Izolacja RNA z nabłonka soczewek ocznych myszy i mas masowych komórek włóknistych

Soczewka oczna to przezroczysty narząd, który precyzyjnie skupia światło na siatkówce, aby uzyskać wyraźny obraz. Soczewka składa się z dwóch głównych typów komórek: monowarstwy komórek nabłonkowych pokrywających przednią półkulę i komórek włóknistych, które tworzą masę masową tkanki (ryc. 1). Soczewka jest otoczona kolagenową błoną podstawną znaną jako torebka soczewki, do której ściśle przylegają komórki nabłonka. W miarę wzrostu soczewki komórki nabłonkowe na równiku proliferują i różnicują się w powstające powłoki komórek włóknistych, które są nakładane na soczewkę w sposób koncentryczny ^1,2,3. Wzrost soczewki przez całe życie zależy od ciągłej proliferacji tej niewielkiej populacji komórek nabłonka równikowego, które tworzą strefę kiełkowania⁴. W miarę dojrzewania komórek włóknistych wszystkie organelle komórkowe ulegają degradacji w celu wyeliminowania obiektów rozpraszających światło 5,6,7,8,9,10,11 i utrzymania przezroczystości tkanek, a najbardziej wewnętrzne komórki włókniste są ostatecznie zagęszczane, co skutkuje sztywnym środkiem soczewki ^9,12. Ze względu na otaczającą torebkę soczewki nie zachodzi obrót komórek w soczewce, a włókna nasienne pozostają w środku soczewki przez całe życie, ponieważ nowe włókna są dodawane na obrzeżach tkanki lub kory. Komórki światłowodowe soczewki mają różne właściwości optyczne w zależności od ich wieku i mogą zapewnić czasowy obraz różnych cech biologicznych na każdym danym etapie¹³.

Pomimo dostępnych opcji chirurgicznych, zaćma, definiowana jako każde zmętnienie normalnie przezroczystej soczewki, pozostaje główną przyczyną ślepoty na świecie¹⁴. Zaćma może objawiać się w nabłonku soczewki, korze lub jądrze o różnych patofizjologiach¹⁵. Jednak komórkowe i molekularne mechanizmy powstawania zaćmy pozostają niejasne^16,17. Aby lepiej zrozumieć, jak zapobiegać tym różnym typom zaćmy i opracować alternatywy dla operacji, musimy lepiej zrozumieć, w jaki sposób te różne typy komórek utrzymują homeostazę w soczewce.

Komórki nabłonkowe i włókniste odgrywają różne role fizjologiczne w soczewce. Na przykład proliferacja komórek jest ograniczona do nabłonka soczewki¹⁸. Tymczasem włókna soczewki stanowią masę masową soczewki, nadając jej strukturę i właściwości refrakcyjne⁹. Aby uzyskać bardziej zniuansowaną perspektywę procesów biologicznych zachodzących w różnych przedziałach soczewki, komórki nabłonkowe i włókniste muszą być badane oddzielnie. W tym miejscu przedstawiamy metodę izolowania nabłonka od masy masowej komórki włóknistej, ekstrakcji mRNA z każdej frakcji i analizy tych transkryptów za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR).

Rysunek 1: Diagram anatomii obiektywu. Soczewka składa się z dwóch typów komórek, jednowarstwowych komórek nabłonkowych (niebieskich i pomarańczowych) pokrywających przednią półkulę oraz masowej masy włókien soczewki (białych). Tkanka jest otoczona cienką błoną kolagenową, znaną jako torebka soczewki (tan). Komórki nabłonka przedniego (niebieskie) są w stanie spoczynku, podczas gdy komórki nabłonka równikowego (pomarańczowe) namnażają się, różnicują i wydłużają, stając się nowymi warstwami komórek włóknistych (białymi) na obrzeżach soczewki. Nowe generacje komórek światłowodowych są nakładane na poprzednie generacje włókien w koncentrycznych powłokach. Najstarsze komórki włókien soczewki są zagęszczone w środku tkanki. Rysunek ten został zmodyfikowany z Cheng (2024)³⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z "Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych" National Institutes of Health oraz zatwierdzonym protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Indiana.

1. Obszar roboczy, sprzęt i przygotowanie odczynników

1. Autoklaw końcówki pipet przed użyciem i wyznacz pudełka z autoklawowanymi końcówkami do eksperymentów RNA, aby uniknąć zanieczyszczenia RNazą.
2. Potraktuj powierzchnię roboczą w dygestoriach i tłuczkach do homogenizacji tkanek roztworem do odkażania RNazy, dokładnie spłucz wodą dejonizowaną i wysusz.
3. Namocz narzędzia do preparowania (zakrzywione kleszcze, kleszcze proste i nożyczki do mikrodysekcji) w 70% etanolu na 5 minut i wysusz delikatną ściereczką przed użyciem.
4. Użyj zupełnie nowych tac preparacyjnych i szalek Petriego do etapów sekcji i izolacji tkanek.
5. Porcję 400 μl zimnego odczynnika kwasowo-guanidynowo-fenolowego na zimno do probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml wolnych od DNA i RNAzy w dygestorium.

2. Analiza soczewek myszy

1. Eutanazja dorosłych myszy przy użyciu przedawkowania CO₂ , a następnie zwichnięcia szyjki macicy jako środka wtórnego.
2. Wyłuszczenie oczu za pomocą zakrzywionych kleszczy.
   1. Delikatnie wciśnij kleszczami tkankę otaczającą oko, powodując wysunięcie oka z oczodołu. Zamknij kleszcze pod okiem i usuń, pociągając równomiernie w górę.
   2. Przenieś oczy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z 750-1000 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
3. W celu wypreparowania przenieś oczy do studzienek na tacy preparacyjnej ze świeżym 1x PBS.
4. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj prostych kleszczy, aby przytrzymać podstawę nerwu wzrokowego i przeciąć nerw jak najbliżej oka ostrymi nożyczkami do mikrodysekcji.
5. Ostrożnie włóż cienkie, proste kleszcze do otworu, w którym został połączony nerw wzrokowy, i ściśnij, aby utrzymać tkankę na miejscu.
6. Włóż końcówkę nożyczek do mikrodysekcji do tego samego otworu i ostrożnie przeciąć od tylnego bieguna oka w kierunku połączenia rogówkowo-twardówkowego. Nie wkładaj instrumentów zbyt głęboko, aby uniknąć uszkodzenia obiektywu.
   UWAGA: Soczewka gryzonia zajmuje dużą objętość w oku, dlatego zaleca się płytkie nacięcia, aby zapobiec przebiciu soczewki.
7. Przeciąć wzdłuż połączenia rogówkowo-twardówkowego za pomocą nożyczek do mikrodysekcji, oddzielając co najmniej połowę obwodu oka.
8. Użyj prostych kleszczy, aby delikatnie odwrócić tkanki oka, jednocześnie naciskając na rogówkę, wysuwając soczewkę przez nacięcie rogówkowo-twardówkowe.
9. Ostrożnie usuń wszelkie duże, przyczepione tkanki z soczewki za pomocą cienkich, prostych kleszczy.
10. W razie potrzeby delikatnie przetocz soczewkę po czystej, delikatnej chusteczce za pomocą zakrzywionych kleszczy, aby usunąć pozostałą przylegającą tkankę pozasoczewkową.
    UWAGA: Szybko przetocz chusteczkę po chusteczce roboczej i nie dopuszczaj do nadmiernego wysuszenia chusteczki. Na powierzchni soczewki mogą występować niewielkie zmętnienia spowodowane suchymi plamami na torebce soczewki. Te nieprzezroczystości są na ogół odwracalne po ponownym umieszczeniu soczewki w 1x PBS i nie wpływają na kolejne kroki.
11. Przenieś oczyszczoną soczewkę na 6-centymetrową szalkę Petriego z 1x PBS.
12. Za pomocą cienkich prostych kleszczyków płytko przebij torebkę soczewki w pobliżu równika i delikatnie oderwij kapsułkę soczewki od masy objętościowej włókna. Komórki nabłonka soczewki pozostaną przyczepione do kapsułki. Delikatnie usuń z kapsułki wszelkie duże kawałki błonnika, które mogły odpaść podczas dekapsulacji.
13. Delikatnie chwyć kapsułkę cienkimi, prostymi kleszkami i zawiruj w 1x PBS, aby usunąć wszelkie pozostałe włókna. Wszelkie luźno połączone komórki włókniste odłączą się od torebki i komórek nabłonkowych.

3. Izolacja RNA

UWAGA: Podsumowany przebieg pracy dla izolacji RNA pokazano na rysunku 2.

1. Umieść 2 kapsułki soczewek lub 2 masy objętościowe włókien w odpowiednich probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zawierających 400 μl zimnego odczynnika TRIzol.
   UWAGA: Masy włókien należy przenieść z naczynia do rurki za pomocą zakrzywionych kleszczy, aby zebrać tkankę.
2. Szczelnie zakryj rurki i przenieś je do okapu oparów chemicznych, aby wykonać kolejne kroki.
3. Delikatnie homogenizuj masy objętościowe włókien soczewki za pomocą czystego tłuczka do granulek.
   UWAGA: Pamiętaj, aby całkowicie rozbić masę światłowodową.
4. Próbki należy inkubować (kapsułki soczewek lub masę objętościową z homogenizowanego włókna) w TRIzolu przez 30 minut w temperaturze pokojowej w dygestorium.
5. W dygestorium dodać 200 μl chloroformu na 400 μl odczynnika TRIzol do każdej probówki. Zamknij szczelnie probówki i energicznie potrząsaj ręką przez 15 sekund, trzymając kciuk na dnie tubki, a palec wskazujący na nasadce.
   UWAGA: Probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zanotowane na liście materiałów są używane ze względu na szczelne uszczelnienie. W przypadku korzystania z probówek do mikrowirówek innych marek, przed potrząśnięciem przetestuj zamknięcie i uszczelnienie probówki, ponieważ roztwór TRIzolu i chloroformu może wyciekać spod nakrętki probówek, które nie mają szczelnego zamknięcia.
6. Próbki należy inkubować przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić separację faz.
   UWAGA: Na dnie probówki zawierającej lipidy i białko powinna znajdować się różowa warstwa odczynnika TRIzol, biała warstwa między fazami zawierającymi DNA oraz przezroczysta faza wodna na górze zawierająca RNA. Biała warstwa DNA może być trudniejsza do zauważenia w próbkach komórek nabłonkowych.
7. Odwirować próbki o masie 14 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Ostrożnie wkładaj i wyjmuj probówki z wirówki, uważając, aby nie zakłócić faz przenoszenia.
8. Zbierz probówki i odczynniki z zestawu RNA Clean and Concentrator. Rurki z kolumną wirującą są zamontowane w rurce zbiorczej z zestawu.
9. W dygestorii ostrożnie przenieś klarowną fazę wodną (górną warstwę) do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, zwracając uwagę na objętość.
   UWAGA: Unikaj naruszania, dotykania lub wciągania białej warstwy DNA pod fazą wodną. Przechyl rurkę podczas przenoszenia fazy wodnej, aby uniknąć naruszenia białej warstwy. Lepiej jest pozostawić niewielką ilość fazy wodnej w probówce, niż zanieczyścić próbkę. Zazwyczaj na 200 μl dodanego chloroformu można odzyskać 180-190 μl fazy wodnej.
10. Dodaj 200-procentowy etanol do fazy wodnej w stosunku objętościowym 1:1.
    UWAGA: Bufor wiążący RNA z zestawu koncentratora można dodać w stosunku objętościowym 2:1 do fazy wodnej przed dodaniem etanolu. Ten krok jest pomijany, aby zwiększyć wydajność RNA i dlatego, że RNA ma wystarczającą czystość po izolacji.
11. Delikatnie wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę lub pipetując roztwór w górę i w dół. Przenieść zmieszany roztwór do kolumny wirowej RNA za pomocą pipetora.
    UWAGA: Uważaj, aby nie dotknąć filtra końcówką pipety.
12. Wirować kolumny wirujące przy 16 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Zaleca się oznaczenie pokrywy kolumny i boku probówki zbiorczej, aby utrzymać porządek w zestawach probówek i na wypadek, gdyby nasadka oderwała się w kolejnym etapie wirowania.
13. Odrzucić przepływ i dodać 400 μl buforu przygotowawczego RNA do kolumny wirowej.
14. Wirować kolumny wirujące przy 16 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C.
15. Odrzucić przepływ i dodać 700 μl buforu do płukania RNA do kolumny wirowej.
16. Wirować kolumny wirujące przy 16 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C.
17. Odrzucić przepływ i dodać 400 μl buforu do płukania RNA do kolumny wirowej.
18. Wirować kolumny wirujące przy 16 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
19. Odrzucić przepływowy i ponownie odwirować przy 16 000 x g przez 30 s w temperaturze 4°C, aby upewnić się, że kolumna wirowa jest sucha.
20. Przenieś kolumnę wirującą do nowej oznaczonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1.5 ml.
21. Dodaj 15 μl wody wolnej od RNaz do filtra membranowego. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Uważaj, aby nie dotknąć filtra końcówką pipety.
22. Odwirować kolumnę wirową o stężeniu 16 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C w celu elucji oczyszczonego RNA.
    UWAGA: Nasadka probówki do mikrowirówki o pojemności 1.5 ml pozostanie otwarta podczas wirowania. Ostrożnie umieść kolumny wirujące i probówki do mikrowirówek tak, aby otwarte nasadki opierały się o pokrywę wirnika, aby nie kołysała się i nie pękała podczas wirowania. Pokrywy powinny podążać zgodnie z kierunkiem obrotu wirnika.
23. Usuń i wyrzuć kolumny wirujące. RNA będzie znajdować się w cieczy zebranej w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
24. Szczelnie zamknąć probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i inkubować próbki RNA w temperaturze 55-65 °C przez 10 minut, aby ułatwić ich rozpuszczanie.
25. Po etapie ogrzewania natychmiast umieścić próbki na lodzie.
26. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C lub dokonywać odwrotnej transkrypcji na cDNA w celu długotrwałego przechowywania.
    UWAGA: Próbki RNA przechowywano do 3 miesięcy bez zauważalnej utraty stężenia. Porcjuj próbki RNA do mniejszych objętości w celu przechowywania, aby zminimalizować cykle zamrażania i rozmrażania i zapobiec degradacji.

4. Pomiar stężenia RNA za pomocą spektrofotometru UV-Vis

1. Trzymaj próbki RNA na lodzie, włącz NanoDrop (spektrofotometr UV-Vis) i poczekaj, aż instrument się zainicjalizuje.
2. W menu Kwasy nukleinowe wybierz moduł kwantyfikacji RNA.
3. Wykonać ślepą próbę spektrofotometru UV-Vis, pipetując 2,0 μl eluentu ze stopnia stężenia RNA na cokół, w tym przypadku wodę molekularną. Opuść ramię przyrządu i odczytaj ślepą próbkę.
4. Podnieś ramię instrumentu, wyczyść cokół czujnika za pomocą czystej, suchej, delikatnej ściereczki roboczej, a następnie ponownie przetrzyj kolejną chusteczkę zwilżoną wodą dejonizowaną, a następnie ponownie wytrzyj na sucho.
5. W razie potrzeby wprowadź szczegóły próbki do interfejsu spektrofotometru UV-Vis.
6. Załaduj 2,0 μl próbki RNA na cokół, opuść ramię i dokonaj oceny ilościowej.
7. Powtórzyć kroki od 4.4 do 4.6, aby oczyścić cokół między próbkami.
8. Po zakończeniu zapisz i wyeksportuj eksperyment w celu dalszej kwantyfikacji, jeśli to konieczne.

5. Odwrotna transkrypcja

1. Używając wysoce procesywnej i termostabilnej odwrotnej transkryptazy, dokonaj odwrotnej transkrypcji 2,0 μg RNA włókna soczewki i całego wyekstrahowanego nabłonkowego RNA przy użyciu zalecanego przez producenta protokołu. Wymieszaj odczynniki i RNA dla każdej próbki w czystej probówce do PCR. Wszystkie roztwory i próbki RNA należy przechowywać na lodzie.
   UWAGA: Ta transkryptaza może odwrócić transkrypcję do 2,5 μg RNA na reakcję. Zakłada się pełną konwersję z RNA do cDNA, więc jako przypuszczalne stężenie cDNA stosuje się początkowe stężenie RNA.
2. Przeprowadzić reakcję w termocyklerze, stosując warunki wymienione w tabeli 1.
3. Przechowuj odwróconą transkrypcję cDNA w temperaturze -80 °C lub przejdź do etapu qPCR.
   UWAGA: próbki cDNA były przechowywane do 4 miesięcy bez zauważalnej degradacji, ponieważ cDNA jest bardziej stabilne niż RNA. Próbki mogą być prawdopodobnie przechowywane przez dłuższy czas, pod warunkiem, że cykle zamrażania i rozmrażania zostaną zminimalizowane.

Tabela 1: Warunki termocyklera do odwrotnej transkrypcji. Warunki te są dostosowane do specyficznej, wysoce procesyjnej i termostabilnej odwrotnej transkryptazy. Warunki pracy mogą się różnić w zależności od użytego enzymu i zestawu.

6. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym

1. Przed rozpoczęciem reakcji należy przygotować roztwory podstawowe cDNA do pożądanego stężenia, rozcieńczając je wodą molekularną. W tych eksperymentach 1 μl cDNA zostanie użyty przy 5 ng/μl do reakcji 5 ng/studzienkę. Wszystkie roztwory i próbki cDNA należy przechowywać na lodzie.
   UWAGA: Płytki macierzy TaqMan (format 0,1 ml) są zalecane do przeprowadzania reakcji 5-50 ng cDNA na studzienkę. Tworzenie porcji cDNA jest przydatne do ograniczania cykli zamrażania i rozmrażania. W tym badaniu próbki ograniczono do maksymalnie 5 cykli zamrażania i rozmrażania.
2. Przygotuj działającą mieszankę główną składającą się z Advanced Master Mix i sond zgodnie z zaleceniami komercyjnymi. Patrz sekcja 7, aby zapoznać się z przykładowym przygotowaniem. Wszystkie roztwory i próbki cDNA należy przechowywać na lodzie.
   UWAGA: Para sond z dwoma różnymi barwnikami jest powszechnie używana na studzienkę. Na przykład w tym badaniu Crygs-FAM-MGB został użyty jako sonda genu będącego przedmiotem zainteresowania, a Ppia-VIC-MGB jako kontrola wewnętrzna. Zalecenia handlowe dotyczące końcowych stężeń sondy i startera wynoszą odpowiednio 250 nM i 900 nM. Jeśli cel jest bardzo silnie eksprymowany, może być potrzebna sonda z ograniczoną ilością starterów, aby zapobiec wyczerpaniu odczynników reakcyjnych.
3. Załadować zapas cDNA (1 μl) do odpowiednich dołków na płytce qPCR, a następnie roboczą mieszankę główną (9 μl). Mieszać roztwory, pipetując powoli w górę i w dół, dodając mieszankę główną. Upewnij się, że kropla cDNA jest zmieszana z roztworem i unikaj pęcherzyków.
   UWAGA: W zależności od czułości celu, może być konieczne załadowanie płyty na lód.
4. Uszczelnij płytkę qPCR, ostrożnie nakładając optyczną osłonę samoprzylepną. Użyj aplikatora do folii samoprzylepnej, aby wygładzić pokrywę i zapewnić szczelne uszczelnienie wokół każdej studzienki.
5. Wiruj płytki przy 1000 obr./min przez 10 sekund, aby wymieszać.
6. Odwirować płytki o masie 1000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby upewnić się, że na dnie studzienek nie ma pęcherzyków powietrza.
7. Załadować płytkę do ilościowego termocyklera PCR i uruchomić zgodnie z cyklami wymienionymi w tabeli 2.
   UWAGA: Konwencjonalne protokoły qPCR są zazwyczaj ograniczone do 40 cykli. Jest mało prawdopodobne, aby zwiększenie liczby cykli przyniosło znaczące wyniki, ponieważ po 40 cyklach pojedyncza kopia docelowa może teoretycznie dać około 1 biliona amplikonów¹⁹.

Tabela 2: Warunki termocyklera dla ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy. Warunki te są dostosowane do określonej serii komercyjnych testów ekspresji genów. Stosowane są parametry domyślne, z wyjątkiem zwiększania cykli wzmocnienia z 40 do 45.

7. Przykładowe obliczenie objętości dla qPCR

UWAGA: Kod źródłowy R dla kalkulatora objętości dla opisanych poniżej równań jest dostępny w pliku uzupełniającym 1. Ten kalkulator jest przeznaczony dla sond Taqman i mieszanki głównej wymienionych w Tabeli Materiałów.

1. Określ liczbę studzienek, które mają być pipetowane, i oblicz co najmniej 12,5% nadwyżki. Ta stała nadmiaru (k_Excess) kompensuje błąd pipetowania i zapewnia wystarczającą ilość roztworu. W tym przykładzie 96 studzienek zostanie użytych jako cel przygotowania próbki.
   Równanie:
   
   Przykład:
   
   UWAGA: Jeśli 12,5% nadwyżki nie jest liczbą całkowitą, łatwym sposobem na zapewnienie "ładnych" liczb w kolejnych krokach jest zaokrąglenie w górę do najbliższego dołka i odpowiednie dostosowanie k_Nadwyżki .
2. Oblicz objętość roboczej mieszanki głównej. W tych eksperymentach używa się 1 μl cDNA i 9 μl roboczej mieszanki głównej na studzienkę. Objętości cDNA i miksu głównego można dostosować w razie potrzeby.
   Równanie:
   
   Przykład:
   
3. Obliczyć modyfikator stężenia (k_Conc). Ten modyfikator służy do tworzenia bardziej skoncentrowanej roboczej mieszanki wzorcowej, która rozcieńczy się do 1x po zmieszaniu z cDNA.
   Równanie:
   
   Przykład:
   
4. Oblicz objętość sondy (20x).
   Równanie:
   
   Przykład:
   
5. Oblicz objętość surowca głównego mieszanki (2x).
   Równanie:
   
   Przykład:
   
6. Doprowadzić roboczą mieszankę wzorcową do obliczonej objętości za pomocą cząsteczkowego H₂O.
   Równanie:
   
   
   
   
   
   Przykład:
   
   
   
   
   

Plik uzupełniający 1: Kod źródłowy R dla kalkulatora objętości. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Nabłonek i włókna soczewki wyizolowano od 6- do 7-tygodniowych myszy typu dzikiego. Do tych eksperymentów wykorzystano trzy myszy, a 2 kapsułki soczewkowe lub 2 masy komórek włóknistych od każdej myszy połączono w jedną replikę biologiczną. Jak opisano w protokole, RNA wyekstrahowano za pomocą separacji faz odczynnika TRIzol. Średnio para mas nabłonka soczewki i włókien dała odpowiednio 0,8 μg (SD ± 0,2) i 9,7 μg (±SD 2,3) RNA. Średnie stężenie w 15 μl elucji wynosiło 55,4 ng/μl (SD ± 16,3) i 650,0 ng/μl (SD ± 152,2) odpowiednio dla próbek nabłonka i włókien. Wykorzystując reakcje 5 ng / studzienkę, teoretycznie pozwala to na średnio 160 reakcji z jednej pary nabłonka soczewki wyizolowanego przy użyciu tego protokołu. Średnia czystość RNA mierzona stosunkami A260/280 wynosiła 1,92 (SD ± 0,05) dla nabłonka i 2,05 (SD ± 0,01) dla włókien, co wskazuje na minimalne zanieczyszczenie białkami. Ogólnie rzecz biorąc, stosunek A260/280 wynoszący ~ 2,0 jest uważany za czysty dla RNA20. Ogólnie rzecz biorąc, izolacja ta pozwoliła uzyskać wystarczające stężenie wysoce czystego RNA, aby odwrócić transkrypcję do cDNA i przeprowadzić powtarzające się eksperymenty qPCR.

Przeprowadziliśmy odwrotną transkrypcję i qPCR zgodnie z opisem w protokole. Wybraliśmy 7 genów o znanej wysokiej ekspresji transkryptów lub białek w soczewce do analizy qPCR w czasie rzeczywistym, aby ujawnić różnicową ekspresję między przedziałami tkankowymi 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Ekspresja względna jest pokazana jako wartości 2-ΔΔCq, znormalizowane do komórek nabłonkowych (ryc. 3). Średnie wyrażenie względne jest pokazane jako średnie geometryczne z odchyleniami standardowymi. Ze względu na znaną ekspresję różnicową, koneksyny użyto do określenia pomyślnego oddzielenia komórek nabłonka i włókien. Connexin 43 (Cx43; białko połączenia szczelinowego alfa 1; Gja1) ulega ekspresji w komórkach nabłonka soczewki33, Cx46 (Gja3) ulega ekspresji w komórkach włókien soczewki34, a Cx50 (Gja8) ulega ekspresji zarówno w komórkach nabłonkowych, jak i włóknistych25,29. Obserwuje się, że włókna soczewki wyrażają Gja1 i Gja8 na około 200 i 7,5 razy niższych poziomach niż nabłonek soczewki. Tymczasem Gja3 jest około 1,5 raza bardziej wyrażony we włóknach soczewki, co jest zgodne z poprzednimi raportami28.

Podobnie zróżnicowaną ekspresję zaobserwowano w przypadku kadheryny, a mianowicie E-kadheryny (Cdh1) i N-kadheryny (Cdh2). Ekspresja białka E-kadheryny jest ograniczona do nabłonka soczewki, podczas gdy N-kadheryna ulega ekspresji zarówno w nabłonku, jak i włóknach35. Tutaj pokazujemy, że ekspresja Cdh1 i Cdh2 jest około 330-krotnie i 2,4-krotnie niższa we włóknach w porównaniu z nabłonkiem.

Dwa dodatkowe markery komórek nabłonkowych i włóknistych, odpowiednio sparowane pudełko 6 (Pax6) i krystalina γS (Crygs), zostały również wykorzystane do wykazania pomyślnego oddzielenia przedziałów soczewki36,37. Zgodnie z wcześniej obserwowanymi wzorcami ekspresji, Pax6 jest ograniczony do komórek nabłonkowych, wykazując 8-krotnie niższą ekspresję we włóknach. Białka gamma-krystalinowe ulegają ekspresji głównie w komórkach włókien soczewkowych i obserwujemy, że Crygs jest około 3-krotnie wyższy we włóknach w porównaniu z nabłonkiem1. Dane te wskazują na wyraźne oddzielenie nabłonka soczewki i masy włókien, co pozwala na analizę transkryptomiczną każdego przedziału tkankowego w celu porównania.

Rysunek 2: Schemat przebiegu izolacji RNA krok po kroku. (A) Separacja faz: kroki 3.1-3.11. Etapy te przedstawiają proces homogenizacji tkanki pierwotnej, ekstrakcji RNA i izolowania RNA poprzez separację faz kwasowo-guanidynowo-fenolowych. (B) Stężenie RNA: etapy 3.12-3.19. Kroki te przedstawiają mycie i koncentrację wyizolowanego RNA przy użyciu kolumn czyszczących i zagęszczonych. (C) Elucja: kroki 3.20-3.26. Kroki te przedstawiają elucję RNA z kolumn czyszczących i zagęszczających przy użyciu wody wolnej od RNaz i ogrzewania w celu promowania rozpuszczania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Względna ekspresja genów porównująca izolowany nabłonek soczewki z masą masową komórek włóknistych. Poziomy RNA są znormalizowane do przedziału nabłonkowego. Markery komórek nabłonkowych Gja1 [kodują koneksynę 43 (Cx43)], Chd1 (kodują E-kadherynę) i Pax6 (kodują czynnik transkrypcyjny Pax6) wykazują podwyższoną ekspresję w komórkach nabłonka w porównaniu z komórkami włóknistymi. Markery komórek światłowodowych Gja3 (kodują Cx46) i Crygs (kodują γS-krystalinę) wykazują podwyższoną ekspresję w porównaniu z nabłonkiem. Markery wyrażane zarówno w komórkach nabłonka, jak i włóknistych, Gja8 (koduje dla Cx50) i Chd2 (koduje dla N-kadheryny), wykazują wykrywalny sygnał w obu przedziałach. Wykresy przedstawiają średnie geometryczne z odchyleniami standardowymi przy użyciu metody 2-ΔΔCq . Istotność statystyczną określono za pomocą dwukierunkowej ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Šidáka. * p ≤ 0,05; ** p≤ 0,01; p≤ 0,001; p≤ 0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.