Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Badanie to wykazuje, że wywar Yangjing Zhongyu poprawia wyniki wspomaganego rozrodu u kobiet z obniżoną rezerwą jajnikową poprzez poprawę jakości komórek jajowych i zarodków. W modelu szczura z przedwczesną niewydolnością jajników wywar przywracał równowagę hormonalną, wspierał rozwój pęcherzyków oraz modulował autofagię i metabolizm lipidów.
Wywar Yangjing Zhongyu (YZD), tradycyjna chińska formuła zioła, sugerowano poprawę funkcji jajników i wyników płodności, jednak standaryzowane dowody kliniczne pozostają ograniczone. Badanie to oceniało skutki YZD u kobiet z obniżoną rezerwą jajnika (DOR) poddawanych IVF/ICSI-ET, wraz z mechanistyczną weryfikacją przedwczesnej niewydolności jajnika (POF) w modelu szczura. W badaniu klinicznym pacjenci z DOR otrzymywali albo standardowy protokół antagonisty GnRH, samodzielnie lub w połączeniu z YZD. Podstawowe cechy między grupami były porównywalne, a grupa YZD wykazała wyższą liczbę pobranych oocytów i wysokiej jakości zarodków, a także poprawione wyniki zespołu tradycyjnej medycyny chińskiej. Równolegle POF indukowano u szczurów, a zwierzęta leczone YZD wykazywały poprawę cykliczności rui, przywrócenie poziomu estradiolu w surowicy, obniżenie hormonu folikulostymulującego oraz zdrowszą histologię jajników. Mikroskopia elektronowa wykazała, że YZD zmniejsza nadmierne tworzenie autofagosomów i nagromadzenie lipidów w komórkach jajnika, co sugeruje regulację osi metabolizmu autofagii-lipidów. Razem te wyniki wskazują, że YZD zwiększa funkcję rezerwy jajnika, poprawia rozwój zarodków i może zwiększać potencjał ciążowy u kobiet z DOR. Ten ustandaryzowany protokół stanowi powtarzalne ramy integracji YZD z cyklami technologii wspomaganego rozrodu, wspierając jej potencjał translacyjny w medycynie rozrodu klinicznego.
Zmniejszona rezerwa jajnikowa (DOR) to stan kliniczny, który zagraża zdrowiu reprodukcyjnemu kobiet i charakteryzuje się spadkiem liczby lub jakości pęcherzyków jajnikowych1. Klinicznie objawia się to przez zmniejszoną liczbę pęcherzyków antralnych, obniżony poziom hormonu anty-Müllera (AMH) lub podwyższone stężenia hormonu pęcherzykowego (FSH)2. DOR stanowi około 10% przypadków niepłodności i stanowi poważną przeszkodę w pomyślnym poczęciu3. W kontekście technologii wspomaganego rozrodu (ART) częstość występowania DOR szacuje się na 19%-26% w Stanach Zjednoczonych4, a wiąże się ona ze zmniejszoną liczbą ciąż, wyższą częstością stanu przedrzucawkowego oraz zwiększonym ryzykiem nawracających poronień5. Pomimo dostępności wielu podejść terapeutycznych, poprawa wyników ART u pacjentów z DOR pozostaje znaczącym wyzwaniem, co podkreśla potrzebę nowych i skutecznych interwencji6.
Dekokt Yangjing Zhongyu (YZD), klasyczna wieloziołołowe formułowanie tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM), od dawna jest stosowane w praktyce rozrodczej7. Uważa się, że poprawia równowagę hormonalną i wspiera funkcjonowanie jajników, co poprawia wyniki zapłodnienia in vitro oraz intracytoplazmatycznego zastrzyku plemnika-transferu zarodku (IVF/ICSI-ET)8. Wstępne dane kliniczne sugerują, że YZD może poprawić odpowiedź jajników, jednak rygorystyczne badania mechanistyczne i translacyjne są nadal ograniczone. Dokładne biologiczne szlaki, przez które YZD działa u pacjentów z DOR, pozostają niejasne 9,10. Obecna literatura wskazuje, że chińskie związki ziołowe mogą wpływać na mikrośrodowisko jajnika poprzez wiele mechanizmów, takich jak modulacja ekspresji AMH, hamowanie szlaków sygnalizacyjnych związanych z atrezją pęcherzyków, w tym PI3K/AKT/mTOR, oraz redukcja uszkodzeń stresu oksydacyjnego. Jednak te mechanistyczne hipotezy są w dużej mierze pośrednie i nie mają potwierdzenia eksperymentalnego.
Niniejsze badanie wypełnia te luki, integrując ocenę kliniczną z weryfikacją eksperymentalną. Konkretnie badaliśmy skutki YZD u kobiet z DOR poddawanych ART oraz badaliśmy jego mechanistyczne podstawy za pomocą modelu DOR indukowanego przez glikozydy tripterygium. W eksperymentach na zwierzętach monitorowaliśmy markery endokrynologiczne (estradiol i FSH), liczbę pęcherzyków antralnych, formowanie autofagosomów oraz nagromadzenie lipidów w tkance jajnika. Łącząc wyniki kliniczne z eksperymentalnymi danymi mechanistycznymi, praca ta dostarcza standaryzowanego protokołu włączania YZD do cykli IVF/ICSI-ET oraz przedstawia nowe dowody potwierdzające jego potencjał jako terapii uzupełniającej poprawę rezerwy jajnikowej i wyników rozrodczych u pacjentek z DOR. Nowością tego badania jest jego podwójne podejście – łączenie standaryzowanych zastosowań klinicznych z mechanistycznymi wglądami – co rozwija zarówno tłumaczenie kliniczne, jak i teoretyczne rozumienie YZD w medycynie rozrodu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie procedury kliniczne były przeprowadzane zgodnie z Deklaracją Helsińską i zatwierdzone przez Komitet Etyki Szpitala Szanghajskiego w Changhai (Aprobata nr CHEC2022-156). Wszyscy uczestnicy uzyskali pisemną świadomą zgodę. Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Changhai Medical College (Zatwierdzenie nr CHEC2022-156) i spełniał krajowe standardy opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi.
Cechy kliniczne
Rekrutacja pacjentów i grupowanie
Od sierpnia 2022 do marca 2023 roku 78 pacjentów z niepłodnością zdiagnozowaną z zespołem niedoboru nerek-yin10 i poszukujących ART zostało zrekrutowanych z Centrum Medycyny Rozrodczej Pierwszego Szpitala Afiliowanego Uniwersytetu Medycznego Marynarki oraz z oddziału ambulatoryjnego Szpitala Yueyang Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej Uniwersytetu w Szanghaju. Uczestnicy zostali losowo przydzieleni do grupy kontrolnej lub grupy leczeń (po 39 przypadków każda) przy użyciu generowania liczb losowych SPSS 23.0.
Kryteria diagnostyczne
Zachodnia diagnoza medyczna była następcą opinii Komitetu American Society for Reproductive Medicine (ASRM) z 2020 roku dotyczącej wskaźników rezerwy jajnikowej11. Kryteria obejmowały FSH ≥ 10 IU/L, estradiol ≥ 80 pg/mL, liczbę pęcherzyków antralnych (AFC) < 7 oraz AMH < 0,5-1,1 ng/mL. Zespół niedoboru nerki i yiny został zdiagnozowany zgodnie z Ginekologią Tradycyjnej Medycyny Chińskiej12 oraz Kryteriami Skuteczności Diagnostycznej zespołów TCM13.
Kryteria włączenia i wykluczenia
Kryteria włączenia zostały zaplanowane IVF/ICSI-ET z wykorzystaniem protokołu antagonisty; wywiad słabej odpowiedzi jajników (< 5 pobranych komórek jajowych); wiek 20-40 lat; spełnia kryteria zarówno DOR, jak i zespołu TCM; oraz podpisał świadomą zgodę. Kryteria wykluczenia obejmowały patologię endometrium (lipy, gruźlica, dysplazja, nowotwory), malformacje macicy, choroby współistniejące (cukrzyca, toczeń), niedawną terapię hormonalną (< 3 miesiące), historię operacji miednicy, nieprawidłowości chromosomowe lub alergię na leki. Kryteria eliminacji stosowano dla odstępstw od protokołu, działań niepożądanych, wycofania lub spontanicznego poczęcia w ciągu 2 tygodni od zapisania się na studia.
Metoda leczenia
Obie grupy przeszły ocenę wyjściową w dniu 2-3 miesiączki za pomocą ultrasonografii przezpochwowej oraz testów hormonalnych. Grupa kontrolna otrzymała schemat antagonistów: rekombinowany FSH lub ludzką gonadotropinę menopauzalną, początkowa dawka 225 U/dzień domięśniowo przez 5 dni, a następnie dostosowanie dawki w zależności od wzrostu mieszków mieszkowych. Gdy średnica przedniego pęcherzyka przekraczała 12 mm, rozpoczęto dawkę antagonisty GnRH (0,125 mg/dzień podskórnie), która była kontynuowana aż do momentu wyzwalającego. Gdy ≥ 1 pęcherzyk osiągnął 18 mm, ≥ 2 17 mm, a ≥ 3 16 mm, owulacja była wywołana 250 μg rekombinowanym hCG, a następnie pobierano oocyty po 34-36 godzinach.
Grupa stosowała ten sam protokół, dodając wywar Yangjing Zhongyu (YZD), podawany doustnie 2 razy dziennie (rano i wieczorem), po jednym wywarze dziennie, począwszy od dnia 2-3 cyklu menstruacyjnego aż do dnia wyzwalającego. Formuła kliniczna zawierała Rehmannia 12 g, Paeonia lactiflora 12 g, Cornus officinalis 10 g oraz Angelica sinensis 12 g.
Wskaźniki obserwacji
Wyniki kliniczne obejmowały parametry wyjściowe: wiek, BMI (obliczane jako waga (kg)/wzrost² (m²)), czas trwania niepłodności, FSH, dawka/czas trwania gonadotropiny, wyniki zespołu niedoboru nerek-yin, liczba pęcherzyków antralnych (ocenianych za pomocą USG przezpochwowego, średnica 2-9 mm), pobrane oocyty, oocyty Metaphase II (MII) (zidentyfikowane podczas pobierania oocytów), zapłodnione zarodki, rozszczepienia, wysokiej jakości zarodki (określone według standardowych kryteriów laboratoryjnych embriologii), oraz kliniczną ciążę, która została zdefiniowana jako obecność pęcherzyka ciążowego na USG w 6-7 tygodniu ciąży.
Zwierzęta doświadczalne
Tutaj 30 samic szczurów Sprague-Dawley o stopniu SPF (8 tygodni, 160-200 g) zostało aklimatyzowanych w warunkach kontrolowanych (23 ± 2 °C, wilgotność 40%-45%, cykl światła/ciemności 12 godzin) z pokarmem ad libitum i wodą.
Przygotowanie leków
YZD przygotowywano z Rehmannia 30 g, Angelica 15 g, Paeonia lactiflora 15 g oraz Cornus officinalis 15 g. Zioła były wywarzane w wodzie, filtrowane przez filtr o średnicy 200 mesh, a następnie koncentrowane pod obniżonym ciśnieniem w temperaturze 70 °C. Ostateczne roztwory dla dawek niskich, średnich i wysokich to 0,34 g/mL, 0,68 g/mL oraz 1,35 g/mL, co odpowiada 0,5x, 1,0x i 1,2x dawki klinicznej YZD. Wywary przechowywano w temperaturze 4 °C.
Modelowanie i grupowanie
Model DOR został wywołany przez podanie glikozydów tripterygiu w dootrzewnowej (40 mg/kg dziennie przez 15 dni). Szczury zostały losowo przydzielone do grup leczenia pustymi (n = 6), modelowych (n = 6) oraz YZD (niskie, średnie i wysokie dawki; n = 6 każda). Podawanie gawu (10 mL/kg masy ciała) było wykonywane 1 razy dziennie, począwszy od pierwszego dnia podawania glikozydów tripterygium, kontynuowano przez 15 dni.
Cytologia pochwowa
Etapy cyklu rui oceniano za pomocą cytologii złuszczającej pochwy. Rozmazy z pochwy pobierano raz dziennie (08:00-10:00) sterylnymi wacikami watowymi, rozcieńczano w 30 μL soli fizjologicznej i badam pod mikroskopem świetlnym z 100-krotnym powiększeniem. Okres obserwacji trwał 15 kolejnych dni. Normalny indeks cyklu rujowego definiowano jako odsetek szczurów wykazujących regularne cykle rujowe trwające 4-5 dni w tym okresie.
Testy hormonalne
Cała krew była pobierana pod znieczuleniem, na koniec 15-dniowego okresu leczenia przez nakłucie serca, pozostawiona do zakrzepnięcia w temperaturze pokojowej przez 30 minut i wirowana w 1000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać surowicę. Poziomy E2 i FSH były mierzone metodą ELISA zgodnie z instrukcjami producenta.
Histologia jajnika
Tkanka jajnika była pobierana bezpośrednio po eutanazji poprzez chirurgiczne usunięcie obu jajników, płukana zimną solą fizjologiczną w celu usunięcia krwi, a następnie utrwalona w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C przez 24-48 godzin. Tkanki były odwodniane w oczyszczonym etanolu, oczyszczane ksylenem, osadzane w parafinie i przecinane w 4-5 μm. Fragmenty były barwione hematoksyliną i eozyną, odwodnione, oczyszczane i mocowane.
Analiza statystyczna
Dane zostały przeanalizowane za pomocą SPSS 26.0. Zmienne normalne zostały wyrażone jako średnia ± SD i porównane testem t; zmienne nienormalne jako mediana (IQR) i porównane testem Mann-Whitney U. Zmienne kategoryczne wyrażono w procentach i porównano za pomocą testu chi-kwadrat. P < 0,05 uznano za istotne statystycznie. Dla spójności te same metody statystyczne zastosowano do analiz danych (brak osobnego opisu testu Student na teście t).
Bezpieczeństwo i utylizacja odpadów
Paraformaldehyd, ksylen i glikozydy tripterygium były przetwarzane w certyfikowanych okapach oparowych z rękawiczkami, goglami i fartuchami laboratoryjnymi; Wycieki i skażone materiały jednorazowe były zbierane w oznaczonych pojemnikach na odpady niebezpieczne i utylizowane zgodnie z instytucjonalnym standardem biobezpieczeństwa biologicznego. Wszystkie procedury z udziałem paraformaldehydu, ksylenu i glikozydów tripterygium wykonywano w okapach oparowych z odpowiednim sprzętem ochronnym (rękawice, fartuchy laboratoryjne, gogle). Odpady chemiczne i zwłoki zwierząt zostały utylizowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego dotyczącym biobezpieczeństwa.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Cechy kliniczne
W trakcie badania 3 pacjentów z grupy kontrolnej wycofało się z powodu zakażenia COVID-19, a 1 został wykluczony z powodu nieprawidłowej funkcji wątroby, pozostawiając 35 pacjentów. W grupie leczonej 4 osoby wycofały się z powodu COVID-19, a 35 pacjentów ukończyło badanie. W rezultacie w końcowej analizie uwzględniono łącznie 70 badanych. Nie stwierdzono istotnych różnic między grupami pod względ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W niniejszym badaniu badaliśmy potencjalną rolę wywaru Yangjing Zhongyu (YZD) jako terapii uzupełniającej zmniejszoną rezerwę jajnika (DOR) w technologii wspomaganego rozrodu (ART). Wyniki kliniczne wykazały, że pacjenci otrzymujący YZD oprócz standardowego protokołu antagonisty osiągnęli istotnie wyższą liczbę pobranych oocytów i wysokiej jakości zarodków. Chociaż wskaźniki ciąż nie różniły się istotnie między grupami, zaobserwowano pozytywny trend. Wyniki te sugerują, że YZD może poprawić jakość mieszków mieszkowych, a...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy oświadczyli, że nie istnieją konkurencyjne interesy.
Wsparcie dla tych badań zapewnia Narodowy Program Badań i Rozwoju Chin (numer grantu: 2018YFC1004900): badanie wpływu i mechanizmu wywaru Yangjing Zhongyu na regulację metabolitu mikroorganizmów erukamidu w płynie pęcherzykowym w celu poprawy funkcji jajników u szczurów (Numer grantu: 2024QN027)
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wirówka | Separacja surowicy (1000 x g, 15 min, 4 stopnie; C) | Eppendorf 5810R | 5811 000.012 |
| Patyki wacikowe (sterylne) | Zebranie próbek cytologii pochwy | Materiały medyczne Jiangsu Kangjian | KJ-MW-01 |
| Zestaw ELISA na E2 | Ilościowa ilościowość estradiolu w surowicy (szczur) | Elabscience Biotechnology Inc. | E-EL-0152 |
| Zestaw ELISA do FSH | Ilościowa ilościowa FSH w serumie (szczur) | Elabscience Biotechnology Inc. | E-EL-R0391 |
| Etanol (70 i pochówka; 100%) | Stopniowe odwodnienie w histologii | Sinopharm Chemical Reagent Co., Chiny | 100092683 |
| Szklane slajdy i Pokrywki | Montaż próbki | Citotest Scientific, Chiny | 7101/1812 |
| Hematoksylina i Eozyną | Roztwór barwienia w histologii | Beyotime Biotechnology, Chiny | C0105S |
| Mikroskop optyczny | Obserwacja histologiczna i cytologiczna | Olympus (generyczny, bez znaku towarowego) | CX23 |
| Parafina | Ośrodek osadzający | Leica Biosystems | 39601095 |
| Paraformaldehyd (4%) | Utrwalacz do przygotowania tkanek | Sigma-Aldrich | P6148 |
| Roztwór soli fizjologicznej (0,9%) | Przygotowanie cyrku pochwy | Sinopharm Chemical Reagent Co., Chiny | 10019318 |
| Sprague– Szczury Dawley | Zwierzęta doświadczalne (samica, 8 tygodni, 160 i ndash; 200 g) | Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Tech Co., Ltd. | SCXK (Pekin)2024-0011 |
| Oprogramowanie SPSS | Analiza statystyczna (wersja 26.0) | IBM Corp. | RRID:SCR_002865 |
| Transmisyjny mikroskop elektronowy | Obserwacja ultrastrukturalna | JEOL Ltd. | JEM-1400Plus |
| Glikozydy tripterygium | Indukcja modelu DOR rat | Dostawca generyków (bez znaku towarowego) | TG-001 |
| Ksylen | Odczynnik oczyszczający do histologii | Sinopharm Chemical Reagent Co., Chiny | 10023418 |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.