośrednie porównanie wydajności, jakości, wykonalności i kosztów. Zoptymalizowana metoda z użyciem gorącego fenolu wykazała porównywalną lub lepszą wydajność i jakość RNA, znacząco redukując koszty odczynników i zależność od specjalistycznego sprzętu. Ze względu na swoją efektywność, powtarzalność i przystępność, protokół ten stanowi praktyczną alternatywę dla szeroko zakrojonych badań ekspresji genów i transkrypcyjnych u Mtb oraz innych gatunków prątków.

Wprowadzenie

M. tuberculosis (Mtb), czynnik etiologiczny gruźlicy (TB), pozostaje główną przyczyną zgonów wywołanych przez pojedynczy patogen zakaźny, przewyższając HIV/AIDS. W 2024 roku gruźlica odpowiadała za około 1,3 miliona zgonów na całym świecie1. Obciążenie to jest potęgowane przez rosnącą rozpowszechnioną szczepów wielolekoopornych (MDR) i ekstensywnie lekoopornych (XDR). W związku z tym istnieje pilna potrzeba zrozumienia molekularnych podstaw patogenezy gruźlicy oraz zidentyfikowania nowych celów terapeutycznych2.

Profilowanie transkrypcyjne Mtb stało się ważnym narzędziem w wyjaśnianiu elementów funkcjonalnych zaangażowanych w interakcje gospodarz-patogen3, adaptację do stresu środowiskowego4 oraz mechanizmy leżące u podstaw oporności na leki5. Zaawansowane metodologie, takie jak PCR w czasie rzeczywistym, mikromacierze oraz sekwencjonowanie RNA (RNA-seq), znacznie zwiększyły możliwość analizy transkryptomu prątków6. Jednak sukces tych metod w dużej mierze zależy od dostępności wysokiej jakości RNA, co z kolei zależy od efektywnej lizy komórek podczas ekstrakcji. Złożona ściana komórkowa Mtb, składająca się z mykolylo-arabinogalaktanu i peptydoglikanu, sprawia, że ekstrakcja RNA jest szczególnie trudna7. Istniejące techniki lizy, w tym hydroliza enzymatyczna8, sonikacja9 oraz rozbijanie kuleczkami (bead-beating)10, często wymagają kosztownego sprzętu i dużych objętości hodowli, co ogranicza ich praktyczność w wielu laboratoriach BSL-3. Ponadto powolny wzrost Mtb wymusza wydłużenie czasu hodowli w celu uzyskania wystarczającej biomasy11.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano zoptymalizowaną, szybką i ekonomiczną metodę ekstrakcji RNA opartą na gorącym fenolu. Przy użyciu zaledwie 3 mL hodowli w średniej fazie logarytmicznej, metoda ta pozwala uzyskać 45–60 µg wysokiej jakości RNA, nadającego się do późniejszych analiz transkryptomicznych. Lizę komórek przeprowadza się za pomocą kompaktowego ręcznego homogenizatora do tkanek oraz łatwo dostępnych odczynników, co eliminuje potrzebę stosowania kosztownych urządzeń. Chociaż metoda gorącego fenolu była opisywana wcześniej11,12, zoptymalizowana wersja poprawia wygodę użytkowania, efektywność kosztową oraz wydajność RNA. Optymalizacja została przeprowadzona z wykorzystaniem M. smegmatis mc2155 (Msmeg) i pomyślnie zwalidowana przy użyciu Mtb H37Rv.

Protokół

Odczynniki i sprzęt użyte w eksperymencie wymieniono w Tabeli materiałów.

1. Hodowla Mycobacterium

  1. Zaszczep 1 ml z zapasu glicerynowego Msmeg lub Mtb do 10 ml pożywki Middlebrook 7H9 uzupełnionej o 0,2% glicerolu, 0,05% Tween 80 oraz 10% ADC w 37 °C z wytrząsaniem przy 150 obr./min aż do osiągnięcia wartości OD w zakresie 1–1,5.
  2. Hodowlę wtórną prowadzić, dodając 1% hodowli pierwotnej do 10 ml pożywki 7H9, aż do osiągnięcia fazy średnio-logarytmicznej, OD600 nm = 0.6–0.7.
  3. Rozdzielić na aliquoty po 3 ml i odwirować hodowle przy 2000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej (23–25 °C).
  4. Przechowywać osady w temperaturze -80 °C do momentu ekstrakcji RNA.
    OSTRZEŻENIE: W przypadku hodowli Mtb należy przestrzegać odpowiednich wytycznych BSL3 i poddać osad inaktywacji termicznej w temperaturze 95 ˚C przez 20–25 min.
    UWAGA: Rysunek 1 przedstawia schemat blokowy podstawowych etapów izolacji RNA metodą gorącego fenolu.

Schemat ekstrakcji RNA metodą gorącego fenolu; schemat obejmuje wirowanie, rozdział faz i analizę integralności RNA.
Rycina 1: Schematyczna prezentacja metody gorącego fenolu oraz analizy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Izolacja RNA

  1. Metoda z użyciem gorącego fenolu (metoda HP)
    1. Do osadu komórkowego dodać 200 µL buforu TES (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 5 mM EDTA, pH 8,0; 0,1 M NaCl; % SDS; 1% β-merkaptoetanolu) i resuspenderć osad za pomocą wortexowania.
    2. Do próbki dodać około 0,1 g kulek krzemionkowych o średnicy 0,1 mm. Użyć ręcznego homogenizatora tkankowego przez 10–15 s, aż osad zostanie całkowicie rozmrożony na lodzie. Powtórzyć ten krok w 2 kolejnych cyklach, a po każdym powtórzeniu szybko zamrozić próbkę w ciekłym azocie.
    3. LUB użyć wysokoprędkościowego laboratoryjnego urządzenia do rozbijania kulek przez 1 min przy ustawieniu prędkości 5 (5,0 m/s) w temperaturze pokojowej. Powtórzyć ten krok przez 3 cykle i inkubować próbkę na lodzie po każdym cyklu, aby zapobiec nagrzewaniu.
      UWAGA: Lizę komórek Mtb powtórzyć przez 6–8 cykli (każdy cykl trwa 1 min) przy użyciu ręcznego homogenizatora tkankowego lub urządzenia do rozbijania kulek, okresowo chłodząc na lodzie po każdym cyklu. Do przygotowania wszystkich buforów i odczynników potrzebnych do ekstrakcji RNA należy użyć wody traktowanej DEPC (piroweglianem dietylu).
    4. Do każdej próbki dodać dodatkowe 200 µL buforu TES (podgrzanego do 65 °C), aby uzyskać objętość 400 µL. Do każdej próbki dodać 200 µL fenolu kwasowego (fenolu zrównoważonego z 100 mM buforem cytrynianowym, pH 4,5) oraz 200 µL chloroformu (wymieszać fenol kwasowy i chloroform w równym stosunku przed dodaniem do próbki).
    5. Inkubować próbkę w temperaturze 65 °C w bloku grzewczym z wytrząsaniem przy 900 rpm przez 30 min i odwirować przy 12000 x g przez 15 min w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu upewnić się, że nastąpiła prawidłowa separacja faz (powinna być widoczna przejrzysta górna faza wodna zawierająca RNA, wyraźna interfaza z DNA oraz dolna faza organiczna zawierająca białka i lipidy).
    6. Zdjąć górną warstwę fazy wodnej i przenieść ją do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Ponownie dodać taką samą objętość fenolu kwasowego i chloroformu. Wirować przy 12 000 x g przez 15 min w temperaturze pokojowej. Upewnić się, że nastąpiła prawidłowa separacja faz.
    7. Przenieść górną warstwę wodną do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL, a następnie dodać 30 µL buforu octanu sodu 3 M, pH 5,3, oraz 240 µL schłodzonego izopropanolu. Inkubować w temperaturze −80 °C od 30 min do 1 h.
      UWAGA: Na tym etapie probówkę do mikrocentryfugi można przechowywać przez noc w temperaturze -80 °C. Uszczelnić probówkę kilkoma warstwami parafilmu, aby zapobiec jej otwarciu w temperaturze 65 °C podczas inkubacji.
      OSTRZEŻENIE: Fenol i chloroform są substancjami niebezpiecznymi; dlatego należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (Środki Ochrony Indywidualnej), zabezpieczenia techniczne, takie jak dygestoria, oraz specyficzne procedury utylizacji odpadów.
    8. Wirować przy 12 000 x g przez 1 h w temperaturze pokojowej. Upewnić się, że powstał osad i ostrożnie usunąć nadsącz, nie naruszając osadu.
    9. Resuspenderć osad w 1 mL 75% etanolu i wirować przy 12 000 x g przez 1 min w temperaturze pokojowej. Wykonać ten krok dwukrotnie i wysuszyć osad na powietrzu.
    10. Resuspenderć osad w 50 µL wody wolnej od nukleaz.
      ​UWAGA: Aby rozpuścić RNA, należy inkubować je w wodzie wolnej od RNaz przez 10–30 min w temperaturze pokojowej.
  2. Metoda z użyciem TRIzol
    1. Do osadu komórkowego dodać 200 µL odczynnika TRIzol.
      OSTRZEŻENIE: TRIzol jest substancją niebezpieczną; dlatego należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (Środki Ochrony Indywidualnej), zabezpieczenia techniczne, takie jak dygestoria, oraz specyficzne procedury utylizacji odpadów.
    2. Postępować zgodnie z metodą lizy komórek opisaną w krokach 2.1.2 - 2.1.3.
    3. Dodać dodatkowe 200 µL odczynnika TRIzol, a następnie 200 µL chloroformu i wortexować przez 1 min. Wirować przy 13 400 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Upewnić się, że po wirowaniu nastąpiła prawidłowa separacja faz.
    4. Ostrożnie przenieść fazę wodną do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.
    5. Wytrącić RNA, dodając 500 µL izopropanolu do fazy wodnej i inkubując w temperaturze −80 °C od 30 min do 1 h.
    6. Zestresować RNA poprzez wirowanie przy 15 000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C. Uważnie zlokalizować osad i usunąć nadsącz, nie naruszając go.
    7. Resuspenderć osad w 1 mL 75% etanolu i wirować przy 13 400 x g przez 1 min w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten krok dwukrotnie, wysuszyć osad na powietrzu przez 30 min w temperaturze pokojowej i resuspenderć w 50 µL wody wolnej od nukleaz.
  3. Metoda z użyciem komercyjnego zestawu do ekstrakcji RNA
    1. Resuspenderć osad komórkowy w 200 µL buforu do resuspensji (dołączonego do zestawu).
    2. Postępować zgodnie z metodą lizy komórek opisaną w krokach 2.1.2 - 2.1.3.
    3. Przeprowadzić dalszą część eksperymentu zgodnie z instrukcjami producenta.

3. Traktowanie DNazą, kwantyfikacja i wizualizacja

  1. Aby usunąć zanieczyszczenia DNA genomicznym, dodać 1 µL DNazy I (10units) oraz 5 µL buforu RDD (1x) do każdej próbki RNA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
  2. Ilość RNA w próbce oznaczyć spektrofotometrycznie za pomocą Nanodrop, a integralność RNA za pomocą Qubit4. Akceptowalna wartość RIN mieści się w przedziale 7,5–10. Akceptowalne wartości A260/A280 oraz A260/A230 wynoszą odpowiednio od 1,8 do 2,0 oraz od 2,0 do 2,2.
  3. Wizualizować RNA na 1% żelu agarozowym, używając 1X barwnika do ładowania RNA (RNA loading dye).

4. Synteza cDNA i ilościowe PCR w czasie rzeczywistym

  1. Przygotować 20 µL reakcji do syntezy cDNA, wykorzystując zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA oraz 1 µg RNA, zgodnie z instrukcjami producenta w termocyklerze.
  2. Przygotować 10 µL reakcji PCR w czasie rzeczywistym, wykorzystując 50 ng cDNA, 0,4 µM każdego primera oraz SYBR, zgodnie z instrukcjami producenta. Próbkę poddać amplifikacji w termocyklerze do Real-Time PCR.
    UWAGA: Do analizy qPCR wykorzystano następujące primery:
    Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3'
    Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3'
    Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3'
    Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3'
    Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3'
    Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'

5. Analiza statystyczna

  1. Wykonaj test t Studenta test t-Studenta z wykorzystaniem wszystkich powtórzeń biologicznych w programie GraphPad Prism, P Wartość p ≤ 0,05 uznano za statystycznie istotną. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy z co najmniej trzech powtórzeń biologicznych.

Wyniki

Jakość i wydajność RNA

Jakość i ilość RNA oceniono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (Rysunek 2). We wszystkich zastosowanych metodach ekstrakcji zaobserwowano wyraźne, ostre prążki odpowiadające 23S i 16S rRNA, co potwierdziło pomyślną izolację całkowitego RNA. Metody Hot Phenol oraz TRIzol wykazały trzy wyraźne prążki reprezentujące 23S (~2900 bp), 16S (~1500 bp) i 5S rRNA (~120 bp), co wskazuje na nienaruszone, wysokiej jakości RNA. W przeciwieństwie do nich, metoda z wykorzystaniem kolumienki wykazała jedynie prążki 23S i 16S, przy czym prążek 5S rRNA był nieobecny lub znajdował się poniżej granicy wykrywalności, co prawdopodobnie wynikało z preferencyjnej utraty małych RNA podczas oczyszczania kolumienkowego. Pod względem ilościowym metoda Hot Phenol pozwoliła uzyskać od 1,5 do 2 razy więcej RNA niż odpowiednio TRIzol i RNeasy (Rysunek 2A,C). Średnie wydajności wyniosły ~60 µg dla Hot Phenol, ~45 µg dla TRIzol i ~30 µg dla RNeasy, przy czym ta ostatnia wartość reprezentuje wydajność o ok. 50% niższą niż w przypadku Hot Phenol. Pomimo różnic w wydajności, integralność i czystość RNA były porównywalne dla wszystkich metod (Rysunek 2D,E).

Aby ocenić efektywność metody lizy, RNA wyekstrahowano również przy użyciu homogenizatora kuleczkowego. Uzyskano porównywalne wydajności, jakość i integralność, co dowodzi, że skuteczną lizę można osiągnąć za pomocą prostego ręcznego homogenizatora do tkanek, bez konieczności polegania na specjalistycznym sprzęcie, takim jak homogenizator kuleczkowy (Rysunek 2B,F–H).

Ponieważ Mtb jest bardziej odporne na lizę niż Msmeg, w dalszej kolejności zwalidowano zoptymalizowaną metodę gorącego fenolu z wykorzystaniem szczepu Mtb H37Rv. Liza komórek przy użyciu zarówno homogenizatora tkankowego, jak i ruptora kuleczkowego pozwoliła na uzyskanie RNA o dobrej wydajności, jakości i integralności (Rycina 3A–D), co potwierdza skuteczność tej metody. Chociaż ekstrakcja RNA przy użyciu ręcznego homogenizatora tkankowego wykazała niższą wydajność (~35–45 µg/3 mL hodowli) w porównaniu z ruptorem kuleczkowym (50–60 µg/3 mL), różnica ta okazała się statystycznie nieistotna, a uzyskana ilość mieściła się w dopuszczalnym zakresie, wystarczającym do szeroko zakrojonych badań ekspresji genów. Wszystkie ekstrakcje RNA powtórzono wielokrotnie, a przedstawione zostały wszystkie niezależne powtórzenia biologiczne. Przeprowadzono analizę densytometryczną obrazów żelowych, co dodatkowo potwierdza statystyczne różnice w wydajności RNA pomiędzy różnymi metodami, przy czym metoda gorącego fenolu zapewniła najwyższą wydajność (Rycina dodatkowa 1A–D).

Czystość i integralność RNA

Wszystkie metody pozwoliły na otrzymanie RNA z akceptowalnymi stosunkami A260/A280 w okolicy 2,0, co wskazuje na minimalne zanieczyszczenie białkami (Rysunek 2D). Integralność RNA (RIN) była porównywalna we wszystkich metodach, a wartości mieściły się w zakresie od 7,5 do 10 (Rycina 2D–H, Materiały uzupełniające Rysunek 2, dolny panel). Świadczy to o dobrej jakości, integralności i minimalnej degradacji.

Analiza ilościową PCR w celu sprawdzenia jakości RNA

Aby ocenić przydatność RNA wyekstrahowanego każdą z metod do dalszych badań ekspresji genów, przeprowadzono analizę qRT-PCR. Badano ekspresję genu gospodarczego Msmeg, mysA (MSMEG 2758), oraz dwóch regulatorów transkrypcyjnych, sigE (MSMEG 5072) i sigH (MSMEG 1914), stosując równoważne ilości RNA wejściowego. Uzyskane wartości Ct (cycle threshold) odzwierciedlają względną zawartość nienaruszonego, możliwego do amplifikacji RNA w każdej próbce. Jak pokazano na (Rysunku 2I), RNA wyekstrahowane przy użyciu gorącego fenolu oraz TRIzol dało porównywalne wartości Ct w zakresie około 22–25, co świadczy o wyższej integralności RNA i kompatybilności z odwrotną transkrypcją oraz amplifikacją. Metoda z użyciem zestawu wykazała nieco wyższe wartości Ct (~27–30), co wskazuje na niższy poziom wykrywalnych transkryptyów. Analiza krzywej topnienia wykazała specyficzną amplifikację genów mysA, sigE oraz sigH, potwierdzając specyficzność i wydajność qPCR (Rysunek dodatkowy 2, panel górny). Analiza qPCR z wykorzystaniem genów Mtb również wykazała akceptowalne wartości Ct (~20–25), potwierdzając przydatność do dalszych badań ekspresji genów (Rysunek 3E).

Porównanie ekstrakcji RNA; elektroforeza żelowa (28S, 18S, 5S) i wykresy słupkowe wydajności, Ct, czystości.
Rysunek 2: Porównanie metod ekstrakcji RNA dla Mycobacterium. (A) Elektroforeza żelowa w agarozie wykazująca całkowite RNA wyekstrahowane metodami Hot Phenol, TRIzol oraz RNeasy. W wszystkich próbkach widoczne są wyraźne prążki rRNA 23S i 16S, co wskazuje na nienaruszone RNA. (B) Elektroforeza żelowa w agarozie wykazująca całkowite RNA wyekstrahowane metodą Hot Phenol poprzez różne metody lizy, tj. bead ruptor i ręczny homogenizator tkanek. (C) Wydajność całkowitego RNA, wykazująca najwyższą wydajność dla metody Hot Phenol, a następnie dla TRIzol i metody z zestawu. (D) Czystość RNA została oceniona za pomocą stosunków A260/A280; wszystkie metody dały wartości około ~2,0, co świadczy o minimalnym zanieczyszczeniu białkami. (E) Liczba integralności RNA (RIN) wykazująca porównywalną integralność. (F–H) Porównanie wydajności RNA, stosunku 260/280 i integralności RNA między próbkami lizowanymi ręcznym homogenizatorem tkanek a Bead Ruptorem i izolowanymi metodą Hot Phenol. (I) Wartości Ct z qRT-PCR celującego w gen gospodarski (np. mysA) oraz czynniki transkrypcyjne (sigE i sigH). Słupki błędów reprezentują błąd standardowy z trzech powtórzeń biologicznych (n = 3). Wartość P obliczona za pomocą testu t-Studenta. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie ekstrakcji RNA z Mycobacterium, elektroforeza w żelu i wykresy słupkowe analizujące wydajność i czystość.
Rycina 3: Izolacja RNA z Mtb z zastosowaniem metody gorącego fenolu. (A) Elektroforeza w żelu agarozowym wykazująca całkowite RNA wyekstrahowane za pomocą rozrywacza kuleczkowego i ręcznego homogenizatora do tkanek z zastosowaniem zoptymalizowanej metody gorącego fenolu z szczepu Mtb H37Rv. (B–D) Porównanie izolowanego RNA pod kątem wydajności, stosunku 260/280 oraz oceny integralności RNA (RIN). (E) Wartości Ct z qRT-PCR celującej w geny sigA, 16s rRNA i hsp70. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy z trzech powtórzeń biologicznych (n = 3). Wartość P obliczona za pomocą testu t Studenta. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Gorący fenolTrizolzestaw RNeasy
Wydajność60 -70 μg35 -50 μg30 - 45 μg
Czas2,5–3 godz.2–2,5 godz.30–45 min
Koszt/reakcja$0.10 – $0.20$1.500 – $2.00$7.00 – $10.00
Ograniczenia Czasochłonne, silne denaturanty (fenol/SDS) Czasochłonne, zastosowanie wysoce toksycznych odczynników, takich jak Trizol, konieczność użycia wirówki chłodzącej, koszt 15 razy wyższy niż w przypadku metody z gorącym fenolemKoszty wyższe (72 razy droższe niż Hot Phenol), niższa wydajność, zapychanie się kolumny
ZaletyWyższa wydajność z mniejszej objętości, niski koszt, brak konieczności stosowania homogenizatora kuleczkowego (bead beater) do lizy komórek, brak wymogu odwirowania w niskiej temperaturzeUmiarkowana wydajność i umiarkowany koszt, wymagana wirowka chłodzącaUmiarkowana wydajność, bardzo wysoki koszt
Główny czynnik kosztowyPowszechne odczynniki laboratoryjne (składniki buforu TES, fenol zakwaszony, chloroform, izopropanol, etanol)Komercyjny odczynnik TRI Reagent®, chloroform lub chloroform: alkohol izoamylowy, izopropanol, etanolAutorskie kolumny wiriówek i bufory firmy Qiagen
RIN (wskaźnik integralności RNA)RIN 8-107,5–10 RINRIN 9-10

Tabela 1: Porównanie kosztów, czasu i ograniczeń trzech różnych procedur ekstrakcji RNA (metody Hot Phenol, TRIzol oraz RNeasy).

Rysunek dodatkowy 1: Optymalizacja ekstrakcji RNA. (A) Ekstrakcja RNA z użyciem gorącego fenolu i lizy za pomocą ręcznego homogenizatora do tkanek. (B) Ekstrakcja RNA z użyciem TRIzol. (C) Ekstrakcja RNA metodą RNeasy. (D) Analiza densytometryczna obrazów żelowych ekstrakcji RNA z Msmeg z zastosowaniem różnych metod. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy obliczony w programie GraphPad Prism (n = 8). (E) Ekstrakcja RNA z użyciem gorącego fenolu ze szczepu Mtb. Wszystkie obrazy żelowe stanowią niezależne powtórzenia biologiczne. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: (Panel górny) Analiza krzywych topnienia dla mysA, sigE, i sigH z M. smeg, n = 3; (Panel dolny) Analiza integralności RNA. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W celu opracowania prostej i niezawodnej metody ekstrakcji RNA z Mycobacterium zoptymalizowano metodę gorącego fenolu (Hot Phenol). Następnie wyekstrahowane RNA porównano z dwiema powszechnie stosowanymi podejściami: TRIzol oraz metodą z wykorzystaniem zestawu kolumienkowego12,13. Techniki te porównano pod kątem wydajności RNA, czystości, integralności, kosztów i czasu przetwarzania, aby ocenić ich praktyczność w dalszych zastosowaniach molekularnych. Zarówno metoda gorącego fenolu, jak i TRIzol, choć stosunkowo czasochłonne w porównaniu z metodą zestawową, pozwoliły na uzyskanie nienaruszonego, wysokiej jakości RNA. Wszystkie trzy metody dostarczyły RNA o porównywalnej czystości i integralności; jednak metoda gorącego fenolu konsekwentnie zapewniała wyższą wydajność RNA. Ponadto RNA wyekstrahowane przy użyciu gorącego fenolu i TRIzol wykazało podobne wartości Ct. Jednakże między metodami gorącego fenolu a RNeasy zaobserwowano statystycznie istotną różnicę w wartościach Ct. Ponieważ w eksperymencie użyto równych ilości RNA, oczekiwano podobnych wartości Ct dla wszystkich metod. Różnice zaobserwowane w przypadku metody RNeasy można przypisać różnicom w chemii ekstrakcji RNA. Gorący fenol i TRIzol są metodami opartymi na rozpuszczalnikach organicznych i często okazują się bardziej skuteczne w solubilizacji trudnych transkryptywów, takich jak te kodujące białka błony wewnętrznej lub transkrypty o wysokiej zawartości GC. W przeciwieństwie do nich, RNeasy jest metodą opartą na kolumnach krzemionkowych i może prowadzić do mniejszego odzysku niektórych transkryptywów, które nie wiążą się efektywnie z membraną lub są tracone podczas etapów płukania, w porównaniu z metodami opartymi na fenolu (Rysunek 2). Co istotne, porównywalne wydajności RNA osiągnięto, stosując albo ręczny homogenizator tkankowy, albo urządzenie do rozbijania komórek kuleczkami (bead ruptor) do lizy komórek, co zapewnia elastyczność operacyjną podczas przeprowadzania lizy. Dodatkowo metoda ekstrakcji została zoptymalizowana do pracy z małymi objętościami kultur i bez konieczności stosowania wirowania w niskich temperaturach. Takie uproszczenie zwiększa ogólną łatwość i wydajność przetwarzania próbek.

Ważnym czynnikiem przy wyborze metody ekstrakcji RNA jest zrównoważenie kosztów, czasu i jakości uzyskanego produktu (Tabela 1). Metoda z użyciem gorącego fenolu, mimo że jest nieco czasochłonna, pozostaje wysoce opłacalna dzięki zastosowaniu powszechnych odczynników laboratoryjnych oraz zdolności do uzyskiwania wysokich wydajności RNA (RNA z Msmeg 60–70 µg i RNA z Mtb 35–45 µg z 3 mL kultury w średniej fazie logarytmicznej), nawet przy niskiej objętości kultury wynoszącej 3 mL i bez użycia zaawansowanego sprzętu do rozbijania kuleczkowego, który jest wykorzystywany w większości metod opublikowanych do tej pory. Czyni to tę metodę szczególnie korzystną dla laboratoriów działających w warunkach ograniczonych zasobów. Wcześniej opublikowane metody ekstrakcji RNA oparte na gorącym fenolu różnią się w kilku kluczowych aspektach. Na przykład Mangan i wsp. wykorzystali M. bovis do ekstrakcji RNA za pomocą metody z gorącym fenolem, raportując wydajność około 20 µg RNA na 109 komórek. Jednakże krytyczne parametry, takie jak objętość kultury i temperatura ekstrakcji, nie zostały jasno określone. Dodatkowo ich metoda obejmuje przemywanie detergentem Divolab-1 przed mechaniczną dezintegracją komórek, przy użyciu odczynnika, który nie jest łatwo dostępny, a następnie ekstrakcję chloroformem i alkoholem izoamylowym11. W innej metodzie z gorącym fenolem RNA ekstrahowano z komórek Mtb, uzyskując około 39 µg całkowitego RNA, co jest wynikiem porównywalnym z opisaną tutaj zoptymalizowaną metodą. Jednak metoda ta wymagała stosunkowo dużej objętości kultury (25 mL), co zwiększało czas przetwarzania i wymuszało użycie większych wirówek. Co więcej, ekstrakcja obejmuje mieszaninę chloroformu i alkoholu izoamylowego, a temperatura ekstrakcji nie została podana12,14. TRIzol jest również powszechnie stosowany w celu uzyskania dobrej wydajności i jakości RNA przy umiarkowanym koszcie15; jednak wydajność była porównawczo niska. Zestaw RNeasy oferuje wyjątkową wygodę i szybkość, co czyni go odpowiednim dla procesów ograniczonych czasowo lub dla mniej doświadczonych użytkowników, ale przy znacznie wyższym koszcie niż w przypadku dwóch pozostałych metod, a wydajność była znacząco niska. Podsumowując, metoda opisana w niniejszej pracy zapewnia elastyczność operacyjną w lizie komórek prątków i późniejszej ekstrakcji RNA. Umożliwia ona użytkownikom wybór najodpowiedniejszej metody w zależności od ich priorytetów, czy są to koszty i wydajność, czy czas przetwarzania, przy zachowaniu porównywalnej jakości i integralności RNA we wszystkich trzech metodach.

Oświadczenia

Autorzy nie stwierdzili żadnych konfliktów interesów. Wszyscy autorzy zatwierdzili przesłanie pracy.

Podziękowania

Pragnę podziękować za wsparcie Departamentu Biotechnologii (DBT), Indyjskiej Rady Badań Medycznych (ICMR) oraz Rady Badań Naukowych i Inżynieryjnych (SERB).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
kuleczki krzemionkowe 0,1 mmMP BiomedicalsPrzeprowadzenie analizy korelacji Pearsona i korelacji Spearmana w programie SPSS W statystyce korelacja służy do mierzenia siły i kierunku liniowego związku między dwiema zmiennymi. Dwie najczęściej stosowane metody obliczania korelacji to współczynnik korelacji Pearsona oraz współczynnik korelacji Spearmana. Współczynnik korelacji Pearsona, znany również jako korelacja produktowo-momentowa, mierzy siłę i kierunek liniowej zależności między dwiema zmiennymi ilościowymi. Wymaga on, aby obie zmienne miały rozkład normalny i żeby zależność między nimi była liniowa. Współczynnik korelacji Spearmana jest nieparametryczną miarą siły i kierunku związku monotonicznego między dwiema zmiennymi. Jest on stosowany, gdy dane nie mają rozkładu normalnego, gdy zmienne są mierzone na skali porządkowej lub gdy zależność między zmiennymi nie jest liniowa. W tym filmie dowiesz się, jak przeprowadzać oba te testy korelacji przy użyciu oprogramowania SPSS. Słowa kluczowe: korelacja, korelacja Pearsona, korelacja Spearmana, SPSS, analiza statystyczna, współczynnik korelacji, analiza danych
2-propanolSigma278475
Bead Ruptor 4 revvity
ChloroformSigma288306
Wirówka chłodzącaThermoScientific42541217
DNaza I Qiagen79254
EDTAsigmaE02SS
HClSRL62889
Blok grzewczyMIULABMU-E02-1049
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o wysokiej wydajności Thermo Fisher Scientific4368814
Zmotoryzowany homogenizator do tkanek G10KoronaG22616008
NaClsigmaS5886
Nanofotometr N50 IMPLEMENTACJAT51601
fenol nasycony buforem cytrytowym 0,1 M o pH 4,5SigmaP4682
PowerUP SYBRApplied BiosystemsA25742
fluorometr Qubit 4 Invitrogen2,32262E+12
Termocykler do PCR w czasie rzeczywistymAnalytik Jena AG844-00503-2
Zestaw RNeasyQiagen74104
SDSSigmaS9888
Octan soduSigmaS2889
termocykler Bio-Rad621BR29739
TRI ReagentSigmaT9424
Tris (zasada)HimediaMB029
β-merkaptoetanolSigma516732

Bibliografia

  1. Global tuberculosis report, 2024. , Available from: https://www.who.int/publications/b/74877 (2024).
  2. Lange, C., et al. Drug-resistant tuberculosis: An update on disease burden, diagnosis and treatment. Respirology. 23 (7), 656-673 (2018).
  3. Tailleux, L., et al. Probing host-pathogen cross-talk by transcriptional profiling of both Mycobacterium tuberculosis and infected human dendritic cells and macrophages. PLoS One. 3 (1), e1403(2008).
  4. Voskuil, M. I., et al. Inhibition of respiration by nitric oxide induces a Mycobacterium tuberculosis dormancy program. J Exp Med. 198 (5), 705-713 (2003).
  5. Zhang, Y., Yew, W. W. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 13 (11), 1320-1330 (2009).
  6. Arnvig, K. B., Young, D. B. Identification of small RNAs in Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 73 (3), 397-408 (2009).
  7. Brennan, P. J., Nikaido, H. The envelope of mycobacteria. Annu Rev Biochem. 64, 29-63 (1995).
  8. Belisle, J. T., Sonnenberg, M. G. Isolation of genomic DNA from mycobacteria. Methods Mol Biol. 101, 31-44 (1998).
  9. Manganelli, R., et al. Role of the extracytoplasmic-function sigma factor σH in Mycobacterium tuberculosis global gene expression. Mol Microbiol. 45 (2), 365-374 (2002).
  10. Rustad, T. R., et al. Global analysis of mRNA stability in Mycobacterium tuberculosis. Nucleic Acids Res. 41 (1), 509-517 (2013).
  11. Mangan, J. A., Sole, K. M., Mitchson, D. A., Butcher, P. D. An effective method of RNA extraction from bacteria refractory to disruption, including mycobacteria. Nucleic Acids Res. 25 (3), 675-676 (1997).
  12. Venkataraman, B., Gupta, N., Gupta, A. A robust and efficient method for the isolation of DNA-free, pure and intact RNA from Mycobacterium tuberculosis. J Microbiol Meth. 93 (3), 198-202 (2013).
  13. Hiebert, R. M., et al. RNA extraction and RNA-sequencing method for transcriptomic analysis of Mycobacterium tuberculosis. Biotechniques. 77 (1), 23-34 (2025).
  14. Kumar, K., Tharad, M., Ganapathy, S., et al. Phenylalanine-rich peptides potently bind ESAT6, a virulence determinant of Mycobacterium tuberculosis, and concurrently affect the pathogen's growth. PLoS One. 4, e7615(2009).
  15. Alli, A. O., et al. Optimization of RNA extraction in Mycobacterium tuberculosis for studying intracellular gene expression. Afr J Clin Exp Microbiol. 10 (2), 64-79 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekstrakcja gor cym fenolemMycobacterium tuberculosisbadania transkryptomiczneintegralno RNAelektroforeza elowaanaliza qPCRpor wnanie z TRIzolpor wnanie z RNeasy
Zoptymalizowana ekstrakcja RNA z prątków z wykorzystaniem gorącego fenolu: solidne podejście zapewniające wiarygodną analizę ekspresji genów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.