Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja RNA z nabłonka soczewek ocznych myszy i mas masowych komórek włóknistych

909 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69079

⸱

10 października 2025

 ,  , 
1School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten szczegółowo opisuje oddzielenie nabłonka soczewki oka myszy od masy masowej komórek włóknistych, a następnie izolację RNA i analizę qPCR. Metoda ta pozwala na oddzielenie przedziałów komórek soczewki w celu bardziej szczegółowej analizy transkryptomu i procesów biologicznych w komórkach nabłonkowych w porównaniu ze zróżnicowanymi komórkami włóknistymi.

Streszczenie

Soczewka jest wyspecjalizowaną, przezroczystą tkanką w przedniej komorze oka, która składa się z dwóch głównych typów komórek, komórek nabłonkowych i komórek włóknistych. Monowarstwa komórek nabłonka soczewki pokrywa przednią półkulę soczewki, podczas gdy większość soczewki składa się z masy komórek włókien soczewki. Kolagenowa błona podstawna, znana jako kapsułka, otacza i otacza całą tkankę. Komórki nabłonka soczewki są silnie przylegające do torebki soczewki i można je łatwo oddzielić od masy włókien poprzez oderwanie kapsułki od tkanki. Trudności z uzyskaniem wystarczającego stężenia RNA z powodu małej liczby komórek nabłonkowych w monowarstwie soczewki wcześniej utrudniały badanie transkryptomów komórek nabłonkowych w porównaniu z komórkami włóknistymi. Protokół ten przedstawia metodę czystego oddzielania i izolowania przedziałów komórek nabłonkowych i włóknistych oraz etapów koncentracji RNA, aby umożliwić późniejsze eksperymenty transkryptomiczne na próbkach komórek nabłonka z jednej pary soczewek myszy. Możliwość indywidualnego badania głównych typów komórek soczewki pomaga w badaniu biologicznych mechanizmów utrzymania i rozregulowania soczewki, umożliwiając scharakteryzowanie specyficznych dla typu komórek zakłóceń odpowiedzialnych za patologie soczewki związane z wiekiem.

Wprowadzenie

Soczewka oczna to przezroczysty narząd, który precyzyjnie skupia światło na siatkówce, aby uzyskać wyraźny obraz. Soczewka składa się z dwóch głównych typów komórek: monowarstwy komórek nabłonkowych pokrywających przednią półkulę i komórek włóknistych, które tworzą masę masową tkanki (ryc. 1). Soczewka jest otoczona kolagenową błoną podstawną znaną jako torebka soczewki, do której ściśle przylegają komórki nabłonka. W miarę wzrostu soczewki komórki nabłonkowe na równiku proliferują i różnicują się w powstające powłoki komórek włóknistych, które są nakładane na soczewkę w sposób koncentryczny 1,2,3. Wzrost soczewki przez całe życie zależy od ciągłej proliferacji tej niewielkiej populacji komórek nabłonka równikowego, które tworzą strefę kiełkowania4. W miarę dojrzewania komórek włóknistych wszystkie organelle komórkowe ulegają degradacji w celu wyeliminowania obiektów rozpraszających światło 5,6,7,8,9,10,11 i utrzymania przezroczystości tkanek, a najbardziej wewnętrzne komórki włókniste są ostatecznie zagęszczane, co skutkuje sztywnym środkiem soczewki 9,12. Ze względu na otaczającą torebkę soczewki nie zachodzi obrót komórek w soczewce, a włókna nasienne pozostają w środku soczewki przez całe życie, ponieważ nowe włókna są dodawane na obrzeżach tkanki lub kory. Komórki światłowodowe soczewki mają różne właściwości optyczne w zależności od ich wieku i mogą zapewnić czasowy obraz różnych cech biologicznych na każdym danym etapie13.

Pomimo dostępnych opcji chirurgicznych, zaćma, definiowana jako każde zmętnienie normalnie przezroczystej soczewki, pozostaje główną przyczyną ślepoty na świecie14. Zaćma może objawiać się w nabłonku soczewki, korze lub jądrze o różnych patofizjologiach15. Jednak komórkowe i molekularne mechanizmy powstawania zaćmy pozostają niejasne16,17. Aby lepiej zrozumieć, jak zapobiegać tym różnym typom zaćmy i opracować alternatywy dla operacji, musimy lepiej zrozumieć, w jaki sposób te różne typy komórek utrzymują homeostazę w soczewce.

Komórki nabłonkowe i włókniste odgrywają różne role fizjologiczne w soczewce. Na przykład proliferacja komórek jest ograniczona do nabłonka soczewki18. Tymczasem włókna soczewki stanowią masę masową soczewki, nadając jej strukturę i właściwości refrakcyjne9. Aby uzyskać bardziej zniuansowaną perspektywę procesów biologicznych zachodzących w różnych przedziałach soczewki, komórki nabłonkowe i włókniste muszą być badane oddzielnie. W tym miejscu przedstawiamy metodę izolowania nabłonka od masy masowej komórki włóknistej, ekstrakcji mRNA z każdej frakcji i analizy tych transkryptów za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Diagram anatomii obiektywu. Soczewka składa się z dwóch typów komórek, jednowarstwowych komórek nabłonkowych (niebieskich i pomarańczowych) pokrywających przednią półkulę oraz masowej masy włókien soczewki (białych). Tkanka jest otoczona cienką błoną kolagenową, znaną jako torebka soczewki (tan). Komórki nabłonka przedniego (niebieskie) są w stanie spoczynku, podczas gdy komórki nabłonka równikowego (pomarańczowe) namnażają się, różnicują i wydłużają, stając się nowymi warstwami komórek włóknistych (białymi) na obrzeżach soczewki. Nowe generacje komórek światłowodowych są nakładane na poprzednie generacje włókien w koncentrycznych powłokach. Najstarsze komórki włókien soczewki są zagęszczone w środku tkanki. Rysunek ten został zmodyfikowany z Cheng (2024)38. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z "Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych" National Institutes of Health oraz zatwierdzonym protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Indiana.

1. Obszar roboczy, sprzęt i przygotowanie odczynników

  1. Autoklaw końcówki pipet przed użyciem i wyznacz pudełka z autoklawowanymi końcówkami do eksperymentów RNA, aby uniknąć zanieczyszczenia RNazą.
  2. Potraktuj powierzchnię roboczą w dygestoriach i tłuczkach do homogenizacji tkanek roztworem do odkażania RNazy, dokładnie spłucz wodą dejonizowaną i wysusz.
  3. Namocz narzędzia do preparowania (zakrzywione kleszcze, kleszcze proste i nożyczki do mikrodysekcji) w 70% etanolu na 5 minut i wysusz delikatną ściereczką przed użyciem.
  4. Użyj zupełnie nowych tac preparacyjnych i szalek Petriego do etapów sekcji i izolacji tkanek.
  5. Porcję 400 μl zimnego odczynnika kwasowo-guanidynowo-fenolowego na zimno do probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml wolnych od DNA i RNAzy w dygestorium.

2. Analiza soczewek myszy

  1. Eutanazja dorosłych myszy przy użyciu przedawkowania CO2 , a następnie zwichnięcia szyjki macicy jako środka wtórnego.
  2. Wyłuszczenie oczu za pomocą zakrzywionych kleszczy.
    1. Delikatnie wciśnij kleszczami tkankę otaczającą oko, powodując wysunięcie oka z oczodołu. Zamknij kleszcze pod okiem i usuń, pociągając równomiernie w górę.
    2. Przenieś oczy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z 750-1000 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  3. W celu wypreparowania przenieś oczy do studzienek na tacy preparacyjnej ze świeżym 1x PBS.
  4. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj prostych kleszczy, aby przytrzymać podstawę nerwu wzrokowego i przeciąć nerw jak najbliżej oka ostrymi nożyczkami do mikrodysekcji.
  5. Ostrożnie włóż cienkie, proste kleszcze do otworu, w którym został połączony nerw wzrokowy, i ściśnij, aby utrzymać tkankę na miejscu.
  6. Włóż końcówkę nożyczek do mikrodysekcji do tego samego otworu i ostrożnie przeciąć od tylnego bieguna oka w kierunku połączenia rogówkowo-twardówkowego. Nie wkładaj instrumentów zbyt głęboko, aby uniknąć uszkodzenia obiektywu.
    UWAGA: Soczewka gryzonia zajmuje dużą objętość w oku, dlatego zaleca się płytkie nacięcia, aby zapobiec przebiciu soczewki.
  7. Przeciąć wzdłuż połączenia rogówkowo-twardówkowego za pomocą nożyczek do mikrodysekcji, oddzielając co najmniej połowę obwodu oka.
  8. Użyj prostych kleszczy, aby delikatnie odwrócić tkanki oka, jednocześnie naciskając na rogówkę, wysuwając soczewkę przez nacięcie rogówkowo-twardówkowe.
  9. Ostrożnie usuń wszelkie duże, przyczepione tkanki z soczewki za pomocą cienkich, prostych kleszczy.
  10. W razie potrzeby delikatnie przetocz soczewkę po czystej, delikatnej chusteczce za pomocą zakrzywionych kleszczy, aby usunąć pozostałą przylegającą tkankę pozasoczewkową.
    UWAGA: Szybko przetocz chusteczkę po chusteczce roboczej i nie dopuszczaj do nadmiernego wysuszenia chusteczki. Na powierzchni soczewki mogą występować niewielkie zmętnienia spowodowane suchymi plamami na torebce soczewki. Te nieprzezroczystości są na ogół odwracalne po ponownym umieszczeniu soczewki w 1x PBS i nie wpływają na kolejne kroki.
  11. Przenieś oczyszczoną soczewkę na 6-centymetrową szalkę Petriego z 1x PBS.
  12. Za pomocą cienkich prostych kleszczyków płytko przebij torebkę soczewki w pobliżu równika i delikatnie oderwij kapsułkę soczewki od masy objętościowej włókna. Komórki nabłonka soczewki pozostaną przyczepione do kapsułki. Delikatnie usuń z kapsułki wszelkie duże kawałki błonnika, które mogły odpaść podczas dekapsulacji.
  13. Delikatnie chwyć kapsułkę cienkimi, prostymi kleszkami i zawiruj w 1x PBS, aby usunąć wszelkie pozostałe włókna. Wszelkie luźno połączone komórki włókniste odłączą się od torebki i komórek nabłonkowych.

3. Izolacja RNA

UWAGA: Podsumowany przebieg pracy dla izolacji RNA pokazano na rysunku 2.

  1. Umieść 2 kapsułki soczewek lub 2 masy objętościowe włókien w odpowiednich probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zawierających 400 μl zimnego odczynnika TRIzol.
    UWAGA: Masy włókien należy przenieść z naczynia do rurki za pomocą zakrzywionych kleszczy, aby zebrać tkankę.
  2. Szczelnie zakryj rurki i przenieś je do okapu oparów chemicznych, aby wykonać kolejne kroki.
  3. Delikatnie homogenizuj masy objętościowe włókien soczewki za pomocą czystego tłuczka do granulek.
    UWAGA: Pamiętaj, aby całkowicie rozbić masę światłowodową.
  4. Próbki należy inkubować (kapsułki soczewek lub masę objętościową z homogenizowanego włókna) w TRIzolu przez 30 minut w temperaturze pokojowej w dygestorium.
  5. W dygestorium dodać 200 μl chloroformu na 400 μl odczynnika TRIzol do każdej probówki. Zamknij szczelnie probówki i energicznie potrząsaj ręką przez 15 sekund, trzymając kciuk na dnie tubki, a palec wskazujący na nasadce.
    UWAGA: Probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zanotowane na liście materiałów są używane ze względu na szczelne uszczelnienie. W przypadku korzystania z probówek do mikrowirówek innych marek, przed potrząśnięciem przetestuj zamknięcie i uszczelnienie probówki, ponieważ roztwór TRIzolu i chloroformu może wyciekać spod nakrętki probówek, które nie mają szczelnego zamknięcia.
  6. Próbki należy inkubować przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić separację faz.
    UWAGA: Na dnie probówki zawierającej lipidy i białko powinna znajdować się różowa warstwa odczynnika TRIzol, biała warstwa między fazami zawierającymi DNA oraz przezroczysta faza wodna na górze zawierająca RNA. Biała warstwa DNA może być trudniejsza do zauważenia w próbkach komórek nabłonkowych.
  7. Odwirować próbki o masie 14 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Ostrożnie wkładaj i wyjmuj probówki z wirówki, uważając, aby nie zakłócić faz przenoszenia.
  8. Zbierz probówki i odczynniki z zestawu RNA Clean and Concentrator. Rurki z kolumną wirującą są zamontowane w rurce zbiorczej z zestawu.
  9. W dygestorii ostrożnie przenieś klarowną fazę wodną (górną warstwę) do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, zwracając uwagę na objętość.
    UWAGA: Unikaj naruszania, dotykania lub wciągania białej warstwy DNA pod fazą wodną. Przechyl rurkę podczas przenoszenia fazy wodnej, aby uniknąć naruszenia białej warstwy. Lepiej jest pozostawić niewielką ilość fazy wodnej w probówce, niż zanieczyścić próbkę. Zazwyczaj na 200 μl dodanego chloroformu można odzyskać 180-190 μl fazy wodnej.
  10. Dodaj 200-procentowy etanol do fazy wodnej w stosunku objętościowym 1:1.
    UWAGA: Bufor wiążący RNA z zestawu koncentratora można dodać w stosunku objętościowym 2:1 do fazy wodnej przed dodaniem etanolu. Ten krok jest pomijany, aby zwiększyć wydajność RNA i dlatego, że RNA ma wystarczającą czystość po izolacji.
  11. Delikatnie wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę lub pipetując roztwór w górę i w dół. Przenieść zmieszany roztwór do kolumny wirowej RNA za pomocą pipetora.
    UWAGA: Uważaj, aby nie dotknąć filtra końcówką pipety.
  12. Wirować kolumny wirujące przy 16 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Zaleca się oznaczenie pokrywy kolumny i boku probówki zbiorczej, aby utrzymać porządek w zestawach probówek i na wypadek, gdyby nasadka oderwała się w kolejnym etapie wirowania.
  13. Odrzucić przepływ i dodać 400 μl buforu przygotowawczego RNA do kolumny wirowej.
  14. Wirować kolumny wirujące przy 16 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C.
  15. Odrzucić przepływ i dodać 700 μl buforu do płukania RNA do kolumny wirowej.
  16. Wirować kolumny wirujące przy 16 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C.
  17. Odrzucić przepływ i dodać 400 μl buforu do płukania RNA do kolumny wirowej.
  18. Wirować kolumny wirujące przy 16 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
  19. Odrzucić przepływowy i ponownie odwirować przy 16 000 x g przez 30 s w temperaturze 4°C, aby upewnić się, że kolumna wirowa jest sucha.
  20. Przenieś kolumnę wirującą do nowej oznaczonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1.5 ml.
  21. Dodaj 15 μl wody wolnej od RNaz do filtra membranowego. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Uważaj, aby nie dotknąć filtra końcówką pipety.
  22. Odwirować kolumnę wirową o stężeniu 16 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C w celu elucji oczyszczonego RNA.
    UWAGA: Nasadka probówki do mikrowirówki o pojemności 1.5 ml pozostanie otwarta podczas wirowania. Ostrożnie umieść kolumny wirujące i probówki do mikrowirówek tak, aby otwarte nasadki opierały się o pokrywę wirnika, aby nie kołysała się i nie pękała podczas wirowania. Pokrywy powinny podążać zgodnie z kierunkiem obrotu wirnika.
  23. Usuń i wyrzuć kolumny wirujące. RNA będzie znajdować się w cieczy zebranej w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  24. Szczelnie zamknąć probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i inkubować próbki RNA w temperaturze 55-65 °C przez 10 minut, aby ułatwić ich rozpuszczanie.
  25. Po etapie ogrzewania natychmiast umieścić próbki na lodzie.
  26. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C lub dokonywać odwrotnej transkrypcji na cDNA w celu długotrwałego przechowywania.
    UWAGA: Próbki RNA przechowywano do 3 miesięcy bez zauważalnej utraty stężenia. Porcjuj próbki RNA do mniejszych objętości w celu przechowywania, aby zminimalizować cykle zamrażania i rozmrażania i zapobiec degradacji.

4. Pomiar stężenia RNA za pomocą spektrofotometru UV-Vis

  1. Trzymaj próbki RNA na lodzie, włącz NanoDrop (spektrofotometr UV-Vis) i poczekaj, aż instrument się zainicjalizuje.
  2. W menu Kwasy nukleinowe wybierz moduł kwantyfikacji RNA.
  3. Wykonać ślepą próbę spektrofotometru UV-Vis, pipetując 2,0 μl eluentu ze stopnia stężenia RNA na cokół, w tym przypadku wodę molekularną. Opuść ramię przyrządu i odczytaj ślepą próbkę.
  4. Podnieś ramię instrumentu, wyczyść cokół czujnika za pomocą czystej, suchej, delikatnej ściereczki roboczej, a następnie ponownie przetrzyj kolejną chusteczkę zwilżoną wodą dejonizowaną, a następnie ponownie wytrzyj na sucho.
  5. W razie potrzeby wprowadź szczegóły próbki do interfejsu spektrofotometru UV-Vis.
  6. Załaduj 2,0 μl próbki RNA na cokół, opuść ramię i dokonaj oceny ilościowej.
  7. Powtórzyć kroki od 4.4 do 4.6, aby oczyścić cokół między próbkami.
  8. Po zakończeniu zapisz i wyeksportuj eksperyment w celu dalszej kwantyfikacji, jeśli to konieczne.

5. Odwrotna transkrypcja

  1. Używając wysoce procesywnej i termostabilnej odwrotnej transkryptazy, dokonaj odwrotnej transkrypcji 2,0 μg RNA włókna soczewki i całego wyekstrahowanego nabłonkowego RNA przy użyciu zalecanego przez producenta protokołu. Wymieszaj odczynniki i RNA dla każdej próbki w czystej probówce do PCR. Wszystkie roztwory i próbki RNA należy przechowywać na lodzie.
    UWAGA: Ta transkryptaza może odwrócić transkrypcję do 2,5 μg RNA na reakcję. Zakłada się pełną konwersję z RNA do cDNA, więc jako przypuszczalne stężenie cDNA stosuje się początkowe stężenie RNA.
  2. Przeprowadzić reakcję w termocyklerze, stosując warunki wymienione w tabeli 1.
  3. Przechowuj odwróconą transkrypcję cDNA w temperaturze -80 °C lub przejdź do etapu qPCR.
    UWAGA: próbki cDNA były przechowywane do 4 miesięcy bez zauważalnej degradacji, ponieważ cDNA jest bardziej stabilne niż RNA. Próbki mogą być prawdopodobnie przechowywane przez dłuższy czas, pod warunkiem, że cykle zamrażania i rozmrażania zostaną zminimalizowane.
KrokTemperatura (°C)Czas (min)Cykli
Wyżarzanie25101
Odwrotna transkrypcja50101
Inaktywacja enzymów8551
Trzymać4∞1

Tabela 1: Warunki termocyklera do odwrotnej transkrypcji. Warunki te są dostosowane do specyficznej, wysoce procesyjnej i termostabilnej odwrotnej transkryptazy. Warunki pracy mogą się różnić w zależności od użytego enzymu i zestawu.

6. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym

  1. Przed rozpoczęciem reakcji należy przygotować roztwory podstawowe cDNA do pożądanego stężenia, rozcieńczając je wodą molekularną. W tych eksperymentach 1 μl cDNA zostanie użyty przy 5 ng/μl do reakcji 5 ng/studzienkę. Wszystkie roztwory i próbki cDNA należy przechowywać na lodzie.
    UWAGA: Płytki macierzy TaqMan (format 0,1 ml) są zalecane do przeprowadzania reakcji 5-50 ng cDNA na studzienkę. Tworzenie porcji cDNA jest przydatne do ograniczania cykli zamrażania i rozmrażania. W tym badaniu próbki ograniczono do maksymalnie 5 cykli zamrażania i rozmrażania.
  2. Przygotuj działającą mieszankę główną składającą się z Advanced Master Mix i sond zgodnie z zaleceniami komercyjnymi. Patrz sekcja 7, aby zapoznać się z przykładowym przygotowaniem. Wszystkie roztwory i próbki cDNA należy przechowywać na lodzie.
    UWAGA: Para sond z dwoma różnymi barwnikami jest powszechnie używana na studzienkę. Na przykład w tym badaniu Crygs-FAM-MGB został użyty jako sonda genu będącego przedmiotem zainteresowania, a Ppia-VIC-MGB jako kontrola wewnętrzna. Zalecenia handlowe dotyczące końcowych stężeń sondy i startera wynoszą odpowiednio 250 nM i 900 nM. Jeśli cel jest bardzo silnie eksprymowany, może być potrzebna sonda z ograniczoną ilością starterów, aby zapobiec wyczerpaniu odczynników reakcyjnych.
  3. Załadować zapas cDNA (1 μl) do odpowiednich dołków na płytce qPCR, a następnie roboczą mieszankę główną (9 μl). Mieszać roztwory, pipetując powoli w górę i w dół, dodając mieszankę główną. Upewnij się, że kropla cDNA jest zmieszana z roztworem i unikaj pęcherzyków.
    UWAGA: W zależności od czułości celu, może być konieczne załadowanie płyty na lód.
  4. Uszczelnij płytkę qPCR, ostrożnie nakładając optyczną osłonę samoprzylepną. Użyj aplikatora do folii samoprzylepnej, aby wygładzić pokrywę i zapewnić szczelne uszczelnienie wokół każdej studzienki.
  5. Wiruj płytki przy 1000 obr./min przez 10 sekund, aby wymieszać.
  6. Odwirować płytki o masie 1000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby upewnić się, że na dnie studzienek nie ma pęcherzyków powietrza.
  7. Załadować płytkę do ilościowego termocyklera PCR i uruchomić zgodnie z cyklami wymienionymi w tabeli 2.
    UWAGA: Konwencjonalne protokoły qPCR są zazwyczaj ograniczone do 40 cykli. Jest mało prawdopodobne, aby zwiększenie liczby cykli przyniosło znaczące wyniki, ponieważ po 40 cyklach pojedyncza kopia docelowa może teoretycznie dać około 1 biliona amplikonów19.
KrokTemperatura (°C)Czas (s)Cykli
Inaktywacja uracylo-N-glikozylazy (UNG)501201
Denaturacja951201
Denaturacja95145
Wyżarzanie6020
Trzymać4∞1

Tabela 2: Warunki termocyklera dla ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy. Warunki te są dostosowane do określonej serii komercyjnych testów ekspresji genów. Stosowane są parametry domyślne, z wyjątkiem zwiększania cykli wzmocnienia z 40 do 45.

7. Przykładowe obliczenie objętości dla qPCR

UWAGA: Kod źródłowy R dla kalkulatora objętości dla opisanych poniżej równań jest dostępny w pliku uzupełniającym 1. Ten kalkulator jest przeznaczony dla sond Taqman i mieszanki głównej wymienionych w Tabeli Materiałów.

  1. Określ liczbę studzienek, które mają być pipetowane, i oblicz co najmniej 12,5% nadwyżki. Ta stała nadmiaru (kExcess) kompensuje błąd pipetowania i zapewnia wystarczającą ilość roztworu. W tym przykładzie 96 studzienek zostanie użytych jako cel przygotowania próbki.
    Równanie:
    figure-protocol-1
    Przykład:
    figure-protocol-2
    UWAGA: Jeśli 12,5% nadwyżki nie jest liczbą całkowitą, łatwym sposobem na zapewnienie "ładnych" liczb w kolejnych krokach jest zaokrąglenie w górę do najbliższego dołka i odpowiednie dostosowanie kNadwyżki .
  2. Oblicz objętość roboczej mieszanki głównej. W tych eksperymentach używa się 1 μl cDNA i 9 μl roboczej mieszanki głównej na studzienkę. Objętości cDNA i miksu głównego można dostosować w razie potrzeby.
    Równanie:
    figure-protocol-3
    Przykład:
    figure-protocol-4
  3. Obliczyć modyfikator stężenia (kConc). Ten modyfikator służy do tworzenia bardziej skoncentrowanej roboczej mieszanki wzorcowej, która rozcieńczy się do 1x po zmieszaniu z cDNA.
    Równanie:
    figure-protocol-5
    Przykład:
    figure-protocol-6
  4. Oblicz objętość sondy (20x).
    Równanie:
    figure-protocol-7
    Przykład:
    figure-protocol-8
  5. Oblicz objętość surowca głównego mieszanki (2x).
    Równanie:
    figure-protocol-9
    Przykład:
    figure-protocol-10
  6. Doprowadzić roboczą mieszankę wzorcową do obliczonej objętości za pomocą cząsteczkowego H2O.
    Równanie:
    figure-protocol-11
    figure-protocol-12
    figure-protocol-13
    figure-protocol-14
    figure-protocol-15
    Przykład:
    figure-protocol-16
    figure-protocol-17
    figure-protocol-18
    figure-protocol-19
    figure-protocol-20

Plik uzupełniający 1: Kod źródłowy R dla kalkulatora objętości. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nabłonek i włókna soczewki wyizolowano od 6- do 7-tygodniowych myszy typu dzikiego. Do tych eksperymentów wykorzystano trzy myszy, a 2 kapsułki soczewkowe lub 2 masy komórek włóknistych od każdej myszy połączono w jedną replikę biologiczną. Jak opisano w protokole, RNA wyekstrahowano za pomocą separacji faz odczynnika TRIzol. Średnio para mas nabłonka soczewki i włókien dała odpowiednio 0,8 μg (SD ± 0,2) i 9,7 μg (±SD 2,3) RNA. Średnie stężenie w 15 μl elucji wynosiło 55,4 ng/μl (SD ± 16,3) i 650,0 ng/μl (SD ± 152,2) odp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawione tutaj kroki pokazują zdolność do izolowania RNA z oddzielnych przedziałów soczewki, które można z powodzeniem odwrócić transkrypcję na cDNA w metodach biologii molekularnej. Ze względu na wrażliwy charakter metod analizy, ważne jest, aby soczewka była oczyszczona z przyczepionych tkanek na etapie sekcji. Może to wymagać kilku iteracji toczenia soczewki na Kimwipe, aby uzyskać odpowiednią czystość. Należy zachować ostrożność, aby nie wnikać zbyt głęboko w soczewkę podczas oddzielania torebki kolagenowej od w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca ta została sfinansowana z grantu R01 EY032056 (do CC) z National Eye Institute.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wirówka i wirnikFisher Naukowy14285554po południu
Chloroform, klasa HPLCAlfa Aesar22920
Etanol (190 proof)Laboratoria Decon2801
Etanol (200 proof)Odczynniki biologiczne FisherZobacz materiał BP2818
Fisherbrand Tłuczek do pelletuFisher Naukowy12-141-363
kleszcze, zakrzywione; Pęseta studencka #7Światowe instrumenty precyzyjne501981
kleszcze, proste; Dumont #5Narzędzia naukowe11252-40
kleszcze, proste; Pęseta studencka #4Światowe instrumenty precyzyjne501978
Chusteczki kimowe, małeKimberly-Clark34155Delikatne czyszczenie zadań
Aplikator folii samoprzylepnej MicroAmpBiosystemy stosowane4333183
MicroAmp EnduraPlate Optyczna 96-dołkowa, szybka, przezroczysta płytka reakcyjna z kodem kreskowymBiosystemy stosowane4483485
MikropipetyEppendorf powiedział:  01-671-120
Mikroskop, sekcjaCarl ZeissSteREO Discovery.V8
Przezroczysta osłona optyczna MiniAmpBiosystemy stosowane4360954
Cykler termiczny MiniAmpBiosystemy stosowaneA37834 (wersja angielska)
MixMate Mieszalnik płytowy VortexEppendorf powiedział:5353000529
Woda klasy molekularnejFisher NaukowyBP28191
Spektrofotometr UV-VIS Nanodrop One MicrovolumeThermo ScientificND-JEDEN-W
Minitacki Nunc MicroWellFisher Naukowy12-565-154Taca preparcyjna
Probówki do PCRFirma VWR201007-012
szalka Petriego, 60 mm x 15 mmFisher NaukowyFB0875713A
sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1x Dulbecco'sGibco (firma Gibco)14190-136
Końcówki do pipet, 10 i mikro; L Z podziałkąUSA Naukowe1161-3700
Końcówki do pipet, 1250 i mikro; L XL z podziałkąUSA Naukowe1161-1720
Końcówki do pipet, 200 i mikro; Profil L z podziałkąUSA Naukowe1163-1700
System QuantStudio 3 do PCR w czasie rzeczywistymBiosystemy stosowaneNr kat. A28567
Odwrotna transkryptaza, SuperScript IV VILO Invitrogen11756050Wysoce procesyjna i termostabilna odwrotna transkryptaza
Zestaw do czyszczenia i koncentratora RNA 5Zymo powiedział:Zobacz materiał ZR1013
Woda wolna od RNazOdczynniki biologiczne FisherZobacz materiał BP2819
RNaseZap powiedział:SigmaCzynnik chłodniczy 2020Roztwór do dekontaminacji RNazy
Probówki do mikrowirówek SealRite 1,5 mlUSA Naukowe1615-5500
Vanny SuperFine 8 cmŚwiatowe instrumenty precyzyjne501778Nożyczki
TaqMan FAST Advanced Master Mix do qPCRBiosystemy stosowane4444557
Test ekspresji genów TaqMan (FAM) Sonda (MTO)ThermoFisher Naukowy4448892
TRIzolInvitrogen15596026Roztwór kwasowo-guanidynowo-fenolowy
Mieszalnik wirowyThermo Scientific88880017

Bibliografia

  1. Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the Ocular Lens. , Cambridge University Press. (2004).
  2. Bassnett, S., Winzenburger, P. A. Morphometric analysis of fibre cell growth in the developing chicken lens. Exp Eye Res. 76 (3), 291-302 (2003).
  3. Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. Int Rev Cytol. 163, 305-350 (1995).
  4. Yamamoto, N., Majima, K., Marunouchi, T. A study of the proliferating activity in lens epithelium and the identification of tissue-type stem cells. Med Mol Morphol. 41 (2), 83-91 (2008).
  5. Bassnett, S. On the mechanism of organelle degradation in the vertebrate lens. Exp Eye Res. 88 (2), 133-139 (2009).
  6. Bassnett, S. The fate of the Golgi apparatus and the endoplasmic reticulum during lens fiber cell differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (9), 1793-1803 (1995).
  7. Bassnett, S. Lens organelle degradation. Exp Eye Res. 74 (1), 1-6 (2002).
  8. Bassnett, S., Beebe, D. C. Coincident loss of mitochondria and nuclei during lens fiber cell differentiation. Dev Dyn. 194 (2), 85-93 (1992).
  9. Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: Structural determinants of eye lens transparency. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
  10. Vrensen, G. F., Graw, J., De Wolf, A. Nuclear breakdown during terminal differentiation of primary lens fibres in mice: A transmission electron microscopic study. Exp Eye Res. 52 (6), 647-659 (1991).
  11. Counis, M. F., et al. Analysis of nuclear degradation during lens cell differentiation. Cell Death Differ. 5 (4), 251-261 (1998).
  12. Piatigorsky, J. Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features. Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).
  13. Al-Khudari, S., Donohue, S. T., Al-Ghoul, W. M., Al-Ghoul, K. J. Age-related compaction of lens fibers affects the structure and optical properties of rabbit lenses. BMC Ophthalmol. 7, 19(2007).
  14. World Report on Vision. , World Health Organization. Geneva. (2019).
  15. Hashemi, H., et al. Global and regional prevalence of age-related cataract: A comprehensive systematic review and meta-analysis. Eye (Lond). 34 (8), 1357-1370 (2020).
  16. Cheng, C., Gong, X. Diverse roles of eph/ephrin signaling in the mouse lens. PLoS One. 6 (11), e28147(2011).
  17. Ibaraki, N. A brighter future for cataract surgery. Nat Med. 3 (9), 958-960 (1997).
  18. Scullica, L., Grimes, P., Mcelvain, N. Further autoradiographic studies of the lens epithelium. Normal and x-irradiated rat eyes. Arch Ophthalmol. 70, 659-665 (1963).
  19. Caraguel, C. G., Stryhn, H., Gagne, N., Dohoo, I. R., Hammell, K. L. Selection of a cutoff value for real-time polymerase chain reaction results to fit a diagnostic purpose: Analytical and epidemiologic approaches. J Vet Diagn Invest. 23 (1), 2-15 (2011).
  20. 60/280 and 260/230 ratios. , Thermo Scientific. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/Product-Bulletins/T123-NanoDrop-Lite-Interpretation-of-Nucleic-Acid-260-280-Ratios.pdf (2009).
  21. Beyer, E. C., Kistler, J., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Antisera directed against connexin43 peptides react with a 43-kd protein localized to gap junctions in myocardium and other tissues. J Cell Biol. 108 (2), 595-605 (1989).
  22. Gong, X., Cheng, C., Xia, C. H. Connexins in lens development and cataractogenesis. J Membr Biol. 218 (1-3), 9-12 (2007).
  23. Leonard, M., Zhang, L., Bleaken, B. M., Menko, A. S. Distinct roles for n-cadherin linked c-src and fyn kinases in lens development. Dev Dyn. 242 (5), 469-484 (2013).
  24. Leonard, M., et al. Modulation of n-cadherin junctions and their role as epicenters of differentiation-specific actin regulation in the developing lens. Dev Biol. 349 (2), 363-377 (2011).
  25. Logan, C. M., et al. N-cadherin regulates signaling mechanisms required for lens fiber cell elongation and lens morphogenesis. Dev Biol. 428 (1), 118-134 (2017).
  26. Maddala, R., Nagendran, T., Lang, R. A., Morozov, A., Rao, P. V. Rap1 gtpase is required for mouse lens epithelial maintenance and morphogenesis. Dev Biol. 406 (1), 74-91 (2015).
  27. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178(2022).
  28. Paul, D. L., Ebihara, L., Takemoto, L. J., Swenson, K. I., Goodenough, D. A. Connexin46, a novel lens gap junction protein, induces voltage-gated currents in nonjunctional plasma membrane of xenopus oocytes. J Cell Biol. 115 (4), 1077-1089 (1991).
  29. Rong, P., et al. Disruption of gja8 (alpha8 connexin) in mice leads to microphthalmia associated with retardation of lens growth and lens fiber maturation. Development. 129 (1), 167-174 (2002).
  30. Terrell, A. M., et al. Molecular characterization of mouse lens epithelial cell lines and their suitability to study RNA granules and cataract associated genes. Exp Eye Res. 131, 42-55 (2015).
  31. White, T. W., Bruzzone, R., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Mouse cx50, a functional member of the connexin family of gap junction proteins, is the lens fiber protein mp70. Molecular Biology of the Cell. 3 (7), 711-720 (1992).
  32. Xia, C. H., et al. Altered cell clusters and upregulated Aqp1 in connexin 50 knockout lens epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (11), 27(2024).
  33. Beyer, E. C., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Connexin43: A protein from rat heart homologous to a gap junction protein from liver. J Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2621-2629 (1987).
  34. Gong, X., et al. Disruption of Alpha3 connexin gene leads to proteolysis and cataractogenesis in mice. Cell. 91 (6), 833-843 (1997).
  35. Xu, L., Overbeek, P. A., Reneker, L. W. Systematic analysis of E-, N- and P-cadherin expression in mouse eye development. Exp Eye Res. 74 (6), 753-760 (2002).
  36. Nishina, S., et al. Pax6 expression in the developing human eye. Br J Ophthalmol. 83 (6), 723-727 (1999).
  37. Wistow, G., et al. Gamman-crystallin and the evolution of the betagamma-crystallin superfamily in vertebrates. FEBS J. 272 (9), 2276-2291 (2005).
  38. Cheng, C. Tissue, cellular, and molecular level determinants for eye lens stiffness and elasticity. Front Ophthalmol (Lausanne). 4, 1456474(2024).
  39. Huynh, P. N., Cheng, C. Spatial-temporal comparison of eph/ephrin gene expression in ocular lenses from aging and knockout mice. Front Ophthalmol (Lausanne). 4, 1410860(2024).
  40. Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. J Vis Exp. (31), e1519(2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Masa kom rek w kiensoczewka myszykom rki nab onka soczewkikom rki w kien soczewkimikrodyssekcjaoczyszczanie za pomoc kolumien wir wkowychr nicowa ekspresja gen wekspresja koneksyn
Izolacja RNA z nabłonka soczewek ocznych myszy i mas masowych komórek włóknistych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.