Artykuł metodologiczny

Pomiar starzenia pojedynczych komórek za pomocą biomarkera chromatyny i epigenetycznego starzenia się opartego na obrazowaniu

DOI:

10.3791/69057

⸱

30 stycznia 2026

 ,  ,  , 
1Harry Perkins Institute of Medical Research, QEII Medical Centre and Centre for Medical Research, The University of Western Australia, 2Scintillon Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół przedstawia proces obrazowania i obliczeniowy do wyodrębniania i weryfikacji chromatyny oraz epigenetycznego wieku (ImAge) opartego na obrazowaniu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby rozwijać spersonalizowaną opiekę zdrowotną i oceniać potencjalne strategie odmładzania, kluczowe są biomarkery odzwierciedlające wiek biologiczny. Wprowadziliśmy chromatynę opartą na obrazowaniu oraz epigenetyczny wiek (ImAge), biomarker oparty na obrazowaniu pochodzący z przestrzennej organizacji chromatyny i znaków epigenetycznych w pojedynczym jądrach, rejestrujący wewnętrzne zmiany związane z wiekiem. ImAge skutecznie rejestruje i ilościowo określa efekty interwencji modulujących wiek biologiczny, wykazując wrażliwość poprzez znaczące spadki po strategiach odmładzania (takich jak ograniczenie kalorii i częściowe przeprogramowanie poprzez ekspresję przejściowych Oct4, Sox2, Klf4 i Myc (OSKM)) oraz wzrost po leczeniu takim jak chemioterapia. Ponadto niższy ImAge koreluje z wyższą aktywnością lokomotoryczną, co sugeruje, że odzwierciedla poprawę funkcjonalną wraz z biologicznym odwróceniem wieku, oferując obiecujące narzędzie jednokomórkowe do oceny interwencji długowieczności. Ponieważ ImAge jest metodą integracyjną wymagającą wysokiej jakości obrazowania i skrupulatnej analizy obliczeniowej, dążymy do zapewnienia szczegółowych wskazówek w celu jej wyodrębnienia i weryfikacji. Ten kompleksowy protokół szczegółowo określi przepływ pracy zarówno dla procedur laboratoryjnych mokrych (przygotowanie próbek i obrazowanie), jak i właściwe wykorzystanie naszego otwartoźródłowego pipeline'u obliczeniowego (konfiguracja środowiska i przetwarzanie danych obrazowania) do wyodrębnienia i walidacji ImAge.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wydłużająca się średnia długość życia oraz starzejąca się populacja świata podkreślają krytyczną potrzebę skutecznych biomarkerów funkcjonalnego lub biologicznego wieku 1,2,3. Te biomarkery są niezbędne do dokładnego przewidywania ryzyka chorób i długości życia, co może znacząco poprawić opiekę geriatryczną i obniżyć związane z tym koszty. Chociaż zegary metylacji DNA (DNAm) poczyniły znaczące postępy w ilościowym określaniu biologicznego starzeniasię 4,5,6, często opierają się na regresji liniowej i wymagają dużych grup grup, potencjalnie pomijając złożone, kontekstowe komponenty biologiczne specyficzne dla osób 7,8. Ponadto techniki oparte na sekwencjonowaniu wymagają lizy komórek, złożonego przygotowania próbek oraz kosztownych odczynników dla każdej komórki, co czyni je droższymi i trudniejszymi przy badaniach o dużej przepustowości, na dużą skalę lub podłużnych, gdzie niszczenie próbki jest wadą9.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy chromatynę opartą na obrazowaniu oraz wiek epigenetyczny (ImAge), nowatorską technikę mającą na celu ilościowe określenie starzenia i odmładzania z rozdzielczością pojedynczych komórek. Technika ta została zastosowana i zweryfikowana w obwodowej krwi myszy oraz różnych narządach stałych, jak opisali Alvarez-Kuglen i in.1. Publikacja ta szczegółowo opisuje zoptymalizowane protokoły, aby mogły być adaptowane i wdrażane przez innych badaczy do różnych zastosowań.

To podejście zasadniczo różni się od tradycyjnych zegarów DNAm, rejestrując wewnętrzne trajektorie związane z wiekiem na podstawie przestrzennej organizacji chromatyny i znaków epigenetycznych w pojedynczym jądrze1. Metody oparte na obrazowaniu oferują wyraźne zalety: są z natury niedestrukcyjne, co oznacza, że komórki nie są niszczone podczas przetwarzania, w przeciwieństwie do metod opartych na sekwencjonowaniach. Ta niedestrukcyjna natura pozwala na zachowanie struktury przestrzennej chromatyny i znaków epigenetycznych na poziomie pojedynczych komórek, zachowując kontekst przestrzenny komórek w tkankach – perspektywę często traconą w konwencjonalnych procesach sekwencjonowania. Ponadto techniki obrazowania są zazwyczaj bardziej opłacalne dla badań na dużą skalę lub podłużnych, ponieważ nie wymagają kosztownych odczynników ani złożonego przygotowania biblioteki na komórkę, co czyni je odpowiednimi do powtarzających się obserwacji w czasie10,11.

Kluczową zaletą ImAge jest zdolność do ujawniania trajektorii związanych z wiekiem jako wewnętrznych głównych cech samych danych, bez konieczności regresji w chronologicznym wieku. ImAge wykazał silną korelację z wiekiem chronologicznym w komórkach monojądrowych krwi obwodowej myszy oraz różnych narządach stałych1. Co istotne, ImAge skutecznie rejestruje oczekiwane zaburzenia do wieku biologicznego, wykazując wzrost po leczeniu chemioterapii oraz spadek wraz z ograniczeniem kalorii i częściowym przeprogramowaniem poprzez przejściową ekspresję OSKM w wątrobie i mięśniach szkieletowych. Ponadto zaobserwowano, że odczyty ImAge są odwrotnie powiązane z aktywnością lokomotoryczną u chronologicznie identycznych myszy, co wskazuje na ich przydatność w pomiarze aspektów wieku biologicznego i funkcjonalnego.

Wdrożenie metodologii ImAge wymaga wiedzy zarówno w procedurach eksperymentalnych w laboratoriach mokrych12 , jak i analizach obliczeniowych1 (Rysunek 1); Dlatego niniejszy artykuł przedstawia kompleksowe, krok po kroku protokoły dla obu aspektów. Ten zoptymalizowany protokół ma na celu ułatwienie szerokiego przyjęcia ImAge, umożliwiając badaczom badanie zmian związanych z wiekiem chromatyny i organizacji epigenetycznej w rozdzielczości pojedynczej komórki w różnych typach komórek i tkankach. W tym protokole wybrano H3K27ac i H3K27me3, dwa markery zapewniające wystarczający kontrast i rozdzielczość do określenia ImAge, jako reprezentatywne znaki. Naukowcy mogą powtórzyć ten protokół, aby ilościowo określić biologiczne starzenie się, ocenić wpływ interwencji na rzecz długowieczności oraz zbadać wrodzoną heterogeniczność procesów starzenia się i odmładzania na poziomie pojedynczego organizmu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzane są zgodnie z wytycznymi i protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytucjonalnych (IACUC) Instytutu Badawczego Scripps (Protokół 09-0004-6). Dane przedstawione w tym manuskrypcie zostały uzyskane z użyciem samców myszy i4F, w wieku od 2 do 14 miesięcy. Narządy zainteresowania (wątroba i mięśnie szkieletowe) zostały pobrane od 13,8-miesięcznych myszy kontrolnych i4F i rodzeństwa miotu, które przez tydzień podawano niską dawkę doksycykliny (0,2 mg/ml)14. Jądra zostały wyizolowane z próbek młodych (3,2 miesiąca), w wieku (13,8 miesiąca) oraz w wieku poddanych doksycyklinie do nadmiernej ekspresji czynników OSKM (starzenie się OSKM).

1. Obrazowanie próbek

  1. Przygotowanie próbki
    1. Zbieraj interesujące narządy (wątrobę i mięśnie szkieletowe) od świeżo rozciętych myszy (lub innych interesujących gatunków) i zamrażaj je na szybko, używając ciekłego azotu. Przechowuj próbki w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
    2. Przenieś organy i tkanki do wcześniej schłodzonej zaprawy i połóż na suchym lodzie. Wlej ciekły azot na zamrożoną tkankę i zmiel za pomocą wcześniej schłodzonego tłuczka. Zmielić próbkę za pomocą wcześniej schłodzonego moździerza i tłuczka, aż uzyskamy jednolity drobny proszek.
    3. Aliquot mielę tkankę za pomocą wcześniej schłodzonej metalowej łopatki w kilka probówek i przechowuje niewykorzystane próbki w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Próbki tkanek zmielonych w probówkach można przechowywać w temperaturze -80 °C lub poddawać izolację jąder.
    4. Ekstrakt jąder z zamrożonych aliquotów, używając komercyjnie dostępnego zestawu Nuclei Lysis Buffer zgodnie z instrukcjami producenta.
    5. Liczenie jąder za pomocą Trypan Blue. Wymieszaj jądra i Trypan Blue w równych proporcjach w osobnej tubie. Przelej 10 μl roztworu jąder Trypan Blue do hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
    6. Rozcieńcz próbki w PBS + 0,5% BSA tak, aby 10 000 jąder można pokryć w objętości 20-30 μL/dołek.
  2. Przygotowanie powłoki
    1. Wprowadź wszystkie istotne metadane do przygotowania powłoki i analizy obliczeniowej do Platemap (udostępnionej w Pliku Uzupełniającym 1). Zapisz identyfikatory próbek (np. liczby lub znaki) w tym samym układzie co faktyczna płytka studni w zakładce sampleID. Zapisz warunki eksperymentalne, w tym wiek próbki, w tym w tym samym układzie co faktyczna płytka studni w zakładce warunków.
      UWAGA: Informacje zawarte w zakładce warunków będą wykorzystywane do identyfikacji grupy wiekowej każdej próby (tj. młodzi lub starsi). Zidentyfikowane grupy wiekowe będą następnie posłużyć jako odniesienia do budowy modelu prognozowania starzenia się (ImAge). Dlatego zakładka warunków musi zawierać dane, które można powiązać z wiekiem, a także inne istotne warunki eksperymentalne, jeśli to konieczne.
    2. Zapisz docelowe biomarkery (np. H3K27me3) w tym samym układzie co faktyczna płytka studni w zakładce kanał# (# zastąpione liczbą). Sprawdź, czy wszystkie kombinacje metadanych są zgodne i poprawnie odzwierciedlone w jednym kolejnym formacie tabeli w zakładce platemap.
      UWAGA: Każda kolumna w tabeli powinna odpowiadać wyznaczonej nazwie zakładki (np. "sampleID"). Dodatkowa zakładka oznaczona jest "metadane" do dokumentowania celów projektu i szczegółów barwienia; Te informacje nie zostaną wykorzystane w analizie danych. Korzystaj z tej zakładki w razie potrzeby.
    3. Eksportuj tab-platemapę w formacie pliku csv z krótką, opisową nazwą projektu (np. project.csv).
      UWAGA: Zakładka metadanych stanowi szablon do podsumowania celów projektu oraz informacji immunobarwnych. Użycie zakładki metadanych w szablonie Platemap jest opcjonalne dla samego procesu powłokowania. Jednak do analizy obliczeniowej wymagane są inne zakładki, w tym sampleID, kanał# (# zastąpiony liczbą).
  3. Płyta 10 000 jąder na odwór w objętości 20 - 30 μL w płycie studni (np. płytki z 384 dołkami). Płyta odwrotna przy 1000 x g (przyspieszenie dziewięć, hamowanie 4) przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Utrwal 1:1 objętości 8% paraformaldehydu (PFA) w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Wykonuj kroki PFA w okapie spalinowym i utylizuj odpady zgodnie z procedurami bezpieczeństwa instytucjonalnego.
  5. Usuń roztwór. Dodaj 30 μL 0,1 M glicyny do PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór. Przemyj 100 μL PBS 2x i dodaj 30 μL PBS do przechowywania.
    UWAGA: Komórki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C lub natychmiast podstąpić immunoznakowanie.
  6. Immunoznakowanie
    1. Usuń PBS. Dodaj 30 μL roztworu blokującego (2% BSA i 0,5% Triton X-100 w PBS) i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Usuń środek blokujący.
    2. Dodaj 25 μL przeciwciał pierwotnych: myszy anty-H3K27ac (1:250) oraz Rabbit anty-H3K27me3 (1:250) rozcieńczone w buforze blokującym (0,4 - 2 μg/mL). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Usuń pierwotny roztwór przeciwciał. Przepraj 100 μL PBS 3x przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    4. Dodaj 25 μL przeciwciał wtórnych: Alexa 488 Donkey Anti-Mouse (1:250) oraz Alexa 555 Donkey Anti-Rabbit (1:250) rozcieńczonych w buforze blokującym (1 - 10 μg/mL). Inkubuj przez 2 godziny w 4 °C lub 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    5. Przepraj 100 μL PBS 3x przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Barw DAPI/Hoechst w stężeniu 30 μL 0,01 mg/mL. Przemyj z 100 μL PBS.
      UWAGA: Przechowywać talerz w temperaturze 4 °C w folii lub natychmiast rozpocząć badania obrazowe. Do etapu segmentacji jąder wymagane jest DAPI/Hoechst.
  7. Obrazowanie
    1. Komórki obrazowe na obrazie o wysokiej zawartości dla maksymalnej rozdzielczości (dla tego zestawu danych użyto 20x, ale zalecane jest 63x).
      UWAGA: Chociaż obrazowanie można wykonać za pomocą dowolnego obrazowania o wysokiej zawartości, protokół ten zakłada płaską strukturę folderów z pobranymi obrazami oraz ogólny format obrazu (np. .tiff) jako wyjście pobranego obrazu (Rysunek 2).
    2. Zbieraj wiele pól na dołek oraz wiele stosów z, najlepiej pokrywając jądra komórkowe od góry do dołu. Pokrycie 10 μm wraz z osią z (np. 20 wycinków z w kroku 0,5 μm) zazwyczaj obejmuje większość jąder komórek myszy. Wielkość i wymagane pokrycie zależą od gatunku i rodzaju komórek, które są przedmiotem zainteresowania. Obrazowanie reprezentatywne pokazano na Rysunku 3.
    3. Przenieś dane obrazowe do komputera, gdzie zostanie przeprowadzona analiza obliczeniowa, zgodnie ze strukturą folderów przedstawioną na Rysunku 2.
    4. Dodaj przedrostek nazwy projektu oznaczony nawiasem kwadratowym z nazwą zdefiniowaną w kroku 1.2.2 powyżej do folderu danych obrazów (np. [project]original_folder_name)

2. Analiza obliczeniowa danych obrazowych

  1. Przygotowanie wymagań do oprogramowania systemowego (wymagane tylko przy początkowej konfiguracji)
    1. Zainstaluj Windows Subsystem for Linux (WSL), jeśli działa na komputerze z Windows, postępując zgodnie z instrukcjami z https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install. Zainstaluj Anacondę lub Minicondę, postępując zgodnie z instrukcjami na https://www.anaconda.com/docs/getting-started/anaconda/main
  2. Przygotowanie środowiska obliczeniowego (wymagane tylko do początkowego przygotowania)
    1. Pobierz skrypty workflow z repozytorium GitHub https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow. Rozpakuj pobrany plik.
      UWAGA: Miejsce przechowywania danych może być wskazane dowolnie; jednak zaleca się wybór katalogu innego niż miejsce przechowywania plików systemowych (np. dysk C w Windows).
    2. Zorganizuj sklonowane repozytorium ImAge tak, aby odpowiadało zakładanej strukturze folderów dla prawidłowego wykonywania skryptów (Rysunek 2).
    3. Otwórz aplikację terminala, jeśli działasz na Linuksie lub macOS. Otwórz aplikację WSL, jeśli działasz na Windowsie.
    4. Zmień folder na sklonowany plik repozytorium. Od tego momentu termin Command: oznacza instrukcję skopiowania i wklejenia kolejnego kodu do aplikacji terminalowej, po czym należy naciśnięcie klawisza Enter .
      Komenda: cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      UWAGA: Zamień "/PATH_TO_CLONED_REPOSITORY" na ustawienie specyficzne dla użytkownika. Na przykład, gdy repozytorium zostanie rozpakowane w folderze "analysis" na dysku D i uzyskane dostęp z WSL, będzie to "/mnt/d/analysis".
    5. Stwórz nowe środowisko obliczeniowe w Pythonie wersji 3.10, korzystając z conda (aplikacja wiersza poleceń zainstalowana z Anaconda/miniconda).
      Command: conda create -n ImAge_workflow python=3.10
    6. Aktywuj nowo utworzone środowisko.
      Komenda: conda aktywuj ImAge_workflow
    7. Zainstaluj poetry (menedżera pakietów w Pythonie) za pomocą instalatora pip (instalator pakietów w Pythonie instalowany podczas tworzenia środowiska ImAge_workflow).
      Polecenie: pip install poezja
    8. Instaluj wymagane pakiety Pythona za pomocą Poezry.
      Polecenie: poetry install
      UWAGA: Upewnij się, że aktualny folder to folder ImAge_workflow, który można zweryfikować, uruchamiając komendę: pwd.
    9. Konfiguruj CUDA w środowisku Conda, aby umożliwić funkcjonalność jednostki graficznej (GPU) w etapie segmentacji dla szybszego przetwarzania (dotyczy to tylko Linuksa lub Windows PC z GPU Nvidia).
      Polecenie: mkdir -p $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d
      echo 'NVIDIA_PACKAGE_DIR=$(nazwa $(python -c "import nvidia; print(nvidia.__file__)"))' >> $CONDA_PREFIKS/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      echo 'for dir in $NVIDIA_PACKAGE_DIR/*; zrobić, jeśli [ -d "$dir/lib" ]; następnie eksportuj LD_LIBRARY_PATH="$dir/lib:$LD_LIBRARY_PATH"; fi done' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      UWAGA: Skrypty automatycznie wykrywają dostępność GPU na serwerze. Jeśli nie ma dostępnych kart graficznych, domyślnie będzie działał na CPU.
  3. Wykonaj obliczenia opisane poniżej.
    UWAGA: Analiza obliczeniowa składa się z czterech etapów: segmentacji jąder, wyodrębniania cech obrazowych, konstrukcji osi starzenia (ImAge) oraz prognozowania ImAge. Każdy proces wykonywany jest za pomocą skryptów Pythona; o1_illumination_correction, o2_segmentation, o3_extract_features i o4_ImAge_validation. Wszystkie te kroki są zawarte w jednym skrypcie Pythona, main.py. Wyodrębnione odczyty ImAge można zwizualizować za pomocą wykresu pudełka i skrzypiec, jak przedstawiono na Rysunku 4. Odczyt ImAge można również wyodrębnić w prostym formacie tabelowym (standardowy format pliku .csv), z przykładami przedstawionymi jako wiersze oraz odpowiadającymi odczytami i metadanymi jako kolumnami. Użytkownicy mają elastyczność przeprowadzania dodatkowych analiz numerycznych odczytów ImAge w razie potrzeby. Te wykresy oraz plik CSV można uzyskać, używając jednego skryptu Pythona, visualization.py. Proces predykcji ImAge wykorzystuje sygnały bootstrapowane uzyskane z pojedynczych komórek w tej samej tkance. Te bootstrapowane sygnały są uśrednionymi sygnałami pochodzącymi z losowego próbkowania i powtarzających się iteracji. Celem tego podejścia jest zapewnienie, że analiza obejmuje najbardziej wiarygodne i reprezentatywne odczyty, przy czym niepewność analizy jest proporcjonalna do wrodzonej heterogeniczności tkanki.
    1. Otwórz aplikację terminala, jeśli działasz na Linuksie lub macOS. Otwórz aplikację WSL, jeśli działasz na Windowsie.
      Komenda: cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      UWAGA: Upewnij się, że aktualny folder to folder ImAge_workflow, który można zweryfikować, uruchamiając komendę: pwd.
    2. Aktywuj środowisko.
      Komenda: conda aktywuj ImAge_workflow
    3. Konfiguruj parametry analizy workflow/pliku main.py w kodzie lub edytorze tekstu (np. aplikacja Notepad, Microsoft Visual Studio Code itp.).
      1. Ustaw nazwę projektu w zmiennej p na krótki, bezpieczny dla systemu plików identyfikator używany do organizacji wyników (np. p = brain_3ages_k27me3).
      2. Ustaw listę kanałów do wyodrębniania cech w CHS. Uwzględnij kanał segmentacyjny, jeśli do analizy wymagane są cechy z tego kanału (chs = ['DAPI', 'H3K27me3', 'H3K27ac']).
      3. Mapowanie identyfikatorów kanałów obrazów z nazw plików na kolumny mapy płyt za pomocą imageIndex. Określ format etykiety kanału używany przez system obrazowania do pobierania danych obrazowych i użyj tej etykiety jako klucza. Przypisz każdą etykietę do dokładnego, na wielka czy zmienionego nagłówka kolumny w mapie płyty zapisanej w kroku 1.2.2 (np. imageIndex = {'1': 'Channel1', '2': 'Channel2', '3': 'Channel3'}).
        UWAGA: Nazwy kolumn są zależne od wielkości liter i muszą odpowiadać plikowi mapy tabliczki.
      4. Ustaw lokalizacje danych: orgDataLoadPath do rootu datasetu, orgDataSubFolder do podfolderu obrazu, jeśli to konieczne, oraz resultsSavePath do root output.
      5. Potwierdź rozszerzenie pliku w imageFileFormat i edytuj imageFileRegEx, aby używać nazwowych grup przechwytujących wszystkie wymagane części: row, col, field, zposition i channel. Użyj następującej składni: (? P\d+), gdzie GROUP jest zastępowany przez wiersz, col, field, zposition lub channel.
        UWAGA: Zaktualizuj regex, jeśli nazwy plików się różnią; wszystkie nazwane grupy muszą poprawnie się rozsłużyć (pars). Na przykład nazwa pliku r01c11f01p01-ch1sk1fk1fl1.tiff powinna zostać przekonwertowana na następującą: r(? P\d+)c(? P\d+)f(? P\d+)p(? P\d+)-ch(? P\d+)sk1fk1fl1\.tiff.
      6. Ustaw kanał segmentacji w segmentation_ch na kanał jądrowy używany do wykrywania obiektów (np. segmentation_ch = 'DAPI').
      7. Zdecyduj, czy użyć korekcji iluminacji, ustawiając illumiCorrection. Ustaw na True, aby obliczać i stosować modele BaSiC; ustawiony na False do przetwarzania obrazów RAW.
        UWAGA: Dla płyt z ≥ 25 otworami zaleca się korektę oświetlenia, aby zmniejszyć systematyczne błędy.
      8. Ustaw fizyczny rozmiar woksela w mikrometrach w voxel_dim jako [z, y, x]. Użyj metadanych mikroskopowych do określenia odstępów (np. voxel_dim = [1,0, 0,6, 0,6]). Zapisz plik i zamknij edytor po weryfikacji każdego parametru
    4. Uruchamiaj skrypty do uzyskania odczytów ImAge i weryfikacji. Podczas uruchamiania skryptu nie zamykaj terminala ani aplikacji WSL.
      Polecenie: Python workflow/main.py
      UWAGA: Skrypt (main.py) obejmuje wszystkie etapy, w tym segmentację, ekstrakcję cech, konstrukcję osi ImAge oraz domyślne przewidywanie. Skrypt generuje szacowany czas ukończenia każdego etapu (np. segmentacja jąder). Każdy proces (np. o1_illumination_correction) generuje pliki pośrednie w formacie .pickle, zawierające wyniki z każdego procesu. Jednak jest to przeznaczone wyłącznie do transferu danych między procesami, aby zapewnić ustandaryzowane przetwarzanie i nie jest przeznaczone do manipulacji przez użytkownika, jak opisano w tym artykule. Niemniej jednak, jeśli użytkownicy muszą je zmodyfikować lub adoptować, zapoznaj się z dokumentacją dołączoną do każdej funkcji Pythona dotyczącą kształtu i typówdanych 13.
    5. Wizualizuj wyniki i eksportuj surowe odczyty ImAge do dalszej analizy na zewnętrznem oprogramowaniu. Polecenie: workflow/visualization.py w Pythonie
      UWAGA: Ten etap generuje wykresy i tabele odczytów ImAge, a pliki znajdują się odpowiednio na fig_o4_ImAge_validation_VIOLIN i export_o4_ImAge_validation (Rysunek 2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazy reprezentatywne powinny być dobrze zaludnione, aby uzyskać pojedyncze komórki, jednak poszczególne jądra nie powinny się stykać, ponieważ pogorszy to jakość segmentacji jąder komórkowych. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne obrazowanie umożliwiające uzyskanie solidnych wyników analizy obliczeniowej.

Wyniki opisane w rękopisie tej metody zostały zaadaptowane z rękopisu ImAge autorstwa Alvareza-Kuglena i in.1. ImAge skutecznie wykrył...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie próbki
Do przygotowania próbki natychmiast pobieraj interesujące tkanki i natychmiast zamrażaj je w ciekłym azocie. Podczas mielenia tkanek moździerzem można użyć silikonowej osłony moździerza, aby zapobiec utracie próbki. Dodaj więcej ciekłego azotu, jeśli tkanka jest trudna do rozdrobnienia. W przypadku bardziej delikatnych tkanek próbki można również przetwarzać na świeżo (zamiast mrożonych), aby zmniejszyć zakłócenia mechaniczne lub uszkodzenia tkanek. Protokoły izolacji jąder mogą...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wszystkim obecnym i byłym członkom laboratorium Terskikh za pomoc w tworzeniu protokołów i ram obliczeniowych. Prace te były wspierane przez granty National Institutes of Health R21 AG068913, R21 AG075483, R21 AG083782 oraz Future Health Research and Innovation Fund Departamentu Zdrowia Australii Zachodniej, BU/PG: 01760/47004300 do A.V.T.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Albumina surowicy bydlęcejSigma-Aldrich A9647
Przeciwciało przeciwwtórne o silnej adsorbacji krzyżowej przeciwciała przeciwciała przeciwmysza antymysich osioł, Alexa 488 InvitrogenA-21202
Przeciwciało przeciwwtórne przeciwciało przeciw królikom osiołka (H+L) wysoce krzyżowo adsorbowane, Alexa 555InvitrogenA-31572
GlycineBio-Rad161-0718
Przeciwciało histon H3K27ac (mAb) Motyw aktywny39685
Przeciwciało histonu H3K27me3 (pAb)  Motyw aktywny39155
Hoechst 33342InvitrogenH3570
Zestaw do izolacji jąder: Nuclei EZ PrepSigma-AldrichNUC101
Operetta CLS High Content ImagerRevvityhttps://www.revvity.com/au-en/product/operetta-cls-system-hh16000020
Paraformaldehyd 16% roztwór wodny EM klasyNauki o mikroskopii elektronowej15710-S
PBSThermo FisherAM9624
Mikropłytka PhenoPlate 384-dołkowaRevvity6057302
Triton-XSigmaT8787
Roztwór Trypan Blue 0,4% Gibco  15250061 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvarez-Kuglen, M., et al. ImAge quantitates aging and rejuvenation. Nat Aging. 4, 1308-1327 (2024).
  2. Zampino, M., et al. Biomarkers of aging in real life: three questions on aging and the comprehensive geriatric assessment. GeroScience. 44 (6), 2611-2622 (2022).
  3. Moqri, M., et al. Biomarkers of aging for the identification and evaluation of longevity interventions. Cell. 186 (18), 3758-3775 (2023).
  4. Bell, C. G. DNA methylation aging clocks: challenges and recommendations. Genome Biol. 20 (1), 249(2019).
  5. Horvath, S., Raj, K. DNA methylation-based biomarkers and the epigenetic clock theory of ageing. Nat Rev Genet. 19 (6), 371-384 (2018).
  6. Field, A. E., et al. DNA methylation clocks in aging: Categories, causes, and consequences. Mol Cell. 71 (6), 882-895 (2018).
  7. Galow, A. M., Peleg, S. How to slow down the ticking clock: Age-associated epigenetic alterations and related interventions to extend life span. Cells. 11 (3), 468(2022).
  8. Westneat, D. F., Wright, J., Dingemanse, N. J. The biology hidden inside residual within-individual phenotypic variation. Biol Rev Camb Philos Soc. 90 (3), 729-743 (2015).
  9. Lähnemann, D., et al. Eleven grand challenges in single-cell data science. Genome Biol. 21 (1), 31(2020).
  10. Ninomiya, K. ImAge: quantifying epigenetic ageing with single-cell images. Nat Rev Cancer. 25, 755(2025).
  11. Stepanov, A. I. Genetically encoded epigenetic sensors for visualization of H3K9me3, H3K9ac and H3K4me1 histone modifications in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 733, 150715(2024).
  12. Farhy, C., et al. Improving drug discovery using image-based multiparametric analysis of the epigenetic landscape. Elife. 8, e49683(2019).
  13. ImAge_workflow. , https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow (2025).
  14. Chondronasiou, D., et al. Multi-omic rejuvenation of naturally aged tissues by a single cycle of transient reprogramming. Aging Cell. 21 (3), e13578(2022).
  15. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189 (5), 777-782 (2010).
  16. The Open Microscopy Environment. , bioformats. https://github.com/ome/bioformats (2025).
  17. González-Ramírez, M., et al. Differential contribution to gene expression prediction of histone modifications at enhancers or promoters. PLoS Comput Biol. 17 (9), e1009368(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biomarker chromatynyocena wieku biologicznegoizolacja j der kom rkowychbarwienie immunofluorescencyjnekomputerowa analiza obrazumodyfikacja histon wstrategie odm adzania

Powiązane artykuły