Ocena odpowiedzi liści na metabolity drugorzędne mikroorganizmów przy użyciu formatu o wysokiej przepustowości

Podsumowanie

Protokół ten opisuje podejście o wysokiej przepustowości do oceny wycieku jonów roślinnych, aktywności peroksydazy oraz produkcji kalloz w tej samej próbce.

Streszczenie

Mikroby wydzielają strukturalnie zróżnicowane metabolity wtórne podczas infekcji roślin, z których część są wykrywane przez komórki roślinne, wywołując reakcje stresowe. W tej metodzie mierzy się indukcję wycieku jonów, aktywności nadoksydazy oraz produkcji kallosy w tej samej próbce dysku liściowego. Po pierwsze, dyski liści jęczmienia (Arabidopsis) są infiltrowane próżniowo w płycie z 96 dołkami. Po 4-6 godzinach mierzy się przewodność, następnie aktywność peroksydazy i osadzanie kallosy po 24 godzinach. Peptyd flg22 wywołuje wszystkie trzy odpowiedzi i jest przystępną cenowo kontrolą pozytywną. Lipopeptydy cykliczne surfaktyny i gramilliny indukują aktywność peroksydazy i wyciek jonów, odpowiednio, podczas gdy fitotoksyczny trychotecen T-2 hamuje aktywność peroksydazy. Ogólnie rzecz biorąc, takie podejście umożliwia wielokrotne porównania zarówno między genotypami roślin, jak i metodami leczenia metabolitów. To podejście można zastosować w genetyce chemicznej lub bioprotekcji, aby zidentyfikować związki modulujące stres do dalszych badań. W genetyce roślin to podejście może być stosowane do porównywania odpowiedzi w populacjach roślin w celu mapowania genetycznego oraz do lepszego zrozumienia interakcji roślin-mikroorganizmy.

Wprowadzenie

Rośliny reagują na różne cząsteczki mikroorganizmów, aby aktywować komórkowe reakcje stresowe, co może zakończyć się odpornością na choroby. Wzorce molekularne związane z mikroorganizmami (MAMP), takie jak peptyd flg22 z bakteryjnej flagelliny, są wykrywane przez białka receptorów roślinnych, inicjując szereg komórkowych odpowiedzi sygnalizacyjnych. Należą do nich wczesne odpowiedzi, takie jak kaskady kinaz, produkcja reaktywnych form tlenu (ROS), skoki wapnia, depolaryzacja błon oraz późne reakcje, takie jak osadzanie kallozy i indukcja aktywności peroksydazy¹. Metabolity drugorzędne mikroorganizmów (MSM) to małe (50-1 500 Daltonów), strukturalnie zróżnicowane cząsteczki, które są zbędne do wzrostu i rozwoju, ale wspierają przeżywalność mikroorganizmu. Niektóre MSM wywołują komórkowe reakcje stresowe u roślin, choć mechanizmy inicjacji tych reakcji pozostają nierozwiązane ^2,3. Proponowane mechanizmy rozpoznawania MSM przez rośliny obejmują mechanosensing, modyfikacje białek indukowane przez redoks lub sygnalizację opartą na lipidach ^4,5. W niektórych przypadkach MSM wywołuje reakcje stresowe lub powoduje uszkodzenia komórek, w zależności od stężenia. Na przykład toksyna T-2 indukuje produkcję kallozy i ROS przy 1 μM oraz powoduje śmierć komórek przy 10 μM, i zazwyczaj opisuje się ją jako fitotoksynę⁴. MSM wpływają na patogenezę w niektórych interakcjach roślin-mikroorganizmy i mogą wywoływać podatność lub odporność roślin. Na przykład cykliczny lipopeptyd gramiliny indukuje produkcję ROS, wyciek jonów i produkcję kallo, jednocześnie zwiększając podatność jęczmienia na Fusarium graminearum². Cykliczne lipopeptydy syringomycyny i syringopeptyny indukują produkcję ROS roślin oraz wspierają odporność gospodarza na bakterie Pseudomonas fluorescens ³. Inne MSM, takie jak surfaktyna i iturin, są produkowane przez niepatogenne mikroorganizmy i wspierają odporność na kolejne infekcje patogenami poprzez wywoływanie reakcji stresowych roślin ^6,7. Te bioprotekcyjne MSM indukują odpowiedzi komórkowe, w tym przepływy jonów, produkcję ROS, zmiany transkrypcyjne oraz produkcję kalloz⁸. Zrozumienie interakcji między MSM a roślinami może pomóc określić rolę MSM w odporności na choroby oraz zidentyfikować geny gospodarza, które można wykorzystać do poprawy odporności na rośliny.

Obecne metody oceny reakcji stresowych roślin wywołanych przez MSM zazwyczaj polegają na testowaniu jednej reakcji stresowej na raz^{, 8}. Biorąc pod uwagę, że wtórne MSM może być trudne do ekstrakcji, a dostępna może być ograniczona ilość metabolitów, testowanie wielu odpowiedzi w tej samej próbce może zapewnić pewność, że MSM wpływa na komórki roślinne. Jedną z wysokoprzepustowych metod oceny apoplastycznych wybuchów ROS jest wykrywanie luminescencji generowanej przez utleniony luminol w obecności nadoksydazy chrzanu⁹. Niestety, luminescencja oparta na luminolu jest tłumiona przez kationy i niektóre rozpuszczalniki, co ogranicza zastosowanie tego testu dla ekstraktów zawierających sole lub dla cząsteczek niepolarnych, które muszą być rozpuszczane w DMSO, co wymaga metody działającej z tymi zanieczyszczeniami⁹. Aby rozwiązać te problemy, rozszerzyliśmy obecne metody oceny trzech reakcji stresowych (wyciek jonów, aktywność nadoksydazy i kalozę) z tej samej próbki liścia w wysokoprzepustowym badaniu (Rysunek 1)10,11,12. Nasze podejście polega na traktowaniu dysków liściowych za pomocą MSM za pomocą infiltracji próżniowej w płytce z 96 dołkami. Następnie pomiary przewodności wykonuje się 4-6 godzin po zabiegu, aby ocenić wyciek jonów, a następnie pomiary aktywności peroksydazy i osadzania kallozy po 24 godzinach. Nasze podejście zostało zoptymalizowane pod kątem Arabidopsis i jęczmienia, ale można je rozszerzyć na inne gatunki roślin po zatwierdzeniu eksperymentalnym. Na przykład indukowana aktywność nadoksydazy jęczmienia nie jest wykrywalna tą metodą, ale można wykryć tłumienie aktywności przez toksyczne związki. W związku z tym cechy liści lub amplituda wywołanej reakcji różnią się między gatunkami, co ogranicza zastosowanie tego podejścia do niektórych gatunków roślin.

Projektowanie eksperymentów przy użyciu tej metody powinno uwzględniać kontrolę, replikację i koncentrację MSM, aby zapewnić najlepsze rezultaty. Kontrola negatywna jest niezbędna do identyfikacji MSM, które wywołują statystycznie różne poziomy reakcji stresowej w porównaniu do skutków ran. Idealnie byłoby, gdyby kontrola ujemna zawierała ten sam rozpuszczalnik co MSM, ale bez MSM. Typowe rozpuszczalniki hydrofobowe MSM to DMSO i metanol, które wywołują odpowiedzi komórkowe, takie jak produkcja ROS przy wysokich stężeniach^13,14. W tym teście obserwujemy wpływ na aktywność peroksydazy, gdzie 10% lub wyższe DMSO i metanol blokują aktywność peroksydazy indukowanej flg22 (Rysunek 2). W przypadku ekstraktów złożonych może być trudno wypracować negatywną kontrolę bez MSM, gdy interesujące się metabolity są nieznane. Zamiast tego frakcjonowanie ekstraktów na podstawie rozmiaru, polaryzacji lub ładunku umożliwiłoby porównania względne między frakcjami w celu zidentyfikowania najbardziej stresującej frakcji do dalszej analizy. Dodatkowo, uwzględnienie dodatniej kontroli, takiej jak toksyna T-2 w stężeniu 1 μM flg22 lub 10 μM, zapewnia badaczowi możliwość oceny, czy test działa. Zalecamy uwzględnienie czterech technicznych replik na każde leczenie oraz uwzględnienie pozytywnych i ujemnych kontroli na każdej płytki, gdy w eksperymencie mierzone jest wiele płytek.

Ogólnie rzecz biorąc, to podejście obejmuje trzy reakcje na stres roślin wywołane przez MSM, oferując dostępną i opłacalną metodę badania interakcji między rośliną a MSM. Format o wysokiej przepustowości pozwala badaczom wychwycić subtelne różnice między genotypami roślin lub ekstraktami mikroorganizmów w obrębie tej samej jednostki eksperymentalnej. Umożliwia to podejścia na poziomie systemowym do zrozumienia rodzin genetycznych roślin lub badania populacji roślin w celu mapowania genetycznego. Po stronie mikroorganizmów podejście to mogłoby być stosowane do wykrywania potencjalnych związków bioprotekcyjnych lub w genomice chemicznej do identyfikacji związków wzmacniających lub tłumiących określone reakcje stresowe.

Protokół

1. Przygotowanie i obróbka próbek

UWAGA: Wszystkie odpowiednie środki ostrożności i praktyki utylizacji należy podejmować, aby zminimalizować ryzyko dla eksperymentatora i środowiska.

1. Uprawa roślin
   1. Uprawiaj Arabidopsis do stadium 4-5 tygodnia na mieszance gleby Cornell (300 torfów: 630 wermikulitu: 1 nawóz o wolnym uwalnianiu: 4,2 wapna) z dwoma roślinami w doniczce w 24 doniczkach na tacę. Podlewaj rośliny od dołu, dodając wodę do tacy. Ustaw warunki w komorze wzrostu na 21 ^°C nieprzerwanie, z 16 godzinami światła i 8 godzinami ciemności, utrzymując wilgotność około 30-50%. Używaj^{w pełni} powiększonych liści 5-9 do eksperymentów i zbiorów rano.
   2. Uprawiaj jęczmień aż pierwszy i drugi prawdziwy liść będą w pełni rozrosłe w 75 glebie doniczkowej: 24 ziemia: 1 mieszanka wapienna. Sadz jedno nasiono w doniczce w 24 działkach na tacę, podlewając w razie potrzeby. Ustaw warunki w komorze wzrostu na 21 ^°C, 16 godzin światła i 8 godzin ciemności przy wilgotności około 30-50%. Spróbuj pierwszych i drugich, w pełni rozwiniętych liści, a zbierz rano.
2. Zbieraj trzy tarcze liściowe na roślinę za pomocą korkowego wiertnika o średnicy 4 mm, omijając żyłkę środkową. Unikaj maceracji tkanki za pomocą ostrego wierca z ruchem skręcającym ruch.
3. Natychmiast i delikatnie umieść dyski liściowe w jednej z dołków na 96-dołowej płytce w 196 μL sterylnego Milli-Q H₂O. Kontynuuj pobieranie dysków, aż zostanie pobrana wymagana liczba próbek.
4. Dodaj wtórne metabolity lub preparaty rozpuszczalnikowe w pożądanym stężeniu do końcowej objętości 200 μL do pojedynczych dołków.
5. Włóż płytkę z 96 dołkami z odkręconą pokrywką do słoika z dyszą próżniową.
6. Podłącz wąż próżniowy do dyszy dzwonka i włącz ciśnienie próżniowe, aż podciśnienie osiągnie 9,8 funta/cal kwadratowy (zazwyczaj 10 sekund). Powtórz ten proces jeszcze raz.
7. Umieść pokrywkę na talerzu i inkubuj na orbitalnym shakerze (55 rpm) pod światłem (13 W, 50 μmol∙^m-2∙^s-1) umieszczonym 23 cm nad shakerem przez 4 godziny.

2. Pomiary wycieku jonów

1. Przemyj sondę wodą Milli-Q i lekko osusz Kimwipe, żeby wyschła. Zwróć uwagę na odczyt przewodności wody dla porównania.
2. Po 4-6 godzinach po zabiegu pobieraj próbkę i rejestruj przewodność z poszczególnych dołków, zanurzając sondę w cieczy otaczającej dysk liścia. Trzymaj płytkę pod kątem 45°, aby upewnić się, że sonda jest całkowicie wtopiona.
3. Przepłukaj sondę między próbkami, zanurzając ją w wodzie Milli-Q i wysuszając sondę na Kimwipe. Czasami testuj przewodność wody, aby upewnić się, że odczyty sondy pozostają stabilne.
4. Umieść plastikową folię uszczelniającą na płytce i wróć do orbitalnego shakera na inkubację przez noc.

3. Pomiary aktywności nadoksydazy

1. Codziennie przygotowuj podłoże z nadoksydazą świeże jako roztwór 50 mL. Podgrzej 40 ml destylowanej wody sterylnej do 70 ^°C w zlewce z batonem mieszającym i rozpuścić 50 mg kwasu 5-aminosalicylowego (1 mg/mL) w podgrzanej wodzie. Dodaj wodę do 50 mL i dostosuj pH do 6 za pomocą NaOH. Roztwór jest światłoczuły, więc przykryj folią aluminiową lub użyj bursztynowej rurki.
2. W bursztynowej stożkowej rurce o pojemności 50 mL przygotuj roztwór 1% H_2O2, dodając 1,7 mL 30% H₂O_{2 do} 48,3 mL Milli-Q H₂O.
3. Bezpośrednio przed testem dodaj 10 μL roztworu 1% H_{2O2 na} mililitr roztworu 5-aminosalicylowego, potrzebnego do wygenerowania medium testowego.
4. Aby pobrać próbkę z obtraktowanych dysków liściowych, należy pobrać 50 μL z każdego odwiertu w pożądanym momencie. Przelej na przezroczystą, płaską płytę z 96 dołkami i dodaj 50 μL medium testowego, mieszając pipetując 5 razy.
5. Inkubuj reakcję w temperaturze pokojowej przez 3 minuty i zatrzymaj ją, dodając 20 μL 2 N NaOH, delikatnie stukając w celu wymieszania.
6. Zmierz absorpcję odwiertów na 595 nm w czytniku płytowym.

4. Obrazowanie Callose i analiza obrazów

1. Po pobieraniu próbek z dołków do testu peroksydazy, usuń pozostałą ciecz z otworów i dodaj 100 μL roztworu kwasu octowego:etanolu (1:3) w celu utrwalenia i odbarwienia. Przyłóż pokrywkę na talerz i inkubuj ją na shakerze (60 obr./min) w okapie przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
2. Zamień roztwór odbarwiający na świeży i inkubuj przez kolejne 24 godziny w temperaturze pokojowej.
3. Pipetą wyjmij roztwór odbarwiający i dodaj 100 μL 150 mM K₂HPO₄ do każdego otworu. Umieść talerz na shakerze i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
4. Usuń roztwór K₂HPO₄ i dodaj 100 μL 150 mM K₂HPO₄ z 0,1 mg/mL aniline blue. Przykryj płytę z 96 dołkami pokrywką i folią aluminiową oraz inkubuj na shakerze przez co najmniej 2 godziny (Arabidopsis) lub przez noc (jęczmień).
   UWAGA: Aniline Blue jest światłoczuły i powinien być świeży przy każdej technicznej replikacji.
5. Usuń roztwór błękitu anilinowego i zamień go na 50% glicerol. Przykryj płyty z 96 dołkami folią aluminiową i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu gotowości do zdjęcia.
6. Nałóż kroplę 50% roztworu glicerolu na czystą szklaną szkiełkę. Delikatnie podnieś dysk liścia pęsetą i połóż go stroną do góry na zasuwce. Przykryj się warstwą 1,5, minimalizując pęcherzyki powietrza, i dodaj dodatkowe 50% glicerolu, jeśli to konieczne, aby wypełnić pod pokrywą.
7. Ustawiaj ostrość materiału liścia za pomocą przepuszczonego białego światła (jasne pole) pod obiektywem 20x suchym.
8. Wybierz długość fali wzbudzenia do 370 nm oraz długość fali emisyjnej do 509 nm dla obrazowania błękitu anilinowego i ustaw czas naświetlania. Optymalizuj czas naświetlania, aby zapewnić odpowiedni sygnał, ale uniknąć przesycenia pikselami. Dla porównania ilościowego obrazów należy upewnić się, że intensywność lasera i czas naświetlania są spójne dla wszystkich biologicznych replikacji, zabiegów i technicznych replik.
9. Dla każdego dysku liściowego wybierz trzy różne pola widzenia i pobierz obrazy dla każdego z nich korzystając z parametrów ustawionych w kroku 4.8. Uzyskuj wszystkie zdjęcia z materiałem roślinnym całkowicie wypełniającym pole widzenia z minimalnymi obszarami tła (materiał nieroślinny). Pobieraj obrazy na jednej płaszczyźnie z powierzchni liścia.
   UWAGA: Posiadanie pewnego tła może być nieuniknione i można je skorygować w późniejszych etapach kwantyfikacji obrazu. W tym przykładzie zdjęcia wykonywane są za pomocą pionowego mikroskopu epifluorescencyjnego z lampą rtęciową oraz kostką filtra DAPI (wzbudzenie 360/40 nm, emisja 460/50 nm). W przypadkach, gdy lampa rtęciowa nie jest dostępna, można użyć wielofalowego źródła światła LED.
10. Aby ilościowo określić plamy kallosu na podstawie obrazów, pobierz i zainstaluj bezpłatne oprogramowanie FIJI do przetwarzania obrazów, korzystając z instrukcji online pod https://imagej.net/Fiji/Downloads. Otwórz FIJI i zaimportuj obrazy aniline blue do analizy. Do tej analizy użyj .tiff plików o rozdzielczości co najmniej 300 dpi. Eksportuj pliki obrazów w .tiff formacie za pomocą oprogramowania mikroskopowego przed analizą lub pozwól FIJI otworzyć pliki.
    UWAGA: Fiji może otwierać większość zastrzeżonych typów plików (np. .czi, .nd2, .lif, .vsi).
11. Ustaw skalę na obrazie (kliknij Analizuj | Ustaw skalę), używając wartości odległości z zestawu mikroskopu.
12. Przekonwertuj obraz na 32-bitowy obraz w skali szarości (kliknij Obraz | Typ | 32 bity).
13. Dostosuj próg (kliknij na Obraz | Dostosuj | Threshold), aby uwzględnić tylko sygnał fluorescencji reprezentujący barwienie anilinowego niebieskiego poprzez kliknięcie Auto i ręczne dostosowanie minimalnych i maksymalnych wartości na krzywej progowej. Po ustaleniu progu kliknij Apply | Przekonwertuj na maskę. Za pomocą oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych zapisz wybrane parametry progowe dla każdego obrazu.
    UWAGA: Ze względu na wrodzoną autofluorescencję próbek roślin i usuwanie tkanek roślinnych, próg może się różnić między próbkami. Dla powtarzalności niezbędne jest zapisywanie progu każdego obrazu i konsekwentne dostosowywanie wartości progowych między próbkami.
14. Ilościowo określ liczbę i rozmiar anilinowych niebieskich punktów za pomocą Analizuj cząstki (kliknij Analizuj | Analizuj cząstki) używając domyślnych ustawień. Aby uzyskać średnie wartości wszystkich punktów na obrazku, wybierz Podsumowanie w okienku wyskakującym (Summarize), a następnie kliknij OK.
15. Skopiuj i wklej te wyniki z pola Podsumowania do arkusza kalkulacyjnego wraz z parametrami progowymi do dalszej analizy. Wartości uwzględnione w tej ilościowości obejmują: Liczbę (liczbę anilinowych niebieskich punktów), całkowitą powierzchnię (całkowitą powierzchnię w jednostkach² anilinowego niebieskiego punkta), średni rozmiar (średni rozmiar w jednostkach² aniliniowego niebieskiego punkta), %Powierzchnię (procent średniego pokrycia w jednostkach² fluorescencji anilinowego niebieskiego względem całkowitej powierzchni), Obwód (średni obwód punktów) oraz IntDen (wskazanie intensywności fluorescencji zabarwienia aniliniowego niebieskiego).
16. Powtórz kroki 4.11-4.15 dla wszystkich obrazów uzyskanych podczas eksperymentu. Podczas zamykania obrazu z progiem z FIJI wybierz Nie zapisuj , aby uniknąć zmiany obrazu surowego na maskę progową.
17. Jeśli jakiekolwiek obrazy zawierają obszar o tle nieroślinnym, zmierz powierzchnię tkanki roślinnej, ręcznie obrysowując obszar tkanki roślinnej za pomocą narzędzi Polygon lub Freehand i mierząc powierzchnię (kliknij Analizuj | Measure). Skopiuj tę wartość do arkusza kalkulacyjnego dla każdego obrazu.
18. W arkuszu kalkulacyjnym uśrednij wartości z trzech obrazów pola widzenia z jednego biologicznego replikowania. Jeśli niektóre obrazy z eksperymentu zawierają obszar nieroślinny (patrz krok 4.17), popraw wszystkie wartości na podstawie powierzchni tkanki roślinnej na każdym obrazie. Na przykład należy podzielić wartość Count przez powierzchnię tkanki roślinnej dla każdego obrazu przed wykresem i porównaniem statystycznym.

5. Analiza danych

1. Oceń jakość eksperymentu, porównując pozytywne kontrole z ujemnymi kontrolami na tej samej płytce za pomocą testu T. Jeśli pozytywne kontrole nie wywołały istotnych zmian w reakcjach stresowych, należy ponownie ocenić warunki eksperymentalne, takie jak zdrowie roślin, termin leczenia, kontrola negatywna oraz potencjalne pogorszenie się MSM.
2. Testy istotności
   1. Jeśli wszystkie techniczne repliki leczenia są oceniane na tej samej płytce, przeanalizuj różnice między poszczególnymi metodami leczenia a kontrolą ujemną, stosując standardowe metody statystyczne, takie jak jednokierunkowa ANOVA z testem Tukey'ego.
   2. Jeśli techniczne repliki terapii były oceniane na wielu płytkach, normalizować każdą próbkę względem kontroli ujemnej, aby zminimalizować wpływ błędu między płytkami. Podziel każdą wartość przez średnią negatywnych próbek kontrolnych z tej samej płyty. Poddaj znormalizowane wartości standardowym metodom statystycznym.

Wyniki

Dzięki tej metodzie można określić, czy MSM aktywuje podzbiór komórkowych reakcji stresowych roślin. Wyniki tego badania pozwalają ilościowo określić aktywność nadoksydazy, wyciek jonów oraz produkcję kallos, aby określić, czy MSM wywołuje różnice odpowiedzi w porównaniu do kontroli ujemnej. Pozytywny wynik dla związku byłby wskazany przez istotną różnicę względem kontroli ujemnej, jak pokazano w przypadku jonoforu gramylinowego, który indukuje wyciek jonów i produkcję kallow (Rysunek 3)². Włączenie dodatniej kontroli, takiej jak 1 μM flg22, która wywołuje wszystkie trzy reakcje, zapewnia nienaruszoną wydajność rośliny i warunki eksperymentalne (Rysunek 3)^11,15. Gramillin i flg22 rozpuszczają się w wodzie, natomiast hydrofobowa surfaktyna i toksyna T-2 rozpuszczają się w DMSO. Aby przygotować cząsteczki hydrofobowe, najpierw przygotowujemy zapas 10 mM w DMSO. Ten zapas służy do uzyskania końcowego stężenia 10 μM w wodzie Milli-Q przeznaczonej do obróbki liści, która zawiera 0,1% DMSO. Surfaktyna (10 μM) indukuje aktywność peroksydazy i kalozę, natomiast toksyna T-2 (10 μM) tłumi aktywność peroksydazy i indukuje produkcję kallozy, prawdopodobnie z powodu śmierci komórek ^2,6,16. Stosowanie wody lub 0,1% DMSO jako kontroli negatywnej jest odpowiednie dla wskazanych zabiegów, ponieważ obie grupy dają podobne efekty (Rysunek 2).

W naszych wstępnych testach 100 komercyjnie dostępnych MSM widzimy indukcję kallose dla większości badanych związków (>70%), podczas gdy wyciek jonów i aktywność nadoksydazy są wywoływane przez mniejszą liczbę związków (30% i 35%). Większość tych związków jest produkowana przez gatunki Fusarium , w tym siedem różnych trychotekenów, takich jak deoksyniwalenol (DON) i toksyna T-2. Chociaż trwają dalsze replikacje potwierdzające te wyniki, wskazują one na podobne trendy jak w naszych pozytywnych kontrolach (Rysunek 3), gdzie kallose była wywołana przez wszystkie terapie, a wyciek jonów lub nadoksydaza była wywołana przez niektóre, ale nie wszystkie terapie.

Rysunek 1: Przegląd procedury oceny odpowiedzi komórkowych wywołanych przez MSM w liściach. Dyski liściowe umieszcza się w płytce z 96 dołkami zawierającą interesujące zabiegi, a dyski są infiltrowane próżniowo. Każda płytka zawiera cztery repliki negatywnej kontroli (woda z rozpuszczalnikiem) oraz dodatniej kontroli (toksyna flg22 lub T-2). Po 4-6 godzinach przewodność cieczy otaczającej tarczę liść mierzy się jako ilościową wypowiedź wycieku jonów. Po 24 godzinach aktywność peroksydazy jest ilościowo określana za pomocą testu kolorymetrycznego z cieczą otaczającą dysk liścia, a dysk liściowy jest odbarwiony i przetwarzany w celu ilościowego określenia kallo. Skrót: MSM = metabolit drugorzędowy mikroorganizmów. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Wpływ rozpuszczalnika na wyciek jonów lub aktywność peroksydazy wywołany przez flg22. Cztery replikowane próbki Arabidopsis zostały poddane 1 μM flg22 połączonym z DMSO lub metanolem (0, 0,01, 0,1, 1, 10%). Wykresy słupkowe pokazują średnią przewodność próbki po 4 godzinach lub aktywność peroksydazy (OD₆₀₀) po 24 godzinach po zabiegu z pojedynczego eksperymentu (n = 4, SD). Eksperyment powtórzono dwukrotnie, z podobnymi wynikami. Istotna różnica w porównaniu z kontrolą wody została określona za pomocą testu t i wskazana gwiazdką (p < 0,05). Skróty: DMSO = dimetylsulfotlenek; MeOH = metanol. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Indukcja wycieku jonów, aktywność peroksydazy lub osadzanie kallozy w dyskach liściowych Arabidopsis przez cząsteczki pochodzące od mikroorganizmów. Leczenie obejmowało immunogenny, nietoksyczny peptyd flg22 (1 μM), cykliczne lipopeptydy gramylina i surfaktyna (10 μM) oraz toksyna T-2 (10 μM)^2,6. Wszystkie dane zostały znormalizowane do wody + 0,1% kontroli DMSO. Wykresy typu box-and-whisker pokazują przewodność próbki po 4 godzinach, aktywność nadoksydazy (OD₆₀₀) po 24 godzinach lub liczbę osadów kallow po 24 godzinach z pojedynczego eksperymentu (n = 4-16 roślin). Wykresy pudełkowe wskazują literę 'x', aby pokazać wartość średniej, a ramki wskazują pierwszy kwartyl, medianę i trzeci kwartyl traktowania. Najwyższe i najniższe obserwacje, które nie są odstawione, są oznaczane przez wąsy (>1,5x zakres interkwartylowy, oznaczony kółkami). Istotna różnica w porównaniu z kontrolą wody jest wskazana gwiazdką i została określona przez jednokierunkową ANOVA za pomocą testu Tukeyego (str. < 0,05). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Dyskusja

Społeczności mikroorganizmów kolonizujące rośliny wydzielają różnorodne MSM, aby ułatwić tworzenie biofilmu, tłumić konkurencyjne mikroorganizmy i wpływać na żywiciela rośliny¹⁷. Podczas gdy niektóre MSM nie mają wpływu na roślinę, inne wywołują szybką śmierć komórek, tłumią funkcjonowanie komórek lub wywołują oporność roślin¹⁷. Niektóre MSM wpływają na odporność roślin na mikroorganizmy produkujące MSM, a odporne genotypy można wybrać na podstawie nieczułości MSM ^2,3,18. Inne MSM indukują ogólnoustrojową oporność i zapewniają ochronę przed patogenami mikroorganizmów, co było wykorzystywane w rolnictwie do opracowywania produktów bioprotekcyjnych do tłumienia chorób⁸. Aby opracować skuteczne i zrównoważone strategie poprawy upraw, kluczowe jest zidentyfikowanie korzystnych MSM oraz genów roślin umożliwiających optymalną reakcję MSM.

Znajdowanie korzystnych MSM jest utrudnione przez fakt, że te związki są produkowane enzymatycznie, gdzie do końcowego produktu potrzebne jest wiele enzymów². To utrudnia określenie, który gen należy skierować, aby wyeliminować produkcję MSM w badaniach genetycznych. Biosynteza enzymatyczna skutkuje wieloma wariantami strukturalnymi tego samego MSM o potencjalnie różnych bioaktywnościach¹⁹. Rozdzielanie i oczyszczanie tych MSM w celu znalezienia bioaktywnych cząsteczek może być czasochłonne lub niemożliwe. W niektórych przypadkach można oczyścić tylko o niskich stężeniach pojedynczych MSM, wymagając kilku cykli oczyszczania². Po uzyskaniu bioaktywnego związku lub ekstraktu można zastosować kilka metod, aby zrozumieć, jak mikroorganizm może wpływać na roślinę.

Dotychczasowe działania koncentrowały się na monitorowaniu wpływu MSM na przeprogramowanie transkrypcyjne lub bioprotekcję w modelowych roślinach²⁰. Aby ocenić odpowiedzi MSM poza modelowymi zakładami, potencjalnie przydatne są testy o wysokiej przepustowości, które rejestrują odpowiedzi na różnorodne MSM i wymagają minimalnej liczby MSM. Najnowsze badania wskazują, że wybuchy ROS są częstą wczesną reakcją na MSM, w tym gramillinę, surfaktynę, syringomycynę i syringopeptynę ^2,3,7. Test na bazie luminolu wykrywa apoplastyczne wybuchy ROS wywołane przez nadoksydazy i oksydazy NADPH i jest podatny na testy wysokoprzepustowe²¹. Niestety, wewnątrzkomórkowe ROS indukowane przez MSM, takie jak surfaktyna, nie są wykrywalne tą metodą⁷. Ilościowe określenie aktywności nadoksydazy stanowi bardziej czułą alternatywę niż test na bazie luminolu do wykrywania przejściowej aktywacji enzymów produkujących ROS podczas stresu¹¹. Nasza obserwacja, że surfaktyna indukuje aktywność peroksydazy, jest zgodna z najnowszymi badaniami pokazującymi, że aktywność peroksydazy jest wywoływana przez surfaktynę i beauwerycynę w Arabidopsis (Rysunek 3)². Ponadto wykazaliśmy, że flg22 i jonofor-gramylina indukują wyciek jonów, a wszystkie testowane związki, w tym flg22, toksyna T-2, surfaktyna i gramillina, indukują kallozę zgodnie z oczekiwaniami (Rysunek 3)^2,4,7.

Poprzez ocenę wielu odpowiedzi w ramach tej samej próby minimalizujemy eksperymentalne zmienności w ocenie każdej z tych cech osobno oraz umożliwiamy korelację między cechami w badaniach systemowych dotyczących reakcji roślin na stres. Ocena wielu terapii lub genotypów w ramach jednej jednostki eksperymentalnej umożliwia również fenotypowanie na poziomie populacji dla genetyki populacyjnej. Na przykład podobne podejście zastosowano do identyfikacji QTL leżącego u podstaw produkcji ROS indukowanej flg22 w^{jęczmieniu 22}. Test ten może być również wykorzystywany do badań genetycznych chemicznych, aby znaleźć modulatory reakcji roślin na stres lub identyfikować potencjalne bioprotekcyjne MSM z ekstraktów mikrobiologicznych.

Aby upewnić się, że metoda eksperymentalna działa w ramach danego systemu, badacze powinni wziąć pod uwagę następujące czynniki i ograniczenia:

Jakość tkanki liściowej
Upewnij się, że tkanka liściowa nie jest obciążona przed zbiorem. Oznaki stresu roślin różnią się w zależności od gatunku, ale zazwyczaj obejmują więdnięcie, żółknięcie, zaczerwienienie, plamy, nadmierne zwijanie lub zwijanie liści. Pobieranie próbek z tkanki liściowej powoduje uszkodzenia, więc unikanie nadmiernej maceracji tkanki zmniejszy błąd tła spowodowany manipulacją.

Gatunki roślin
Protokół ten jest zoptymalizowany do stosowania z liśćmi jęczmienia i Arabidopsis. Liście jęczmienia wymagają dłuższego czasu barwienia dla kallose niż Arabidopsis, prawdopodobnie ze względu na grubszy wosk skórkowy w trawach, który zwiększa hydrofobowość i ogranicza dyfuzję zabiegów w liści²³. Może to również częściowo tłumaczyć brak indukcji aktywności peroksydazy przy użyciu naszej metody, choć udało nam się zauważyć tłumienie aktywności peroksydazy przez toksyczne związki podobne do tego, co zaprezentowaliśmy w Arabidopsis (Rysunek 3). Próbowaliśmy zwiększyć liczbę dysków liściowych na próbkę do 5, dostosować pH do 5, 6 lub 7, zwiększyć liczbę infiltracji próżniowych do 10 oraz zmodyfikować stężenie substratu lub zmienić podłoże na^{guaiacol 24}. Chociaż zaobserwowaliśmy zwiększoną aktywność peroksydazy przy większej liczbie dysków liściowych i rundach infiltracji, różnice między kontrolą ujemną a flg22 pozostały niewielkie (wzrost o 10% przy flg22) lub nieistotne w różnych eksperymentach. Wiemy, że jęczmień reaguje na flg22 poprzez indukowanie produkcji ROS, produkcji kalozy oraz ekspresji peroksydazy^25,26. W korzeniach kukurydzy ekstrakty białkowe wykazywały aktywność peroksydazy indukowanej przez MAMP, co sugeruje, że do zobaczenia indukcji może być konieczne wyekstrakcjonowanie białka, w przeciwieństwie do wykrywania aktywności białka wypłukiwającej z dysków liściowych, jak to robimy w naszym teście²⁴. W naszym teście rana wyraźnie indukuje aktywność nadoksydazy w próbce kontrolnej z ujemnym wynikiem ubocznym, ponieważ aktywność ta znika, gdy komórki obumierają z powodu ekspozycji na toksyny. Możliwe, że leczenie flg22 może wywołać te same nadoksydazy co rany, więc wydaje się, że nie doszło do indukcji. Alternatywnie, nasz test może nie być wystarczająco czuły, by wykryć subtelne zmiany, albo nadoksydazy mogą nie dyfundować dobrze w roztworze.

Aby zastosować ten protokół do innych gatunków roślin, sugerujemy stosowanie opisanej metody oraz uwzględnienie Arabidopsis jako środka kontrolnego, aby upewnić się, że protokół działa. Jeśli aktywność peroksydazy wydaje się niska, zwiększenie liczby dysków liściowych na próbkę, zwiększenie liczby infiltracji próżniowych do 5 lub 10 oraz próbowanie różnych metod leczenia, w tym innych MAMP, jonoforów lub toksyn T-2, może dać pozytywny rezultat.

Leczenie negatywnej kontroli
Metoda ta opiera się na skutecznej i odpowiedniej kontroli negatywnej dla porównań. Idealnie byłoby, gdyby negatywna kontrola zawierała ten sam tło rozpuszczalnik co interesująca go metoda MSM, ale bez MSM. Rozpuszczalnikiem tła byłaby woda lub miałaby taki sam wpływ na mierzone naprężenia jak woda. Jest to praktyczne podejście w przypadkach, gdy MSM jest już oczyszczony i można go rozpuścić w wybranym rozpuszczalniku. Porównując ekstrakty mikroorganizmów, negatywną kontrolą może być produkt częściowy oczyszczenia MSM, zawierającego ten sam nośnik tła, ale z obniżonym stężeniem MSM po frakcjonacji. Eksperymentator może też użyć medium hodowlającego użytego do wygenerowania ekstraktu zawierającego MSM jako kontroli ujemnej. W tych bardziej złożonych próbkach negatywna kontrola może zawierać sole zwiększające pomiar przewodności lub rozpuszczalniki mogą hamować aktywność nadtlenksydazy (Rysunek 2). Aby ustalić, czy sole wpływają na wyniki wycieku jonów, eksperymentator może sprawdzić przewodność testu negatywnego i próbki w przypadku braku tarczy liściowej, aby sprawdzić, czy próbka lub liść powodują zmiany przewodności. Aby ustalić, czy rozpuszczalniki wpływają na odpowiedzi nadtlenkowania, eksperymentator może dodać flg22 do kontroli ujemnej i porównać wynik z flg22 rozpuszczonym w wodzie, aby określić, czy występuje różnica. Możliwe, że rozpuszczalniki, związki barwione lub nadmiar soli w negatywnej kontroli mogą zaciemniać wpływ MSM na określone reakcje roślin na stres, dlatego takie podejście nie będzie odpowiednie we wszystkich scenariuszach.

Czas próbkowania
Ważne jest, aby rozpocząć leczenie rano, ponieważ indukowalne odpowiedzi obronne podążają za cyklem okołodobowym i mają najwyższą amplitudę wcześnie rano²⁷. Z naszego doświadczenia wynika, że Arabidopsis powoduje wyciek jonów w odpowiedzi na gramylinę szybciej (4 godziny) niż jęczmień i kukurydza (4-7 godzin), dlatego może być wymagany przebieg czasowy, aby ustalić parametry eksperymentalne ^2,28. Reakcja komórek maleje z czasem i nie zalecamy testowania odpowiedzi stresowych po 30+ godzinach od leczenia.

Koncentracja
Stężenie MSM może mieć nieliniowy wpływ na wywoływanie reakcji roślin na stres, co jest zjawiskiem zwanym hormezą²⁰. W zależności od dostępności i rozpuszczalności MSM, eksperymentatorzy idealnie testowaliby reakcje na stres roślin w zakresie stężeń MSM. Typowe stężenia wahają się od 100 nM do 1 000 μM jako punkt wyjścia^{2, 11, 20}.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas 5-aminosalicylowy	Millipore Sigma	A79809
Pompa próżniowa Barnart	Grupa Technologii Rzemieślniczych	400-3910
Sonda mikroprzewodności COND-905	Lazar Research Laboratories Inc.
Peptyd FLg22	AnaSpec	AS-62633
Infinite 200PRO F	TeCan Group Ltd.	30190086
Surfaktyna	Sigma-Aldrich	S3523
Toksyna T-2	Cayman Chemical Company Inc	20433