Artykuł metodologiczny

Modelowanie dysplastycznej i funkcjonalnej naprawy płuc pęcherzyków płucnych po zakażeniu grypą

885 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69062

⸱

19 września 2025

 ,  ,  , 
1Cancer and Developmental Biology Laboratory, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące podawania IAV w ciągu nosa oraz dalszej analizy uszkodzeń płuc myszy i związanych z tym zmian transkrypcyjnych typów komórek płucnych.

Streszczenie

Zakażenie wirusowe powoduje zarówno ostre, jak i długotrwałe uszkodzenia pęcherzyka płucnego, wyspecjalizowanej struktury tkanki odpowiedzialnej za wymianę gazów między układem sercowo-naczyniowym a środowiskiem zewnętrznym. Zakażenie wirusem grypy A (IAV) u myszy stanowi model translacyjny odpowiedzi ludzkiego płuca na infekcję wirusową i wywołuje zarówno przejściowe, jak i trwałe zmiany stanu komórkowego w pęcherzyku płucnym. W niektórych przypadkach nieprawidłowe stany komórkowe wywołane uszkodzeniem wirusowym, które nie ustępują z czasem, mogą trwale upośledzić kluczową funkcję wymiany gazowej płuc. Niniejszy artykuł demonstruje metody zakażenia nosa myszy IAV A/PR/8/34 oraz charakteryzuje przejściowe i długotrwałe zmiany w składzie komórkowym i strukturze tkanek uszkodzonych płuc. Model ten umożliwia szczegółowe badanie molekularnych i komórkowych mechanizmów leżących u podstaw naprawy płuc i przewlekłych zaburzeń. Takie podejście stanowi również platformę do oceny interwencji terapeutycznych mających na celu wspieranie skutecznej regeneracji płuc i przywracanie funkcji oddechowej po uszkodzeniu spowodowanym wirusem.

Wprowadzenie

Płuca odgrywają kluczową rolę w dostarczaniu tlenu i składników odżywczych do lokalnych tkanek. Komórki śródbłonka (EC), które wypełniają małe naczynia krwionośne w naczyniach kapilarnych płuc, są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania tkanki płucnej, utrzymując integralność naczyń i efektywną wymianę gazów1. EC tworzą niszę naczyniową i wzajemnie komunikują się z innymi komórkami, takimi jak komórki nabłonkowe, układy odpornościowe i komórki mezenchymalne. Przyczynia się to do regulacji rozwoju płuc oraz naprawy tkanek w odpowiedzi na uraz lub chorobę2.

Zakażenie wirusem grypy H1N1 A to problem na całym świecie3. U pacjentów z zakażeniem H1N1 często diagnozuje się wysypane uszkodzenie pęcherzyka wysypowego (DAD)4. Zakażenie H1N1 może prowadzić do poważnych uszkodzeń płuc i poważnych konsekwencji, w tym zapalenia płuc, ciężkiego ostrego uszkodzenia płuc (ALI) oraz ostrego zespołu niedowładności oddechowej (ARDS)5. Uszkodzenia wynikają głównie z infekcji komórek nabłonka płuc przez wirusa, co wywołuje nadmierną reakcję immunologiczną prowadzącą do stanu zapalnego, uszkodzenia tkanek i gromadzenia się płynu w płucach. Komórki nabłonkowe wyściełające drogi oddechowe i pęcherzyki oddechowe, odpowiedzialne za wymianę gazów, są bezpośrednio uszkadzane przez wirusa H1N1, co prowadzi do zaburzenia prawidłowej struktury płuc 6,7. Stało się jasne, że inne typy komórek, choć nie są bezpośrednio zakażone IAV, mogą ulec uszkodzeniu w odpowiedzi na infekcję 8,9. Uszkodzenie tkanek po zakażeniu grypą dotyka więc wszystkie przedziały komórkowe płuc, a ostatnio wykazano, że infekcja IAV powoduje zarówno przejściowe, jak i trwałe zmiany stanu komórkowego w wielu przedziałach komórkowych9. Ta plastyczność komórek w odpowiedzi na chorobę może być pomocna lub szkodliwa dla skutecznej naprawy tkanek i wymaga dalszych badań.

Najczęściej stosowanym modelem eksperymentalnym do badania grypy i jej patogenezy jest zakażenie myszy przez nos wirusem grypy A/PR/8/3410. Jest to ważna technika umożliwiająca badanie nasilenia choroby, śmiertelności i zakaźności wirusowej. Infekcja wewnątrznosowa myszy naśladuje naturalną drogę zakażenia u ludzi i umożliwia badanie zarówno adaptacyjnej, jak i wrodzonej odporności na wirusa. W 1934 roku wyizolowano konkretny szczep wirusa grypy A "A/PR/8/34" z pacjenta w Portoryko11. Ten szczep wirusa grypy został już przystosowany do myszy i nie infekuje już produktywnie ludzi. Ze względu na podobieństwa między myszami a ludzkim układem odpornościowym, myszy są najpopularniejszym modelem zwierzęcym do badań nad IAV12. W tej metodzie szczep H1N1 A/PR/8/34 jest podawany myszom bezpośrednio przez nozdrza, naśladując naturalne zakażenie13. Jest to łatwa, opłacalna i wygodna metoda badania wpływu infekcji wirusowej na tkankę płuc gospodarza w warunkach typu dzikiego (WT) oraz knockoutu (KO). Alternatywne techniki mają zalety i wady w porównaniu z modelem donosowym. Szczepienie wewnątrztchawicowe (IT) pozwala na dokładne dostarczenie wirusa do płuc, jednak ta technika nie w pełni naśladuje infekcji przez wdech i nie dostarcza informacji o toksyczności w górnych dróg oddechowych. Szczepienie IT wymaga również dużych umiejętności, aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia tchawicy13,14. Inokulacja inhalacją aerozolem (AR) naśladuje naturalną drogę zakażenia i tworzy bardziej jednolitą patologię płuc w porównaniu z infekcją wewnątrznosową, jednak może być trudno utrzymać jednolite stężenie wirusa w aerozoli i osiągnąć dokładne podanie aerozolu wirusowego. Bezpieczeństwo jest również ważnym aspektem metody szczepienia AR10. Dlatego technika donośnej inokulacji w podawaniu IAV jest kluczowym podejściem do badań skoncentrowanych na płucach nad dalszymi skutkami infekcji wirusowej w uszkodzeniach i naprawie tkanek. W przeciwieństwie do modeli chemicznych czy mechanicznych, zapewnia bardziej realistyczny i mniej inwazyjny sposób badania uszkodzeń płuc wywołanych przez grypę oraz interakcji gospodarz-patogen.

Tutaj ustalamy powtarzalną metodę zakażenia myszy wirusem grypy A u myszy (A/PR/8/34) oraz do charakteryzowania zarówno krótkotrwałych, jak i długoterminowych zmian komórkowych i strukturalnych w pęcherzyku płucnym wynikających z uszkodzenia wirusowego. Badania z użyciem tej metody mogą pomóc w odkrywaniu mechanizmów uszkodzeń i naprawy tkanek płucnych, aby zidentyfikować nowe cele terapeutyczne dla chorób płuc.

Protokół

Praca z wirusem grypy A w modelu zwierzęcym jest uznawana za poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) oraz poziom bezpieczeństwa biologicznego zwierząt 2 (ABSL2). Wszystkie procedury na zwierzętach użyte do generowania tych danych zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health (Protokół #24-452). Protokół ten jest również zatwierdzony przez Komitet ds. Bezpieczeństwa Instytucjonalnego Centrum Badań nad Rakiem, National Cancer Institute, National Institutes of Health. Przed rozpoczęciem tego protokołu zaleca się, aby użytkownicy uzyskali zgodę od instytucjonalnego komitetu ds. opieki i użytkowania zwierząt oraz instytucjonalnego komitetu ds. biobezpieczeństwa.

1. Przygotowanie materiału roboczego

UWAGA: Wszystkie prace z wirusem grypy powinny być wykonywane na lodzie w szafce bioasekuracji. Wyrzucaj końcówki i wszystko, co ma kontakt z wirusem, do pojemnika z 10% wybielaczem. Wiadra na lód, pipety i pudełka na końcówki powinny być spryskane roztworem wybielacza 10% zamiast zanurzać. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut. Odpady stałe uwalniaj w pojemniku na odpady niebezpieczne biologiczne, a ciekłe odpady do zlewu, spłukując wodą.

  1. Rozmroź zamrożony zapas (0,5 mL) wirusa na lodzie w szafce do zabezpieczeń biologicznych.
  2. Ustaw pojemnik na odpady zawierający 10% wybielacza w wodzie z kranu. Włóż do zamrażarki o temperaturze -80 °C dwa plastikowe lub kartonowe pudełka do schłodzienia, które mogą pomieścić do 100 probówek.
  3. Przed oznaczeniem 160 probówek po 1,5 mL na aliquoty wirusa. Rurki z nakrętką są lepsze niż z odchylaną kapslą, aby uniknąć powstawania aerozoli podczas otwierania oryginalnych tub wirusowych do użytku. Umieść rurki na lodzie, aby je wcześniej schłodziły przed przygotowaniem aliquotów wirusa.
  4. Zrób 3 μL aliquotów wirusa, używając skalibrowanej pipety P20 i końcówek, umieszczając wirusa tylko w schłodzonych tubach i trzymając aliquoty cały czas na lodzie.
  5. Po przygotowaniu aliquotów przechowuj je w schłodzonej zamrażarce oznaczonej "A/PR/8/34 Influenza Virus (IAV)", czyli numerem katalogowym, numerem partii i datą ważności.
    UWAGA: Różne serie wirusów mają różną zakaźność i nie powinny być mieszane.
  6. Włóż pudełko do zamrażarki o temperaturze -80 °C. Upewnij się, że wszystko jest jak najchłodniejsze, bo miano wirusowe zmniejsza się z każdym cyklem zamrożenia i rozmrażania.

2. Rozcieńczanie aliquotów wirusa do zastosowań w eksperymentach z infekcjami wewnątrznosowymi

  1. Rozmroź jedną 3 μL aliquot zapasów wirusowych na lodzie w szafie biobezpieczeństwa.
  2. Wykonaj rozcieńczenie 1:100 (rozcieńczenie A), przenosząc 2 μL z 3 μL aliquoty do schłodzonej rurki 1,5 mL zawierającej 198 μL zimnego D-PBS.
  3. Kontynuuj rozcieńczanie zapasów wirusowych, aż osiągnie odpowiednie stężenie 0,5-1 LD50 w tle szczepowym użytych myszy. Trzymaj wszystko w lodzie i używaj wcześniej schłodzonych rurek, aby zapobiec przegrzewaniu wirusa.
    UWAGA: Na przykład dla VR-95PQ, partia 70063082, zakaż myszy wirusem CEID50/μL od 12 600 do 31 500 (skalowanym według masy ciała) w rozcieńczeniu 1:500 000.
  4. Z rozcieńczenia A (1:100) uzyskaj rozcieńczenie 1:50 000 (rozcieńczenie B), dodając 10 μL rozcieńczenia A do 4990 μL zimnego D-PBS w schłodzonej rurce o pojemności 15 mL. Dobrze wymieszaj, pipetując pipetką serologiczną o pojemności 5 mL.
  5. Z rozcieńczenia B uzyskaj rozcieńczenie 1:500 000 (rozcieńczenie C), dodając 200 μL rozcieńczenia B do 1,8 mL D-PBS w schłodzonej rurce o pojemności 5 mL. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.
    UWAGA: Aby określić idealne rozcieńczenie wirusa do zakażenia zwierząt przy zakupie nowej partii, można oszacować, używając miana wirusa wskazanego na kartce produktu i dostosowując rozcieńczenie na podstawie miana poprzedniej partii. Najlepszym sposobem na określenie idealnego rozcieńczenia jest empiryczne miatowanie nowej partii wirusa za pomocą dzikich myszy typu C57BL/6. Zaplanuj różne rozcieńczenia w zakresie od 1:50 000 do 1:500 000 i zamów 1-2 klatki z C57BL/6 samic myszy na każde rozcieńczenie do testowania. Zarażaj myszy w różnych stężeniach i monitoruj ich utratę wagi. Aby przetestować miana wirusa, badanie proponuje użycie wyłącznie samic myszy, aby zmniejszyć zmienność mogącą być spowodowaną różnicami płci lub wagi między myszymi. Samice myszy często chorują bardziej niż samce, prawdopodobnie z powodu mniejszego rozmiaru lub z powodu różnic płciowych w odpowiedzi na zakażenie grypą, jak to ma miejsce w innych formach urazu płuc myszy15. Chociaż nie badano tego szczegółowo, w eksperymentach z mianem użyto samic myszy, ponieważ jeśli miano było określane na samcach, samice mogłyby umrzeć przy określonej dawce. Jednak stwierdzono, że samce myszy poważnie chorują i mają widoczne uszkodzenia płuc po zakażeniu mianem wirusowym, które zidentyfikowano wyłącznie na samicach. Idealnym rozcieńczeniem przy użyciu myszy mieszanych lub rozmówczonych będzie "1 LD50", czyli rozcieńczenie, przy którym 50% dzikich myszy C57BL/6 ginie. Myszy wyhodowane są bardziej odporne na infekcję16 i doznają urazów oraz dobrze się regenerują przy tym rozcieńczeniu. Jeśli myszy do eksperymentu będą na inbed C57BL/6, idealna dawka będzie połową tego "0,5 LD50". Ponieważ celem tych eksperymentów jest badanie urazów i naprawy, idealnie jest określić dawkę, przy której myszy chorują i tracą 20-25% masy ciała, ale większość myszy ostatecznie wraca do zdrowia (Rysunek 1). Jeśli wszystkie myszy w badaniu ważą mniej więcej taką samą (~25 g), możliwe jest podanie wirusa grypy w odpowiednim stężeniu 50 μL każdej myszy. Jednak myszy ważą od 15 do 35 g. Dlatego należy podać 2 μL rozcieńczenia wirusa na gram masy ciała (na przykład mysz ważąca 15 g otrzymałaby 30 μL grypy, a mysz 35 g 70 μL). Skutkuje to bardziej stałym poziomem infekcji i uszkodzenia tkanek u zwierząt o różnej wielkości. Te informacje są potrzebne do planowania objętości rozcieńczenia C.

3. Transport wirusowych aliquotów do obiektów zwierzęcych

  1. Włóż probówkę 5 mL z ostatnim rozcieńczeniem wirusa do lodu i oznacz pojemnik naklejką biologiczną. Wyłóż plastikowe pudełko na próbki ręcznikami papierowymi, aby wchłonąć ewentualne rozlania.
  2. Umieść materiały potrzebne do zakażenia wewnątrznosowego pudełka oznaczonego jako zagrożenie biologiczne: pipetę P200, nieotwarte pudełko z filtrowanymi końcówkami pipet P200, długopis oraz stożkową rurkę o pojemności 50 ml wypełnioną świeżym wybielaczem 10% przeznaczonym na odpady wirusowe. Jako środek kontroli zakażeń nałóż probówkę o pojemności 1,5 ml tym samym D-PBS, który rozcieńcza IAV.

4. Podawanie IAV myszom

UWAGA: Praca z wirusem grypy w ośrodku zwierzęcym wymaga posiadania ośrodka na poziomie bezpieczeństwa ABSL2. Standardowe środki ochrony osobistej obejmują fartuchy ochronne, jednorazowy fartuch laboratoryjny, dwie czapeczki do włosów, podwójne rękawice nitrylowe, podwójne pokrowce na buty, okulary ochronne (okulary ochronne) oraz maseczkę. Rozcieńczony wirus grypy powinien być przechowywany w lodzie przez cały protokół podawania, aby uniknąć utraty zakaźności.

  1. Cała praca z wirusami musi odbywać się w szafie zabezpieczeń biologicznych. Chociaż wirus grypy A/PR/8/34 jest szczepem przystosowanym do myszy, wirusy grypy są podatne na mutacje, dlatego traktują wirusa tak, jakby mógł być potencjalnie zakaźny dla ludzi.
  2. Podawaj zwierzętom znieczulenie izofluranem pojedynczo z przepływem 2,5-3% na maszynie do waporyzatora. Przenieś zwierzęta z pudełka z anestezją do nosa przed podaniem grypy.
  3. Gdy mysz jest pod narkozą, sprawdź jej oddychanie i uszczypnij palce, aby zobaczyć, czy reaguje. Myszy są gotowe na zakażenie IAV, gdy wykazują odruchy obwodowe kręgosłupa (np. cofnięcie kończyn) bez centralnej świadomości (co wskazuje ruch głową i rozglądanie się myszy).
    UWAGA: Preferowana jest podchirurgiczna płaszczyzna znieczulenia (ani całkowicie przytomna, ani na płaszczyźnie chirurgicznej) do podawania donosowego. Na płaszczyźnie chirurgicznej myszy mają zwiększone ryzyko śmiertelności z powodu zasysania płynu do płuc, natomiast niewystarczająca znieczulenie prowadzi do wydalenia szczepionki i nieregularnego podawania dawki. Ta płaszczyzna pośrednia, gdzie myszy mogą reagować na uszczypnięcie palca, optymalizuje bezpieczeństwo i efektywność infekcji.
  4. Używając pipety P200 ustawionej na 50 μL (lub 2 μL/g masy ciała; patrz UWAGA poniżej krok 2.5), zasysaj rozcieńczony IAV (lub kontrolę PBS) z fiolki na lodzie i połóż pipetę na pudełku z końcówką lub ręczniku papierowym, gdzie końcówka nie będzie miała kontaktu z rękawicami ani powierzchnią szafki na zabezpieczenia biologicznego.
  5. Podnieś znieczuloną mysz, chwytając za szyję i trzymaj mysz ustawioną pionowo pod kątem 45°. Ściśnij mysz na tyle mocno, by tchawica była wydłużona dla lepszego wdechu, ale nie tak mocno, by utrudnić oddychanie. Upewnij się, że oddech myszy jest płytki, ale równy, bez łapania powietrza.
  6. Powoli wprowadzaj rozcieńczenie IAV do nozdrzy myszy. Można to skutecznie zrobić za pomocą jednej z dwóch metod, jak opisano w krokach 4.6.1 i 4.6.2.
    1. Wpuszczaj wirusowe rozcieńczenie do nozdrzy kropelkowo, na przemian między nozdrzami, tak aby wirus dostał się po obu stronach nosa.
    2. Stwórz "bańkę" wirusa obejmującą oba nozdrza, utrzymywaną przez regularne i powolne pipetowanie podczas wdychania płynu przez mysz.
      UWAGA: W tym badaniu konsekwentnie stosowano metodę instylacji bąbelkowej, która była bardziej kontrolowana i powtarzalna. Ta metoda umożliwia łatwe dostarczanie zawiesiny wirusa do nozdrzy pod znieczuleniem i ułatwia naturalne oddychanie. Metoda dropwise jest równie ważna, ale niezależnie od zastosowanej metody, należy stosować spójność w różnych eksperymentach, aby zmniejszyć zmienność wyników.
  7. Trzymaj końcówkę pipety blisko nosa, ale nie dotykaj nosa. Jeśli mysz się budzi, podaj połowę dawki i wróć ją do czopka nosa izofluranowego przed podaniem drugiej połowy dawki.
  8. Jeśli mysz jest na tyle przytomna, by potrząsnąć głową, zakaszlać lub wypluć wirusa, konieczna jest dodatkowa znieczulenie, aby uniknąć wywołania wirusa w aerozoli i zapewnić dobrą infekcję. Jeśli mysz nie jest przytomna, podaj całą dawkę. Jeśli mysz została umieszczona z powrotem na stożku nosowym, powtórz krok 4.6, aby podać pozostałą dawkę IAV.
  9. Wyrzuć końcówkę do pojemnika na odpady zawierającego świeży wybielacz 10%. Użyj świeżej końcówki do każdej klatki z myszami.
  10. Po każdym podaniu IAV trzymaj mysz pionowo przez 1-2 minuty, aby utrzymać drożność dróg oddechowych i upewnić się, że grypa została odpowiednio dostarczona do płuc. Jeśli wirus grypy został pomyślnie dostarczony do płuc myszy, trzaski można wyczuć, kładąc jeden palec po obu stronach klatki piersiowej myszy.
  11. Gdy mysz zacznie się regenerować, umieść ją z powrotem w klatce, aby całkowicie się zregenerowała. Myszy szybko dochodzą do siebie po izofluranie, ale muszą być monitorowane, dopóki nie staną się w stanie poruszać.
  12. Odnotowano zdarzenia, takie jak trzaski w klatce piersiowej i głębokie oddychanie, które wskazują, że IAV zostało dobrze wdychane, albo bąbelki i pryski nosowe, które wskazują, że część tego wypłynięcia została wydalona przez nozdrza myszy. Zapisuj te informacje w arkuszu rejestracyjnym urazów (Plik Uzupełniający 1) oraz w notatniku laboratoryjnym.
  13. Powtórz kroki 4.2-4.12, aby każda mysz została zainfekowana.

5. Transport z powrotem do laboratorium

  1. Włóż 50 mL stożkowego wybielacza i końcówki z powrotem do plastikowego pudełka na próbki, razem z pozostałą rozcieńczeniną IAV (jeśli występuje) oraz materiałami laboratoryjnymi używanymi do zakażenia grypą.
  2. Po powrocie do laboratorium inkubuj wszystko, co miało kontakt z wirusem, z 10% wybielaczem. Spryskuj wiadra z lodem, pipety i pudełka na wybielanie roztworem 10% zamiast zanurzać. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut. Odpady stałe utylizuj do pojemnika na odpady biohazardowe, a ciekłe odpady do zlewu, spłukując wodą.

6. Monitorowanie myszy i dodatkowe procedury eksperymentalne

  1. Codziennie monitoruj ocenę kondycji ciała (BCS)17 oraz masę ciała wszystkich myszy kontrolnych (PBS) i zakażonych IAV po zakażeniu grypą, zaczynając od dnia po zakażeniu (dzień 1) lub 3 dni po zakażeniu (dzień 4). Myszy zakażone IAV raczej nie stracą znacznej wagi aż do 4. dnia po zakażeniu (Rysunek 1).
    UWAGA: Myszy, które tracą ponad 30% masy ciała lub osiągają wynik kondycji ciała 1, powinny zostać uśpione.
  2. W razie potrzeby należy podać EdU myszom przez iniekcję dootrzewną (i.p.) lub w wodzie pitnej, aby monitorować proliferację komórek po zakażeniu grypą.
    UWAGA: Wiele typów komórek w płucach myszy proliferuje się po uszkodzeniu wywołanym przez IAV9. Możliwe jest podawanie innych leków, specjalnej żywności lub specjalnej wody w zależności od potrzeb do określonych celów eksperymentalnych. Pamiętaj, że myszy nie jedzą ani nie piją tyle co zwykle podczas rekonwalescencji grypy, dlatego metoda podawania oparta na zastrzykach może być bardziej pożądana; z drugiej strony, może być trudno wstrzyknąć myszom BCS 2-2,5.

7. Pobór tkanki płucnej do podejść poniżej rzeki

  1. Pobieranie tkanki płucnej do dalszych zastosowań, w tym analizy immunofluorescencji, cytometrii przepływowej lub sekwencjonowania pojedynczokomórkowego RNA w myszim ośrodku lub laboratorium w szafce biobezpieczeństwa.
  2. Uśpij myszy pojedynczo za pomocąCO2. Nie zwichnij szyjki macicy, aby uniknąć zwichnięcia tchawicy. Obustronna torakotomia jest zazwyczaj zatwierdzoną metodą wtórnej eutanazji.
    UWAGA: Badanie to stosuje zatwierdzone wytyczne dotyczące opieki nad zwierzętami oraz protokół eutanazjiCO2 i konsekwentnie stosowało tę metodę w poprzednich badaniach grypowych, nie wprowadzając istotnej zmienności w uszkodzeniach płuc czy wynikach hisstopatologicznych. Ketamina/ksylazyna może być również użyta do eutanazji myszy, aby uniknąć uszkodzeń spowodowanych wdychaniemCO2 . Jednak inhalacjaCO2 jest akceptowalną metodą, jeśli zdobycie ketaminy/ksylazyny jest zbyt kosztowne lub jeśli uzyskanie licencji DEA jest zbyt trudne.
  3. Rozciąć klatkę piersiową i odsłonić klatkę piersiową oraz tchawicę.
  4. Rozciń przeponę i ostrożnie rozciń ją z dala od klatki piersiowej, aby nie przebić płuc. Przetnij boki klatki piersiowej i usuń klatkę piersiową na górze. Przeciąć obojczyki i rozcinać kość oraz tkanki miękkie z przodu tchawicy.
  5. Rozciąć mięśnie i tkanki otaczające tchawicę, aż pierścienie chrząstki będą widoczne, ale nie przebijaj tchawicy. Za pomocą zakrzywionych kleszczy wypchnij przełyk zza tchawicy i rozczłonkuj go z dala od tchawicy.
  6. Przewij kawałek szwu za tchawicę i zawiąż luźny węzeł (podwójnie oplataj jeden koniec wokół jednej kleszczy drugą, chwyć luźny koniec szwu i przeciągnij luźny koniec przez pętle).
  7. Przeprowadź układ krążenia D-PBS. Przypiąć duże naczynie (pod kończyną przednią lub na dole przepony) i przeprowadzić D-PBS przez prawą komorę (dolna część serca, skierowana do góry), powoli naciskając na koniec strzykawki. Jeśli igła nie jest widoczna przez ścianę serca, prawdopodobnie znajduje się w lewej komorze. To usuwa krew z płuc.
    UWAGA: Nie pchaj bańków. Jeśli w żyłce są pęcherzyki, usuń je przed wcisnięciem D-PBS strzykawką. Jeśli śmierć komórek śródbłonka jest problemem, delikatniej jest stosować perfuzję grawitacyjną niż ręcznie wypychać PBS.
  8. Jeśli pobierasz tkanki wyłącznie do histologii lub immunofluorescencji, przejdź do kroku 7.9; jeśli pobierasz tylko do zawiesiny jednokomórkowej, odetnij wszystkie płaty płuc i umieść je w PBS na lodzie, a następnie przejdź do kroku 7.11.
  9. Inflacja płuc dla immunofluorescencji lub histologii:
    1. Napompuj płuca w 2% paradehydu (PFA) i odwodnij przez etanol, aby osadzić parafinę, lub napompuj w 2% PFA i odwodnij przez sacharozę do kriosekcji.
    2. W technikach wykrywania RNA, takich jak RNAscope lub reakcja łańcuchowa hybrydyzacji (HCR), utrwalaj płuca w stężeniu 4% PFA. Dla najlepszego utrwalenia płuc napompuj płuca w 2% ultra-niskotopniącej agarozie i natychmiast przecień na wibrującym mikrotomie na 2% lub 4% PFA w płytce do hodowli tkankowej dla dalszej immunofluorescencji.
  10. Ręczne napompowanie płuc:
    1. Napompuj płuca ręcznie strzykawką i igłą 21-23 G, z rurką lub bez, lub używając grawitacji, przymocowując rurkę z PFA do podstawki pierścieniowej 30 cm nad powierzchnią stołu.
    2. Po izolacji tchawicy włóż igłę na górę tchawicy, skos do góry, nie przebijając dolnej części tchawicy, i dokręć szew wokół tchawicy i igły przed włożeniem płynu.
      UWAGA: Użycie ostrej igły wiąże się z niewielkim ryzykiem przebicia tchawicy w porównaniu do igły z końcówką, dlatego badacze muszą zachować szczególną ostrożność podczas zabiegu, aby uniknąć uszkodzeń. Jeśli ostra igła przebija tchawicę, należy użyć igły.
  11. Aby stworzyć zawiesinę jednokomórkową do cytometrii przepływowej lub analizy sekwencjonowania pojedynczych komórek, usuń tkankę płucną z D-PBS i zmiel tkankę płucną nożyczkami, a następnie tnij żyletką przez 2-3 minuty, aby uzyskać jeszcze drobniejsze fragmenty tkanki.
  12. Dysocjuj w buforze trawiennym zawierającym kolagenazę I o stężeniu 480 U/mL, dipazę 100 μL/mL oraz 2 μL/mL DNazę w D-PBS, w temperaturze 37 °C przez 30-35 minut. Przefiltruj przez filtry o średnicy 100 μm i 40 μm, lizuj pozostałe czerwone krwinki za pomocą buforu lizyzującego amon-chlorek potasu (ACK) oraz ponownie zawiesij 1% BSA w PBS do dalszego przetwarzania i analizy.
    UWAGA: Aby wykryć infekcję wirusową i jej ustąpienie po zakażeniu w płucach, można ocenić obciążenie wirusem za pomocą testu qRT-PCR lub TCID50 w homogenatach płucnych do pomiaru replikacji wirusa. Barwienie neuraminidazą i kapsydami może być również stosowane do wykrywania infekcji wirusowej. Usunięcie wirusa powinno nastąpić w dniach 8-9 po zakażeniu18, 19, natomiast naprawa i regeneracja tkanki płucnej trwa przez kilka tygodni9.

Wyniki

W porównaniu z myszami niezainfekowanymi, leczonymi PBS, myszy zakażone IAV wykazują niejednorodne uszkodzenia tkanek (Rysunek 1A). Uszkodzenia tkanek można ilościowo określić za pomocą algorytmu klastrowania k-średnich w MATLAB20 (Rysunek 1B). Myszy zakażone IAV zaczną tracić na wadze między 3 a 4 dniami po zakażeniu. Przy idealnym mianie myszy tracą od 20 do 30% początkowej masy ciała, a maksymalna utrata masy ciała następuje 8-10 dni po zakażeniu (dpi) (Rysunek 1C). Do 11-12 dpi myszy powinny zacząć przybierać na wadze i wrócić do 10-15% swojej początkowej masy ciała do 14 dpi. W badaniach regeneracji jest przydatne, jeśli większość myszy w eksperymencie schudnie i doznała uszkodzeń tkanek, ale nie umiera. Jednak ze względu na heterogeniczność uszkodzeń tkanek (rysunek 1A,B) oraz możliwą zmienność podawania donastopustowego, normalne jest, że kilka myszy w eksperymencie nie traci na wadze ani nie dochodzi do uszkodzenia tkanek, a kilka myszy traci >30% masy ciała, co prowadzi do eutanazji (rysunek 1D). Eksperymenty mające na celu określenie różnicy w przeżyciu i utracie masy ciała pomiędzy na przykład myszami z KO danego genu a ich kontrolnymi grupami WT mogą wymagać korekty miana i dawki IAV oraz wykonania obliczenia mocy, aby określić wielkość próbki potrzebnej do wykrycia takiej różnicy w tych dwóch parametrach.

Oprócz zmian w ogólnej strukturze tkanek i zdrowiu myszy, zmiany transkrypcyjne we wszystkich przedziałach komórkowych płuc zachodzą w trakcie reakcji tkanek na uszkodzenia. Obejmuje to zarówno stany przejściowe, które ostatecznie ustępują w miarę naprawy tkanki, w tym stany komórek nabłonka przejściowego lub pośredniego oraz stany komórek odpornościowych szpiku, jak i stany komórek utrzymujących, które nie przyczyniają się do funkcjonalnej naprawy, w tym komórki nabłonkowe Krt5+ i śródbłonkowe TrkB+9. Na przykład w śródbłonku kapilarnym płuca myszy pojawia się przejściowy stan komórek śródbłonka stymulowany interferonem przy 6 dpi, charakteryzujący się wysoką ekspresją genów stymulowanych interferonem (Rysunek 2A). Ten stan rozwiązuje się o 11-19 dpi (Rysunek 2A). Stan śródbłonka kapilarnego (iCAP) wywołany urazem powstaje przy 11 dpi, charakteryzujący się wysoką ekspresją Ntrk2 (TRKB), Sparcl1 i Bnip3 (Rysunek 2B). W przeciwieństwie do stanu komórek śródbłonka stymulowanego interferonem, stan komórki śródbłonka iCAP utrzymuje się w obszarach poważnie uszkodzonych tkanek i jest obecny rok po zakażeniu (Rysunek 2C). Po infekcji pojawiają się także przejściowe stany komórek nabłonka pęcherzykowego, w tym komórki przejściowe i niedojrzałe stany nabłonka pęcherzyka pęcherzyka I (AT1), które powstają po infekcji (Rysunek 2D). Wreszcie, infekcja prowadzi do utraty wielu endogennych makrofagów pęcherzykowych (aMAC_a) oraz ich odbudowy zarówno z monocytów zapalnych (iMON), jak i endogennych aMACów. Makrofagi pęcherzykowe rok po zakażeniu mają różne stany transkrypcyjne (aMAC_a i aMAC_b) w zależności od swojego pochodzenia (Rysunek 2E)9. Przejściowe i utrzymujące się stany komórkowe pojawiające się po ostrym uszkodzeniu płuc wymagają dalszych badań, ponieważ ich nieprawidłowe zachowanie w niszy może przyczyniać się do skutecznej naprawy tkanek i jej funkcjonowania zarówno produktywnie, jak i negatywnie. Dane sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek zostały wcześniej opublikowane9 i są deponowane w Omnibusie Ekspresji Genów jako GEO: GSE262927.

figure-results-1
Rysunek 1: Monitorowanie urazów płuc i zdrowia zwierząt. (A) Barwienie hematoksyliny i eozyny (HE) przekrojów tkanki płucnej z płuca zakażonego pozornie (PBS) po lewej stronie oraz płuca zakażonego IAV po prawej stronie. W porównaniu z nieuszkodzonym płucem, płuco zakażone IAV wykazuje niejednorodne uszkodzenia tkanek. Paski skalowe, 1 mm. (B) Stosując algorytm klasteryzacji k-średniej w MATLAB20, uszkodzenia tkanek można scharakteryzować jako poważne (czerwone), uszkodzone (zielone) lub normalne (niebieskie). Ważne jest, aby zauważyć, że w płatku płuca leczonym PBS po lewej stronie struktury dróg oddechowych są klasyfikowane jako "ciężkie" ze względu na gęstość i intensywność barwienia komórek nabłonka dróg oddechowych. Jednak nadal można łatwo dostrzec różnicę między płucami leczonymi PBS a zakażonymi grypą, biorąc pod uwagę ten poziom wyjściowy. Paski łuski, 1 mm. (C) Przykład krzywej utraty masy ciała z reprezentatywnego eksperymentu z infekcją IAV, w którym płuca myszy zostały pobrane 13 dni po zakażeniu (dpi). Krzywa zawiera dane od sześciu myszy typu dzikiego, a kropki oznaczają średnią, natomiast słupki błędu oznaczają standardowy błąd średniej. (D) Przykładowa krzywa przeżycia z reprezentatywnego eksperymentu z infekcją IAV, w którym płuca myszy zostały pobrane 14 dni po zakażeniu (dpi). Krzywa zawiera dane od siedmiu dzikich myszy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Monitorowanie zmian stanu komórek śródbłonka kapilarnych po zakażeniu IAV. (A) Stan EC stymulowany interferonem powstaje przy 6 dpi, który jest rozdzielany między 11-19 dpi. Ponowna analiza opublikowanych danych sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek z płuc myszy w kilku różnych momentach po zakażeniu grypą pokazuje, że wskaźnik modułów interferonowych we wszystkich typach komórek śródbłonka kapilarnych jest najwyższy i wynosi 6 dpi. Dane zostały ponownie przeanalizowane za pomocą R, a wynik modułu interferonu opiera się na ekspresji 87 genów stymulowanych interferonem w każdym typie komórek. CAP1, komórka śródbłonka kapilarnego typu 1; iCAP, komórka śródbłonka wywołanego urazem; CAP2, komórka śródbłonka typu kapilarnego typu 2; EC, komórka śródbłonkowa. (B) Dla porównania, stan EC wywołany urazem, charakteryzujący się ekspresją Ntrk2 (TRKB), pojawia się przy 11 dpi i utrzymuje się do roku po zakażeniu. Pasek skalowy, 500 μm. (C) Dane transkrypcyjne z sekwencjonowania pojedynczych komórek RNA komórek śródbłonka śródbłonka śródbłonka płuc po zakażeniu grypą pokazują dynamiczny charakter stanu komórek śródbłonka kapilarnego podczas naprawy tkanek. (D) Komórki nabłonka pęcherzyka również doświadczają plastyczności komórkowej po zakażeniu grypą. Typ komórki przejściowej pęcherzyka wyrostowego powstaje między 6-11 dpi i jest rozdzielony przez 19 dpi. Niedojrzały stan komórkowy AT1 (AT1_c) powstaje przy 11 dpi i utrzymuje się do 90 dpi. (E) Po zakażeniu wiele istniejących makrofagów pęcherzyków (aMAC_a) zostaje utracone, a napływ zapalnych monocytów (iMON) obserwuje się przy 6 dpi. Populacja makrofagów pęcherzykowych jest rekonstytuowana zarówno przez istniejące aMAC, aby odtworzyć populację aMAC_a, jak i przez zapalne monocyty, generując populację aMAC_b. Chociaż oba reprezentują stan makrofagów pęcherzykowych, powstałe aMAC można rozróżnić transkrypcjono. Wykresy w (C-E) pokazują procent komórek w każdej populacji w każdym momencie czasowym w zbiorze danych o zakażeniu grypą podłużnym i zostały wygenerowane za pomocą R. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Plik uzupełniający 1: Dziennik próbek urazów, wagi i wskaźnika kondycji ciała (BCS) do monitorowania zwierząt po zakażeniu grypą. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Tutaj przedstawiliśmy wygodną metodę przeniesienia wirusa grypy do myszy, aby szybko i skutecznie uszkadzać płuca myszy oraz badać mechanizmy skutecznej regeneracji i dysplastycznej naprawy. Wykazujemy, że donośna inokulacja A/PR/8/34 IAV może być techniką bezstresową. Zakończenie inokulacji po znieczuleniu izofluranem zajmuje mniej niż 2 minuty na mysz. Jest to prosta i nieinwazyjna technika szczepienia wirusa, która podąża naturalną ścieżką infekcji i pozwala badać reakcję zarówno tkanki, jak i układu odpornościowego w sposób bardziej fizjologicznie istotny. Wirus zaszczepiony przez nozdrza myszy może wywołać zarówno odporność śluzową, jak i ogólnoustrojową21. Co ważniejsze, uszkodzenia spowodowane infekcją wirusową są wyraźnie widoczne w przecinkach tkanki płuc zabarwionych hematoksyliną i eozyną (HE)22 (Rysunek 1). Pełna oś czasu oczekiwanych zmian transkrypcjowych w typach komórek płuc w każdym przedziale płuca została wcześniej opublikowana9. Tutaj ponownie przeanalizowaliśmy część tych danych, aby wykazać, że w kapilarnych przedziałach immunologicznych płuc myszy zachodzą przejściowe i trwałe zmiany transkrypcyjne w ciągu odpowiedzi na zakażenie grypą u niezakażonych myszy do roku po zakażeniu (Rysunek 2).

W tym protokole jest kilka kluczowych etapów, a odpowiednie rozwiązywanie problemów z tymi krokami prowadzi do udanego eksperymentu. Wirus grypy A/PR/8/34 to szczep grypy przystosowany do myszy, który nie zakaża produktywnie ludzi23, ale zawsze ważne jest, aby podczas eksperymentu przestrzegać wszystkich wskazanych procedur bezpieczeństwa, aby uniknąć ryzyka zakażenia personelu laboratoryjnego. Podanie znieczulenia izofluranem jest kluczowym krokiem zapewniającym skuteczne dostarczenie wirusa, ponieważ myszy nie wdychają wirusa dobrze, gdy są przytomne. Sprawdź oddech i monitoruj ruchy głowy myszy podczas zabiegu, aby upewnić się, że wirus został zaszczepiony w obu nozdrzach. Jeśli myszy nie są całkowicie znieczulone, mogą powstać pęcherzyki, które zarówno ograniczają wdychanie wirusa, jak i generują aerozole. Oba wypadki powinny być unikane, a myszy powinny być ponownie umieszczone na stożku izofluranowym, jeśli zaobserwuje się kichanie lub pęcherzyki przy nozdrzach. Monitorowanie po infekcji, takie jak mierzenie utraty masy ciała, oceny kondycji ciała i stanu zdrowia, a także dostarczanie suplementu diety do regeneracji, jest również ważnym elementem tego eksperymentu. Jeśli zaobserwuje się, że myszy nie tracą wystarczającej ilości masy ciała lub nie mają oczekiwanego poziomu uszkodzenia tkanek (Rysunek 1), możliwe, że dawka jest zbyt niska; Z drugiej strony, jeśli wiele myszy osiągnie 30% utraty masy ciała, możliwe, że dawka jest zbyt wysoka. W obu przypadkach najlepiej określić właściwą dawkę poprzez empiryczne miano serii wirusa, korzystając z kohorty myszy C57BL/6, jak opisujemy tutaj.

Ponieważ zakażenie grypą nadal jest powszechne na całym świecie, powoduje ciężkie choroby układu oddechowego i może być śmiertelne, zrozumienie procesu zakaźności wirusowej oraz odpowiedzi komórkowej na infekcję i uszkodzenie tkanek w płucach jest niezwykle ważne. Metoda infekcji wewnątrznosowej opisana w tym badaniu może zatem pomóc w identyfikacji ważnych mechanizmów regulacyjnych oraz opracowaniu nowych metod terapeutycznych w leczeniu chorób płuc. Ponadto przyszłe zastosowania tej techniki mogłyby wykorzystać inny szczep wirusa grypy przystosowanej do myszy, taki jak X31, aby określić wpływ na strukturę i funkcjonowanie tkanki płucnej w przypadku powtarzających się infekcji dróg oddechowych. Ponieważ wiele osób w ciągu życia cierpi na liczne infekcje dróg oddechowych, takie rozszerzenie tego modelu mogłoby mieć istotne znaczenie dla badań nad regeneracją tkanek płucnych, a tym samym dla zdrowia publicznego.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania te były wspierane przez Intramural Research Program amerykańskich National Institutes of Health (NIH), National Cancer Institute oraz Center for Cancer Research.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 mL w tubce;Fisher Scientific02-682-557
100 &mikro; Sitnik komórek MFalcon352360
15 mL stożkowa lampaFalcon352196
1x PBSGibc010010-023
40 & mikro; Sitnik komórek MFalcon352340
Rurka 5 mLGlobe6101C
50 mL stożkowa rurkaFalcon352098
Akcje A/PR/8/34 Influenza VirusATCC VR-95PQRóżne grupy mają różne miary wirusowe
Bufor lizy ACKJakość biologiczna118-156-101
Przeciwciało anty-TRKBR& D SystemsAF1494
WybielaczClorox10% wybielacza
Albumina surowicy bydlęcejSigma AldrichA8022
Komora indukcyjna do znieczulenia CO2DowolnyNie ma
Kolagenaza typu IGibco17100017
DAPIMilipore Sigma28718-90-3
DysposCorningCB-40235
Narzędzia do sekcji: nożyczki, zakrzywione kleszcze, proste kleszczeDowolnyNie ma
DnaseSigma Aldrich4716728001
D-PBSCorning21-031-CM
EtanolPharmco111000200
Szklane fiolkiDWK Nauki o Życiu986562
Wiadro z lodemDowolnyNie ma
IzofluranCovetrus29404
Igły, 21 i poduszka; 23 GDowolnyNie ma
P20/P200 pipetka & nbsp;PipetmanF144056M/F144058M,
Końcówki pipety P20/P200Thomas Scientific1159M43/1159M40
Paraformaldehyd (PFA)  Thermo ScientificJ19943-k22% PFA
PipetmanDowolnyNie ma
Plastikowe lub kartonowe pudełka do zamrażaniaDowolnyNie ma
ŻyletkaDowolnyNie ma
Ring StandDowolnyNie ma
Pipety serologiczne, 5 mLFalcon357543
Komora izofluranowa z indukcyjną myszą z wysuwem na górzeSomni Scientific
SzewFisher ScientificNC9422522
Rurki strzykawkowe i blokady luer-lockDowolnyNie ma
Strzykawka, 10 mLDowolnyNie ma
Aparat do znieczulenia stołowego izofluranOhmedaOhmeda Isotec- 4Przepływ powinien wynosić 2,5 i smysł; 3%
Agaroza o ultra-niskim topnieniuSigma AldrichA5030-1G
Waga wagaOHAUSCS200

Bibliografia

  1. Mammoto, A., Mammoto, T. Vascular niche in lung alveolar development, homeostasis, and regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 7, 318(2019).
  2. Tsikis, S. T., Hirsch, T. I., Fligor, S. C., Quigley, M., Puder, M. Targeting the lung endothelial niche to promote angiogenesis and regeneration: a review of applications. Front Mol Biosci. 9, 1093369(2022).
  3. Torrego, A., Pajares, V., Mola, A., Lerma, E., Franquet, T. Influenza A (H1N1) organising pneumonia: figure 1. BMJ Case Rep. 2010, bcr1220092531(2010).
  4. Murota, M., et al. Influenza H1N1 virus-associated pneumonia often resembles rapidly progressive interstitial lung disease seen in collagen vascular diseases and COVID-19 pneumonia; CT-pathologic correlation in 24 patients. Eur J Radiol Open. 7, 100297(2020).
  5. Niethamer, T. K., et al. Defining the role of pulmonary endothelial cell heterogeneity in the response to acute lung injury. eLife. 9, e53072(2020).
  6. Klomp, M., Ghosh, S., Mohammed, S., Khan, M. N. From virus to inflammation, how influenza promotes lung damage. J Leukoc Biol. 110 (1), 115-122 (2021).
  7. Newton, A. H., Cardani, A., Braciale, T. J. The host immune response in respiratory virus infection: balancing virus clearance and immunopathology. Semin Immunopathol. 38 (4), 471-482 (2016).
  8. Jones, D. L., et al. An injury-induced mesenchymal-epithelial cell niche coordinates regenerative responses in the lung. Science. 386 (6727), eado5561(2024).
  9. Niethamer, T. K., et al. Longitudinal single-cell profiles of lung regeneration after viral infection reveal persistent injury-associated cell states. Cell Stem Cell. 32 (2), 302-321.e6 (2025).
  10. Belser, J. A., Gustin, K. M., Katz, J. M., Maines, T. R., Tumpey, T. M. Comparison of traditional intranasal and aerosol inhalation inoculation of mice with influenza A viruses. Virology. 481, 107-112 (2015).
  11. Oltean, T., Maelfait, J., Saelens, X., Vandenabeele, P. Need for standardization of influenza A virus-induced cell death in vivo to improve consistency of inter-laboratory research findings. Cell Death Discov. 10 (1), 247(2024).
  12. Nguyen, T. -Q., Rollon, R., Choi, Y. -K. Animal models for influenza research: strengths and weaknesses. Viruses. 13 (6), 1011(2021).
  13. Jin, X. -Y., et al. Comparative pathogenicity of influenza virus-induced pneumonia mouse model following intranasal and aerosolized intratracheal inoculation. Virol J. 21 (1), 240(2024).
  14. Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 164(2012).
  15. Cantu, A., Gutierrez, M. C., Dong, X., Leek, C., Anguera, M., Lingappan, K. Modulation of recovery from neonatal hyperoxic lung injury by sex as a biological variable. Redox Biol. 68, 102933(2023).
  16. Sunagar, R., Kumar, S., Namjoshi, P., Rosa, S. J., Hazlett, K. R. O., Gosselin, E. J. Evaluation of an outbred mouse model for Francisella tularensis vaccine development and testing. PLoS One. 13 (12), e0207587(2018).
  17. Cowley, P. M., Roberts, C. R., Baker, A. J. Monitoring the health status of mice with bleomycin-induced lung injury by using body condition scoring. Comp Med. 69 (2), 95-102 (2019).
  18. Gonzalez, A. J., Ijezie, E. C., Balemba, O. B., Miura, T. A. Attenuation of influenza A virus disease severity by viral coinfection in a mouse model. J Virol. 92 (23), e00881-e00918 (2018).
  19. Lv, J., et al. Kinetics of pulmonary immune cells, antibody responses and their correlations with the viral clearance of influenza A fatal infection in mice. Virol J. 11, 57(2014).
  20. Liberti, D. C., et al. Alveolar epithelial cell fate is maintained in a spatially restricted manner to promote lung regeneration after acute injury. Cell Rep. 35 (6), 109092(2021).
  21. Cipolla, D., et al. Inhalable and nasal biologics: analytical, formulation, development, and regulatory considerations. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 2024, (2025).
  22. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), (2014).
  23. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal models for influenza virus pathogenesis and transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Infekcja donosowap cherzykowe kom rki nab onkowestany kom rek r db onkowychsekwencjonowanie pojedynczych kom rekcytometria przep ywowatrawienie tkanki p ucnejbarwienie immunofluorescencyjnemakrofagi p cherzykowe
Modelowanie dysplastycznej i funkcjonalnej naprawy płuc pęcherzyków płucnych po zakażeniu grypą
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.