Specyficzna dla podtypu komórki analiza proteasomu błony neuronalnej w neuronach somatosensorycznych

Funkcja proteasomu jest niezbędna do optymalnego rozwoju i utrzymania obwodowego układu nerwowego (PNS)1,2,3,4,5,6. Zarówno badania in vitro, jak i in vivo z wykorzystaniem inhibitorów proteasomów wykazują, że aktywność proteasomów ma kluczowe znaczenie dla rozwoju neurologicznego, mielinizacji, pobudliwości i funkcji komórek glejowych 7,8,9,10. Ponadto chemioterapia oparta na inhibitorach proteasomów wywołuje bolesne neuropatie u 30-60% pacjentów, często charakteryzujące się przewlekłym bólem i zmienionym czuciem w kończynach 8,9,11,12,13. Co ciekawe, podawanie małych dawek tych samych inhibitorów zmniejsza wrażliwość na bodźce bolesne, co sugeruje złożoną rolę proteasomu w przetwarzaniu sensorycznym ^6,14,15. Jednak pomimo tych szeroko zakrojonych badań, specyficzna funkcja proteasomów w PNS pozostaje słabo poznana.

Proteasomy są podstawową maszynerią degradacji białek we wszystkich dziedzinach życia i są niezbędne do utrzymania homeostazy białek¹⁶. Proteasom rdzeniowy 20S składa się z czterech pierścieni heptamerycznych podjednostek α, β, β α i pośredniczy w niezależnej od ubikwityny degradacji białek ^17,18. Asocjacja z cząstkami regulatorowymi tworzy proteasom z pokrywą 26S i 30S, który pośredniczy w zależnej od ubikwityny degradacji białek ^4,17. W neuronach proteasomy zostały zidentyfikowane we wszystkich przedziałach komórkowych, a ich subkomórkowa lokalizacja wpływa na funkcję¹⁹. Jednak wielu powszechnie stosowanych inhibitorów proteasomu brakuje swoistości, aby selektywnie celować w różnie zlokalizowane populacje proteasomów.

Rzeczywiście, przy użyciu nieprzepuszczalnych dla błony inhibitorów proteasomu i znakowania przeciwciał w nieprzepuszczalnych komórkach, stwierdzono, że specyficzny dla neuronów kompleks proteasomu lokalizuje się w błonie plazmatycznej w podzbiorze neuronów somatosensorycznych²⁰. Analiza scRNA-seq pierwotnych neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG), podzielonych na populacje NMP⁺ i NMP^- poprzez karmienie przeciwciałami przeciwko podjednostce proteasomu i sortowanie FACS, dała wynik 20 transkrypcyjnie odrębnych klastrów komórkowych²⁰. Dalsza analiza wykazała, że komórki NMP⁺ grupowały się tylko w 3 z 20 klastrów. Korzystając z zestawów markerów genowych dla określonych podtypów neuronów, zidentyfikowano 13 różnych podtypów neuronów somatosensorycznych²⁰. Większość neuronów NMP⁺ skupiała się w neuronach czuciowych MrgprA3⁺ i Cysltr2^{+ 20}. Minimalna liczba komórek NMP⁺ skupiła się w trzecim klastrze, w którym nie zidentyfikowano żadnych konkretnych zestawów genów, a zatem klaster ten pozostał nieprzypisany^{do 20}. Neurony MrgprA3 ⁺ i Cysltr2 ⁺ są nocyceptorami typu C, wrażliwymi na bodźce cieplne, mechaniczne i świądowe, odpowiadającymi odpowiednio podtypom neuronów CGRP-θ i SST^21,22. Spośród 20 zidentyfikowanych klastrów komórkowych, 7 klastrów NMP^- wykazywało ekspresję markerów genowych zgodnych z komórkami nieneuronalnymi, w tym komórkami Schwanna, komórkami glejowymi satelitarnymi i komórkami odpornościowymi, a także pozostawiono nieprzypisanych²⁰. Spodziewano się tych populacji komórek, ponieważ nie jest możliwe oddzielenie komórek nieneuronalnych od neuronalnych podczas hodowli neuronów DRG²⁰.

Badając jego funkcję, hamowanie in vitro NMP zmieniło pobudliwość neuronów na stymulację KCl, histaminy i 5'-trifosforanu αβ-metylenoadenozyny²⁰. In vivo hamowanie NMP zmniejszało wrażliwość na bodźce mechaniczne i bólowe bez wpływu na czucie termiczne²⁰. Odkrycia te ujawniają, że NMP jest kluczowym regulatorem odczuwania bólu i swędzenia oraz potencjalnym celem terapeutycznym w leczeniu bólu²⁰. Jednak specyficzne mechanizmy łączące aktywność NMP z rozwojem bólu w różnych kontekstach chorobowych pozostają słabo poznane. W związku z tym uzasadnione są dalsze badania nad dynamiką i funkcją ekspresji NMP w stanach związanych z bólem i neuropatią.

W tym artykule opisano solidny przepływ pracy (ryc. 1) do identyfikacji i izolowania populacji neuronów NMP⁺ DRG. Takie podejście umożliwia specyficzne dla typu komórki badanie dynamiki ekspresji NMP przy użyciu sortowania FACS, sekwencjonowania scRNA i barwienia immunologicznego. Podejścia te umożliwiają analizę ekspresji NMP w wysokiej rozdzielczości w sposób specyficzny dla typu komórki, co można wykorzystać do zbadania roli NMP w normalnych i różnych stanach związanych z bólem.

Wszystkie metody opisane na zwierzętach doświadczalnych zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Loyola University of Chicago Stritch School of Medicine.

1. Przygotowanie roztworów mineralizacyjnych, pożywek DRG i pożywek FACS

1. Przygotować kompletny roztwór soli fizjologicznej (CSS) zawierający 137 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1 mM MgCl₂·6H₂O, 25 mM sorbitolu, 10 mM HEPES i 3 mM CaCl₂·2H₂O. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą NaOH i wysterylizuj filtr.
2. Przygotować roztwór roboczy mieszaniny enzymów dysocjacji tkanek (umiarkowane rozcieranie), łącząc 190 μl podstawowego (5 mg/ml w H₂O), 84 μl 50 mM EDTA i 6,5 ml CSS. Przygotuj świeże i wysterylizuj filtrem przed użyciem.
3. Przygotować mieszaninę enzymów dysocjacji tkanek (niskie rozcieranie) i roztwór papainy zawierający 190 μl roztworu podstawowego mieszanki enzymów, 150 μl papainy, 84 μl 50 mM EDTA i 6,5 ml CSS. Przygotuj świeże i wysterylizuj filtrem przed użyciem.
4. Przygotować roztwór BSA/TI/DMEM, łącząc 7,5 mg inhibitora trypsyny i 7,5 mg BSA w 5 ml pożywki DMEM/F12. Przygotuj świeże i wysterylizuj pod filtrem.
5. Przygotuj pożywkę neuronową DRG, łącząc 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny, 1% glutaminy i 2% 50-krotnego suplementu B27 w 430 ml DMEM/F12.
6. Przygotować bufor FACS, łącząc 1% FBS, 1x PBS, 25 mM HEPES i 1% penicyliny/streptomycyny w autoklawowanej wodzie. Przygotuj świeże i wysterylizuj pod filtrem.
7. Dwadzieścia cztery godziny przed rozpoczęciem protokołu pokryj dwie probówki okrągłodenne z polistyrenu o pojemności 5 ml, napełniając je buforem FACS i umieszczając w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny neuronów DRG

1. Zbierz wszystkie DRG od 4-6 myszy P20-P23 zgodnie z wcześniej opisanymi metodami ^20,23.
2. Przenieść DRG do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodać 7 ml roztworu roboczego mieszaniny enzymów dysocjacji tkanek (umiarkowane rozcieranie). Inkubować z delikatnym mieszaniem (obracając) w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
3. Obracaj zwoje w dół przy 120 × g przez 2 minuty. Ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić zwoje w 7 ml mieszaniny enzymów dysocjacji tkanek (niskie rozcieranie) i roztworu roboczego papainy. Inkubować z delikatnym mieszaniem (obracając się) w temperaturze 37 °C przez 15 min.
4. Wirować z prędkością 120 × g przez 2 minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić zwoje nerwowe w 500 μl roztworu BSA/TI/DMEM.
5. Rozetnij zwoje jaj 12-16 razy za pomocą 1 ml zatkanej, polerowanej ogniowo szklanej pipety Pasteura.
6. Odfiltruj zanieczyszczenia komórkowe, przepuszczając komórki przez sitko o wielkości 40 μm. Umyj sitko 1 ml roztworu BSA/TI/DMEM, aby zapewnić pobranie wszystkich neuronów DRG. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
7. Wirować z prędkością 120 × g przez 2 minuty. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad w 1 ml pożywki DRG.
   UWAGA: Jest to jednokomórkowa zawiesina neuronów DRG.

3. Karmienie przeciwciałami w celu znakowania neuronów NMP-dodatnich

1. Podziel zawiesinę neuronu DRG na dwie probówki o pojemności 1,5 ml, z których każda zawiera 500 μl, i oznacz dwie probówki: "pierwotna" i "bez pierwotnej".
2. Dodać 20 μl koziego przeciwciała anty-proteasomu 20S podjednostki alfa 2 (PSMA2) do "pierwotnej" znakowanej probówki (rozcieńczenie 1:25).
   1. Opcjonalnie: Aby przetestować integralność błony i swoistość przeciwciała PSMA2, dołącz dodatkową próbkę pierwotnych DRG inkubowanych z ciężkim łańcuchem anty-neurofilamentowym (NF-H) kurczaka (1:1,000), a następnie anty-kurczaka (np. 488-sprzężonym) wtórnym (1:250) (krok 3.10).
      UWAGA: Kontrola znakowania anty-NF-H powinna skutkować brakiem znakowania komórkowego, jeśli błona neuronalna jest nienaruszona.
3. Inkubować komórki pod delikatnym mieszaniem przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
4. Ciepło przefiltrowany, wysterylizowany 1x PBS podczas inkubacji przeciwciał pierwotnych.
5. Odwirować probówki o masie 200 × g przez 2 minuty i usunąć 90% supernatantu (wyrzucić).
6. Zawieś neurony w 500 μl ciepłego 1x PBS. Inkubować probówki, delikatnie mieszając przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.
7. Powtórz kroki 3.5-3.6, co daje w sumie trzy prania.
8. Podczas gdy etapy mycia są w toku, przygotuj przeciwciało drugorzędowe, rozcieńczając 4 μl antykoziej IgG (fluoroforu 555 nm) w 1,000 μl ciepłej pożywki DRG (rozcieńczenie 1:250).
9. Po trzecim przemyciu ponownie zawiesić probówkę "pierwotną" i "bez pierwotnej" w 500 μl roztworu przeciwciała wtórnego.
   UWAGA: Od tego momentu chroń rurki przed światłem, owijając je folią aluminiową.
10. Inkubować probówki, delikatnie mieszając przez 40 minut w temperaturze 37 °C.
11. Umyj komórki, powtarzając kroki 3,5-3,6, co daje w sumie trzy prania.
12. Po trzecim płukaniu ponownie zawiesić neurony w 300 μl buforu FACS. Przenieś zawieszone komórki do oddzielnych probówek z okrągłym dnem o pojemności 5 ml z polistyrenu i umieść na lodzie w wiaderku z pokrywką w celu ochrony przed światłem.
13. Umieść wstępnie poddane obróbce probówki okrągłodenne zawierające bufor FACS z poprzedniego dnia w pojemniku na lód wraz z probówkami zawierającymi komórki i przejdź do etapu sortowania FACS.

4. Separacja neuronów NMP-dodatnich (NMP⁺) i NMP-ujemnych (NMP^-) poprzez sortowanie FACS

1. Natychmiast po podaniu przeciwciał i znakowaniu neuronów DRG, należy przenieść komórki i powlekane probówki do sortera FACS.
2. Dodaj 7-aminoaktynomycynę D (7-AAD) (1:1,000) zarówno do probówki "pierwotnej", jak i "bez pierwotnej". Inkubować przez 10-30 minut na lodzie.
   UWAGA: 7-AAD służy do wykluczania martwych komórek z procesu sortowania.
3. Usuń bufor FACS z probówek, które były powlekane przez noc i zastąp 1 ml świeżego buforu FACS. Rurki te służą jako probówki zbiorcze dla posortowanych neuronów.
4. Użyj rurki oznaczonej jako "brak podstawowej", aby ustawić parametry i bramkowanie dla nieznakowanych neuronów.
5. Zastosuj bramkowanie z rozproszeniem do przodu (FSC), aby wyizolować komórki zgodne z wielkością neuronów czuciowych. Średnice neuronów czuciowych wahają się od 10 do 50 μm.
6. Zastosuj bramkowanie z rozproszeniem bocznym (SSC), aby wykluczyć martwe komórki i szczątki (rozproszenie po dolnej stronie) oraz wyizolować zdarzenia zgodne z ziarnistością neuronów DRG (większe rozproszenie boczne).
7. Załaduj rurkę "pierwotną" i ustaw parametry bramkowania zgodnie z próbką "bez pierwotnej", aby wykryć nieznakowane (NMP^-) i 555-dodatnie (NMP⁺) populacje neuronów.
8. Używając dyszy 100 μm i ciśnienia sortowania 15-20 psi, posortuj neurony na 555⁺ i 555^-.
9. Przejdź do dalszej analizy posortowanych neuronów.

5. Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA neuronów NMP⁺ i NMP^-

1. Przenieś posortowane komórki do probówek o pojemności 1,5 ml i umieść na lodzie. Przenieś komórki do rdzenia sekwencjonowania pojedynczej komórki.
2. Wykonaj sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki na neuronach ^{posortowanych} NMP⁺ i NMP na głębokości od 30 000 do 100 000 odczytów na komórkę.
3. Analizuj dane sekwencyjne scRNA za pomocą różnych swobodnie dostępnych programów do generowania klastrów komórek zgodnie z określonymi profilami ekspresji genów. Aby uzyskać więcej informacji na temat wcześniej używanych etapów analizy i programów, zapoznaj się z Villalón Landeros et ^al.20.
4. Skonstruuj listę określonych markerów genetycznych, aby zidentyfikować poszczególne populacje neuronów, korzystając z dostępnych baz danych, takich jak https://painseq.shinyapps.io/harmonized_painseq_v2/ lub https://kleintools.hms.harvard.edu/tools/springViewer_1_6_dev.html?datasets/Sharma2019/all
5. Użyj listy określonych markerów genetycznych, aby zidentyfikować wynikowe klastry komórek.
   UWAGA: Poprzednio przeprowadzona analiza sekwencyjna scRNA została przeprowadzona przez niezależną firmę konsultingową (www.cmcherryconsulting.com).

6. Pierwotne kultury wzbogaconych neuronów NMP⁺ i NMP^-

1. Dzień przed eksperymentem umieścić okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm na 24-dołkowej płytce hodowlanej (1 szkiełko nakrywkowe/studzienkę) i przemywać 70% etanolem przez 15 minut. Następnie spłucz sterylną wodą 3x i wysusz na powietrzu w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych.
2. Po wyschnięciu szkiełek nakrywkowych pokryj je 0,1 mg/ml bromowodorkiem poli-L-lizyny (PLL) i umieść na noc w temperaturze 4 °C.
3. W dniu eksperymentu usuń PLL, spłucz szkiełka nakrywkowe sterylną wodą 3x i pozostaw do wyschnięcia w kapturze do hodowli tkankowej.
   UWAGA: PLL można zapisać i ponownie wykorzystać.
4. Rozcieńczyć 10 μl 1 mg/ml lamininy w 125 μl pożywki DRG i umieścić 20-30 μl na środku każdego szkiełka nakrywkowego.
5. Pokryj szkiełka nakrywkowe lamininą przez co najmniej 40 minut przed użyciem.
6. Przenieść komórki posortowane metodą FACS do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 200 × g przez 5 minut w celu zebrania komórek. Usuń supernatant i ponownie zawieś neurony w 50 μl ciepłej pożywki DRG.
7. Odessać lamininę ze szkiełka nakrywkowego i pozostawić szkiełko nakrywkowe do wyschnięcia.
8. Wysiew 15-20 μl zawieszonych neuronów na każdym szkiełku nakrywkowym. Ostrożnie przenieść płytkę ze szkiełkami nakrywkowymi z nasionami do inkubatora do hodowli tkankowych i inkubować przez co najmniej 30 minut (nie więcej niż 1 godzinę), aby umożliwić przyleganie komórek.
9. Przenieść płytkę z powrotem do kaptura do hodowli tkankowej i dodać 1 ml sterylnej, ciepłej pożywki DRG do każdej studzienki zawierającej komórki na szkiełkach nakrywkowych.
   UWAGA: Opuść końcówkę pipety do dolnego rogu dołka i dozuj powoli, aby uniknąć dotykania szkiełka nakrywkowego i niszczenia komórek. Zbyt szybkie dodawanie pożywki może powodować turbulencje i przemieszczenie komórek.
10. Utrzymuj kultury w temperaturze 37 °C przy wilgotności 5%_CO2/95% przy 75% wymianie pożywki co 2-3 dni.

7. Analiza ekspresji NMP specyficzna dla typu komórki

1. Przygotuj płytkę hodowlaną o średnicy 140 mm lub tacę do barwienia immunofluorescencyjnego, wykładając ją dużym kawałkiem parafilmu.
2. Za pomocą sterylnych kleszczy 5/45 przenieś szkiełka nakrywkowe z naczynia do hodowli tkankowej na parafilm na tacy do barwienia, upewniając się, że strona zawierająca neurony DRG jest skierowana do góry.
3. Dodaj 100 μl podłoża DRG do każdego szkiełka nakrywkowego na parafilmie, aby zapobiec wysychaniu komórek.
   UWAGA: Płyny należy dodawać, pipetując powoli tuż nad krawędzią szkiełka nakrywkowego.
4. Rozcieńczyć kozie przeciwciało pierwszorzędowe anty-PSMA2 w ciepłym podłożu DRG w rozcieńczeniu 1:20.
5. Używając aspiratora wyposażonego w niefiltrowaną końcówkę P10, powoli usuwaj podłoże z szkiełka nakrywkowego, zasysając je od krawędzi. Dodać 100 μl koziego roztworu przeciwciała anty-PSMA2 do szkiełek nakrywkowych i inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut.
6. Ostrożnie odessać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego ze szkiełek nakrywkowych. Dodać 100 μl PBS (w temperaturze pokojowej) i inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej do umycia.
7. Odessać PBS ze szkiełka nakrywkowego i powtórzyć dodawanie i aspirację PBS, w sumie trzy płukania.
8. Przygotować przeciwciało drugorzędowe antykozie (np. sprzężone z 555) w ciepłym podłożu DRG w rozcieńczeniu 1:250.
9. Po trzecim przemyciu dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do szkiełka nakrywkowego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut.
   UWAGA: Od tego kroku naprzód chroń ogniwa przed światłem.
10. Odessać roztwór przeciwciała drugorzędowego ze szkiełka nakrywkowego i przemyć 3 razy, jak opisano w krokach 7.6-7.7.
11. Usuń ostatnie płukanie PBS i utrwal komórki, dodając 100 μl roztworu utrwalającego zawierającego 4% paraformaldehydu (PFA), 4% sacharozy w 1x PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
12. Odessać utrwalacz i przemyć 3x, powtarzając kroki 7.6-7.7.
13. Przepuszczalność komórek poprzez dodanie 100 μl 0,1% niejonowego detergentu (np. Triton X-100) w 1x PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
14. Odessać roztwór przepuszczalny i przemyć 3x, powtarzając kroki 7.6-7.7.
15. Dodać 100 μl roztworu blokującego składającego się z 5% FBS, 5% surowicy osła w 1x PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 min.
16. Przygotować mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych specyficznych dla komórek neuronów DRG zgodnie z następującymi rozcieńczeniami w roztworze blokującym: peptyd związany z genem antykalcytoniny królika (CGRP) (1:500); izolektyna B4, koniugat biotyny (IB4) (1:50); Anty-NF-H kurczaka (1:1000).
    UWAGA: Przeciwciała te nie zakłócają się nawzajem i mogą być dodawane do siebie w tym samym roztworze.
17. Usunąć roztwór blokujący i dodać pierwszorzędową mieszaninę przeciwciał do szkiełka nakrywkowego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
18. Usunąć roztwór przeciwciał i przemyć 3x, powtarzając kroki 7.6-7.7.
19. Przygotować roztwór mieszaniny przeciwciał drugorzędowych, rozcieńczając streptawidynę (np. 647-sprzężoną), anty-królika osła (np. 488-sprzężoną) i anty-kurczaka osła (np. 405-sprzężoną) do 1:500 każdy.
20. Usunąć ostatnie przepłukanie PBS i dodać 100 μl roztworu przeciwciał wtórnych do szkiełek nakrywkowych. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
21. Umyj 3x, powtarzając kroki 7.6-7.7.
22. Opcjonalnie: Przygotuj plamę jądrową o stężeniu 1-10 μg/ml. Dodać 100 μl roztworu barwienia jądrowego, inkubować przez 30 s w temperaturze pokojowej i przemyć 2x wodą dejonizowaną (diH₂O), powtarzając kroki 7,6-7,7.
23. Odessać ostatnie płyn z szkiełka nakrywkowego i za pomocą kleszczyków z cienką końcówką podnieść szkiełko nakrywkowe z parafilmu. Zetrzyj nadmiar płynu, delikatnie dotykając krawędzi szkiełka nakrywkowego do niestrzępiącej się chusteczki.
24. Umieścić kroplę 7 μl podłoża montażowego na szkiełku mikroskopowym. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na kropli podłoża montażowego, upewniając się, że komórki są skierowane w dół i stykają się z podłożem.
25. Umieść szkiełka mikroskopowe z szkiełkami nakrywkowymi w ciemnej, suchej szufladzie lub pudełku na co najmniej 1 godzinę w celu wyschnięcia i uszczelnienia krawędzi szkiełka nakrywkowego. Zakończ uszczelnianie krawędzi szkiełek nakrywkowych szybkoschnącym lakierem do paznokci i odczekaj 10-15 minut przed obrazowaniem.
26. Slajdy obrazowe za pomocą fluorescencyjnego lub wirującego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w odpowiednie filtry światła do wizualizacji fluorescencji niebieskiej, zielonej, czerwonej i dalekiej czerwieni.

Zdolność do rozróżnienia NMP i wewnątrzkomórkowych proteasomów opiera się na metodach znakowania nieprzepuszczalnych dla błony. Podawanie przeciwciał umożliwia stosowanie przeciwciał specyficznych dla podjednostki proteasomu na żywych neuronach do znakowania proteasomów dostępnych tylko z zewnątrz komórki. Ze względu na swoją wielkość i hydrofilowość przeciwciała nie są w stanie przekroczyć nienaruszonych błon komórkowych24. Żywe neurony utrzymują integralność błony, zapobiegając przedostawaniu się przeciwciał do komórki. Korzystając z tego podejścia, możliwe jest wiarygodne oznakowanie NMP i odróżnienie neuronów, które go wyrażają (NMP+) od tych, które go nie wyrażają (NMP-) (Figura 2A). Komórki kontrolne, które otrzymują tylko wtórne znakowanie przeciwciałami, nie wykazują znakowania NMP (Figura 2B). Co więcej, metoda ta pokazuje, że tylko subpopulacja neuronów DRG wyraża NMP. Aby rozdzielić neurony DRG na populacje NMP+ i NMP- do dalszych badań, użyj sortowania FACS. Sortowanie komórek neuronów znakowanych NMP przyniosło spójne wyniki. Sorter jest najpierw dostosowywany w celu wykluczenia martwych komórek i zanieczyszczeń poprzez zastosowanie strategii bramkowania rozpraszania do przodu i z boku w celu wyizolowania zdarzeń zgodnych z rozmiarem (średnica >10 μm) i ziarnistością neuronów DRG. Komórki są następnie sortowane do populacji NMP+ i NMP- w oparciu o obecność lub brak fluorescencji 555-dodatniej (ryc. 3A). Sortowanie FACS pokazuje, że neurony NMP + DRG stanowią około 4% posortowanej populacji komórek, podczas gdy ~ 40-60% komórek to NMP- (Figura 3B).

Bezpośrednio po sortowaniu neuronów NMP+ i NMP- przez FACS, sekwencja scRNA jest przeprowadzana w dalszych badaniach w celu analizy ekspresji genów zależnej od NMP w różnych populacjach neuronów. Reprezentatywne wyniki tej analizy sekwencjonowania przedstawiono w Villalón Landeros et al.20. Co ważne, posortowane komórki pozostają żywotne do hodowli, umożliwiając badanie wzbogaconych populacji neuronów NMP+ i NMP- za pomocą markerów specyficznych dla typu komórki (NF-H, CGRP, IB4) (Figura 4). Pokazuje to, że przepływ pracy tworzy żywotne, możliwe do analizy populacje zarówno do analiz molekularnych, jak i opartych na kulturach.

Rysunek 1: Przepływ pracy do znakowania, sortowania komórek i dalszej analizy neuronów NMP+ i NMP-DRG. Ogólny przegląd kroków wymaganych do uzyskania neuronów DRG, identyfikacji i wyizolowania komórek wykazujących ekspresję NMP, a następnie dogłębne sekwencjonowanie scRNA w celu profilowania ekspresji specyficznego dla typu komórki lub analizy dynamiki ekspresji NMP oparte na hodowli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Karmienie przeciwciałami w zawiesinie pojedynczej komórki. (A) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne neuronów w zawiesinie wykazujące selektywne znakowanie komórek NMP+ (czerwonych) przy użyciu przeciwciała przeciwko podjednostce proteasomu PSMA2. (B) Nie zaobserwowano znakowania w kontroli pierwszorzędowej przeciwciał. Zielona fluorescencja jest reprezentatywna dla normalnej autofluorescencji komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Aktywowane fluorescencją sortowanie komórek neuronów NMP+ znakowanych Alexa Fluor 555. (A) Wykres FACS (po prawej) pokazuje identyfikację neuronów NMP+ znakowanych Alexa Fluor 555. Wykres FACS (po lewej) nie pokazuje wykrywania 555-dodatnich neuronów w kontroli bez podstawowego. (B) Kwantyfikacja posortowanych populacji neuronów wykazująca, że neurony NMP- reprezentują ~ 46% posortowanych komórek, podczas gdy neurony NMP+ reprezentują ~ 4%. n = 2 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Znakowanie specyficzne dla typu komórki w posortowanych kulturach neuronalnych. Barwienie immunofluorescencyjne kultur neuronalnych w dniu 4 wykazało reprezentatywne znakowanie podtypów neuronów NF-H (zielony), CGRP (magenta) i IB4 (żółty). Kolor niebieski przedstawia barwienie jądrowe z Hoechstem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.