Precyzyjna mutageneza fagowa za pomocą systemów CRISPR-Cas wspomaganych NgET

Podsumowanie

W tym miejscu przedstawiamy protokół redukcji modyfikacji DNA w bakteriofagach za pomocą enzymu NgRET, umożliwiający skuteczną i pozbawioną blizn mutagenezę CRISPR-Cas. Metoda ta ułatwia inżynierię genetyczną fagów do zastosowań w biotechnologii i terapii fagowej.

Streszczenie

Bakteriofagi, wirusy, które atakują swoich gospodarzy bakteryjnych, mają znaczny potencjał w biotechnologii i medycynie, zwłaszcza w zwalczaniu zakażeń wielolekoopornych. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw infekcji fagowej pozostają w dużej mierze niedostatecznie zbadane. Precyzyjna, specyficzna dla miejsca mutageneza fagów jest potężnym narzędziem do wyjaśniania funkcji genów i interakcji-gospodarz.

Jednak głównym wyzwaniem w mutagenezie genomu fagów jest obecność modyfikacji DNA fagów, które zakłócają konwencjonalne narzędzia do edycji genomu, takie jak CRISPR-Cas.

Chociaż systemy CRISPR-Cas są z powodzeniem stosowane do ukierunkowanej mutagenezy w różnych organizmach, ich skuteczność w mutagenezie fagów jest często ograniczona przez modyfikacje DNA, takie jak glikozylacja cytozyny. Aby pokonać tę barierę, opracowaliśmy skuteczną metodę, która tymczasowo zmniejsza obfitość modyfikacji DNA fagów, umożliwiając skuteczne celowanie w CRISPR-Cas i precyzyjne wprowadzanie mutacji do genomów fagów. W szczególności używamy dioksygenazy metylocytozyny Ten Eleven Translocation (TET) z Naegleria gruberi (NgTET), która iteracyjnie demodyfikuje metylowane i hydroksymetylowane cytozyny w DNA. Poprzez utlenianie hydroksymetylowanych cytozyn w DNA faga, NgTET zapobiega późniejszym modyfikacjom cytozyny, takim jak glikozylacja, i znacznie zwiększa skuteczność rozszczepienia DNA za pośrednictwem Cas.

Podsumowując, przedstawione tutaj bezbliznowe i precyzyjne podejście do edycji genomu umożliwia skuteczne wprowadzanie mutacji punktowych przy jednoczesnym zachowaniu natywnej architektury genów w genomach fagów. Zachowując nienaruszone ramy transkrypcyjne i translacyjne, metoda ta minimalizuje niezamierzone zakłócenia w złożonych sieciach regulacyjnych. Jest to szczególnie ważne dla badań nad niezbędnymi lub wielofunkcyjnymi białkami fagowymi. Możliwość generowania ukierunkowanych modyfikacji genetycznych bez wprowadzania obcych sekwencji znacznie rozszerza eksperymentalny zestaw narzędzi do biologii fagów. Strategia ta nie tylko ułatwia szczegółowe badania funkcjonalne, ale także zwiększa potencjał racjonalnej inżynierii fagów do zastosowań terapeutycznych i biotechnologicznych.

Wprowadzenie

Bakteriofagi to wirusy, które atakują bakterie. Wzbudziły one duże zainteresowanie naukowców ze względu na ich ogromny potencjał w biotechnologii i medycynie, szczególnie w walce z bakteriami wielolekoopornymi ^1,2,3. Mimo to biologia fagów pozostaje stosunkowo słabo zbadana. Głębsze zrozumienie ich molekularnych mechanizmów przejmowania kontroli nad bakteryjnymi gospodarzami jest niezbędne, aby w pełni wykorzystać ich potencjał terapeutyczny i biotechnologiczny⁴. Aby zbadać mechanizmy molekularne leżące u podstaw skutecznego zakażenia fagami, a następnie zmodyfikować fagi pod kątem konkretnych zastosowań, niezbędna jest możliwość genetycznej modyfikacji genomów fagów. Pozostaje jednak jednym z najważniejszych wyzwań w dziedzinie biologii fagów ^3,5,6.

DNA faga jest często modyfikowane przez specyficzne zmiany chemiczne zasad purynowych i pirymidynowych, np. glikozylację cytozyny i metylację. Modyfikacje te chronią materiał genetyczny fagów przed rozpoznaniem i degradacją przez nukleazy gospodarza⁶. Chociaż modyfikacje te mają kluczowe znaczenie dla sprawności fagów, stanowią one istotną przeszkodę dla podejść inżynierii genomu fagów, które opierają się na systemach celowania w DNA ^2,3,7.

Istniejące strategie mutagenezy, w tym systemy modyfikacji restrykcji i technologie oparte na białkach Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) i CRISPR-associated (Cas), stoją przed poważnymi wyzwaniami podczas modyfikacji DNA fagów ze względu na ochronne modyfikacje epigenetyczne, takie jak glikozylacja cytozyny⁸. Edycja genomu za pośrednictwem CRISPR-Cas, która jest wysoce skuteczna w komórkach bakteryjnych i eukariotycznych, opiera się na dwóch kluczowych etapach: precyzyjnym rozszczepieniu DNA w docelowych loci genomu przez nukleazę Cas, a następnie naprawie DNA poprzez rekombinację homologiczną z DNA dawcy niosącym pożądaną mutację¹. Jednak w fagach modyfikacje DNA często uniemożliwiają nukleazy Cas skuteczne wiązanie lub rozszczepianie genomu. Ponadto szybki i przejściowy charakter replikacji fagów może dodatkowo ograniczać skuteczność rekombinacji homologicznej. Bariery te sprawiają, że szczególnie trudno jest zastosować technologię CRISPR-Cas ukierunkowaną na DNA do mutagenezy fagów. Wykazano, że modyfikacje DNA fagów upośledzają celowanie w DNA fagów za pomocą CRISPR-Cas zarówno in vitro, jak i in vivo ^6,7.

Aby sprostać wyzwaniom związanym z ochronnymi modyfikacjami DNA w fagach, wprowadzamy strategię mutagenezy genomu, która wykorzystuje aktywność dioksygenazy metylocytozyny translokacji dziesięciu jedenastu (TET), w szczególności NgTET. U eukariontów enzymy TET katalizują stopniowe utlenianie metylowanej cytozyny poprzez procesy iteracyjne: metylocytozyna (5mdC) jest najpierw przekształcana w hydroksymetylocytozynę (5hmdC), następnie w formylocytozynę (5fdC), a na końcu w karboksycytozynę (5cadC) (Figura 1).

W naszym podejściu do mutagenezy fagowej NgTET jest stosowany w celu tymczasowego zmniejszenia obfitości ochronnych modyfikacji DNA, zwiększając w ten sposób dostępność DNA fagów do narzędzi do edycji genomu, takich jak enzymy Cas⁹. NgTET został wybrany do modulacji genomu bakteriofaga ze względu na wcześniejsze doniesienia o jego udanej ekspresji w aktywnej rozpuszczalnej formie u heterologicznego gospodarza bakteryjnego, w szczególności E. coli. Ta właściwość jest niezbędna, ponieważ NgTET musi pozostać aktywny podczas infekcji fagowej¹⁰.

Rysunek 1: Stopniowe utlenianie 5-metylocytozyny przez dioksygenazę TET¹. Dioksygenaza TET katalizuje sukcesywne utlenianie 5-metylo-2'-deoksycytydyny (5mdC) do 5hmdC, 5-formylo-2'-deoksycytydyny (5fdC) i ostatecznie do 5-karboksylo-2'-deoksycytydyny (5cadC). Produkt końcowy, 5cadC, spontanicznie lub enzymatycznie powraca do niezmodyfikowanej cytozyny (dC), przyczyniając się w ten sposób do dynamicznej regulacji epigenetycznej. Ten wieloetapowy proces ma kluczowe znaczenie dla aktywnej metylacji DNA u eukariontów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ponieważ metylocytozyna i hydroksymetylocytozyna są powszechnymi prekursorami hipermodyfikacji DNA fagów, w tym masywnych struktur ochronnych, takich jak glikozylacje, aktywność oksydacyjna dioksygenazy TET może być wykorzystana do zapobiegania tworzeniu się tych hipermodyfikacji DNA⁹. W tym podejściu do mutagenezy genomu opartym na TET heterologicznie eksprymujemy NgTET rekombinacyjnie w E. coli w celu utlenienia hydroksymetylowanych cytozyn w genomie faga po zakażeniu, zapobiegając w ten sposób tworzeniu się dużej ilości glikozylacji. Zmniejszając obfitość tych masywnych modyfikacji DNA, nasze podejście może zwiększyć dostępność DNA fagów do nukleaz CRISPR-Cas. Ta zwiększona dostępność ułatwia skuteczne rozpoznawanie celów, precyzyjne rozszczepianie DNA i wprowadzanie bezbliznowych mutacji punktowych do genomu faga, odróżniając je od tradycyjnych metod mutagenezy fagowej, które opierają się na delecjach genów, insercjach genów reporterowych lub integracji sztucznych połączeń w celu selekcji mutantów na podstawie PCR ^1,11. Te konwencjonalne strategie były do tej pory jedynymi dostępnymi narzędziami do ukierunkowanej mutagenezy w genomach fagów i dlatego stanowią ważną podstawę dla przedstawionej tutaj metody. Jednak białka jednofagowe mogą pełnić wiele funkcji. Delecja całego genu kodującego białko będące przedmiotem zainteresowania zakłóca wszystkie związane z tym funkcje. Natomiast celowe wprowadzanie mutacji punktowych pozwala na selektywną inaktywację określonych funkcji, umożliwiając szczegółową analizę ich ról. Do tej pory funkcje wielu białek fagowych pozostają w dużej mierze niescharakteryzowane; W ten sposób możemy przeoczyć dodatkowe działania związane z danym genem. Dlatego preferowane jest minimalistyczne podejście, które ma na celu usunięcie tylko jednej funkcji przy jednoczesnym spowodowaniu minimalnych zmian w całym białku^12,13. Opisana tutaj metoda umożliwia precyzyjne modyfikacje genetyczne bez zakłócania ogólnej organizacji lub funkcji genomu. Innym poważnym wyzwaniem związanym z poprzednimi metodami mutagenezy fagowej była ich niska skuteczność, która zazwyczaj prowadziła do tempa mutacji wynoszącego około 0,1%^1,11. Dzięki tej technice przedstawiamy pierwszą strategię mutagenezy, która jest w stanie wprowadzić zmiany w pojedynczym kodonie, osiągając zauważalny siedmiokrotny wzrost skuteczności celowania. Dzięki połączeniu z wysokoprzepustową metodą przesiewową opartą na ONT, wykrywanie mutacji punktowych jest uproszczone, eliminując potrzebę badań przesiewowych dużych populacji fagów w celu wyizolowania jednego mutanta. Opisana tutaj strategia mutagenezy opartej na TET rozwiązuje długotrwałe ograniczenie w tej dziedzinie i umożliwia bardziej wiarygodną edycję genomu¹⁴.

Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta może być stosowana nie tylko do pogłębienia naszej wiedzy na temat mechanizmów infekcji bakteriofagowych, ale jest również bardzo obiecująca dla biologii syntetycznej. Umożliwiając precyzyjną i wydajną inżynierię genomu fagów, toruje drogę do dostosowania fagów do konkretnych zastosowań, zwiększając w ten sposób ich potencjał w zastosowaniach biotechnologicznych i medycznych.

Protokół

Schemat przedstawiający wytwarzanie faga T4 poddanego działaniu NgTET przedstawiono na rysunku 2.

Rysunek 2: Schematyczny przegląd ustalonego przepływu pracy dla mutagenezy fagów T4 i badań przesiewowych mutantów. Przepływ pracy obejmuje generowanie hipomodyfikowanego faga T4 za pomocą NgTET, który można zwalidować za pomocą analizy LC-MS lub alternatywnie za pomocą testu rozszczepienia CRISPR-Cas. Następnie mutacja, która jest przedmiotem zainteresowania, jest wprowadzana do genomu faga poprzez mutagenezę ukierunkowaną za pośrednictwem CRISPR-Cas i identyfikowana przez kontrselekcję. Obecność pożądanej mutacji można następnie potwierdzić za pomocą sekwencjonowania Nanopore. Po walidacji zmutowany może być rozmnażany w celu przywrócenia hipermodyfikacji DNA. Umożliwia to wykorzystanie zmodyfikowanego faga w dalszych zastosowaniach, w tym w analizie fenotypów infekcji za pomocą testów lizy i pomiarów wielkości serii. Każdy krok na rysunku jest opatrzony odpowiednim numerem protokołu w nawiasach, aby ułatwić powiązanie kroków protokołu z odpowiednimi częściami rysunku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Zmniejszenie modyfikacji DNA fagów za pomocą wstępnego leczenia NgTET (~2 dni)

UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla umożliwienia skutecznego celowania w nukleazę Cas podczas mutagenezy poprzez zmniejszenie obfitości modyfikacji DNA fagów.

1. Zaszczepić szczep E. coli BL21 (DE3) przekształcony za pomocą pET28a_NgTET, przenosząc materiał z zapasu glicerolu do 10 ml pożywki LB uzupełnionej 30 μg/ml kanamycyny. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 160 obr./min.
2. Następnego dnia użyj kultury przez noc, aby zaszczepić główną kulturę do początkowego OD₆₀₀ 0,1 w 50 ml pożywki LB zawierającej 30 μg/ml kanamycyny. Wyindukować kulturę za pomocą 50 μM IPTG, gdy zostanie osiągnięty OD₆₀₀ 0,4.
3. Hodować kulturę w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 160 obr./min, aż osiągnie OD₆₀₀ równą 0,8.
4. Zainfekować kulturę interesującym fagiem przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 0,1 i inkubować przez 4 godziny w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przy 120 obr./min.
5. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
6. Przepuść supernatant przez filtr 0,45 μm, aby uzyskać fagi potraktowane NgTET z hipomodyfikowanym DNA. Przefiltrowane fagi należy przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.
   UWAGA: (PUNKT PAUZY) Przefiltrowane fagi są stabilne przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C, przechowywane w pożywce LB w szklanej butelce.

2. Walidacja

UWAGA: Celem tego etapu jest eksperymentalne zweryfikowanie zmniejszonej obfitości modyfikacji DNA fagów.

1. Walidacja leczenia za pomocą LC-MS (~ 2 dni)
   1. Oczyszczanie fagów za pomocą gradientu sacharozy
      1. Aby usunąć resztki kwasu nukleinowego z lizatu, należy potraktować 500 μl zawiesiny fagowej (>^{10 10} PFU/ml) 20 U DNazy I i 2 μl mieszaniny RNazy A/T1 (4 μg RNazy A, 10 U RNazy T1).
      2. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
      3. Przygotować gradient sacharozy 0-45% w buforze TM (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, pH 7,5). Przygotuj gradient za pomocą miksera gradientów lub ręcznie.
         UWAGA: W przypadku przygotowania ręcznego należy rozpocząć od odpipetowania 5 ml buforu TM do probówki gradientowej. Następnie, za pomocą kaniuli z końcem, powoli odpipetuj 5 ml 45% roztworu sacharozy z dna probówki, pozwalając, aby 0% roztwór stopniowo się unosił.
      4. Załaduj 500 μl roztworu fagowego poddanego działaniu substancji na wierzch gradientu.
      5. Wirować przy 70 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
      6. Zapal probówkę wirówkową od dołu. Pozwoli to na wizualizację faga, który pojawia się jako mętne pasmo w gradiencie. Ostrożnie usuń frakcję zawierającą fagi za pomocą kaniuli.
      7. Przenieś wyekstrahowaną frakcję fagową do nowej probówki do ultrawirówki.
      8. Dodać 30 ml lodowatego buforu TM i odwirować w temperaturze 100 000 × g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
      9. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu TM.
      10. Zawiesinę fagów należy przechowywać przez noc w szklanej fiolce w temperaturze 4 °C.
   2. Izolacja DNA fagowego
      1. Dodać 1 μg proteinazy K do zawieszonych fagów.
      2. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
      3. Dodać 1 objętość mieszaniny fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (P/C/I). Wymieszaj przez odwrócenie. Rozdzielić fazy przez odwirowanie przy 15 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Przenieść fazę wodną do nowej probówki reakcyjnej. Powtórz ekstrakcję trzy razy.
         UWAGA: Fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (P/C/I) jest wysoce toksyczny, i lotny. Zawsze należy obchodzić się z nim pod wyciągiem, nosząc odpowiedni sprzęt ochronny, w tym fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i podwójne rękawice nitrylowe. Unikaj kontaktu ze skórą i oczami i przechowuj w szczelnie zamkniętym pojemniku w przeznaczonej do tego szafce chemicznej. Odpady należy utylizować za pośrednictwem zatwierdzonych kanałów odpadów niebezpiecznych. W przypadku kontaktu natychmiast spłukać wodą i zasięgnąć porady lekarza.
      4. Aby usunąć resztki fenolu, należy wykonać trzykrotną ekstrakcję wsteczną chloroformu z 1 objętością chloroformu.
      5. Wytrącić DNA przez noc z 0,1 objętości 3 M NaOAc (pH 5,5) i 2,5 objętości etanolu w temperaturze -20 °C.
      6. Następnego dnia otopić DNA przez odwirowanie w temperaturze 15 000 × g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
      7. Przepłukać osad DNA dwukrotnie 200 μl 70% etanolu, delikatnie wstrząsając, odwirować w stężeniu 15 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie usuwając sklarowany osad.
      8. Ponownie zawiesić oczyszczone DNA w ultraczystej wodzie.
      9. DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
         UWAGA: (PUNKT PAUZY) Wytrącone DNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
   3. Przygotowanie DNA fagowego do analizy LC-MS
      1. Trawić oczyszczone DNA na pojedyncze nukleozydy za pomocą mieszanki do trawienia nukleozydów.
      2. Analiza składu DNA za pomocą LC-MS.
         UWAGA: Ten krok pozwala na walidację skuteczności leczenia NgRET. Protokół jest dostosowany do konkretnego sprzętu i kolumny dostępnej w laboratorium, ale może być dostosowany w zależności od dostępnych zasobów i warunków.
      3. Użyć strawionego DNA wyizolowanego z oczyszczonego faga (krok 2.1.10).
      4. Uwzględnij następujące dostępne na rynku wzorce pomiarów: dA, dT, dG, dC, 5hmdC, 5fdC, 5cadC. Jeśli to możliwe, należy podać standard hipermodyfikacji cytozyny obecny w DNA faga.
      5. Użyj systemu HPLC wyposażonego w kolumnę C18 (150 × 2,1 mm, 100 A, 3 μm) i kolumnę ochronną 20 × 2,1 mm.
      6. Ustawić temperaturę kolumny na 40 °C, a natężenie przepływu eluentu na 0,2 ml/min.
      7. Przygotować eluenty w następujący sposób:
         Eluent A: 10 mM octan amonu w wodzie (pH 4,5).
         Eluent B: 0,1% kwas mrówkowy w metanolu.
         UWAGA: 0,1% kwas mrówkowy w metanolu jest łatwopalny i może podrażniać skórę, oczy i drogi oddechowe. Zawsze używaj w dobrze wentylowanym pomieszczeniu lub dygestorium. Nosić odpowiedni sprzęt ochronny, w tym fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe. Przechowywać z dala od źródeł ciepła, iskier i otwartego ognia. Przechowywać w łatwopalnej szafce do przechowywania. Utylizację należy przeprowadzić zgodnie z zatwierdzonymi protokołami dotyczącymi odpadów niebezpiecznych.
      8. Zastosuj następujący profil fazy ruchomej: 0-1 min: Stała przy 5% B; 1-5 min: Nachylenie od 5% do 90% B; 5-7 min: Stała przy 90% B; 7-7,1 min: Nachylenie od 90% do 5% B; 7,1-12 min: Stała przy 5% B.
      9. Użyć spektrometru mas w trybie jonizacji ujemnej i dodatniej (oddzielne wtryski) ze źródłem wysokotemperaturowej jonizacji elektronrozpylającej (H-ESI) w następujących warunkach:
         Napięcie rozpylania H-ESI: 3400 V (+), 2400 V (-), Gaz osłonowy: 35 jednostek dowolnych, Gaz pomocniczy: 7 jednostek dowolnych, Gaz przemiatający: 0 jednostek dowolnych, Temperatura rurki jonowej: 300 °C, Temperatura parownika: 275 °C, Tryb wykrywania: Pełne skanowanie za pomocą analizatora masy Orbitrap, Rozdzielczość masy: 120 000, Zakres masy: 200-450 (m/z).
      10. Ekstrahować chromatogramy jonowe form [M-H]^- (dA, dT, dC, 5hmdC, 5fdC, 5cadC) i [M+H]⁺ (5ghmdC) za pomocą oprogramowania Tracefinder.
      11. Oblicz względną obfitość każdej modyfikacji, normalizując obszar piku każdego sygnału do obszaru piku dG w próbce, używając dG jako wzorca wewnętrznego specyficznego dla próbki.
2. Walidacja za pomocą testu rozszczepienia CRISPR-Cas (~2,5 dnia)
   UWAGA: Ten krok umożliwia fenotypową ocenę sukcesu leczenia NgTET i jego wpływu na rozszczepienie CRISPR-Cas. Jeśli NgTET jest aktywny, z traktowanego DNA faga nie powinny tworzyć się blaszki blaszkowe lub miano faga powinno zostać zmniejszone, ponieważ usunięcie ochronnych modyfikacji DNA sprawia, że genom jest podatny na rozszczepienie CRISPR-Cas12 lub 9. W przeciwieństwie do tego, jeśli DNA faga nie jest leczone, liczba utworzonych blaszek będzie odpowiadać mianu fagów, co wskazuje, że hiperzmodyfikowany genom faga T4 jest odporny na rozszczepienie CRISPR-Cas12 lub 9.
   1. Inokulować E. coli BL21 (DE3) z hodowli nocnej, przekształconej zarówno plazmidem pET28a_NgTET, jak i plazmidem o ekspresji Cas12 lub Cas9 (np. DS-spCas lub pCpf1 bez przekładki). Wszystkie plazmidy wraz z dodatkowymi informacjami znajdują się w Tabeli 1.
      1. Hodować komórki na pożywce LB uzupełnionej odpowiednimi antybiotykami w temperaturze 3 °C z wytrząsaniem, zaczynając od OD₆₀₀ 0,1. Gdy hodowla osiągnie OD₆₀₀ około 0,4, indukować ekspresję NgTET przez dodanie 0,05 mM IPTG i inkubować przez dodatkowe 2 godziny w temperaturze 3 °C.
      2. Jako kontrolę porównaj szczepy E. coli BL21 (DE3) z nadekspresją NgTET i bez niej. W przypadku braku aktywności NgTET oczekuje się większej liczby jednostek tworzących płytki nazębne, co wskazuje na zmniejszoną wydajność CRISPR-Cas ze względu na obecność glikozylowanego 5ghmdC w DNA faga.
   2. Przenieść 300 μl kultur E. coli do sterylnej probówki.
   3. Zainfekuj kulturę fagiem potraktowanym T4 WT lub NgTET za pomocą MOI 0,01. W tym eksperymencie zastosuj niski MOI, aby upewnić się, że bakterie są zakażone tylko przez jednego faga na raz. Maksymalizuje to wydajność badania przesiewowego rozszczepienia CRISPR-Cas i upraszcza interpretację wyników. Delikatnie wymieszaj, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie fagów.
   4. Inkubować zawiesinę bakterio-fagową w temperaturze 37 °C przez 7 minut.
   5. Dodaj mieszaninę bakterii i fagów do 4 ml miękkiego agaru LB (0,75%) uzupełnionego antybiotykami. Wymieszaj dokładnie, ale delikatnie, aby uniknąć wprowadzania bąbelków.
   6. Wlej miękką mieszankę agaru na wstępnie podgrzaną płytkę agarową LB.
   7. Pozwól płytkom na chwilę zastygnąć w temperaturze pokojowej. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
   8. Następnego dnia policz powstałe płytki, aby określić jednostki tworzące płytki nazębne (PFU).

3. Mutageneza CRISPR-Cas (~ 1 tydzień)

UWAGA: Mutageneza CRISPR-Cas opiera się na zasadzie, że określone miejsce w genomie faga jest celem nukleazy Cas podczas infekcji fagowej, co powoduje pęknięcie podwójnej nici. Przerwa ta jest naprawiana przez rekombinację homologiczną przy użyciu DNA dawcy, które jest dostarczane na drugi plazmid obecny w zakażonym szczepie gospodarza podczas mutagenezy. Plazmid, który zawiera DNA dawcy, koduje również NgTET, który jest niezbędny do utrzymania dostępności DNA faga dla nukleazy Cas poprzez zmniejszenie obfitości zmodyfikowanych cytozyn, jak opisano wcześniej. Na tym etapie mutacje docelowe są wprowadzane do genomu fagów T4 traktowanych NgTET po zakażeniu E. coli¹⁵. Aby zapewnić niezmiennie niski poziom modyfikacji DNA w genomie T4, dioksygenaza NgTET ulega ekspresji przez dodanie 50 μM IPTG (analogicznie do kroku 1.2) w całym procesie mutagenezy.

1. Generowanie plazmidów DNA pET28a_NgTET_donor metodą klonowania Golden Gate¹⁵
   1. Aby wygenerować DNA dawcy, należy uporządkować żądaną sekwencję jako cały gen lub amplifikować z genomu, na przykład z genomu faga, i wprowadzić pożądaną mutację.
      UWAGA: W przypadku projektowania DNA dawcy należy uwzględnić homologiczne regiony flankujące miejsce docelowe (≈200 pz z każdej strony w przypadku mutacji punktowych; dłuższe regiony w przypadku większych wstawek). Liniowy fragment dawcy powinien zawierać miejsca rozpoznawania BsaI, które generują zgodne zwisy z plazmidem po rozszczepieniu. Zaleca się klonowanie in silico w celu weryfikacji projektu konstrukcji. W reprezentatywnych wynikach zilustrowano na przykładzie wszystkie kluczowe składniki DNA dawcy.
   2. Wprowadź fragment DNA dawcy poniżej sekwencji kodującej NgTET i terminatora do pET28a_NgTET szkieletu za pomocą montażu Golden Gate.
      1. Przygotować reakcje składania, łącząc 70 fmol plazmidu pET28a_NgTET, 140 fmol insercji DNA dawcy, 1 μl BsaI (20 U/μL), 5 U ligazy DNA T4 i 2 μL 10× buforu ligazy, z wodą wolną od nukleaz dodaną do końcowej objętości 20 μl.
      2. Przeprowadzaj reakcje w 25 cyklach w PCR-cyklerze z następującymi ustawieniami: 1) Ograniczenie, 37 °C przez 1,5 min, 2) Podwiązanie, 16 °C przez 3 min, 3) Końcowe ograniczenie, 37 °C przez 5 min i 4) Denaturacja, 60 °C przez 10 min.
   3. Dodać 6 μl mieszaniny reakcyjnej (z kroku 3.1.2) do 100 μl chemicznie kompetentnej E. coli DH5α, inkubować na lodzie przez 10 minut i szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 45 s. Natychmiast umieść komórki na lodzie na 1 minutę, a następnie dodaj 750 μl LB podłoża. Odzyskiwać w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (500 obr./min) przez 1 godzinę. Płytkę na agarze LB zawierającym kanamycynę (30 μg/ml) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
   4. Wybierz pojedynczą kolonię i zaszczep 20 ml pożywki LB uzupełnionej kanamycyną (30 μg/ml). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 160 obr./min.
   5. Z 5 ml nocnej hodowli osadzać komórki i izolować plazmidowe DNA przy użyciu standardowej metody ekstrakcji plazmidu. Eluować plazmid w 40 μl wody wolnej od nukleaz.
   6. Potwierdź poprawność klonowania, sekwencjonując miejsce insercji plazmidu za pomocą sekwencjonowania Sangera.
2. Budowa plazmidów CRISPR-Cas zawierających przekładki (pCpf1-sp jako model)¹⁵
   UWAGA: Plazmid opisany w tym rozdziale umożliwia pierwszy etap mutagenezy poprzez wprowadzenie specyficznego dla miejsca pęknięcia podwójnej nici w genomie faga. Chociaż procedura jest tutaj pokazana za pomocą systemu CRISPR-Cas12 (plazmid pCpfl-sp), można również zastosować alternatywne nukleazy, takie jak CRISPR-Cas9 (plazmid DS-spCas)¹⁵ .
   1. Zaprojektuj dystans 20-nt ukierunkowany na miejsce mutagenezy (PAM: TTTV). Zidentyfikuj i zaprojektuj odpowiednie protoprzekładki i odpowiadające im ramki dystansowe za pomocą narzędzi bioinformatycznych.
   2. Zsyntetyzuj dwa 5′-fosforylowane oligonukleotydy. Upewnij się, że każdy z nich zawiera 10 nt pożądanej sekwencji dystansowej (razem tworzące pełną przekładkę 20 nt) i dodatkowy obszar 10 nt komplementarny do miejsca insercji w plazmidzie pCpf1-sp.
   3. Włóż zaprojektowaną przekładkę CRISPR-Cas do plazmidu pCpf1-sp przez amplifikację PCR przy użyciu starterów z kroku 2. Ustawić reakcję w następujący sposób (objętość końcowa 50 μL): 5 μL 10× buforu GC, 1 μL 10 mM dNTPs, 1 μL startera do przodu (10 μM), 1 μL startera odwrotnego (10 μM), 2,5 μL DMSO, matryca plazmidowa odpowiadająca 2 fmol, 1 μL polimerazy DNA Phusion (2 U/μL), i wody wolnej od nukleaz do 50 μl.
   4. Umieścić probówki reakcyjne w termocyklerze i uruchomić następujący program: wstępna denaturacja w temperaturze 98 °C przez 30 s; 25 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 s, wyżarzanie w odpowiedniej temperaturze (X °C) przez 30 s i przedłużanie w temperaturze 72 °C przez 6 minut; następnie końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 minut. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego przetwarzania.
   5. Wymieszać 5 μl reakcji PCR z buforem ładującym DNA (10×) i obciążyć 1% żelem agarozowym. Uruchom żel pod napięciem 130 V przez 20 minut i uwidocznij prążki DNA za pomocą oświetlenia UV trans. Jeśli amplifikacja się powiedzie, oczyść produkt PCR za pomocą odpowiedniego zestawu do czyszczenia i eluuj w 20 μl wody wolnej od nukleaz.
   6. Cyrkularyzować plazmid przez ligację przy użyciu 100 ng amplifikowanego produktu zmieszanego z 1× buforem ligazy DNA T4 i 60 ligazą DNA T4 w całkowitej objętości reakcji 15 μl. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przekształć 100 μl chemicznie kompetentnej bakterii E. coli za pomocą produktu ligacji, jak opisano w kroku 3.1.3. Umieścić komórki na agarze LB zawierającym 50 μg/ml streptomycyny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
   7. Wybierz pojedynczą kolonię z płytki i zaszczep ją w 20 ml pożywki LB uzupełnionej 50 μg/ml streptomycyny. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 160 obr./min. Z 5 ml nocnej hodowli zebrać komórki przez odwirowanie i wyizolować plazmidowe DNA za pomocą wybranej metody ekstrakcji plazmidowej. Eluować plazmid w 40 μl wody wolnej od nukleaz.
   8. Potwierdź pomyślne klonowanie, sekwencjonując plazmid w miejscu insercji za pomocą sekwencjonowania Sangera.
3. Mutageneza fagowa
   1. Przekształć komórki E. coli BL21 (DE3) za pomocą dwóch plazmidów: pET28a_NgTET_donor-DNA i dystansu pCpf1-sp (Cas12)/DS-SPcas (Cas9) (wygenerowanych w krokach 3.1 i 3.2). Zmieszać 1 μl każdego plazmidu ze 100 μl chemicznie kompetentnego E. coli BL21 (DE3). Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w kroku 3.1.3. Ułożyć przekształcone komórki na agarze zawierającym 50 μg/ml streptomycyny i 30 μg/ml kanamycyny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
   2. Zaszczepić przekształcony szczep E. coli (E. coli BL21 (DE3) pET28a_NgTET_donor-DNA i pCpf1-sp(Cas12)/DS-SPcas(Cas9)_spacer) w 10 ml pożywki LB uzupełnionej 30 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml streptomycyny. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 160 obr./min.
   3. Następnego dnia rozcieńczyć nocną hodowlę do początkowego OD₆₀₀ 0,1 w 50 ml pożywki LB zawierającej 30 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml streptomycyny.
   4. Hodować kulturę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 160 obr./min, aż do osiągnięcia OD₆₀₀ 0,8. Obniż temperaturę do temperatury pokojowej (RT) i zmniejsz prędkość mieszania do 130 obr./min.
      1. Aby zwiększyć adsorpcję fagów i wstrzyknięcie DNA, dodaj MgCl₂ i CaCl₂ do końcowych stężeń 1 mM każdy, ponieważ te dwuwartościowe kationy ułatwiają skuteczne interakcje-gospodarz.
      2. Zakażon kulturę fagami T4 poddanymi działaniu NgTET i jako kontrola negatywna fagami T4 nietraktowanymi NgTET przy MOI 0,1. Kontynuować inkubację w temperaturze pokojowej przez 4 godziny.
   5. Po inkubacji przenieść kultury do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 4000 × g w temperaturze 4 °C przez 20 minut w celu osadzenia komórek. Przefiltruj supernatanty przez filtr 0,45 μm, aby usunąć wszelkie pozostałości komórek bakteryjnych. Filtrowane supernatanty należy stosować do oznaczania płytek nazębnych (opisanych w kroku 2.2) w celu określenia stężenia fagów lub przeprowadzenia kontrselekcji.

4. Identyfikacja mutantów

UWAGA: Celem kontrselekcji jest zmniejszenie odsetka fagów typu dzikiego pozostających w populacji po mutagenezie. W tym celu fagi uzyskane z etapu mutagenezy (etap 3.3) wykorzystuje się do zakażenia E. coli przenoszących ten sam system CRISPR-Cas13, który jest kodowany przez inny plazmid pBA560 (dodatkowe informacje w Tabeli 1) i tę samą sekwencję dystansową zastosowaną podczas mutagenezy. W tej konfiguracji nukleazy Cas selektywnie rozpoznają i rozszczepiają DNA fagów typu dzikiego, podczas gdy fagi niosące pożądane mutacje pozostają nienaruszone. To selektywne ciśnienie hamuje replikację typu dzikiego i wzbogaca populację o zmutowane fagi¹⁴.

1. Kontrselekcja z Cas13
   1. Zakażony Cas13a_spacer E. coli (plazmid pBA560) za pomocą fagów w celu kontrselekcji. Ten etap ułatwia kontrselekcję poprzez degradację RNA faga, które nie przeszło zamierzonej mutacji.
   2. Przeprowadzić kontrselekcję w tych samych warunkach, które są stosowane podczas mutagenezy (zob. kroki 3.3.1-3.3.5). Użyj E. coli wyrażającej niedocelową przekładkę Cas13a jako kontrolę negatywną, aby potwierdzić, że redukcja płytki nazębnej jest specyficzna dla przekładki.
   3. Po inkubacji przefiltruj supernatant zawierający przeciwwybrane fagi przez filtr 0,45 μm w celu usunięcia resztek bakteryjnych.
      UWAGA: (PUNKT PAUZY) Przefiltrowane fagi są stabilne przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C, przechowywane w pożywce LB w szklanej butelce.
   4. Użyj przeciwselekcjonowanych i przefiltrowanych fagów do testu płytkiowego na szczepie E. coli B, aby wyizolować poszczególne płytki do dalszej walidacji.
2. Sekwencjonowanie nowej generacji (~ 1 tydzień)
   UWAGA: Metoda wysoce zwielokrotnionego sekwencjonowania obejmuje dwuetapowy proces PCR w celu wygenerowania multipleksowanego amplikonowego DNA odpowiedniego do sekwencjonowania nowej generacji z długim odczytem¹⁶.
   1. Oddzielić fagi od mutagenezy, posiewając je zgodnie z opisem w kroku 2.2. Uwzględnij odpowiednie kontrole przy użyciu fagów uzyskanych z mutagenezy przeprowadzanej zarówno w obecności, jak i przy braku ekspresji NgRET. Jako kontrola, celowanie w CRISPR-Cas9 i Cas12 bez NgTET nie powinno skutkować wprowadzeniem mutacji punktowych. Oczekuje się natomiast, że koekspresja NgTET umożliwi pomyślną edycję, prowadząc do wyższej wydajności mutagenezy.
   2. Aby wyizolować pojedyncze fagi, należy pobrać pojedyncze blaszki z płytki i przenieść je do probówki zawierającej 100 μl buforu Pi-Mg (26 mM Na₂PHO₄, 68 mM NaCl, 22 mM KH₂PO₄, 1 mM_MgSO4, pH 7,5) i 1 μL CHCl₃.
      UWAGA: Chloroform jest toksyczny, lotny i podejrzewa się, że jest rakotwórczy, nawet w małych ilościach. Używaj tylko w dygestoriach i noś pełne wyposażenie ochronne, w tym fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe. Unikać wdychania i kontaktu ze skórą. Przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku w wentylowanej, łatwopalnej szafce chemicznej. Odpady chloroformowe należy utylizować poprzez zbiórkę odpadów niebezpiecznych.
   3. Użyć 1 μl wyizolowanego faga T4 w buforze Pi-Mg jako matrycy do badań przesiewowych.
   4. Przygotować mieszaninę reakcyjną z 0,125 μM każdego startera (wokół pozycji wtrącenia) i 1x główną mieszanką polimerazy o wysokiej dokładności, dostosowując całkowitą objętość reakcji amplifikacji do 10 μl. Przeprowadzić reakcję PCR z 30 cyklami amplifikacji.
   5. Wykonaj drugi PCR, aby dołączyć kody kreskowe. W związku z tym jako matrycę należy użyć 1 μl produktu o rozcieńczeniu 1:10 z pierwszego testu PCR.
   6. Przygotować mieszaninę reakcyjną ze starterami do kodowania kreskowego 0,3 μM i wysokiej jakości mieszanką polimerazy gorącego startu w łącznej objętości 7 μl. Wykonać PCR z 20 cyklami amplifikacji.
      UWAGA: (punkt pauzy) Produkty PCR można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.
   7. Zbierz wszystkie produkty PCR z kodami kreskowymi i oczyść je za pomocą czyszczenia opartego na kulkach magnetycznych zgodnie ze standardowymi protokołami w celu przygotowania biblioteki sekwencjonowania nowej generacji.
   8. Uchwycić DNA za pomocą kulek magnetycznych, przemyć dwukrotnie 80% etanolem i wymyć w 100 μl buforu elucyjnego (5 mM Tris-HCl, pH 8,5).
   9. Zmierzyć stężenie DNA za pomocą metod spektrofotometrycznych i fluorometrycznych, stosując odpowiednio test o szerokim zakresie lub wysokiej czułości.
      UWAGA: (Punkt pauzy) DNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.
   10. Generuj biblioteki sekwencjonowania przy użyciu protokołu opartego na ligacji zgodnie z instrukcjami producenta, zaczynając od 1 μg wejściowego DNA.

5. Rozmnażanie mutantów, odzyskiwanie modyfikacji DNA i dowód

UWAGA: Po zidentyfikowaniu pożądanego mutanta fagowego, jest on rozmnażany w E. coli typu dzikiego w celu przywrócenia poziomów modyfikacji DNA podobnych do tych z faga WT. Gwarantuje to, że zmutowany może być wykorzystany w kolejnych eksperymentach biologicznych bez żadnych kompromisów, poza wprowadzoną mutacją.

1. Przygotować 10 ml kultury szczepu E. coli B w pożywce LB i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 160 obr./min.
2. Następnego dnia zaszczepić świeżą pożywkę o pojemności 50 ml LB z nocną kulturą, aby osiągnąć początkowy OD₆₀₀ 0,1.
3. Pozwolić kulturze rosnąć w temperaturze 37 °C, wytrząsając ją z prędkością 160 obr./min, aż osiągnie OD₆₀₀ równe 0,8.
4. Dodać 50 μl zmutowanego zasobu fagowego (4.2.2) do hodowli. Ostrożnie usuń fazę, aby uniknąć przeniesienia CHCl₃.
5. Inkubuj zainfekowaną kulturę przez noc w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając przy 120 obr./min.
6. Po inkubacji odwirować kulturę przy 4000 × g w celu usunięcia komórek bakteryjnych. Przefiltrować supernatant przez filtr 0,45 μm, aby zebrać faga.
7. Przefiltrowany zmutowany przenieść do szklanego pojemnika i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
   UWAGA: (PUNKT PAUZY) Przefiltrowane fagi są stabilne przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C, przechowywane w pożywce LB w szklanej butelce.
8. Jako opcjonalną walidację regeneracji modyfikacji DNA, w szczególności cytozyn glikozylowanych, należy przeprowadzić analizę LC-MS zgodnie z opisem w kroku 2.1.
   1. W tym celu należy oczyścić odzyskane DNA faga z potomstwa faga, jak opisano w kroku 2.1.1, wyizolować jak w kroku 2.1.2, a następnie przygotować do analizy LC-MS, jak opisano w kroku 2.1.3.
   2. Przeanalizować chromatogramy jonowe i obliczyć względną obfitość każdej modyfikacji, normalizując obszar piku każdego sygnału do obszaru piku dG w próbce, używając dG jako wzorca wewnętrznego specyficznego dla próbki, jak opisano w krokach 2.1.3.
      UWAGA: Zaleca się włączenie faga typu dzikiego T4, faga T4 traktowanego NgTET i faga T4 traktowanego nieaktywnym wariantem NgTET D234A jako kontroli, w celu bezpośredniej walidacji i porównania obfitości 5ghmdC¹⁰.

Wyniki

Identyfikacja pasma faga w gradiencie.
Widoczność pasma faga w gradiencie zależy od stężenia faga w początkowej próbce załadowanej na gradient. Gdy jest wystarczająco skoncentrowany (~>1 × 10¹¹ PFU/ml), pasmo można wyraźnie zobaczyć, oświetlając gradient od dołu źródłem światła (patrz rysunek 3).

Jednak przy niskich stężeniach fagów pasmo może nie być łatwo widoczne. W takim przypadku zalecamy powtórzenie próby wizualizacji poprze...

Dyskusja

Badanie to przedstawia solidną i elastyczną strategię wprowadzania precyzyjnych mutacji punktowych do genomów bakteriofagów, w tym zmian pojedynczych nukleotydów. Centralnym elementem przepływu pracy jest integracja rygorystycznych etapów walidacji na każdym etapie, co ma zasadnicze znaczenie dla zapewnienia zarówno dokładności, jak i wydajności edycji genomu. Jest to szczególnie istotne, biorąc pod uwagę wieloetapowy charakter przepływu pracy i dynamiczne interakcje między fagami a ich gospodarzami bakteryjnymi, które w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki reakcyjne 1,5 ml	Sarstedt powiedział:	72.690.001
Probówki kanocjalne 15 ml	Sarstedt powiedział:	62.554.502
Cienkościenne rurki polipropylenowe o pojemności 15 ml	Beckman Coulter Nauki Przyrodnicze	361706	16 mm x 95 mm (do ultrawirowania)
Probówki kanoniczne 50 ml	Sarstedt powiedział:	62.547.254
5x bufor GC	Thermo Fisher Naukowy	F519L
6x Barwnik ładujący DNA TriTrack	Thermo Fisher Naukowy	Czynnik R1161
Agarozy	Meridian BIOLOGIA	BIO-41025 powiedział:	Klasa molekularna
Wirówka Avanti J-30I	Beckman Coulter Nauki Przyrodnicze	Brak katalogu  numer	Serien-Nr. JKY14M01, https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe
Kwas borowy	Merck	10043-35-3
BsaI-HF v2	NEB	Czynnik chłodniczy R3733S
Heksahydrat chlorku wapnia	ACROS ORGANICS	7774-34-7	97 %, ekstra czysty
Miernik gęstości komórek	Harvard Biochrom	80211630
ChemiDoc MP	Biorad	12003154
Chloroform	Firma VWR	650498
Kuwety	Sarstedt powiedział:	67.742
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma Aldrich	Zobacz materiał D4540
Wodorofosforan di-sodowy	neoFroxx GmbH	7558-79-4	Klasa farmaceutyczna
Jednorazowe szklane pipety Pasteura	Firma VWR	612-1702	230 milimetr
DNase I	Roche	4716728001	10 U/&mikro; L
Mieszanka dNTP (po 10 mM dNTP)	Sigma-Aldrich	72004
DS_SPcas_ModA	Produkt własny.	https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_maps	Konstrukt plazmidowy zawierający CRISPR-Cas12/ModA sgRNA
DS-spCas (system CRISPR-Cas9)	Addgene	48645 (numer akcesorium AddGene)	Plazmid do budowy plazmidów CRISPR-Cas zawierających przekładki (system CRISPR-Cas9) do mutagenezy fagowej (krok 3.2)
Szczep E. coli B został użyty do zakażenia T4	Komunikacja DSMZ	Brak katalogu  numer	Escherichia coli (Migula 1895) Castellani i Chalmers 1919 (DSM 613, ATCC 11303)
E. coli BL21 (DE3) Szczep ekspresyjny, kompetentna komórka	Invitrogen	C600003	Szczep ekspresji, kompetentne komórki.
E. coli DH5α Szczep klonujący, kompetentne komórki	Invitrogen	18265017	Szczep klonujący, kompetentne komórki.
EDTA	Roth	8043.2
Etanol (bezwzględny)	Firma VWR	200-578-6
Komórka przepływowa Flongle	Technologie Oxford Nanopore	Brak katalogu  numer	R10.4.1. chemia, https://nanoporetech.com/document/flongle
Zestaw minipreparatu plazmidu Gene JET	Thermo Fisher Naukowy	10242490
GeneRuler 1 kb Plus drabinka DNA	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał SM1331
GeneRuler ULR Drabinka DNA	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał SM1213
Mistrz gradientu 108	BIOCOMP	Brak katalogu  numer	https://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming
Wirówka Heraeus Pico 17	Thermo Scientific	75002410
Inkubator Infors HT Minitron	Infors AG	Brak katalogu  numer	https://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs
Izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)	Sigma-Aldrich	367-93-1
Kanamycyna	Carla Rotha	T832.1
LB-Agar	Carl-Roth	Zobacz materiał X969.1
LB-medium (Luria/Miller)	Carl-Roth	Zobacz materiał X968.1
Chlorek magnezu sześciowodny	Sigma-Aldrich	7791-18-6
Siarczan magnezu	Sigma-Aldrich	7487-88-9
Urządzenie MinION	Technologie Oxfrod Nanopore	Brak katalogu  numer	https://store.nanoporetech.com/eu/minion.html
ModA E165A_fw	Identyfikator IDT	GAATTAGTTTCAGATGA ACAAGCGGTAATGATAC CAGCT	Forward starter do wprowadzenia mutacji punktowej dla ModA E165A i wprowadzenia lepkich końcówek do klonowania Golden Gate (Krok 3.1)
ModA E165A_rev	Identyfikator IDT	CATATTACGATAACGA TGACTATCCGGAAAC	Odwrotny starter do wprowadzenia mutacji punktowej dla ModA E165A i do wprowadzenia lepkich końcówek do klonowania Golden Gate (Krok 3.1)
ModA_sgRNA_Cas12_fw	Identyfikator IDT	TCTTGTTCATCTACAAC AGTAGAAATTAATTTAAA GTTCTTAGACCCG	Starter do generowania przekładki dla systemów CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 do mutagenezy fagowej i kontrselekcji (krok 3.2 i krok 4.1)
ModA_sgRNA_Cas12_rev	Identyfikator IDT	AGTAATGATAAAGAACT TTAAATAATTTCTACTGT TGTAGATGCTAC	Odwrotny starter do generowania przekładki dla systemów CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 do mutagenezy i kontrselekcji fagów (krok 3.2 i krok 4.1)
Spektrofotometr NanoDrop ND-1000	Thermo Fisher Naukowy	AZY2019944
Zestaw NucleoMag	Machery Nagel	REF 744970.50
Mieszanka do trawienia nukleozydów	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Zobacz materiał M0649S
pBA560 (system CRISPR-Cas13)	Addgene powiedział:	186236 (numer akcesorium AddGene)	System kodowania plazmidowego CRISPR-Cas13 do kontrselekcji (krok 4.1)
Plazmid pCpfl-sp (system CRISPR-Cas12)	Addgene powiedział:	122186
Plazmid pCpfl-sp (system CRISPR-Cas12)	Addgene powiedział:	122186 (numer akcesorium AddGene)	Plazmid do budowy plazmidów CRISPR-Cas zawierających przekładki (system CRISPR-Cas12) do mutagenezy fagowej (krok 3.2)
Naczynia reakcyjne PCR	Sarstedt powiedział:	72.991.002
PeqZIELONY	Firma VWR	732-3196
pET28a_NgTET	Produkt własny.	Brak katalogu  numer	Plazmid jest dostępny na życzenie, mapę plazmidu można znaleźć pod następującymi https://zenodo.org/records/10615143
pET28a_NgTET	Produkt własny.	Brak katalogu  numer	Plazmid do budowy pET28a_NgTET_donor DNA metodą klonowania Golden Gate (krok 3.1), plazmid  jest dostępny na żądanie, mapę plazmidu można znaleźć pod następującymi https://zenodo.org/records/10615143
Płytki Petriego	Sarstedt powiedział:	82.1473.001	92 x 16 mm z krzywkami
Polimeraza DNA Phusion	Thermo Fisher Naukowy	F-530XL	2 U/&mikro; L
Fosforan potasu	Sigma Aldrich	7778-77-0	Monopodstawowy
Uniwersalny zasilacz PowerPac	Bio Rad	1645070
Proteinaza K	Carl Roth	7528.1	100 mg/ml
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR	QIAGEN powiedział:	28506
Fluoromierz Quantus, system dsDNA QuantiFluor	Preparat Promega	E2670 powiedział:
RNaza A/T1	Thermo Fisher Naukowy	EN0551	zmieszać 2 mg/ml RNazy A 5000 U/ml RNazy T1
Roti-Aqua P/C/I do ekstrakcji DNA	Carla Rotha	Zobacz materiał X985.1
Octan sodu	Sigma-Aldrich	127-09-3
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	7647-14-5
SQK-LSK109 Zestaw do sekwencjonowania ligacji	Technologie Oxford Nanopore	Brak katalogu  numer	https://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109
Filtry Steritop, 0,22 i mikro; m Wielkość porów	Milipory	S2GPT05RE	250 ml i 500 ml
Streptomycyna 50 mg/L	Carla Rotha	Zobacz materiał HP66.1
Sakroza	NeoFroxx GmbH	57-50-1	dla biologii molekularnej
Aluminiowy wirnik wahadłowy	Beckman Coulter Nauki Przyrodnicze	JS[1]24.15
T4 DNA Ligaza 5 U/&mikro; L	Thermo Fisher Naukowy	EL0011 powiedział:
Bufor ligazy DNA T4	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał B69
Probówki o grubych ściankach, bez oprawek	Karl Hecht GmbH	42775054	100 mm x 18 mm
Termocykler, T100	Biorad	1861096
Komfort termomiksera	Eppendorf powiedział:	5382000015
Baza Trizma	Sigma Aldrich	77-86-1
Wanna wannowa, VWB2	Firma VWR	462-0557	Pojemność 12 l