Ustanowienie i ocena modelu mysza indukowanego ekstraktem wyciągiem Candida albicans w chorobie wieńcowej choroby Kawasaki

Podsumowanie

Model myszy indukowany przez CAWS skutecznie symuluje postęp choroby Kawasaki od ostrego stanu zapalnego do przewlekłego włóknienia, ujawniając kluczowe cechy patologiczne i immunopatologiczne, co może ułatwić opracowanie ukierunkowanych strategii terapeutycznych dla choroby Kawasaki.

Streszczenie

Choroba Kawasaki (KD) to ogólnoustrojowe zapalenie naczyń głównie dotykające dzieci, a najpoważniejszym powikłaniem są zmiany na arteriach wieńcowych. W tym badaniu opracowano zoptymalizowany myszy model KD z wykorzystując wodny ekstrakt Candida albicans (CAWS). Stan zapalny mięśnia sercowego oraz związane z nimi zmiany patologiczne oceniano za pomocą barwienia HE oraz barwienia trójchromowego Masson. Technika immunofluorescencji wykrywała infiltrację komórek odpornościowych w tkance sercowej. Ekspresja i lokalizacja białka VDAC1 w tkance mięśnia sercowego zostały wykryte za pomocą immunohistochemii. In vitro opracowano model fagocytowy poprzez współhodowlę makrofagów RAW264.7 z zarodnikami Candida albicans , a formowanie i funkcjonowanie autofagolizosomów oceniono za pomocą barwienia immunofluorescencji LC3 oraz sondy Lyso-Tracker Red. Poprzez badania dawkowe ustalono, że 8 mg jest optymalną dawką modelową wywołującą zapalenie tętnic wieńcowych, przy umiarkowanym wskaźniku śmiertelności przy tej dawce. Barwienie HE wykazało, że zastrzyk CAWS stabilnie wywoływał zmiany w tętniach wieńcowych zgodne z cechami ludzkiej choroby Kawasaki u myszy. Barwienie masona potwierdziło istotne osadzanie się włókien kolagenowych wokół tętnic wieńcowych i aorty w grupie myszy CAWS, co zbliżało się do obszaru zapalnego, a statystycznie istotna różnica w porównaniu z grupą kontrolną zaobserwowano po 14 dniach (p < 0,001). Immunofluorescencja wykazała, że w 14. dniu modelowania infiltracja wielu komórek odpornościowych w tkance sercowej grupy CAWS znacząco wzrosła (p < 0,001). Wyniki immunohistochemiczne wykazały, że 28. dnia modelowania ekspresja białka VDAC1 w tkance mięśnia sercowego grupy CAWS została istotnie zwiększona (p < 0,001). Eksperymenty in vitro wykazały, że u makrofagów zakażonych zarodnikami Candida albicans tworzenie autofagolysosomów wzrasta we wczesnym stadium, podczas gdy przepływ autofagiczny jest blokowany w późniejszym stadium, co sugeruje zaburzenie funkcjonalne.

Wprowadzenie

Choroba Kawasakiego (KD), będąca formą zespołu węzłów chłonnych śluzowo-skórnych, to choroba autoimmunologiczna występująca u dzieci poniżej 5. roku życia i towarzysząca gorączkowemu zapaleniu naczyń ^1,2,3. Badania wskazują, że nieleczone lub leczenie dłuższe niż 10 dni ciężkiej KD mają tendencję do poważnych powikłań sercowo-naczyniowych, głównie w tym tętniaków wieńcowych i zwężenia tętnic^{wieńcowych 4,5}. Pęknięcie tętniaków wieńcowych może prowadzić do wstrząsu kardiogennego, a nawet nagłej śmierci, co jest główną przyczyną nabytych chorób serca u dzieci^6,7 lat. Chociaż stosowanie dożylnej immunoglobuliny znacząco poprawiło rokowanie, jej etiologia i patogeneza pozostają niejasne, co ogranicza rozwój ukierunkowanych strategii terapeutycznych ^8,9. Dlatego opracowanie modeli zwierzęcych, które mogą dokładnie symulować cechy chorób ludzkich, stało się pilną potrzebą obecnych badań.

Obecnie główną przeszkodą w badaniach nad chorobą Kawasaki jest brak dobrze scharakteryzowanych modeli zwierzęcych, które w pełni odwzorowałyby patologię chorób ludzkich. Spośród różnych obecnie opracowanych modeli, model zapalenia naczyń wywołany ekstraktem ze ściany komórkowej Lactobacillus casei (LCWE) jest stosunkowo dojrzałym systemem, a ten model może powodować zapalenie tętnicy wieńcowej. Jest szeroko wykorzystywany do badania mechanizmu dysregulacji odporności oraz specyficznych cytokin w naczyniach podobnych do KD,^10,11. Model zapalenia naczyń wywołany ekstraktem rozpuszczalnym w wodzie Candida albicans (CAWS) również wzbudził dużą uwagę ze względu na dużą podobieństwo do cech patologicznych choroby Kawasaki u człowieka^12,13. Po systematycznej optymalizacji i ulepszaniu przez wiele zespołów badawczych, model indukowany przez CAWS stał się ważnym narzędziem w badaniach nad chorobą Kawasakiego¹⁴. Chociaż CAWS może wywołać zapalenie tętnic wieńcowych poprzez zastrzyk dootrzewnowny, ma ograniczenia, ponieważ nie jest w stanie w pełni odtworzyć dokładnego procesu patologicznego charakterystycznego dla ludzkiego zapalenia naczyń KD. Na przykład w późnej patologii ludzkiego KD¹⁵ nie znaleziono neutrofilów, ale infiltracja neutrofili w tym modelu występowała do 16 tygodni po podaniu CAWS¹⁶. Ponadto mechanizm zapalenia naczyń wywołanego przez CAWS nie został obecnie w pełni wyjaśniony, co ogranicza dogłębne zrozumienie i zastosowanie modelu⁹. Celem tego badania jest ustanowienie standaryzowanego modelu KD na zwierzętach poprzez optymalizację protokołu indukcyjnego CAWS, wyjaśnienie mechanizmu choroby oraz ułatwienie opracowania terapii celowanych.

Badanie to wykorzystało CAWS do opracowania bardziej standaryzowanego modelu zwierzęcego choroby Kawasakiego. Dzięki systematycznym eksperymentom optymalizacji dawki ustalono, że podanie dootrzewnowego 8 mg dziennie przez pięć kolejnych dni jest optymalnym schematem podawania. Ten schemat może stabilnie wywołać zmiany w tętnicach wieńcowych, jednocześnie utrzymując wysoki wskaźnik przeżywalności u zwierząt. Ponadto dalej badaliśmy rolę dysfunkcji mitochondrialnej w powstawaniu włóknienia podczas przewlekłej fazy KD, ze szczególnym uwzględnieniem możliwego mechanizmu napięciowego kanału anionowego 1 (VDAC1), kluczowego białka regulującego apoptozę mitochondrialną, podczas przejścia od stanu zapalnego do włóknienia¹⁷. Warto zauważyć, że dzięki analizie współlokalizacji autofagosomów i lizosomów w tym badaniu zaobserwowano nieprawidłową funkcję autofagii w tym modelu. Ten zoptymalizowany model stanowi ważne narzędzie do systematycznego badania patogenezy zmian tętnic wieńcowych w chorobie Kawasaki oraz oceny nowych strategii leczenia.

Protokół

Wszystkie eksperymenty badawcze z udziałem danych na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Afiliowanego Szpitala Ludowego nr 1 Huai'an Uniwersytetu Medycznego w Nankinie (KY-2024-250-01). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie CAWS

1. Inokuluj Candida albicans w bulionie z dekstrozy Sabouraud zgodnie z ustalonym protokołem Duonga i ^in.18. Następnie wyhoduj zaszczepiony bulion beztlenowo w temperaturze 37 °C przez 48 godzin w szczelnej komorze beztlenowej z mieszaniną gazową.
   UWAGA: Aby zapewnić sterylność podłoża, warunki beztlenowe w temperaturze 37 °C muszą być ściśle kontrolowane, aby zapobiec skażeniu przez różne bakterie.
2. Płucz wielokrotnie medium ograniczającym C-limitujące i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 48 godzin z prędkością obrotową 4,5 x g.
3. Dodaj równą ilość bezwodnego etanolu i pozostawij go na noc w temperaturze 4 °C.
4. Wiruj w 4,5 x g przez 15 minut w 4 °C, usuń supernatant, dodaj równą ilość bezwodnego etanolu do osadu i pozostawij przez noc w 4 °C.
5. Po wirowaniu wyrzuć supernatant, dodać 50 mL acetonu do osadu, odwirować i wysuszyć osad. Rozpuszczać osad w bezpłodnej soli fizjologicznej na późniejsze użycie.

2. Konstrukcja mysiego modelu choroby Kawasakiego

1. Wybierz osiemdziesiąt samców myszy C57BL/6 o klasie SPF w wieku 4-6 tygodni i umieść je w kontrolowanych warunkach z nieograniczonym dostępem do jedzenia i wody.
   UWAGA: Aby zminimalizować potencjalne zakłócenia wahań poziomu estrogenu na odpowiedzi immunologiczne i zapalne, w tym wstępnym badaniu ustalenia i charakteryzacji modelu¹⁹ użyto wyłącznie samców myszy.
2. Podziel myszy równomiernie na 4 grupy metodą losowej tabeli liczbowej, w tym 3 różne grupy dawek do zastrzyków CAWS (4 mg, 8 mg, 12 mg) oraz 1 grupę kontrolną z normalną solą fizjologiczną, po 20 myszy w każdej grupie.
3. Przygotuj proszek CAWS w trzech stężeniach: 40 mg/mL, 80 mg/mL i 120 mg/mL, używając sterylnej soli fizjologicznej (0,9% NaCl). Wstrzyknij grupie eksperymentalnej 0,1 mL CAWS rano od 1 do 5 dnia eksperymentu i podaj grupie kontrolnej równą ilość soli fizjologicznej według tego samego harmonogramu.
   UWAGA: Iniekcja dootrzewnowkowa została wykonana za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 mL. Podczas pracy ustaw mysz z głową niżej i ogonem wyżej, aby zapobiec uszkodzeniom narządów, takich jak jelito grube i cienkie, podczas wkładania strzykawki.
4. Używaj elektronicznej wagi codziennie o 9:00, aby jednocześnie ważyć pozostałą paszę w karmniku i obliczać 24-godzinne spożycie karmy dla każdej klatki z myszami.
5. 3., 7., 14. i 28. dnia po ostatnim zastrzyku losowo wybieraj i składaj ofiarę z każdej grupy po 3 myszy w każdym momencie.
6. Umieść myszy w zamkniętej komorze napełnionej powietrzem pokojowym. Wprowadź sprężony CO₂ z przepływem 30% objętości komory na minutę. Po 5 minutach wykonano zwichnięcie szyjki macicy, aby potwierdzić śmierć.
7. Zbieraj i waż próbki serca. Obserwuj zmiany zapalne serca i naczyń krwionośnych za pomocą barwienia HE (HE).

3. Standardy barwienia i gradacji HE

1. Serce i łuk aorty (około 3 mm × 3 mm) zostały szybko wyizolowane. Wykonaj sternotomię medianową według opisanej metody²⁰. Szybko oddziel serce od łuku aorty (około 3 mm × 3 mm). Zebrane tkanki były utrwalane w 10% neutralnej buforowanej formalinie przez 24 godziny.
2. Po utrwaleniu odwodnij tkanki przez serię etanolu o stopniu (70% etanolu przez 1 godzinę, 80% etanolu przez 1 godzinę, 95% etanolu przez 1 godzinę i 100% etanolu przez 1 godzinę), przezroczysty w ksylenie i osadzony w parafinie. Na koniec podziel bloki na ciągłe fragmenty o długości 5 μm.
3. W przypadku barwienia H&E barw fragmenty hematoksyliną przez 5 minut, spłukuj w bieżącej wodzie przez 10 minut, kontrutruj eozyną przez 2 minuty, a następnie przeprowadź odwodnienie i montaż²¹.
   UWAGA: Według stopnia uszkodzenia naczynia intymnego, klasyfikuje się go na trzy stopnie: stopień I charakteryzuje się głównie obrzękiem śródbłonka i agregacją neutrofili; Stopień II objawia się degeneracją mięśni gładkich, infiltracją komórek zapalnych oraz uszkodzeniem organelli; Stopień III objawia się poważnymi zmianami, takimi jak martwica śródbłonka i wydzielanie się oraz osadzanie fibryny.

4. Trójbarwne barwienie Massona

1. Po utrwaleniu odwodnij próbki tkanek przez serię stopniowego etanolu, przezroczystą w ksylenie, i osadzoną w parafinie.
2. Po odwoszczeniu nawilżaj sekcje przez serię ethanolu stopniowego do wody destylowanej w przygotowaniu do barwienia.
3. Barw jądra żelazem Weigerta przez 5 minut, dokładnie przepłukuj pod bieżącą wodą, a następnie barw cytoplazmę kwasem Lichun Red fuchsynem przez 5 minut.
4. Różnicuj 1% kwasu fosforybdykowego przez 1 minutę, a następnie bezpośrednio barw włókna kolagenowe błękitem anilinowym przez 3 minuty. Szybko płucz 1% kwasu octowego lodowcowego.
   UWAGA: Ściśle kontroluj czas etapu różnicowania, aby zapewnić specyficzność barwienia.
5. Po odwodnieniu etanolem i ksylenem, które stają się przezroczyste, uszczelnij neutralną warstwę.
6. Przepłukaj zabarwione fragmenty pod bieżącą wodą, aby usunąć nadmiar barwnika.
7. Odsusz te fragmenty przez serię ethanolu o stopniu, przezroczystą w ksylenie, i zamontuj z neutralną gumą.
8. Obserwuj przekroje pod mikroskopem świetlnym przy stałym powiększeniu. Włókna kolagenowe powinny wyglądać na niebieskie, włókna mięśniowe i cytoplazma na czerwono, a jądra na głęboko niebieskie.

5. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Napraw przekroje komórek lub tkanek i blokuj 5% BSA przez 1 godzinę, aby zmniejszyć wiązanie niespecyficzne.
2. Użyj zwykłej surowicy o tym samym pochodzeniu co przeciwciało wtórne, rozcieńcz je PBS w proporcji 1:10 i wlej na próbkę. Uszczelnij go w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po zabezpieczeniu delikatnie dwukrotnie opłukaj PBS.
3. Inkubuj fragmenty z głównym przeciwciałem przez noc w temperaturze 4 °C. Po umyciu PBS dodaj fluorescencyjne przeciwciało wtórne i inkubuj w ciemności przez 1 godzinę.
4. Barwienie rdzenia DAPI, uszczelnianie środkiem mocującym przeciw gaszeniu oraz obserwacja pod mikroskopem konfokalnym.

6. Immunohistochemia

1. Po odwoszczeniu i nawodnieniu sekcji parafiny należy przeprowadzić naprawę antygenową i zablokować endogenną nadoksydazę.
2. Inkubacja przeciwciał i rozwój koloru: Najpierw blokuj ją normalnym serum, następnie inkubuj pierwotne przeciwciało i przeciwciało wtórne znakowane przez HRP w sekwencji, a na końcu rozwój koloru DAB. Kontroluj stopień reakcji pod mikroskopem.
3. Ponownie zabarw jądra komórkowe hematoksyliną. Po odwodnieniu i przezroczystości uszczelnij płytki i obserwuj brązowo-żółty sygnał dodatni pod mikroskopem.
   UWAGA: Eksperyment musi ustalić kontrolę i ściśle kontrolować warunki do restauracji i wywoływania kolorów.

7. Wykrywanie autolizosomów

1. Współhodować makrofagi RAW264.7 z zarodnikami Candida albicans w odpowiedniej proporcji (10:1) i inkubować w temperaturze 37 °C i 5%_CO2 przez 4 godziny, 8 godzin, 12 godzin, 16 godzin, 20 godzin, 24 godziny, 28 godzin, 32 godziny, 36 godzin, 40 godzin, 44 godziny i 48 godzin, aby ustalić model fagocytów.
2. Przemyj trzy razy za pomocą schłodzonego PBS, aby usunąć zarodniki niefagocytów.
3. Najpierw zablokuj próbki 5% BSA przez 30 minut. Następnie kolejno inkubować z pierwotnym przeciwciałem przeciwko LC3 (rozcieńczenie 1:200) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie z przeciwciałem wtórnym znakowanym Alexa Fluor 488 w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
4. Dodaj sondę lizosomową Lyso-Tracker Red bezpośrednio do komórek, aby zwizualizować lokalizację lizosomów. Na koniec kontrutruj jądra DAPI (1 μg/mL) przez 5 minut.
   UWAGA: Cały proces operacji powinien odbywać się w ciemności, aby zapewnić dokładną kontrolę czasu inkubacji i stężenia przeciwciała.

Wyniki

Początkowo systematycznie ocenialiśmy patologiczne zmiany mięśnia sercowego wywołane różnymi dawkami CAWS u myszy. Nie zaobserwowano zgonów w grupie kontrolnej PBS, grupie z 4 mg CAWS oraz 8 mg CAWS (n=20 w każdej grupie). Dla porównania, odpowiedź zapalna w grupie podawającej 4 mg była łagodna i nie spełniała wymagań modelowania. Śmiertelność była wyższa w grupie przyjmującej 12 mg CAWS (9/20, 45%), a zgony miały miejsce od 3. do 10. dnia po wstrzyknięciu. Wyniki te sugerują, że dawka 12...

Dyskusja

Tętniaki tętnic wieńcowych (CAA) oraz włóknienie mięśnia sercowego w KD są głównymi przyczynami długotrwałych zdarzeń sercowo-naczyniowych. Pomimo postępów w leczeniu w fazie ostrej, około 5% pacjentów nadal rozwija utrzymujące się CAA^28,29. Mechanizm tej opóźnionej zmiany patologicznej pozostaje nadal niejasny, dlatego pilnie potrzebne są modele zwierzęce, aby ujawnić jej dynamiczny proces³⁰. Ze względu na niezwykle ograniczone próbki tka...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
przeciwciało wtórne dla kóz do Rabbit IgG Alexa Fluor 488	abcam	ab15081	przeciwciało wtórne dla kóz do Rabbit IgG Alexa Fluor 488
Komora beztlenowa	Thermo Scientific	Thermo Scientific	Komora beztlenowa
Błękit anilinowy	Solarbio	G3668	Błękit anilinowy
anty-LC3	abcam	ab192890	główne przeciwciało przeciwko LC3
Szafa bezpieczeństwa biologicznego	Thermo Scientific	1500	Szafa bezpieczeństwa biologicznego
BSA	Solarbio	A8020	BSA
Candida albicans (szczep)	NBRC	1385	Candida albicans (szczep)
CD3e	BD Bioscience	561827	FITC Hamster Anti-Mouse CD3e (145-2C11)
CD86	BD Bioscience	105013	CD86
CD8a	BD Bioscience	100713	CD8a
Inkubator hodowli komórkowych	Thermo Scientific	311	Inkubator hodowli komórkowych
Wirówka	Thermo Scientific	ST4R Plus	Wirówka
Mikroskop konfokalny	Olympus	IX73	Mikroskop konfokalny
DAPI	Beyotime Biotechnology	P0131-25ml	DAPI
DMEM	Gibco	11965126	DMEM
Maszyna do osadzania	P.S.J MEDICAL	BM450A	Maszyna do osadzania
Eozyną	Solarbio	G1100	Eozyną
F4/80	BD Bioscience	123109	F4/80
FBS	Gibco	16000044	FBS
Formaldehyd	Solarbio	P1110	Formaldehyd
W pełni automatyczny suszarka tkanek	Leica Biosystems	ASP3005	W pełni automatyczny suszarka tkanek
Szkiełka mikroskopowe szkiełka	Citotest	250124A1	Szkiełka mikroskopowe szkiełka
H& E dye	Beyotime Biotechnology	C0105M	H& E dye
Strój IHC	Absin Biotechnology	ABS996-5ml	Strój IHC
Sonda LC3	Beyotime Biotechnology	C3018M	Sonda LC3
Niskoprofilowe łopatki mikrotomowe	Thermo Fisher	3052835	Niskoprofilowe łopatki mikrotomowe
Sonda lizosomowa	Beyotime Biotechnology	C1046	Sonda lizosomowa
Marker	Deli	SK109	Marker
Barwnik Masson	Beyotime Biotechnology	C0189M	Barwnik Masson
Mikrotom	Leica Biosystems	HistoCore BIOCUT	Mikrotom
Guma neutralna	Solarbi	G8590	Guma neutralna
NK1.1	BD Bioscience	561117	NK1.1
Mikroskop optyczny	Nikon	Nikon	Mikroskop optyczny
Parafina	Solarbio	YA0012	Parafina
Wosk parafinowy	Solarbio	YA0012	Wosk parafinowy
PBS	Solarbio	P1020	PBS
Kwas fosfolibdowy	Solarbio	G3472	Kwas fosfolibdowy
VDAC1	Abcam	AB34726	Anty-VDAC1