$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
To eksperymentalne badanie zostało przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (numer zatwierdzenia: LL-240077).
Hodowla komórkowa i interwencja farmakologiczna
Szczurze komórki Schwanna (SC) hodowano w pożywce Schwanna Cell Balance, składającej się z podłoża podstawowego, 5% płodowej surowicy bydlęcej, 1% suplementu wzrostu komórek Schwanna, 1% penicyliny i 1% streptomycyny. Wszystkie komórki utrzymywano w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Gdy pozwolono im dorastać do zagęszczenia 70-80%, SC podzielono na cztery grupy (n = 5 na grupę): (1) grupa NC; (2) Grupa NC+CoCl2 ; (3) Grupa NC + CoCl2 + Mus; (4) NC + CoCl2 + siIL-1R1 + grupa Mus.
Chlorek kobaltu (CoCl2), często stosowany środek naśladujący hipoksję, jest znany z wywoływania reakcji podobnych do hipoksji, takich jak hamowanie degradacji i stabilizacji czynników indukowanych hipoksją oraz akumulacja HIF-1α białka15. Zgodnie ze zmodyfikowaną metodą opartą na Osuru i wsp.17, w grupie NC+CoCl2 i grupie NC+CoCl2+Mus, SC hodowano w pożywce Schwann Cell Medium uzupełnionej 240 μM CoCl2 przez 8 godzin, w warunkach atmosferycznych 95% powietrza i 5% CO2 w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze (21%O2). Następnie w grupach Mus zastosowano interwencję 1,25 μg/ml Mus przez dodatkowe 24 godziny. Tymczasem w grupie NC+CoCl2+siIL-1R1+Mus SC najpierw leczono 24-godzinnym zakażeniem siRNA, a następnie stale hodowano 240 μM CoCl2 przez 8 godzin, a następnie interwencję 1,25 μg/ml Mus przez dodatkowe 24 godziny, jak w pierwszych grupach. Schemat blokowy procesu eksperymentalnego przedstawiono na rysunku 1.
Test żywotności komórek
Żywotność SC określono przy użyciu odczynnika do oznaczania liczby komórek Cell Count-8 (CCK-8) zgodnie z instrukcjami producenta. Hodowane SC o gęstości 5 × 105 komórek/basenik wysiewano na 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej ze 100 μl kompletnej pożywki wzrostowej w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 . Gdy konfluencja osiągnęła 70-80%, do każdej studzienki dodano 10 μl roztworu CCK-8, a płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Gęstość optyczną (OD) 96-dołkowych płytek zmierzono przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek i obliczono żywotność komórek. Komórki podzielono na cztery grupy: grupa NC, grupa NC+CoCl2 , grupa NC+CoCl2+Mus i grupa NC+CoCl2+siIL-1R1+Mus. Wyniki eksperymentu skorygowano przy użyciu ślepej studzienki (pożywka + roztwór CCK8). Wskaźnik przeżycia komórek = [(grupa eksperymentalna - studnia ślepa)/(grupa NC - studnia ślepa)] × 100%.
transfekcja siRNA
Transfekcję przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta komercyjnego odczynnika do transfekcji in vitro siRNA/miRNA przy użyciu syntetycznych dupleksów siRNA siIL-1R1 (AUAGUCUUGGAUUUUCUCCAA, GGAGAAAAUCCAAGACA) o stężeniu 100 ng/μL przez 24 godziny. Po transfekcji siIL-1R1 ekspresje siIL-1R1 oceniano, wykonując analizę RT-qPCR po 24 godzinach transfekcji18, przy czym należy upewnić się, że skuteczność jest wyższa niż 80%
Test immunoenzymatyczny (ELISA)
Supernatanty po kulturze zebrano i odwirowano w warunkach specyficznych dla danej grupy (2950 g, 20 min, 25 °C). Zewnątrzkomórkowe poziomy IL-1β, TNF-α, ROS i SOD oznaczono za pomocą testu ELISA zgodnie z instrukcjami zestawu. Końcowe odczyty absorbancji przy długości fali 450 nm uzyskano za pomocą czytnika mikropłytek.
Izolacja RNA i ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)
Zgodnie z instrukcjami producenta, całkowite RNA zostało wyekstrahowane z hodowanych komórek za pomocą odczynnika TRizol. Geny docelowe (IL-1β, TNF-α, S-100b, IL-1R1) amplifikowano w 20 μl reakcji mieszania SYBR qPCR przez 40 cykli na urządzeniu do PCR. Normalizacja danych zastosowana β-aktyna, ze swoistością PCR zweryfikowaną za pomocą analizy krzywej topnienia. Metoda 2−ΔΔCt oznaczała ilościowo względną ekspresję z pięciu niezależnych próbek oznaczonych w trzech powtórzeniach. Startery są wymienione w Tabeli 1.
Plama zachodnia
Po zabiegu SC ze wszystkich grup eksperymentalnych inkubowano przez 24 godziny i zebrano. Białko całkowite ekstrahowano za pomocą zestawu do ekstrakcji białka całkowitego. Lizaty białkowe połączono z elektroforezą w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) buforem denaturowanym w temperaturze 98 °C przez 5 minut i rozdzielono (20 μg na pas) na 10-12% żelach poliakryloamidowych SDS. Rozwiązane białka przeniesiono elektroforetycznie do błon z polifluorku winylidenu (PVDF). Błony blokowano 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku przez 60 minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C w objętości 6 ml z następującymi przeciwciałami pierwszorzędowymi: przeciwciało anty-HIF-1α (1:1000), przeciwciało anty-GAPDH (1:1000), przeciwciało anty-IL-1R1 (1:1000), przeciwciało anty-C-JUN (1:1000), przeciwciało anty-GDNF (1:1000), przeciwciało anty-IRAK1 (1:1000), przeciwciało anty-IKK (1:1000), przeciwciało anty-p65 (1:800), przeciwciało anty-p50 (1:900), przeciwciało anty-IκB-α (1:900) i przeciwciało anty-β-aktyny (1:1000). Po umyciu błony sondowano przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP) przez 60 minut w temperaturze 25 °C. Sygnały białkowe wykryto za pomocą Image Studio Digits Ver 4.0. Intensywność pasma określono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ i znormalizowano do ekspresji β-aktyny i GAPDH. Przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty.
Immunofluorescencji
Lokalizacja IL-1R1 w SC została oceniona za Zhao i wsp.19. Zbierz komórki w logarytmicznej fazie wzrostu przez trypsynizację, ponownie zamów je w świeżym, kompletnym pożywce i dokładnie rozcier, aby uzyskać jednolitą zawiesinę jednokomórkową. Wysiewać komórki na płytkach hodowlanych zawierających sterylne szkiełka nakrywkowe. Gdy komórki osiągną pełne zgranie, przepłucz je 1-2 razy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe i utrwal przylegające komórki 4% paraformaldehydem w PBS przez 10 minut, przesiąknij 0,05% Triton X-100 (10 min) i zablokuj 5% kozią surowicą (1 h). W pierwotnej inkubacji zastosowano króliczy przeciwciała przeciw szczurom IL-1R1. Po przemyciu PBS próbki inkubowano z kozimi anty-króliczymi IgG sprzężonymi z FITC przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Dodaj rozpuszczalne w wodzie środki montażowe do szkiełka nakrywkowego w celu montażu. Komórki znakowane immunologicznie zwizualizowano i określono ilościowo za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o długości fali wzbudzenia 492 nm i długości fali emisji 520 nm.
Analiza ultrastruktury
Zgodnie z protokołem19 Zhao i wsp., SC utrwalono w 2,5% aldehydzie glutarowym i utrwalono przez noc w temperaturze 4°C w 1% tetratlenku osmu. Próbki poddano serii dehydratacji etanolem/acetonem. Ultracienkie skrawki (80 nm) wybarwiono octanem uranylu i cytrynianem ołowiu przed badaniem ultrastrukturalnym przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego.
Utylizacja niebezpiecznych odczynników chemicznych
Pożywkę i roztwory zawierające CoCl2 zbiera się do wyznaczonego pojemnika na odpady metali ciężkich. Wszystkie materiały jednorazowego użytku, które miały kontakt z wyżej wymienionymi płynami, w tym końcówki do pipet, probówki wirówkowe i rękawice, są klasyfikowane jako odpady niebezpieczne z metali ciężkich i są przekazywane do licencjonowanej firmy zajmującej się gospodarką odpadami niebezpiecznymi, zatwierdzonej przez odpowiednie władze w celu prawidłowej utylizacji. Wyrzuć odpadowy roztwór paraformaldehydu do specjalnego pojemnika na odpady aldehydowe. Zużyte materiały eksploatacyjne powinny być zbierane jako odpady aldehydowe i przetwarzane przez tę samą licencjonowaną firmę zajmującą się gospodarką odpadami niebezpiecznymi.
Analiza statystyczna
Porównania wielogrupowe analizowano za pomocą jednoczynnikowej ANOVA z testem post-hoc Tukeya w GraphPad Prism 8.0. Istotność statystyczną określono jako P < 0,05. Dane prezentowane są jako średnia ±± odchylenie standardowe (SD).