Protokół ten szczegółowo opisuje oddzielenie nabłonka soczewki oka myszy od masy masowej komórek włóknistych, a następnie izolację RNA i analizę qPCR. Metoda ta pozwala na oddzielenie przedziałów komórek soczewki w celu bardziej szczegółowej analizy transkryptomu i procesów biologicznych w komórkach nabłonkowych w porównaniu ze zróżnicowanymi komórkami włóknistymi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja RNA z nabłonka soczewek ocznych myszy i mas masowych komórek włóknistych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Soczewka jest wyspecjalizowaną, przezroczystą tkanką w przedniej komorze oka, która składa się z dwóch głównych typów komórek, komórek nabłonkowych i komórek włóknistych. Monowarstwa komórek nabłonka soczewki pokrywa przednią półkulę soczewki, podczas gdy większość soczewki składa się z masy komórek włókien soczewki. Kolagenowa błona podstawna, znana jako kapsułka, otacza i otacza całą tkankę. Komórki nabłonka soczewki są silnie przylegające do torebki soczewki i można je łatwo oddzielić od masy włókien poprzez oderwanie kapsułki od tkanki. Trudności z uzyskaniem wystarczającego stężenia RNA z powodu małej liczby komórek nabłonkowych w monowarstwie soczewki wcześniej utrudniały badanie transkryptomów komórek nabłonkowych w porównaniu z komórkami włóknistymi. Protokół ten przedstawia metodę czystego oddzielania i izolowania przedziałów komórek nabłonkowych i włóknistych oraz etapów koncentracji RNA, aby umożliwić późniejsze eksperymenty transkryptomiczne na próbkach komórek nabłonka z jednej pary soczewek myszy. Możliwość indywidualnego badania głównych typów komórek soczewki pomaga w badaniu biologicznych mechanizmów utrzymania i rozregulowania soczewki, umożliwiając scharakteryzowanie specyficznych dla typu komórek zakłóceń odpowiedzialnych za patologie soczewki związane z wiekiem.
Wprowadzenie
Soczewka oczna to przezroczysty narząd, który precyzyjnie skupia światło na siatkówce, aby uzyskać wyraźny obraz. Soczewka składa się z dwóch głównych typów komórek: monowarstwy komórek nabłonkowych pokrywających przednią półkulę i komórek włóknistych, które tworzą masę masową tkanki (ryc. 1). Soczewka jest otoczona kolagenową błoną podstawną znaną jako torebka soczewki, do której ściśle przylegają komórki nabłonka. W miarę wzrostu soczewki komórki nabłonkowe na równiku proliferują i różnicują się w powstające powłoki komórek włóknistych, które są nakładane na soczewkę w sposób koncentryczny 1,2,3
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z "Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych" National Institutes of Health oraz zatwierdzonym protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Indiana.
1. Obszar roboczy, sprzęt i przygotowanie odczynników
- Autoklaw końcówki pipet przed użyciem i wyznacz pudełka z autoklawowanymi końcówkami do eksperymentów RNA, aby uniknąć zanieczyszczenia RNazą.
- Potraktuj powierzchnię roboczą w dygestoriach i tłuczkach do homogenizacji tkanek roztworem do odkażania RNazy, dokładnie spłu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Nabłonek i włókna soczewki wyizolowano od 6- do 7-tygodniowych myszy typu dzikiego. Do tych eksperymentów wykorzystano trzy myszy, a 2 kapsułki soczewkowe lub 2 masy komórek włóknistych od każdej myszy połączono w jedną replikę biologiczną. Jak opisano w protokole, RNA wyekstrahowano za pomocą separacji faz odczynnika TRIzol. Średnio para mas nabłonka soczewki i włókien dała odpowiednio 0,8 μg (SD ± 0,2) i 9,7 μg (±SD 2,3) RNA. Średnie stężenie w 15 μl elucji wynosiło 55,4 ng/μl (SD ± 16,3) i 650,0 ng/μl (SD ± 152,2) odp.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawione tutaj kroki pokazują zdolność do izolowania RNA z oddzielnych przedziałów soczewki, które można z powodzeniem odwrócić transkrypcję na cDNA w metodach biologii molekularnej. Ze względu na wrażliwy charakter metod analizy, ważne jest, aby soczewka była oczyszczona z przyczepionych tkanek na etapie sekcji. Może to wymagać kilku iteracji toczenia soczewki na Kimwipe, aby uzyskać odpowiednią czystość. Należy zachować ostrożność, aby nie wnikać zbyt głęboko w soczewkę podczas oddzielania torebki kolagenowej od w.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Praca ta została sfinansowana z grantu R01 EY032056 (do CC) z National Eye Institute.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wirówka i wirnik | Fisher Naukowy | 14285554po południu | |
| Chloroform, klasa HPLC | Alfa Aesar | 22920 | |
| Etanol (190 proof) | Laboratoria Decon | 2801 | |
| Etanol (200 proof) | Odczynniki biologiczne Fisher | Zobacz materiał BP2818 | |
| Fisherbrand Tłuczek do pelletu | Fisher Naukowy | 12-141-363 | |
| kleszcze, zakrzywione; Pęseta studencka #7 | Światowe instrumenty precyzyjne | 501981 | |
| kleszcze, proste; Dumont #5 | Narzędzia naukowe | 11252-40 | |
| kleszcze, proste; Pęseta studencka #4 | Światowe instrumenty precyzyjne | 501978 | |
| Chusteczki kimowe, małe | Kimberly-Clark | 34155 | Delikatne czyszczenie zadań |
| Aplikator folii samoprzylepnej MicroAmp | Biosystemy stosowane | 4333183 | |
| MicroAmp EnduraPlate Optyczna 96-dołkowa, szybka, przezroczysta płytka reakcyjna z kodem kreskowym | Biosystemy stosowane | 4483485 | |
| Mikropipety | Eppendorf powiedział: | 01-671-120 | |
| Mikroskop, sekcja | Carl Zeiss | SteREO Discovery.V8 | |
| Przezroczysta osłona optyczna MiniAmp | Biosystemy stosowane | 4360954 | |
| Cykler termiczny MiniAmp | Biosystemy stosowane | A37834 (wersja angielska) | |
| MixMate Mieszalnik płytowy Vortex | Eppendorf powiedział: | 5353000529 | |
| Woda klasy molekularnej | Fisher Naukowy | BP28191 | |
| Spektrofotometr UV-VIS Nanodrop One Microvolume | Thermo Scientific | ND-JEDEN-W | |
| Minitacki Nunc MicroWell | Fisher Naukowy | 12-565-154 | Taca preparcyjna |
| Probówki do PCR | Firma VWR | 201007-012 | |
| szalka Petriego, 60 mm x 15 mm | Fisher Naukowy | FB0875713A | |
| sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1x Dulbecco's | Gibco (firma Gibco) | 14190-136 | |
| Końcówki do pipet, 10 i mikro; L Z podziałką | USA Naukowe | 1161-3700 | |
| Końcówki do pipet, 1250 i mikro; L XL z podziałką | USA Naukowe | 1161-1720 | |
| Końcówki do pipet, 200 i mikro; Profil L z podziałką | USA Naukowe | 1163-1700 | |
| System QuantStudio 3 do PCR w czasie rzeczywistym | Biosystemy stosowane | Nr kat. A28567 | |
| Odwrotna transkryptaza, SuperScript IV VILO | Invitrogen | 11756050 | Wysoce procesyjna i termostabilna odwrotna transkryptaza |
| Zestaw do czyszczenia i koncentratora RNA 5 | Zymo powiedział: | Zobacz materiał ZR1013 | |
| Woda wolna od RNaz | Odczynniki biologiczne Fisher | Zobacz materiał BP2819 | |
| RNaseZap powiedział: | Sigma | Czynnik chłodniczy 2020 | Roztwór do dekontaminacji RNazy |
| Probówki do mikrowirówek SealRite 1,5 ml | USA Naukowe | 1615-5500 | |
| Vanny SuperFine 8 cm | Światowe instrumenty precyzyjne | 501778 | Nożyczki |
| TaqMan FAST Advanced Master Mix do qPCR | Biosystemy stosowane | 4444557 | |
| Test ekspresji genów TaqMan (FAM) Sonda (MTO) | ThermoFisher Naukowy | 4448892 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | Roztwór kwasowo-guanidynowo-fenolowy |
| Mieszalnik wirowy | Thermo Scientific | 88880017 |
Bibliografia
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the Ocular Lens. , Cambridge University Press. (2004).
- Bassnett, S., Winzenburger, P. A. Morphometric analysis of fibre cell growth in the developing chicken lens. Exp Eye Res. 76 (3), 291-302 (2003).
- Kuszak, J. R.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
