Ustanowienie i ocena modelu mysza indukowanego ekstraktem wyciągiem Candida albicans w chorobie wieńcowej choroby Kawasaki

Choroba Kawasakiego (KD), będąca formą zespołu węzłów chłonnych śluzowo-skórnych, to choroba autoimmunologiczna występująca u dzieci poniżej 5. roku życia i towarzysząca gorączkowemu zapaleniu naczyń ^1,2,3. Badania wskazują, że nieleczone lub leczenie dłuższe niż 10 dni ciężkiej KD mają tendencję do poważnych powikłań sercowo-naczyniowych, głównie w tym tętniaków wieńcowych i zwężenia tętnic^{wieńcowych 4,5}. Pęknięcie tętniaków wieńcowych może prowadzić do wstrząsu kardiogennego, a nawet nagłej śmierci, co jest główną przyczyną nabytych chorób serca u dzieci^6,7 lat. Chociaż stosowanie dożylnej immunoglobuliny znacząco poprawiło rokowanie, jej etiologia i patogeneza pozostają niejasne, co ogranicza rozwój ukierunkowanych strategii terapeutycznych ^8,9. Dlatego opracowanie modeli zwierzęcych, które mogą dokładnie symulować cechy chorób ludzkich, stało się pilną potrzebą obecnych badań.

Obecnie główną przeszkodą w badaniach nad chorobą Kawasaki jest brak dobrze scharakteryzowanych modeli zwierzęcych, które w pełni odwzorowałyby patologię chorób ludzkich. Spośród różnych obecnie opracowanych modeli, model zapalenia naczyń wywołany ekstraktem ze ściany komórkowej Lactobacillus casei (LCWE) jest stosunkowo dojrzałym systemem, a ten model może powodować zapalenie tętnicy wieńcowej. Jest szeroko wykorzystywany do badania mechanizmu dysregulacji odporności oraz specyficznych cytokin w naczyniach podobnych do KD,^10,11. Model zapalenia naczyń wywołany ekstraktem rozpuszczalnym w wodzie Candida albicans (CAWS) również wzbudził dużą uwagę ze względu na dużą podobieństwo do cech patologicznych choroby Kawasaki u człowieka^12,13. Po systematycznej optymalizacji i ulepszaniu przez wiele zespołów badawczych, model indukowany przez CAWS stał się ważnym narzędziem w badaniach nad chorobą Kawasakiego¹⁴. Chociaż CAWS może wywołać zapalenie tętnic wieńcowych poprzez zastrzyk dootrzewnowny, ma ograniczenia, ponieważ nie jest w stanie w pełni odtworzyć dokładnego procesu patologicznego charakterystycznego dla ludzkiego zapalenia naczyń KD. Na przykład w późnej patologii ludzkiego KD¹⁵ nie znaleziono neutrofilów, ale infiltracja neutrofili w tym modelu występowała do 16 tygodni po podaniu CAWS¹⁶. Ponadto mechanizm zapalenia naczyń wywołanego przez CAWS nie został obecnie w pełni wyjaśniony, co ogranicza dogłębne zrozumienie i zastosowanie modelu⁹. Celem tego badania jest ustanowienie standaryzowanego modelu KD na zwierzętach poprzez optymalizację protokołu indukcyjnego CAWS, wyjaśnienie mechanizmu choroby oraz ułatwienie opracowania terapii celowanych.

Badanie to wykorzystało CAWS do opracowania bardziej standaryzowanego modelu zwierzęcego choroby Kawasakiego. Dzięki systematycznym eksperymentom optymalizacji dawki ustalono, że podanie dootrzewnowego 8 mg dziennie przez pięć kolejnych dni jest optymalnym schematem podawania. Ten schemat może stabilnie wywołać zmiany w tętnicach wieńcowych, jednocześnie utrzymując wysoki wskaźnik przeżywalności u zwierząt. Ponadto dalej badaliśmy rolę dysfunkcji mitochondrialnej w powstawaniu włóknienia podczas przewlekłej fazy KD, ze szczególnym uwzględnieniem możliwego mechanizmu napięciowego kanału anionowego 1 (VDAC1), kluczowego białka regulującego apoptozę mitochondrialną, podczas przejścia od stanu zapalnego do włóknienia¹⁷. Warto zauważyć, że dzięki analizie współlokalizacji autofagosomów i lizosomów w tym badaniu zaobserwowano nieprawidłową funkcję autofagii w tym modelu. Ten zoptymalizowany model stanowi ważne narzędzie do systematycznego badania patogenezy zmian tętnic wieńcowych w chorobie Kawasaki oraz oceny nowych strategii leczenia.

Wszystkie eksperymenty badawcze z udziałem danych na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Afiliowanego Szpitala Ludowego nr 1 Huai'an Uniwersytetu Medycznego w Nankinie (KY-2024-250-01). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie CAWS

1. Inokuluj Candida albicans w bulionie z dekstrozy Sabouraud zgodnie z ustalonym protokołem Duonga i ^in.18. Następnie wyhoduj zaszczepiony bulion beztlenowo w temperaturze 37 °C przez 48 godzin w szczelnej komorze beztlenowej z mieszaniną gazową.
   UWAGA: Aby zapewnić sterylność podłoża, warunki beztlenowe w temperaturze 37 °C muszą być ściśle kontrolowane, aby zapobiec skażeniu przez różne bakterie.
2. Płucz wielokrotnie medium ograniczającym C-limitujące i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 48 godzin z prędkością obrotową 4,5 x g.
3. Dodaj równą ilość bezwodnego etanolu i pozostawij go na noc w temperaturze 4 °C.
4. Wiruj w 4,5 x g przez 15 minut w 4 °C, usuń supernatant, dodaj równą ilość bezwodnego etanolu do osadu i pozostawij przez noc w 4 °C.
5. Po wirowaniu wyrzuć supernatant, dodać 50 mL acetonu do osadu, odwirować i wysuszyć osad. Rozpuszczać osad w bezpłodnej soli fizjologicznej na późniejsze użycie.

2. Konstrukcja mysiego modelu choroby Kawasakiego

1. Wybierz osiemdziesiąt samców myszy C57BL/6 o klasie SPF w wieku 4-6 tygodni i umieść je w kontrolowanych warunkach z nieograniczonym dostępem do jedzenia i wody.
   UWAGA: Aby zminimalizować potencjalne zakłócenia wahań poziomu estrogenu na odpowiedzi immunologiczne i zapalne, w tym wstępnym badaniu ustalenia i charakteryzacji modelu¹⁹ użyto wyłącznie samców myszy.
2. Podziel myszy równomiernie na 4 grupy metodą losowej tabeli liczbowej, w tym 3 różne grupy dawek do zastrzyków CAWS (4 mg, 8 mg, 12 mg) oraz 1 grupę kontrolną z normalną solą fizjologiczną, po 20 myszy w każdej grupie.
3. Przygotuj proszek CAWS w trzech stężeniach: 40 mg/mL, 80 mg/mL i 120 mg/mL, używając sterylnej soli fizjologicznej (0,9% NaCl). Wstrzyknij grupie eksperymentalnej 0,1 mL CAWS rano od 1 do 5 dnia eksperymentu i podaj grupie kontrolnej równą ilość soli fizjologicznej według tego samego harmonogramu.
   UWAGA: Iniekcja dootrzewnowkowa została wykonana za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 mL. Podczas pracy ustaw mysz z głową niżej i ogonem wyżej, aby zapobiec uszkodzeniom narządów, takich jak jelito grube i cienkie, podczas wkładania strzykawki.
4. Używaj elektronicznej wagi codziennie o 9:00, aby jednocześnie ważyć pozostałą paszę w karmniku i obliczać 24-godzinne spożycie karmy dla każdej klatki z myszami.
5. 3., 7., 14. i 28. dnia po ostatnim zastrzyku losowo wybieraj i składaj ofiarę z każdej grupy po 3 myszy w każdym momencie.
6. Umieść myszy w zamkniętej komorze napełnionej powietrzem pokojowym. Wprowadź sprężony CO₂ z przepływem 30% objętości komory na minutę. Po 5 minutach wykonano zwichnięcie szyjki macicy, aby potwierdzić śmierć.
7. Zbieraj i waż próbki serca. Obserwuj zmiany zapalne serca i naczyń krwionośnych za pomocą barwienia HE (HE).

3. Standardy barwienia i gradacji HE

1. Serce i łuk aorty (około 3 mm × 3 mm) zostały szybko wyizolowane. Wykonaj sternotomię medianową według opisanej metody²⁰. Szybko oddziel serce od łuku aorty (około 3 mm × 3 mm). Zebrane tkanki były utrwalane w 10% neutralnej buforowanej formalinie przez 24 godziny.
2. Po utrwaleniu odwodnij tkanki przez serię etanolu o stopniu (70% etanolu przez 1 godzinę, 80% etanolu przez 1 godzinę, 95% etanolu przez 1 godzinę i 100% etanolu przez 1 godzinę), przezroczysty w ksylenie i osadzony w parafinie. Na koniec podziel bloki na ciągłe fragmenty o długości 5 μm.
3. W przypadku barwienia H&E barw fragmenty hematoksyliną przez 5 minut, spłukuj w bieżącej wodzie przez 10 minut, kontrutruj eozyną przez 2 minuty, a następnie przeprowadź odwodnienie i montaż²¹.
   UWAGA: Według stopnia uszkodzenia naczynia intymnego, klasyfikuje się go na trzy stopnie: stopień I charakteryzuje się głównie obrzękiem śródbłonka i agregacją neutrofili; Stopień II objawia się degeneracją mięśni gładkich, infiltracją komórek zapalnych oraz uszkodzeniem organelli; Stopień III objawia się poważnymi zmianami, takimi jak martwica śródbłonka i wydzielanie się oraz osadzanie fibryny.

4. Trójbarwne barwienie Massona

1. Po utrwaleniu odwodnij próbki tkanek przez serię stopniowego etanolu, przezroczystą w ksylenie, i osadzoną w parafinie.
2. Po odwoszczeniu nawilżaj sekcje przez serię ethanolu stopniowego do wody destylowanej w przygotowaniu do barwienia.
3. Barw jądra żelazem Weigerta przez 5 minut, dokładnie przepłukuj pod bieżącą wodą, a następnie barw cytoplazmę kwasem Lichun Red fuchsynem przez 5 minut.
4. Różnicuj 1% kwasu fosforybdykowego przez 1 minutę, a następnie bezpośrednio barw włókna kolagenowe błękitem anilinowym przez 3 minuty. Szybko płucz 1% kwasu octowego lodowcowego.
   UWAGA: Ściśle kontroluj czas etapu różnicowania, aby zapewnić specyficzność barwienia.
5. Po odwodnieniu etanolem i ksylenem, które stają się przezroczyste, uszczelnij neutralną warstwę.
6. Przepłukaj zabarwione fragmenty pod bieżącą wodą, aby usunąć nadmiar barwnika.
7. Odsusz te fragmenty przez serię ethanolu o stopniu, przezroczystą w ksylenie, i zamontuj z neutralną gumą.
8. Obserwuj przekroje pod mikroskopem świetlnym przy stałym powiększeniu. Włókna kolagenowe powinny wyglądać na niebieskie, włókna mięśniowe i cytoplazma na czerwono, a jądra na głęboko niebieskie.

5. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Napraw przekroje komórek lub tkanek i blokuj 5% BSA przez 1 godzinę, aby zmniejszyć wiązanie niespecyficzne.
2. Użyj zwykłej surowicy o tym samym pochodzeniu co przeciwciało wtórne, rozcieńcz je PBS w proporcji 1:10 i wlej na próbkę. Uszczelnij go w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po zabezpieczeniu delikatnie dwukrotnie opłukaj PBS.
3. Inkubuj fragmenty z głównym przeciwciałem przez noc w temperaturze 4 °C. Po umyciu PBS dodaj fluorescencyjne przeciwciało wtórne i inkubuj w ciemności przez 1 godzinę.
4. Barwienie rdzenia DAPI, uszczelnianie środkiem mocującym przeciw gaszeniu oraz obserwacja pod mikroskopem konfokalnym.

6. Immunohistochemia

1. Po odwoszczeniu i nawodnieniu sekcji parafiny należy przeprowadzić naprawę antygenową i zablokować endogenną nadoksydazę.
2. Inkubacja przeciwciał i rozwój koloru: Najpierw blokuj ją normalnym serum, następnie inkubuj pierwotne przeciwciało i przeciwciało wtórne znakowane przez HRP w sekwencji, a na końcu rozwój koloru DAB. Kontroluj stopień reakcji pod mikroskopem.
3. Ponownie zabarw jądra komórkowe hematoksyliną. Po odwodnieniu i przezroczystości uszczelnij płytki i obserwuj brązowo-żółty sygnał dodatni pod mikroskopem.
   UWAGA: Eksperyment musi ustalić kontrolę i ściśle kontrolować warunki do restauracji i wywoływania kolorów.

7. Wykrywanie autolizosomów

1. Współhodować makrofagi RAW264.7 z zarodnikami Candida albicans w odpowiedniej proporcji (10:1) i inkubować w temperaturze 37 °C i 5%_CO2 przez 4 godziny, 8 godzin, 12 godzin, 16 godzin, 20 godzin, 24 godziny, 28 godzin, 32 godziny, 36 godzin, 40 godzin, 44 godziny i 48 godzin, aby ustalić model fagocytów.
2. Przemyj trzy razy za pomocą schłodzonego PBS, aby usunąć zarodniki niefagocytów.
3. Najpierw zablokuj próbki 5% BSA przez 30 minut. Następnie kolejno inkubować z pierwotnym przeciwciałem przeciwko LC3 (rozcieńczenie 1:200) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie z przeciwciałem wtórnym znakowanym Alexa Fluor 488 w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
4. Dodaj sondę lizosomową Lyso-Tracker Red bezpośrednio do komórek, aby zwizualizować lokalizację lizosomów. Na koniec kontrutruj jądra DAPI (1 μg/mL) przez 5 minut.
   UWAGA: Cały proces operacji powinien odbywać się w ciemności, aby zapewnić dokładną kontrolę czasu inkubacji i stężenia przeciwciała.

Początkowo systematycznie ocenialiśmy patologiczne zmiany mięśnia sercowego wywołane różnymi dawkami CAWS u myszy. Nie zaobserwowano zgonów w grupie kontrolnej PBS, grupie z 4 mg CAWS oraz 8 mg CAWS (n=20 w każdej grupie). Dla porównania, odpowiedź zapalna w grupie podawającej 4 mg była łagodna i nie spełniała wymagań modelowania. Śmiertelność była wyższa w grupie przyjmującej 12 mg CAWS (9/20, 45%), a zgony miały miejsce od 3. do 10. dnia po wstrzyknięciu. Wyniki te sugerują, że dawka 12 mg może powodować nadmierne miejscowe uszkodzenia zapalne oraz toksyczność ogólnoustrojową. W związku z tym ta dawka została wykluczona z kolejnych badań. Ostatecznie wybrano dawkę 8 mg jako optymalny schemat dawkowania, ponieważ mogła skutecznie wywołać znaczne zapalenie tętnic wieńcowych, utrzymując akceptowalny wskaźnik przeżycia i minimalne lokalne reakcje niepożądane. (Rysunek 1A). Ostatecznie ustalono, że optymalną dawką modelową jest podanie dotkliwkowo 8 mg CAWS. Wyniki barwienia HE grupy eksperymentalnej wykazały typowy dynamiczny proces zapalenia i włóknienia. Trzeciego dnia nastąpiła ogniskowa infiltracja zapalna, głównie składająca się z neutrofilów okołonaczyniowych i monocytów. Do siódmego dnia zakres zapalny rozszerzył się do śródmiąższa mięśnia sercowego, towarzyszyło mu znaczne obrzęknięcie komórek sercowych i obrzęk śródmiąższowy. Czternastego dnia stan zapalny osiągnął szczyt, a do tego doszło do zaburzenia układu włókien sercowych i martwicy ogniskowej. 28. dnia, mimo złagodzenia stanu zapalnego, pojawiło się wczesne zwłóknienie (Rysunek 1B i Rysunek 2A). Natomiast struktura mięśnia sercowego pozostawała prawidłowa we wszystkich momentach grupy kontrolnej. Wszystkie wyniki potwierdzono w wyniku podwójnie ślepej oceny, która potwierdziła, że dawka 8 mg CAWS może stabilnie wywołać model uszkodzenia mięśnia sercowego zgodny z cechami choroby Kawasakiego.

Następnie zastosowano metodę barwienia trójkolorowego Masson, aby zbadać, czy zapalenie naczyń podobne do choroby Kawasakiego wywołane przez CAWS prowadzi do utrzymującego się włóknienia wokół tętnic wieńcowych (CA). Wyniki eksperymentalne wykazały, że w grupie myszy poddanych zastrzykom CAWS wykryto wyraźne złoża włókien kolagenowych wokół ścian zapalonych tętnic wieńcowych i aorty, a te obszary włóknione ściśle pokrywały się z miejscami rozmieszczenia infiltracji komórek zapalnych. Natomiast myszy w grupie kontrolnej PBS wykazywały jedynie słabe barwienie kolagenowe, które mieściło się w normalnym zakresie strukturalnym ściany naczyniowej (Rysunek 2A). Analiza ilościowa wykazała, że istotne odkładanie włókien kolagenowych występowało po 14 dniach, a stopień włóknienia był statystycznie inny niż u grupy kontrolnej (rysunek 2C).

Biorąc pod uwagę, że centralną zmianą patologiczną w chorobie Kawasaki jest immunozapalna odpowiedź ściany naczyniowej, która obejmuje skoordynowaną działalność wielu komórek odpornościowych22,23, następnie zbadaliśmy charakterystyczne zmiany mikrośrodowiska immunologicznego w modelu CAWS poprzez barwienie immunofluorescencyjne (IF). 14. dnia po podaniu CAWS wykonano barwienie markerów komórek odpornościowych IF na tkankach sercowych myszy poddanych CAWS. Wyniki eksperymentów wykazały, że w 14. dniu modelowania myszy w grupie leczonej CAWS infiltracja komórek T CD3+, komórek cytotoksycznych T-T CD8+, makrofagów typu M1 CD86+, makrofagów F4/80+ oraz komórek zabójczych NK1.1+ w tętnicach wieńcowych i tkankach mięśnia sercowego była istotnie zwiększona w porównaniu z grupą kontrolną PBS (Rysunek 2B,D). Systematycznie analizując zmiany ekspresji tych markerów immunologicznych, nie tylko potwierdził, że model CAWS może dokładnie symulować cechy immunologiczne ludzkiej choroby Kawasaki, ale co ważniejsze, ujawnił możliwy mechanizm różnych podzbiorów komórek odpornościowych w występowaniu i rozwoju choroby, dostarczając teoretycznych podstaw do dalszego opracowania strategii ukierunkowanej interwencji immunologicznej.

Badania wykazały, że dysfunkcja mitochondrialna jest kluczowym mechanizmem leżącym u podstaw włóknienia mięśnia sercowego 24,25,26. Wiadomo, że pod wpływem stresu zapalnego kanał anionowy zależny od napięcia 1 (VDAC1), kluczowe białko do kontroli jakości mitochondriów, może wywołać nieprawidłowe otwarcie porów przejściowych przepuszczalności mitochondrialnej (mPTP), gdy jego ekspresja jest zwiększona. To z kolei indukuje apoptozę i aktywuje fibroblasty 17,27. Aby zbadać ten mechanizm, oceniliśmy ekspresję VDAC1 w fazie przewlekłej za pomocą immunohistochemii. Nasze wyniki wykazały, że w porównaniu z grupą kontrolną PBS, ekspresja białka VDAC1 w tkance mięśnia sercowego myszy w grupie leczonej CAWS była istotnie podwyższona 28 dni po modelowaniu (Rysunek 3). Pozytywne sygnały były głównie lokalizowane w obszarach włóknionych i wokół naczyń krwionośnych, co wskazuje, że dysfunkcja mitochondrialna wywołana przez VDAC1 może przyczyniać się do włóknienia mięśnia sercowego w modelu choroby Kawasakiego. Dane te dostarczają dowodów eksperymentalnych dotyczących molekularnych mechanizmów uszkodzenia mięśnia sercowego wywołanego przez CAWS.

Wcześniejsze badania wykazały, że dysfunkcja mitochondrialna wywołana VDAC1 jest zaangażowana w proces włóknienia mięśnia sercowego w chorobie Kawasaki, jednak jej konkretny mechanizm nie został jeszcze wyjaśniony. Biorąc pod uwagę, że utrzymanie homeostazy mitochondrialnej zależy od normalnej funkcji układu autofagiczno-lizosomalnego. Przypuszczamy, że VDAC1 może nasilać włóknienie poprzez wpływ na powstawanie lub funkcjonowanie autofagolizomów, prowadząc do nieprawidłowego nagromadzenia mitochondriów. Aby zweryfikować tę hipotezę, najpierw utworzyliśmy model zakażenia zarodnikami Candida albicans w makrofagach (RAW264.7) (Rysunek 4) i wykryliśmy dynamiczne zmiany przepływu autofagicznego i aktywności lizosomalnej w modelu. Wyniki eksperymentalne pokazują, że tworzenie lizosomów autofagicznych wzrasta we wczesnym stadium (w ciągu 2-3 godzin od zakażenia komórki), podczas gdy przepływ autofagiczny jest blokowany w późniejszym stadium (3-4 godziny po infekcji komórkowej). Zmianę przepływu autofagii można ocenić poprzez zmianę barwienia po połączeniu po współlokalizacji autofagosomów i lizosomów. Ten wynik potwierdza, że dysfunkcja autofagolizosomów rzeczywiście może prowadzić do zaburzeń w zakresie oczyszczania komórek.

Rysunek 1: Histopatologiczna analiza serca i tętnic wieńcowych. (A) Krzywe przeżycia myszy poddanych PBS lub różnym dawkom CAWS (4 mg, 8 mg i 12 mg; n = 20 na grupę). (B) Przedstawiono wyniki barwienia HE serca w grupie leczonej CAWS (8 mg) w różnych momentach (3 dni, 7 dni, 14 dni, 28 dni). Skala: 1500 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Rysunek 2: Analiza włóknienia kolagenowego i infiltracji komórek odpornościowych. (A) Wyniki barwienia Massona dla grupy CAWS 8 mg oraz grupy kontrolnej. Włókna kolagenowe mają charakterystyczny niebieski kolor, włókna mięśniowe i cytoplazma są czerwone, a jądro komórkowe ciemnoniebieskie. Strzałki wskazują na zarodniki grzybów. Paski skalowe: 1500 μm. (B) Wyniki barwienia immunofluorescencji grupy CAWS 8 mg oraz grupy kontrolnej (CD3 znakowane komórki CD3+ T, CD8 znakowane cytotoksyczne komórki T CD8+, CD86 znakowane makrofagi typu M1, F4/80 znakowane makrofagi F4/80+ oraz NK1.1 znakowane komórki naturalnego zabójczego). Paski skalowe: 200 μm. (C) Ocenić stopień włóknienia serca. Stopień włóknienia serca oceniono na podstawie procentu trójchromatycznego zabarwienia w tkance serca pola widzenia przy 800-krotnym powiększeniu. Metoda jest następująca: Ponieważ włókna kolagenowe są barwione na jaskrawo zielono barwnikami anionowymi makrocząsteczkowymi, zaobserwowano 100 pól widzenia przy 800-krotnym powiększeniu (wszystkie plasterki o grubości 5 μm), a stopień włóknienia serca określano na podstawie procentu zielonego obszaru w całkowitej powierzchni. Im wyższy procent, tym bardziej nasilona fibroza. (D) Procent komórek odpornościowych został statystycznie przeanalizowany na podstawie wyników barwienia immunofluorescencyjnego, ***p < 0,001. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Analiza immunohistochemiczna ekspresji VDAC1 w grupie PBS i CAWS w dniu 28. (A) Analiza immunohistochemiczna ekspresji VDAC1. Pasek skali: 800 μm. Brązowo-czarne cząsteczki to pozytywne rezultaty. (B) Analiza statystyczna procentu komórek immunohistochemicznie pozytywnych VDAC1, s. < 0,001. (C) Analiza statystyczna wyniku H immunohistochemii VDAC1. Dane pochodziły z wielu biologicznych replikacji (n = 20 myszy na grupę), a wyniki zostały wyrażone jako średnia ± odchylenia standardowego i statystycznie przeanalizowane (***p < 0,001). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Wykrycie autolizosomu po fagocytozie Candida albicans przez komórki myszy RAW264.7. (A) Strzałki wskazują na występowanie zarodników grzybów. Pręty skalowe: 25 μm. Zmianę przepływu autofagii można ocenić poprzez zmianę barwienia po połączeniu po współlokalizacji autofagosomów i lizosomów. (B) Analiza czasowo-przebiegowa tempa powstawania autolizosomów pozwala kwantyfikować istotne parametry. Wyniki zostały wyrażone jako średnia ± odchylenia standardowego i przeanalizowane statystycznie (***p < 0,001). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.