Niniejsze badanie przedstawia metodę oceny funkcji PAK5 w ESCC, wykazując, że jego nadekspresja przewiduje złe rokowanie i sprzyja postępowi guza przez oś sygnalizacji PAK5-GAREM1.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Niniejsze badanie przedstawia metodę oceny funkcji PAK5 w ESCC, wykazując, że jego nadekspresja przewiduje złe rokowanie i sprzyja postępowi guza przez oś sygnalizacji PAK5-GAREM1.
Rak przełyku płaskonakomórkowy (ESCC) jest główną przyczyną śmiertelności związanej z nowotworami na całym świecie, szczególnie w Azji. Ze względu na brak wczesnych objawów, większość pacjentów diagnozowana jest w zaawansowanych stadiach, co ogranicza skuteczność leczenia i pogarsza rokowanie. Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw ESCC oraz identyfikacja biomarkerów lub celów terapeutycznych są kluczowe dla poprawy wyników leczenia pacjentów. Kinaza białkowa 5 (PAK5), aktywowana P21, należąca do rodziny kinaz białkowych aktywowanych przez mitogeny, była powiązana z różnymi nowotworami poprzez regulację cyklu komórkowego, migracji i inwazji. Jednak jego rola w ESCC pozostaje niejasna. Badanie to oceniało ekspresję PAK5 w tkankach ESCC i przyległych tkankach normalnych za pomocą immunohistochemii oraz przeprowadzono analizę przeżycia Kaplana-Meiera w celu oceny związku między PAK5 a rokowaniem. Ustalono modele komórek ESCC z nadekspresją i knockdownem PAK5, a także przeprowadzono testy funkcjonalne, w tym CCK-8, tworzenie kolonii i testy transwellowe. Ponadto przeprowadzono sekwencjonowanie mRNA w celu identyfikacji celów i szlaków sygnalizacyjnych regulowanych przez PAK5. Wyniki te wykazały, że ekspresja PAK5 była istotnie podwyższona w tkankach ESCC w porównaniu z tkankami prawidłowymi i wiązała się ze złym rokowaniem. Testy funkcjonalne wykazały, że PAK5 sprzyja proliferacji komórek ESCC, formowaniu kolonii, migracji i inwazji, podczas gdy analiza transkryptomiczna uwypukliła GAREM1 jako kluczowy czynnik dalszy. Wyniki te wskazują, że PAK5 przyczynia się do progresji ESCC i może służyć jako biomarker prognostyczny oraz cel terapeutyczny.
Na całym świecie rak przełyku należy do najbardziej śmiertelnych nowotworów. W Chinach dominującym podtypem histologicznym jest rak płaskonabłonkowy przełyku (ESCC). Chociaż osiągnięto postępy terapeutyczne, rokowania dla pacjentów z ESCC pozostają przygnębiające i przejawiają się jedynie na poziomie 10% do 25% przeżycia przez 5lat. Wynika to głównie z wyzwań związanych z wczesnym wykrywaniem oraz ograniczonej dostępności skutecznych terapii ukierunkowanych na uczuciamolekularne 2. W przeciwieństwie do innych guzów litych, gdzie terapie celowane wykazały znaczące obietnice, takie podejścia w ESCC są wciąż w powijakach, ograniczone przez niedobór użytecznych celów molekularnych.
PAK5, grupa II PAK, integruje dynamikę cytoszkieletu i sygnalizację pro-survival i została powiązana z chemoopornością w kilku nowotworach 3,4,5,6,7,8,9,10,11. Biorąc pod uwagę znaczącą rolę sygnalizacji MAPK w biologii ESCC i odpowiedzi terapeutycznej 1,2,12, postawiono hipotezę, że PAK5 jest podwyższony w ESCC i promuje złośliwe fenotypy poprzez modulację sygnalizacji MAPUK, potencjalnie z udziałem GAREM1 jako adaptora/regulatora 13,14,15,16. Do testowania tej hipotezy zastosowano ilościowe IHC, funkcjonalną perturbację genetyczną oraz profilowanie transkryptomiczne.
Leczenie ESCC zazwyczaj obejmuje połączenie przełyku, chemioterapii i radioterapii. Chociaż przełyk może być leczniczy, wiąże się z wysokim ryzykiem zachorowalności 4,8. Dodatkowo, zarówno chemioterapia, jak i radioterapia często nie eliminują wszystkich komórek nowotworowych, co prowadzi do oporności, nawrotów i przerzutów 8,9. Immunoterapia stała się ostatnio ważnym obszarem w onkologii, wykazując skuteczność w leczeniu zaawansowanych nowotworów. Rosnące zainteresowanie podkreśla pilną potrzebę nowych biomarkerów, które mogą pomóc we wczesnej diagnozie i planowaniu leczenia ESCC. Poprzednie badania wykazały, że inni członkowie rodziny PAK, tacy jak PAK1 i PAK4, wspierają proliferację, inwazję i odporność na terapię w ESCC, podkreślając znaczenie tej rodziny kinaz w biologii ESCC. Jednak rola PAK5, mniej zbadanego PAK-u grupy II, pozostaje słabo zdefiniowana, co motywuje obecne badanie17,18.
Kinaza aktywowana P21 5 (PAK5), członek podrodziny PAK II, została po raz pierwszy zidentyfikowana jako kinaza specyficzna dla mózgu w 2002 roku. Znajdujący się na chromosomie 20p12, PAK5 koduje białko o masie około 80 kDa i występuje głównie w mitochondriach oraz jądrze, gdzie odgrywa różnorodne role w regulacji komórkowej 10,11,13. Jego funkcje w mitochondriach obejmują metabolizm i regulację energii, natomiast obecność jądra jest powiązana z transkrypcją genów i kontrolą cyklu komórkowego. Chociaż PAK5 jest mniej badane niż jego odpowiedniki, uważa się, że jest kluczowy dla rozwoju neurologicznego, przeżycia komórek oraz postępu raka10. Warto zauważyć, że PAK5 został powiązany z regulacją cytoszkieletu, mechanizmami antyapoptotycznymi oraz proliferacją komórek12. Jego wzrost w komórkach nowotworowych powiązany jest z pojawiającą się opornością na leki, co odpowiada odkryciom powiązanym z nadmierną ekspresją PAK5 ze zwiększoną opornością komórek nowotworowych na chemioterapię 10,11,13,14. Jednak dokładna funkcja PAK5 w progresji ESCC pozostaje nieuchwytna. Niniejsze badanie bada wpływ PAK5 na środowisko transkryptomiczne ESCC oraz jego funkcjonalne konsekwencje. Przeprowadzono profilowanie transkryptomiczne w celu identyfikacji zmian ekspresji genów związanych z aktywnością PAK5 w komórkach ESCC. Dodatkowo opracowano model komórkowy ESCC z kontrolowaną modulacją PAK5, aby wyjaśnić jego rolę w rozwoju guza i potęgach przerzutowych. W przeciwieństwie do konwencjonalnych strategii odkrywania biomarkerów w ESCC, które opierają się głównie na Western blottingu lub pomiarach transkrypcji pojedynczej modalności, obecny workflow integruje ilościową immunohistochemię, profilowanie transkryptomiczne oraz testy funkcjonalne. To połączone podejście umożliwia jednoczesną walidację molekularną i fenotypową, dostarczając mechanistycznego wglądu i jednocześnie zwiększając znaczenie biologiczne. Ponadto protokół kładzie nacisk na eksperymentalną powtarzalność, wykorzystując próbki tkanek z parą guzów i sąsiednich, standaryzowane procedury immunodawistyki oraz wysokiej jakości dane wejściowe RNA (integralność RNA ≥ 7) do sekwencjonowania. Te cechy zwiększają odporność i zastosowanie testu w laboratoriach, szczególnie w badaniach mających na celu zdefiniowanie klinicznie istotnych sieci regulacyjnych opartych na kinazach w ESCC.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Drugiego Szpitala Afiliowanego Uniwersytetu Medycznego Hainan (Zatwierdzenie nr LW2022602), a każdy uczestnik uzyskał świadomą zgodę zgodnie z Deklaracją Helsińską. Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Pobieranie próbek pacjentów i tkanek
Łącznie włączono 40 pacjentów z patologicznie potwierdzonym ESCC, wszyscy z prawidłową funkcją wątroby i nerek przed operacją. Próbki guza (grupa T) oraz sąsiadujące tkanki prawidłowe (grupa N; ≥2 cm od brzegu guza) zostały pobrane bezpośrednio po resekcji chirurgicznej. Tkanki były utrwalane w 4% paraformaldehydzie (PFA) w PBS w temperaturze pokojowej przez 7 dni przed zanurzeniem parafiny.
2. Barwienie immunohistochemiczne
Bloki z osadzoną parafiną były przecinane na 5 μm i wypalane w 60 °C przez godzinę. Fragmenty zostały odparafinizowane substytutem ksylenowym, nawodnione przez stopień etanolu i poddane pobieraniu antygenów w buforze cytrynianu sodu o pojemności 10 mM (pH 6,0) w temperaturze 95-98 °C przez 20 minut. Endogenna aktywność nadtlenku wodoru była schłodzona 3% nadtlenkiem wodoru przez 10 minut, a następnie blokowano 5% naturalną surowicą przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Sekcje były inkubowane przez noc (12-16 godzin) w temperaturze 4 °C z pierwotnym przeciwciałem przeciw PAK5 (rozcieńczenie 1:100, patrz Tabela materiałów). Po płukaniu PBS szkiełka były inkubowane przeciwciałem wtórnym sprzężonym z nadtlenkiem chrzanu przez 30 minut w temperaturze pokojowej, wywoływane za pomocą DAB aż do pojawienia się koloru (1-5 minut, monitorowane pod mikroskopem, aby uniknąć przebarwienia), a następnie kontrumabiowane hematoksyliną przez 30-60 sekund. Fragmenty były odwodniane, montowane i obrazowane pod mikroskopem jasnego pola. Intensywność barwienia i proporcja komórek dodatnich były ilościowo określane za pomocą oprogramowania do analizy obrazów, z co najmniej pięcioma losowymi polami na przekrój (200× powiększenia). Metoda ilościowej przyjęła obliczenie H-score, według wzoru: H-score = ∑ (stopień intensywności barwienia × procent komórek dodatnich) (intensywność oceniana jako 0 = ujemna, 1 = słaba, 2 = umiarkowana, 3 = silna; procent sklasyfikowany jako 0-25%, 26-50%, 51-75%, 76-100%). Aby zapewnić wiarygodność, dwóch niezależnych patologów przeprowadziło ślepe ocenianie, z porozumieniem między obserwatorami o wartości κ ≥ 0,75. Kryteria kontroli jakości zostały ściśle wdrożone: Pozytywne kontrole (znane tkanki ESCC z dodatnim PAK5) oraz kontrolne negatywne (pierwotne przeciwciała zastąpione PBS) muszą przejść weryfikację; intensywność barwienia tła musi być poniżej ustalonego progu (np. H-score < 50); współczynnik zmienności (CV) wyników barwienia w duplikatach partii musi wynosić <20%, aby wykluczyć zmienność eksperymentalną.
3. Linie komórkowe i hodowla
Komórki KYSE-150 (ludzki ESCC) i HEK-293 (opakowanie wirusowe) zostały uwierzytelnione poprzez profilowanie krótkich powtórzeń tandemowych (STR) i potwierdzone, że są wolne od mykoplazmy. Komórki KYSE-150 zostały wyhodowane w podłożu RPMI-1640 z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydła (FBS) oraz 1% penicylin-streptomycyny (100 U/mL penicyliny i 100 μg/mL streptomycyny). Ogniwa HEK-293 były utrzymywane w DMEM uzupełnionym tymi samymi dodatkami. Komórki były subhodowane przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA przy osiągnięciu 70%-80% zbiegu, a następnie zasiewano do odpowiednich gęstości 24 godziny przed każdym eksperymentem.
4. Konstrukcja i infekcja wektorów lentiwirusowych
Wektory lentiwirusowe zostały zaprojektowane tak, aby albo nadekspresować PAK5 (pLV-EF1α-PAK5-PGK-Puro), albo uciszyć PAK5 (pLV-U6-shRNA-PAK5-PGK-Puro). Komórki HEK-293 zostały zasiane w naczyniach o średnicy 10 cm i transfekowane przy 70%-80% zbiegu z plazmidem transferowym, plazmidami opakującymi (gag/pol i rev) oraz plazmidem otoczkowym (VSV-G) w stosunku 4:3:1 przy użyciu lipidowego reagenta transfekcyjnego, z łączną ilością DNA ~20 μg na naczynie o średnicy 10 cm. Medium zostało wymienione 6-8 godzin po transfekcji. Supernatanty wirusowe zbierano w 48 i 72 godzinach, wirowano w 500 × g przez 10 minut w celu usunięcia zanieczyszczeń, filtrowano przez filtr 0,45 μm i koncentrowano lub przechowywano w temperaturze −80 °C. Do transdukcji komórki KYSE-150 zostały zasiane dzień przed infekcją i wystawione na działanie nadmiaru wirusowego przy multipliczności zakażeń (MOI) 5-10 w obecności polibrenu o stężeniu 8 μg/mL. MOI definiowano jako stosunek jednostek zakaźnych do liczby komórek docelowych. Przeprowadzono eksperyment wstępny w celu oszacowania MOI za pomocą liczenia GFP (qPCR), a następnie wybrano MOI na poziomie 5-10. Nośnik został wymieniony po 12-16 godzinach, a krzywa zabójstwa puromycyny została ustanowiona przez traktowanie komórek nieprzekształconych stężeniami puromycyny w zakresie od 0-4 μg/mL przez 72-96 godzin, aby określić minimalne stężenie śmiertelne. Wybrane stężenie do selekcji wynosiło 1-2 μg/mL, a stężenie utrzymujące 0,5-1 μg/mL. Komórki były wybierane puromycyną (1-2 μg/mL) zaczynając 48 godzin później. Nadekspresja lub wyciszanie PAK5 zostało zweryfikowane za pomocą RT-qPCR przy użyciu specyficznych primerów dla PAK5 (forward 5′-CCAAAGCTGGTGGGGACCC-3′, reverse 5′-AGGCCGTTGATGGAGGTTTC-3′) oraz GAPDH (forward 5′-GTGGACATCCGCAAGAC-3′, reverse 5′-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3′). Względne wyrażenie PAK5 zostało obliczone metodą 2−ΔΔCt . Wszystkie eksperymenty przeprowadzono z udziałem co najmniej trzech biologicznych replikatów.
5. Test żywotności CCK-8
Żywotność komórek oceniano za pomocą zestawu Cell Counting Kit-8 (CCK-8), który opiera się na redukcji odczynnika WST-8 przez dehydrogenazy komórkowe. Komórki KYSE-150 rosnące logarytmicznie zostały zasiane w ilości 2 000 komórek na odwiert w płytach 96-dołkowych w medium kompletnym o pojemności 100 μL. W godzinach 0, 24 h, 48 h, 72 h i 96 h do każdego odwiertu dodawano 10 μL odczynnika CCK-8 (zawierającego WST-8). Po inkubacji w 37 °C przez 2 godziny, zmierzono absorpcję przy 450 nm (A450) za pomocą czytnika mikropłyt. Do składu dołączono puste studnie zawierające wyłącznie nośnik. Każda grupa eksperymentalna zawierała co najmniej trzy biologiczne replikaty, a każdy pomiar przeprowadzono za pomocą pięciu technicznych replikacji.
6. Test formowania kolonii
Zawiesiny jednokomórkowe KYSE-150 były zasiewane po 1000 komórek na odwiert w płytkach 6-dołowych i hodowane przez 14 dni, przy czym podłoże wymieniano co 2-3 dni. Kolonie były fiksowane 4% PFA przez 15 minut, barwione 0,1% kryształowym fioletem w 20% metanolu przez 15 minut, płukane wodą i suszone na powietrzu. Kolonie zawierające ponad 50 komórek zostały policzone za pomocą oprogramowania do analizy obrazów, a tempo powstawania kolonii obliczono.
7. Badanie inwazji transwellów
Wkładki z porami o średnicy 8 μm były wstępnie pokrywane matrycą błony podstawnej (50 μL na wkład, rozcieńczenie 1:8) i inkubowane w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę; Przed zasiewem komórek przeprowadzono kontrolę jakości: w celu weryfikacji ważności testu stosowano puste wkładki (bez komórek) oraz wkładki z negatywną kontrolą (bez chemoatraktantu), a jednolitość warstwy matrycy błony podstawnej potwierdzono poprzez wizualną inspekcję (lub pomiar wagi dla surowszej kontroli). Komórki były objęte surowicą w medium o 1% FBS przez 6-12 godzin, a 2 × 10⁵ komórek/mL (200 μL na wkładkę) zostały zasiewane do górnej komory. Dolna komora zawierała 600 μL medium z 20% FBS jako chemioatraktantem. Po 24-godzinnej inkubacji usuwano nieinwazowane komórki na górnej powierzchni, a zaatakowane komórki na dolnej powierzchni utrwalano metanolem przez 10 minut i barwiono 0,1% kryształowym fioletem przez 15 minut. Barwione komórki były obrazowane pod mikroskopem jasnego pola i liczone w co najmniej pięciu losowych polach mikroskopowych na każdą inserwację (200× powiększenia); Liczenie przeprowadzono metodą ślepą (personel liczenia nie był świadomy przydziałów grupowych), aby uniknąć subiektywnej stronniczości.
8. Detekcja apoptozy cytometryczną przepływowo
Komórki (w tym pływające), dwukrotnie płukano PBS i ponownie zawieszono w buforze wiązającym przy 1 × 106 komórek/mL. Do 100 μL zawiesiny dodano Annexin V-FITC (5 μL) oraz jodek propidiu (5 μL), po czym nastąpiła inkubacja w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemności; po inkubacji do każdej próbki dodawano bufor wiążący 400 μL. Przed analizą cytometryczną przepływu korekta była stosowana za pomocą kontroli pojedynczych barwionych (Annexin V-FITC pojedynczo barwione komórki i PI pojedynczo barwione), aby wyeliminować fluorescencyjne przelewanie, a bramka FSC/SSC była ustawiona tak, aby wybierać pojedyncze komórki (z wyłączeniem odpadów komórkowych i agregatów). Próbki zostały przeanalizowane w ciągu 1 godziny na cytometrze przepływowym wyposażonym w laser 488 nm, przy czym na próbkę uzyskano co najmniej 10 000 zdarzeń. Indeksy apoptotyczne zostały ilościowo zdefiniowane za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej: zastosowano jednolity próg bramkowy na wszystkich próbkach, aby zapewnić spójność, a proporcje wczesnych komórek apoptotycznych (Annexin V⁺/PI⁻) i późnych komórek apoptotycznych (Annexin V⁺/PI⁺) zostały osobno opisane, aby scharakteryzować profil apoptotyczny każdej grupy.
9. Sekwencjonowanie RNA i analiza bioinformatyczna
Całkowite RNA zostało wyekstrahowane i ocenione pod kątem czystości (A 260/280 między 1,8 a 2,1) oraz integralności (RIN ≥7 jako próg kontroli jakości). mRNA zostało oczyszczone za pomocą kulek oligo(dT), rozfragmentowane w 94 °C przez 5-7 minut, a następnie odwrócone do cDNA. Biblioteki były przygotowywane przez naprawę końcową, ligację adaptera oraz amplifikację PCR (8-12 cykli), a następnie sekwencjonowane na platformie Illumina, aby generować odczyty parowane 150 bp na głębokości 30-50 milionów par odczytów na próbkę. Odczyty były przycinane i wyrównywane z ludzkim genomem referencyjnym za pomocą STAR lub HISAT2. Liczby genów uzyskano za pomocą FeatureCounts, a analizę różnicową ekspresji wykonano za pomocą DESeq2, stosując progi FDR < 0,05 oraz|log 2 zmiany| ≥ 1. Analiza wzbogacenia funkcjonalnego genów o różnej ekspresji została przeprowadzona za pomocą clusterProfiler for Gene Ontology oraz szlaków KEGG (z korektą Benjamini-Hochberga (BH) FDR < 0,05), a sieci interakcji białko-białko zostały skonstruowane przy użyciu bazy danych STRING.
10. Analiza statystyczna
Dane ciągłe wyrażano jako średnią ± SD z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Porównania między dwiema grupami przeprowadzono za pomocą dwustronnych, niesparowanych testów t, a porównania między trzema lub więcej grupami wykonano za pomocą jednokierunkowej ANOVA, po której następnie wykonano test post-hoc Tukeya. Stosowano testy nieparametryczne, gdy było to stosowne. Rozkłady przeżywalności oszacowano za pomocą analizy Kaplana-Meiera za pomocą testów rangi logarytmicznej. Dla danych RNA-seq wykonano wielokrotną korektę testową metodą Benjamini-Hochberga. Dokładne wartości p są podawane w legendach rysunków; Istotność statystyczna została oceniona na poziomie p < 0,05, przy czym * oznaczało p < 0,05, a **p < 0,01.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
PAK5 jest silnie eksprimowany w ESCC i wiąże się ze złą prognozą
Rysunek 1 ilustruje ogólny przepływ pracy, od walidacji klinicznej PAK5 po analizę funkcjonalną i transkryptomiczną, która identyfikuje GAREM1 jako cel końcowy. Aby przetestować hipotezę, że PAK5 sprzyja progresji ESCC poprzez modulację szlaku MAPK za pomocą GAREM1, zbadano wzorce ekspresji PAK5 w tkankach ESCC oraz ich związek z rokowaniem klinicznym. Po pierwsze, zestaw danych o ekspresji genów...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Badanie to dostarcza dogłębnej analizy roli PAK5 w progresji raka płaskonabłonkowego przełyku (ESCC) poprzez połączenie próbek klinicznych, testów funkcjonalnych oraz analizy transkryptomicznej. Wyniki te poszerzają zrozumienie udziału PAK5 w ESCC, podkreślając jego potencjał zarówno jako markera prognostycznego, jak i celu terapeutycznego.
Wyraźna nadekspresja PAK5 w tkankach ESCC oraz jej związek z gorszym przeżyciem pacjentów są zgodne z wynikami z innych nowotworów, gdzie PAK5 powiązano z ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy deklarują, że nie mają konkurujących ze sobą interesów finansowych ani relacji osobistych, które mogłyby wpłynąć na prace opisane w tym artykule.
Prace te zostały wsparte przez Prowincjonalną Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 822QN474).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw do wykrywania apoptozy Annexin V-FITC | Beyotime Biotechnology | C1062S | Zestaw do barwienia wykrywającego apoptozę |
| Przeciwciało przeciw PAK5 | Abcam | ab110069 | Główne przeciwciało przeciw IHC, rozcieńczenie 1:100 |
| Zautomatyzowany system elektroforezy | Agilent | Bioanalizator 2100 | Ocena integralności RNA |
| Zestaw do syntezy cDNA | Invitrogen | 1896649 | Zestaw do transkrypcji odwrotnej |
| Roztwór kryształowego fioletu | Sigma-Aldrich | C3886 | Barwnik barwiący dla kolonii i inwazja |
| DMEM Medium | Gibco (Thermo Fisher) | 11965092 | Pożywka hodowla komórkowa |
| Serum bydła płodu (FBS) | Gibco (Thermo Fisher) | 16000044 | Suplement hodowli komórkowej |
| Cytometr przepływowy | BD Biosciences | FACSCanto II | Instrument do analizy komórek |
| GraphPad Prism | Oprogramowanie GraphPad | Wersja 8 | Oprogramowanie do analizy statystycznej i tworzenia wykresów |
| H& Zestaw do barwienia E | Solarbio | G1120 | Roztwór barwienia hematoksyliny i eozyny |
| IgG anty-szczurów sprzężony z HRP | Abcam | ab150165 | Przeciwciało wtórne przeciwko IHC |
| Sekwencer Illumina NovaSeq | Illumina | NovaSeq 6000 | Platforma sekwencjonowania o wysokiej przepustowości |
| Linia komórkowa KYSE-150 | Bank komórkowy RIKEN | RCB2057 | Linia komórkowa raka płaskastego przełyku u człowieka |
| Lipofektamina 3000 | ThermoFisher | L3000008 | Odczynnik transfekcyjny |
| Czytnik mikropłyt | Bio-Tek Instruments | ELx808 | Przyrząd do pomiaru absorpcji |
| DynabeadTM Oligo(dT)25s | Thermo Fisher Scientific | 61005 | Do oczyszczania mRNA |
| Penicylina-Streptomycyna | Gibco (Thermo Fisher) | 15140122 | Antybiotyki do hodowli komórek |
| Jodku propidium (PI) | Sigma-Aldrich | P4864 | Barwnik barwiący DNA |
| RPMI-1640 Medium | Gibco (Thermo Fisher) | 11875093 | Pożywka hodowla komórkowa |
| Spektrofotometr | Thermo Fisher | NanoDrop ND-1000 | Pomiar stężenia i czystości RNA |
| Oprogramowanie SPSS | IBM | Wersja 23 | Oprogramowanie do analizy statystycznej |
| Wkłady transwell | Corning | 3422 | Wkładki do testu inwazji komórkowej |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.