Artykuł metodologiczny

Generowanie ludzko indukowanych pluripotentnych pluripotentnych organoidów skórnych z komórek macierzystych z użyciem systemu hodowli powietrze-ciecz

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69088

⸱

17 października 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 2The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center, 3CEA, Inserm, IRIG, UA13 BGE, Biomics, University of Grenoble Alpes

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten określa metodę wytwarzania organoidów skóry zawierających mieszki włosowe pochodzące z ludzko indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych, wykorzystując płaski, fizjologicznie istotny system hodowli powietrzno-cieczowy, aby odwzorować architekturę i funkcję skóry.

Streszczenie

Organoidy skóry (SO) pochodzące z ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych (hiPSC) zawierające mieszki włosowe stanowią zaawansowany model in vitro do badania interakcji międzykomórkowych w mikrośrodowisku skóry. Początkowo opracowane w odwróconej konfiguracji torbielowatej, gdzie skóra jest wystawiona na działanie środowiska, a naskórek skierowana do środka w kierunku centrum organoidalnego, SOs mogą być następnie przenoszone do konfiguracji planarnej w systemie hodowli powietrze-ciecz (ALI), który bardziej przypomina fizjologię ludzkiej skóry. Niniejszy artykuł przedstawia kompleksowy protokół generowania i selekcji torbielowatych SO, które można rozłożyć na planarne SO, a następnie rozwijać w systemie hodowli ALI. Protokół zawiera określone punkty kontrolne makroskopowej oceny jakościowej na krytycznych etapach rozwoju organoidów, szczegółowo opisuje techniczne kroki wymagane do spłaszczenia torbielowatych SO w skórze płaskiej, określa optymalne warunki hodowli ALI oraz demonstruje wyniki za pomocą analizy molekularnej. W 27. dniu barwienie immunofluorescencji markerami specyficznymi dla linii rodowej ujawniło pluristratyfikowany pigmentowany nabłonek z przyrostkami skórnymi, w tym mieszkami włosowymi i strukturami przypominającymi gruczoły łojowe. Protokół ten zapewnia solidną metodę generowania planarnych SO z kończynami, oferując fizjologicznie istotny model in vitro. System ten wspiera różnorodne zastosowania w badaniach nad skórą i został już skutecznie wykorzystany do modelowania infekcji patogenem, ubrań tkanek wywołanych promieniowaniem ultrafioletowym oraz reakcji na leki.

Wprowadzenie

Skóra tworzy kluczową barierę ochronną między organizmami a ich środowiskiem, jednocześnie regulując temperaturę ciała, równowagę wodną i bodźce sensoryczne. Składa się z trzech głównych warstw: naskórka, warstwowego nabłonka keratynocytowego z kornowaną powierzchnią; skóra, tkanka łączna bogata w macierz zewnątrzkomórkową, fibroblasty, nerwy, naczynia krwionośne i komórki odporności; oraz podskórka, która składa się głównie z adipocytów podskórnych. Funkcja ludzkiej skóry zależy również od wyspecjalizowanych kończyn, takich jak mieszki włosowe (HF), gruczoły łojowe i gruczoły potowe1.

Choroby skóry należą do najczęstszych schorzeń zdrowotnych na świecie 2,3. Historycznie większość badań skoncentrowanych na skórze prowadzono na modelach zwierzęcych4, które odtwarzają złożoność fizjologiczną narządu w kontekście systemowym. Jednak istotne różnice międzygatunkowe4, wraz z rosnącymi obawami etycznymi, napędzały rozwój fizjologicznie istotnych modeli ludzkiej skóry.

Konwencjonalne modele ludzkiej skóry dzielą się na dwie kategorie: zrekonstruowaną ludzką skórę, składającą się ze zwarstwowanych keratynocytów, oraz zrekonstruowaną ludzką skórę, która dodatkowo zawiera podłoże przedział skóry złożony z fibroblastów osadzonych w matrycy kolagenowej5. Chociaż oba typy modeli znacząco pogłębiły nasze rozumienie fizjologii skóry, brakuje im pełnej architektonicznej wierności i różnorodności komórkowej, charakterystycznej dla rodzimej ludzkiej skóry. Głównym ograniczeniem tych modeli jest brak przydatków skórnych, takich jak HF, co czyni je nieodpowiednimi do badań i testów na narkotyki związane z chorobami skóry związanymi z przyrostem i regeneracją włosów6. Chociaż zgłaszano bardziej zaawansowane systemy zawierające HF, albo nie oddają one w pełni złożoności struktury HF i mikrośrodowiska, albo opierają się na zaawansowanych technologiach, takich jak biodruk czy mikroformowanie 7,8,9,10.

Nowatorskim modelem skóry, który rozwiązuje kilka z tych wyzwań, jest organoid skóry (SO), generowany z indukowanych przez człowieka pluripotentnych komórek macierzystych (hiPSCs)11. Naśladując rozwój embrionalny, hiPSC mogą być kierowane na linie ektodermy powierzchniowej czaszki i grzebienia nerwowego czaszki, samoorganizując się w torbielowate struktury bardzo przypominające ludzką skórę. Te SO zawierają niemal wszystkie nieodporne typy komórek skóry, zorganizowane w warstwową skórę oraz skórę bogatą w macierz zewnątrzkomórkową. Co ważne, partnerzy wspierają rozwój kończyn skórnych: HF i gruczołów łojowych. Biorąc pod uwagę praktycznie nieograniczoną skalowalność hiPSC, SO umożliwiają zaawansowaną inżynierię genetyczną i rozwój nowych narzędzi funkcjonalnych. W związku z tym SO stanowią znaczący postęp w dziedzinie i dają nadzieję na zastosowanie w biologii rozwojowej, modelowaniu chorób, testowaniu leków oraz medycynie regeneracyjnej.

Jednak pozostaje znaczne ograniczenie: SOs tworzą odwrócone struktury torbielowate, w których naskórek znajduje się wewnątrz torbieli skórnej, chroniony przed siłami mechanicznymi i zanurzony w wodnym medium. Ta konfiguracja jest nie tylko fizjologicznie niedokładna, ale także uniemożliwia ustanowienie interfejsu powietrze-ciecz (ALI). W rezultacie torbielowate SOs mają ograniczone zastosowanie w badaniach dotyczących bariery naskórkowej, sił mechanicznych lub bezpośrednich zabiegów wierzchołkowych. Aby rozwiązać ten problem, poniżej przedstawiono powtarzalną metodę mechanicznego spłaszczania torbielowatych SO i późniejszego hodowli jako skóry płaskiej w warunkach ALI. To podejście, pierwotnie opisane przez Junga i in., reorganizuje architekturę tkanek tak, że wierzchołkowa naskórka jest wystawiona na działanie powietrza, co sprzyja dalszej stratyfikacji i funkcji bariery12. Powstałe płaskie, owłosione organoidy zachowują złożoną architekturę ludzkiej skóry, jednocześnie odzwierciedlając fizjologicznie dokładną orientację tkanek, umożliwiając eksperymentalny dostęp do powierzchni wierzchołkowej. Chociaż procedura trwa długo (~100 dni) i obejmuje techniczne trudne etapy, zwłaszcza przy rozkładaniu torbielowatych SOs na płaskie, może być szczególnie interesująca dla badaczy już pracujących z SOs lub innymi odpowiednikami skóry ludzkiej, którzy chcą zwiększyć fizjologiczną istotność swoich systemów modelowych.

Protokół

Rysunek 1 przedstawia proces generowania planarnych SO z wykorzystaniem systemu kultury ALI. Pierwsza sekcja opisuje generowanie torbielowatych SO z hiPSC na podstawie metodologii zapoczątkowanej przez Karla R.Koehlera 11, z drobnymi modyfikacjami (Rysunek 2). Druga sekcja opisuje procedurę dalszego rozwoju torbielowatych SOs w planarne SO, wykorzystując system hodowli ALI, jak opisano wcześniej12, z modyfikacjami (Rysunek 3). Wszystkie chemikalia i materiały są wymienione w tabeli materiałów. Do generowania SO (https://hpscreg.eu/)13 użyto trzech wcześniej opisanych linii hiPSC (LUMCi001-A, LUMCi004-A i WT2).

1. Generowanie torbielowatych partnerów

Rysunek 2 przedstawia morfologie oczekiwane i nienaturalne na kluczowych etapach.

  1. Agregacja komórek (dzień -2)
    1. Hoduj hiPSC w standardowej płycie z 6 dołkami aż do osiągnięcia 70-80% zbiórki.
    2. Przemyj komórki 1 ml soli fizjologicznej Dulbecco z buforem fosforanowym (DPBS). Dodaj 1 mL odczynnika do dysocjacji komórkowej (CDR) i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez ~6 minut, aby poluzować hiPSC bez ich odłączenia od matrycy (unikając nadtrawienia).
    3. Aspiruj CDR i dodaj 1 mL podtrzymującego hiPSC (hiMM) zawierającego inhibitor ROCK o stężeniu 10 μM. Delikatnie odłącz ogniwa, pipetując w górę i w dół pipetą P1000 i przygotowuj zawiesinę komórkową o stężeniu 3,5 × 103 komórek/mL.
    4. Należy podać 100 μL zawiesiny ogniwa do każdego dołka płytki U z 96 dołkami i ultra-niskiego mocowania, używając pipety wielokanałowej. Wiruj płytę w 110 × g przez 6 minut w temperaturze pokojowej i inkubuj w 37 °C z 5%CO2.
  2. Rozcieńczenie inhibitora ROCK (dzień -1)
    1. Przygotuj hiMM zawierający 100 μg/mL antybiotykowo-przeciwmykotycznego suplementu (AAS).
    2. Podawaj 100 μL na dołek i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5%CO2.
  3. Indukcja ektodermy powierzchniowej (dzień 0)
    1. Rozmroź odpowiednią objętość matrycy błony podstawowej na lodzie, zanim przejdziesz do kolejnego kroku. Przygotuj minimalne medium hiPSC (hiMinM) wzbogacone matrycą błony podstawowej (2%), BMP4 (2,5 ng/mL), SB431542 (10 μM) oraz bFGF (4 ng/mL) (określane jako hiMinM+SFB) na lodzie.
      UWAGA: Stężenie BMP4 może wymagać korekty w zależności od użytej linii komórkowej (zobacz dyskusję).
    2. Zbieraj agregaty komórkowe do rurki o okrągłym dnie o pojemności 2 mL za pomocą szerokiego otworu na pipetę P200.
      UWAGA: Używaj dostępnych komercyjnie końcówek z szerokim otworem. Wybierz otwór o średnicy wewnętrznej co najmniej 2 mm, aby zminimalizować uszkodzenia kruszywów. Alternatywnie, podgrzej skalpel sterylizatorem pętlowym na podczerwień i użyj go do stworzenia szerokiego otworu z konwencjonalnej końcówki pipety.
    3. Pozwól kruszywom osiąść na dnie rury. Ostrożnie zasysaj podłoże i dodaj 2 mL hiMinM, aby przemyć kruszywa. Powtarzaj pranie łącznie 3 razy.
    4. Przenieś agregaty ogniw w zimnym hiMinM+SFB do studni z wcześniej schładzoną płytą 6-dołkową za pomocą szerokiego otworu pipety P1000. Następnie przenieś każdy agregat w 100 μL hiMinM+SFB na płytkę ultra-niskomocowaną z 96 dołkami na dnie, używając szerokiego otworu do pipety P200. Włóż płytkę z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5%CO2.
      UWAGA: Do tego kroku użyj stereomikroskopu umieszczonego pod laminarnym osłoną przepływu powietrza (LAF).
  4. Indukcja populacji komórek nienabłonkowych (dzień 3)
    1. Przygotuj hiMinM zawierający LDN193189 (1 μM), bFGF (250 ng/mL) oraz AAS (100 μg/mL). Do każdej dołki należy podać 25 μL za pomocą pipety wielokanałowej.
    2. Delikatnie mieszaj talerzem, aby zapewnić równomierne rozłożenie podłoża. Włóż płytkę z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5%CO2.
  5. Dostarczanie składników odżywczych (dzień 6)
    1. Przygotuj AAS zawierający hiMinM (100 μg/mL). Do każdej dołki należy podać 75 μL za pomocą pipety wielokanałowej.
    2. Delikatnie mieszaj talerzem, aby zapewnić równomierne rozłożenie podłoża. Włóż płytkę z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5%CO2.
  6. Średnie odświeżenie (dzień 8 i dzień 10)
    1. Przygotuj AAS zawierający hiMinM (100 μg/mL). Ostrożnie usuń 100 μL medium z każdej dołki za pomocą pipety wielokanałowej. Podaj 100 μL świeżego medium do każdej dołki za pomocą pipety wielokanałowej.
    2. Delikatnie mieszaj talerzem, aby zapewnić równomierne rozłożenie podłoża. Włóż płytkę z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5%CO2.
  7. Przejście na płytki o niskim przyczepaniu 24 dołków (Dzień 12)
    1. Rozmroz odpowiednią objętość matrycy błony podstawowej na lodzie, zanim przejdziesz do kolejnego kroku. Przygotuj pożywkę do dojrzewania organoidów (OMM) z wykorzystaniem zaawansowanego medium (49% v/v), podłoża nerwowego bazalnego (49% v/v), suplementu glutaminy (1x), suplementu B-27 bez witaminy A (0,5x), suplementu N2 (0,5x), 2-Merkaptoetanolu (0,1 mM) oraz AAS (100 μg/mL). Przygotuj odpowiednią ilość zimnego OMM zawierającego 1% matrycy błony podstawnej (OMM1%M) i trzymaj na lodzie.
      UWAGA: Używaj środków ochrony osobistej i pracuj w dobrze wentylowanym miejscu podczas manipulacji z 2-merkaptoetanolem.
    2. Zbieraj agregaty komórkowe do rurki o okrągłym dnie o pojemności 2 mL za pomocą szerokiego otworu na pipetę P1000.
    3. Pozwól kruszywom osiąść na dnie rury. Ostrożnie zasysaj podłoże. Dodaj 1,5 mL medium Advanced do mycia kruszyw. Powtarzaj pranie łącznie 3 razy.
    4. Przenieś agregaty ogniwa w zimnym OMM1%M do studni z wcześniej schłodzonej płyty 6-dołkowej za pomocą szerokiego otworu pipety P1000. Następnie przenosi się każdy agregat w 500 μL OMM1%M na płytkę o niskim przyczepie z 24 dołkami, używając szerokiego otworu na końcówce pipety P1000. Włóż płytkę z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5%CO2.
      UWAGA: Do tego kroku użyj stereomikroskopu umieszczonego pod okapem LAF.
  8. Średnie odświeżenie (dzień 15)
    1. Rozmroz odpowiednią objętość matrycy błony podstawowej na lodzie, zanim przejdziesz do kolejnego kroku. Przygotuj odpowiednią ilość zimnego OMM1%M. Trzymaj na lodzie.
    2. Używając końcówek P1000, ostrożnie usuń 250 μL medium z każdego dołku. Następnie do każdego odwiertu dodaj 250 μL OMM1%M. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5%CO2 na orbitalnym shakerze ustawionym na 65 obr./min.
  9. Między dniem 18 a 45 wykonuj połowę średniej zmiany (250 μL) z OMM w poniedziałki, środy i piątki.
  10. Między dniem 45 a 90 wykonaj połowę średniej zmiany (250 μL) z OMM w poniedziałki i środy oraz pełną średnią zmianę w piątki.

2. Przejście od torbielowatych partnerów do planarnych

UWAGA: Torbielowate SO wykazują odwróconą morfologię, z naskórkiem skierowanym do środka organoidu, a skórą w kontakcie z otoczeniem zewnętrznym. Między 70. a 90. dniem, w zależności od linii komórkowej i efektywności różnicowania, wczesna nadpodstawna różnicowanie naskórka jest bardzo zaawansowane, a do tego powstają szpilki do włosów. Jest to etap, na którym torbielowate SOs są przenoszone do systemu hodowli ALI, aby uzyskać tkankę bardziej przypominającą rodzimą skórę ludzką.

  1. Selekcja torbielowatych SOs między 70. a 90. dniem do przejścia do planarnych SO
    1. Wybieraj torbielowate SOs o średnicy co najmniej 5 mm i minimalnej zawartości produktów ubocznych (komórki mezenchymalne, które gromadzą się na jednym biegunie torbieli i mogą również zawierać chrząstkę). Obecność płytków/szpilek do włosów wykorzystaj jako wskaźnik jakości rozwoju organoidów skórnych (Rysunek 1A i Rysunek 2B).
      UWAGA: Spłaszcz 2-4 planarne partnerki z każdego torbielowatego partnera, w zależności od ich wielkości.
  2. Przygotowanie wkładu pokrytego kolagenem (format 12-dołkowy)
    1. Przygotuj roztwór NaOH (1 M) poprzez rozpuszczenie odpowiedniej ilości pelletów NaOH w wodzie destylowanej. Filtrowanie roztworu NaOH sterylizuje za pomocą membranowego filtra o rozmiarze porów 0,2 μm.
      UWAGA: Używaj środków ochrony osobistej i pracuj w dobrze wentylowanym miejscu podczas manipulacji roztworem NaOH (1 M).
    2. Na lodzie rozcieńcz roztwór kolagenu typu I do końcowego stężenia 2 mg/mL przy użyciu 10x PBS (do ostatecznego 1x stężenia), NaOH (5 mM) oraz wody destylowanej, aby dostosować ostateczną objętość. Rozprowadz 150 μL roztworu kolagenowego do każdej wkładki umieszczonej w standardowej płytki z 12 dołkami. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby żel kolagenowy mógł się zpolimeryzować.
  3. Spłaszczenie torbielowatego SO (Rysunek 3)
    UWAGA: Do tego kroku użyj stereomikroskopu umieszczonego pod okapem LAF.
    1. Wybrany torbielowaty SO umieść z niewielką ilością medium na pokrywce 10-cm szalki Petriego, używając pipety P1000 z szerokim otworem. Ostrożnie usuwaj produkty uboczne SO za pomocą sterylnego skalpela. Użyj sterylnych kleszczy po przeciwnej stronie, aby ustabilizować organoid podczas wycięcia (rysunek 3A).
      UWAGA: Na tym etapie torbielowaty SO przypomina spuszczony balon z dwiema warstwami skóry ułożonymi jedna na drugiej.
    2. Wyciśnij około 1 mm z końców organoidu przylegającego do pierwszego nacięcia skalpelem (rysunek 3B,F). Delikatnie rozłóż górną warstwę skóry za pomocą sterylnych kleszczy (rysunek 3C,G).
    3. Pokrój kawałek chusteczki na 2-4 kawałki, w zależności od rozmiaru. Delikatnie przenieś każdy fragment tkanki i umieść go w wkładce pokrytej kolagenem z naskórkiem skierowanym do góry, używając sterylnych kleszczy (rysunek 3D,H).
      UWAGA: Oceniaj kolce pod stereomikroskopem, aby zapewnić prawidłowe ustawienie naskórka.
    4. Przełóż wkład z powrotem na standardową płytkę 12-dołkową zawierającą 600 μL OMM. Włóż talerz z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5%CO2 (Rysunek 3E).
  4. Długoterminowe utrzymanie kultury na styku powietrze-ciecz
    1. Między Dniem 1 a 21 po spłaszczeniu wykonaj pełną średnią zmianę (600 μL) z OMM w poniedziałki, środy i piątki. Włóż talerz z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C, przy 5%CO2 i 95% wilgotności względnej.
    2. Między 21. a 27. dniem po spłaszczeniu umieść talerz w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5%CO2 bez wilgotności, aby wzmocnić barierę skórną. Wykonuj pełną zmianę medium (800 μL) z OMM każdego dnia.

Wyniki

Optymalizacja i punkty kontrolne generowania torbielowatych SO zostały szczegółowo opisane14. Przedstawiona tutaj metoda koncentruje się zatem na kluczowych punktach kontrolnych do oceny podczas rozwoju organoidów torbielowatych (Rysunek 2A), wyborze tych odpowiednich do przejścia do planarnych SO (Rysunek 2B) oraz kryteriach stosowanych do oceny jakości powstałych SO planarnych (Rysunek 1B-D i Rysunek 4).

Pierwszym kluczowym krokiem w rozwoju torbielowatych SOs jest utworzenie pojedynczego, gęstego agregatu komórkowego, który obejmuje większość komórek obecnych w dołku w dniu 0 (Rysunek 2A). Osiąga się to poprzez ostrożne i szybkie obchodzenie się z hiPSC, połączone z efektywną wirowaniem, co skutkuje jednorodnym rozmieszczeniem komórek w centrum studni (Rysunek 2A, dzień -2). Prawidłowa indukcja powierzchniowej ektodermy prowadzi do powstania cienkiego, przezroczystego nabłonka na najbardziej zewnętrznej warstwie agregatu do dnia 3 (Rysunek 2A), który następnie, po indukcji komórek mezenchymalnych, rozwija się w przezroczyste cystyczne agregaty zawierające ciemne jądro komórek mezenchymalnych do 8 dnia. Między dniem 12 a 20 torbiel nabłonkowa jest pokryta cienką warstwą komórek mezenchymalnych, które gromadzą się na jednym biegunie torbieli (Rysunek 2A, dzień 12). Udana współindukcja komórek nabłonkowych i mezenchymalnych ostatecznie prowadzi do powstania nabłonka warstwowego, umożliwiającego powstawanie blaszków i kołków do włosów, które stają się widoczne między dniem 50 a 80 (Rysunek 2A,B). Wybierając odpowiednie SO na podstawie tych punktów kontrolnych rozwoju, zmienność morfologiczna i rozmiarowa może zostać zminimalizowana w momencie przejścia do planarnych SO.

Obecność nazębów włosowych lub szpiączków jest głównym kryterium włączenia do wyboru torbielowatych SO, które mają dalej rozwijać się w planarne SO. Brak widocznych blaszków zwykle wynika z wady warstwy naskórka, która wtedy wydaje się bardzo cienka (Rysunek 2B, dzień 50, panel środkowy). Do spłaszczania stosuje się tylko duże torbiele (co najmniej 5 mm średnicy) z produktami ubocznymi skoncentrowanymi na jednym biegunie i ogólnie minimalnymi produktami ubocznymi, natomiast te z niepolaryzowanymi produktami są wyłączone (rysunek 2B).

Po osiągnięciu konfiguracji planarnej podstawowa kontrola jakości SO polega na makroskopowym monitorowaniu wzrostu HF pod stereomikroskopem. HF stopniowo wydłużają się przez 27 dni hodowli ALI, a gruczoły łojowe stają się widoczne około 14. dnia, a pigmentacja stopniowo rośnie (rysunek 1B,C). Ze względu na ograniczenia przestrzenne narzucone przez membranę wkładku leżącą tuż pod cienkim żelem kolagenowym, tylko HF znajdujące się na obrzeżach płaszczyznowego SO mogą w pełni rosnąć, i robią to w orientacji równoległej do wkładki (Rysunek 1C). Co istotne, trzon włosów rzadko wystaje poza powierzchnię skóry. Aby dokładniej ocenić jakość rozwiniętych płaskich SO, można je osadzić w parafinie lub OCT, przeciąć i barwić w celu badania ich składu i morfologii. Barwienie H&E ujawnia, że ich struktura bardzo przypomina ludzką skórę (rysunek 4A), z w pełni zwarstwowanym nabłonkiem i skórą oddzieloną błoną podstawną. Barwienie immunofluorescencyjne za pomocą specyficznych markerów dla różnych warstw naskórka, gruczołów łojowych i melanocytów dodatkowo potwierdza strukturę tkanki przypominającej skórę człowieka u planarnych SO (Rysunek 1D i Rysunek 4B).

figure-results-1
Rysunek 1: Przepływ pracy generowania planarnych SO zawierających HF z hiPSC z użyciem systemu kultury ALI. Pokazano schematyczne przedstawienia oraz reprezentatywne obrazy kluczowych kroków. (A) Generowanie torbielowatych SO, zasadniczo opisano wcześniej10, aż wokół 80. dnia pojawią się widoczne płytki/szpiączki do włosów. (B) Cystic SO są nacięte i spłaszczane, z kolegą skierowaną do góry, na wkładce komórkowej pokrytej kolagenem typu I. Kultury ALI są utrzymywane przez 21 dni w warunkach nawilżenia, a następnie 6 dni w suchych warunkach. (C) Widok z dużym powiększeniem obszaru pokazanego w (B), ilustrujący wzrost mieszków włosowych, rozwój struktury gruczołów łojowych (groty strzał) oraz stopniowe pigmentowanie w czasie. (D) Konfokalne obrazy płaskich przekrojów SO w dniu 27 po spłaszczeniu, oznaczone przeciwciałem przeciw kolagenowi typu IV wraz z albo Nile Red, który oznacza struktury przypominające gruczoły łojowe, lub przeciwciałem przeciw PMEL, które barwi melanocyty. Jądra są barwione DAPI. Pręty skalowe: 200 μm (A); 500 μm (B,C); 50 μm (D). Skróty: SOs = organoidy skóry; HFs = mieszki włosowe; hiPSC = ludzkie indukowane pluripotentne komórki macierzyste; ALI = interfejs powietrze-ciecz; Col IV = kolagen typu IV; PMEL = białko premelanasomowe; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy morfologii agregatu komórkowego na kluczowych etapach produkcji SO. (A) Reprezentatywne obrazy torbielowatych SOs z odpowiednimi (lewe panele) i niewystarczającymi (panele środkowe i prawe) morfologiami na różnych etapach. Na dzień -2 agregaty komórkowe powinny wykazywać równomierny rozkład (lewy panel), podczas gdy nieprawidłowe obchodzenie się z płytą po wirowaniu może zakłócić rozkład komórek (prawy panel). Na dzień 0 dobrze uformowane agregaty pojawiają się jako zwarte, gęste skupiska komórkowe (lewy panel), podczas gdy niska żywotność komórek prowadzi do powszechnej śmierci komórek i utraty zwartych struktur 3D (prawy panel). W trzecim dniu widoczna staje się wyraźna zewnętrzna warstwa nabłonkowa (lewy panel), jej brak może wskazywać, że stężenie BMP4 wymaga optymalizacji (prawy panel). W 12. dniu komórki mezenchymalne gromadzą się na jednym biegunie i migrują, aby otoczyć torbiel nabłonkową (lewy panel), podczas gdy nadmierna różnicowanie nabłonka (panel środkowy) lub mezenchymalnego (prawy panel) utrudnia prawidłową stratyfikację nabłonka. W 50. dniu SOs wykazują morfologię afektywną dwubiegunową, z torbielowatą skórą po jednej stronie i produktami ubocznymi, głównie chrząstką, po drugiej (lewy panel). Nadmierna różnicowanie nabłonka (panel środkowy) lub mezenchymalnego (prawy panel) utrudnia prawidłowy rozwój skóry. (B) Reprezentatywne obrazy torbielowatych partnerów z widocznymi szpilkami do włosów około 80. dnia. Zwróć uwagę na zmienny udział produktów ubocznych (w lewej stronie do krzywej przerywanej) względem skóry. Trzy najbardziej lewe panele pozwalają generować 2-4 planarne SO, podczas gdy najbardziej prawy panel pokazuje SO o niewystarczającej jakości do spłaszczania. Paski skalowe: 500 μm dla Dnia -2, Dnia 50 i Dnia 80; 200 μm dla dnia 0, dnia 3 i dnia 12. Skrót: SO = organoid skóry. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Schematyczne przedstawienie technicznych kroków tworzenia planarnych SO. Wykonaj spłaszczenie torbielowatych partnerów pod stereomikroskopem w kapturze LAF. (A) Usunąć słup gromadzący produkty uboczne torbielowatego SO za pomocą sterylnego skalpela. (B) Przycięcie górnych i dolnych kończyn SO w celu ułatwienia rozwijania tkanek. (C) Pokrój tkankę planarną na 2-4 kawałki. Przenieś i spłaszcz każdy element, naskórkiem do góry, na wkład pokryty kolagenem za pomocą sterylnych kleszczy. (D) Umieść wkład hodowlowy zawierający spłaszczoną tkankę w standardowej płytki z 12 dołkami zawierającą 600 μL podłoża. (E) Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C z 5%CO2. (F) Schematyczny widok poprzeczny organoidu skóry przedstawionego w (B). (G) Schematyczny widok poprzeczny organoidu skóry przedstawionego w (C). (H) Obraz płaskiego SO umieszczonego na żelu kolagenowym typu I wylanym na wkładkę do hodowli komórkowej umieszczonej na 12-dołkowej płycie zawierającej 600 μL podłoża. Skróty: SO = organoid skóry; LAF = laminarny przepływ powietrza. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Charakterystyka planarnych SO pochodzących z hiPSC. (A) Reprezentatywne zdjęcia jasnego pola powierzchniowego SO barwionego H&E w dniach 1 i 27 po spłaszczeniu. Do 27. dnia planarne SO wykazują dojrzewanie skóry z pluristratyfikowaną epidermis, a HF zawierają struktury przypominające gruczoły łojowe (groty strzał). (B) Obrazy konfokalne płaskich przekrojów SO barwionych integriną anty-β4 oraz przeciwciałami anty-keratyny 10 lub antylorycyny wykazują wczesną różnicację nadpodstawną (komórki KRT10+ ) w dniu 1 oraz późną różnicację (warstwa LOR+ ) w dniu 27. Jądra są barwione DAPI. Pręty skalowe: 50 μm (A); 100 μm (B). Skróty: SO = organoid skóry; hiPSC = pluripotentne komórki macierzyste indukowane przez człowieka; H&E = hematoksylyna i eozyna; β4 = integryna b4; KRT10 = keratyna 10; LOR = lorycyn; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół przezwycięża kluczowe ograniczenie systemu torbielowatego SO, przywracając naturalną orientację tkanek i środowisko poprzez spłaszczenie tkanek oraz ekspozycję wierzchołkowego naskórka na powietrze. Metoda ta zachowuje wewnętrzną złożoność komórkową i strukturalną organoidu, wspiera fizjologicznie istotną organizację oraz zapewnia bezpośredni dostęp do pluristratyfikowanej powierzchni naskórka do eksperymentalnej manipulacji.

Kilka etapów protokołu jest kluczowych dla uzyskania wysokiej jakości planarnych SO, zaczynając od generowania wysokiej jakości SO-ów torbielowatych. Kluczowe kontrole jakości i potencjalne punkty modyfikacji protokołu zostały szczegółowo opisane przed12. Krótko mówiąc, punktem wyjścia powinny być dobrze utrzymane, niezróżnicowane hodowle hiPSC o konfluencji 70-80%, pokazujące gęsto upakowane komórki o wysokim stosunku jądrowo-cytoplazmatycznym. Generowanie torbielowatych SO wymaga precyzyjnej modulacji sygnalizacji BMP4 podczas indukcji powierzchniowej ektodermy12. Ponieważ czułość BMP4 może się różnić między liniami hiPSC, może być konieczna dawkowanie dla optymalnych rezultatów. Zaleca się badanie stężeń BMP4 w zakresie od 2,5 do 15 ng/mL, ponieważ nie zgłoszono żadnych udanych przypadków poza tym zakresem. Istotna jest także spójność źródła odczynników; Dlatego zapasy luzem od jednego dostawcy powinny być przygotowywane i przechowywane w zalecanych warunkach oraz używane przed datą ważności, aby zapewnić pełną aktywność biologiczną i zminimalizować zmienność.

Wybór torbielowatych SO-ów o odpowiedniej morfologii i rozmiarze jest kluczowy dla skutecznego spłaszczenia SO. Dojrzewanie torbielowatych SO, a co za tym idzie powstawania kolczyków i nawierzchni włosów, może się różnić między liniami hiPSC, dlatego czas spłaszczenia może wynosić się od 70. do 90. dnia. Można rozważyć dodanie CHIR99021, inhibitora GSK3 i agonisty sygnalizacji WNT, w trzecim dniu powstawania torbielowatego SO, ponieważ wykazano, że zwiększa rozmiar organoidów i zmniejsza powstawanie chrząstki poprzez promowanie proliferacji i hamowanie migracji grzebienia nerwowego12. Chociaż obiecujące, nie zaobserwowaliśmy spójnych wyników tej modyfikacji w naszych kulturach.

Proces spłaszczania wymaga manualnej zręczności i znajomości tkanki. Warto zauważyć, że podczas przenoszenia fragmentu skóry na wkładkę powłokową należy zachować ostrożność w prawidłowej orientacji tkanki. Zaleca się weryfikację orientacji za pomocą cienkich kleszczy pod stereomikroskopem i delikatne ustawienie tkanki do momentu, gdy strona wierzchołkowa będzie skierowana do góry. Gdy są odpowiednio ustawione, kołki/tabliczki powinny być skierowane w dół. Po przeniesieniu planarnych SO do hodowli ALI, HF zazwyczaj zaczynają wykazywać zauważalny wzrost i pigmentację włosów w ciągu kilku dni.

Główne ograniczenia opisanego modelu to czas i wysoki poziom wymaganej konserwacji oraz niedojrzałość modelu. Rozwój torbielowatych partnerów z oszczepami do włosów trwa od 70 do 90 dni i następuje 4 tygodnie hodowli ALI. Ten wydłużony czas, w połączeniu z żmudnym procesem spłaszczania, sprawia, że system jest mniej odpowiedni do zastosowań o dużej wydajności, zwłaszcza w porównaniu z komercyjnie dostępnymi odpowiednikami skóry ludzkiej. Chociaż drobne optymalizacje mogą nieco skrócić czas hodowli, znaczne skrócenie jest mało prawdopodobne. Wysoka różnorodność komórkowa i strukturalna skóry zależy od złożonej sekwencji interakcji nabłonk-mezenchymal oraz sygnałów mechanicznych, których prawdopodobnie nie można przyspieszyć przez dodanie czynników egzogennych in vitro 15,16,17,18. Tworzenie torbielowatych substancji chemicznych i ich przejście do formy płaskiej wymaga wysokiego poziomu utrzymania. Jednym z najbardziej wymagających okresów obsługi – poza pierwszymi 18 dniami hodowli torbielowatych – występuje, gdy płaskie spółki są utrzymywane w atmosferze o niskiej wilgotności i wymagają codziennego uzupełniania podłoża. Podobnie jak w przypadku innych modeli pochodzących od hiPSC, partnerzy zachowują fenotyp podobny do płodu in vitro. Ponadto gruczoły potowe i mięśnie arrector pili są w dużej mierze nieobecne u SOs14, prawdopodobnie z powodu braku unaczynienia, komórek odpornościowych oraz sił mechanicznych, takich jak naprężenia ścinające, rozciąganie i tarcie – wszystkie te czynniki są niezbędne do prawidłowego dojrzewania 15,16,17,18,19 . Niektóre z tych ograniczeń można rozwiązać poprzez zwiększenie złożoności modelu. Współhodowla z autologicznymi makrofagami pochodzącymi z hiPSC17, integracja systemu perfuzyjnego9 lub zastosowanie mechanicznego rozciągania17 może pomóc w rozwoju dojrzałości modelu20,21.

Należy zauważyć, że format insertu transwell w pewnym stopniu ogranicza spadkowy wzrost HF w planarnych SO. W rezultacie HF mają tendencję do rozprzestrzeniania się na boki i mogą być wystawione na działanie powietrza. Ponieważ HF są zwykle chronione w skórze in vivo, należy to uwzględnić przy projektowaniu eksperymentów. Modyfikacja powłoki wkładu poprzez nałożenie grubszej warstwy hydrożelu może pomóc złagodzić ten problem. Dodatkowo, w tym modelu włosy rzadko wystają poza powierzchnię skóry. Nasze obserwacje wskazują, że HF w płaskich SO pozostają w anagenach, czyli fazie aktywnego wzrostu, do 27. dnia hodowli ALI. Biorąc pod uwagę wydłużony czas działania anagenu u ludzkich HF, nie jest to całkiem niespodziewane. Chociaż długoterminowa kultura może ostatecznie wspierać przejście fazowe, jest to mało prawdopodobne bez sygnalizacji systemowej. Identyfikacja i uzupełnienie sygnałów molekularnych niezbędnych do cyklu pęcherzykowego może umożliwić sztuczną indukcję faz katagenu i telogenu.

Podsumowując, protokół generowania planarnych SO umożliwia szeroki zakres podejść eksperymentalnych, które nie są wykonalne ani istotne w przypadku SO. Planarne SO zostały już skutecznie wykorzystane do modelowania infekcjibakteryjnej 11 i wirusowych22, uszkodzenia tkanek wywołanych promieniowaniem ultrafioletowym22 oraz powiązanych odpowiedzi lekowych12, 22, 23. Możliwość dostępu do powierzchni wierzchołkowej fizjologicznie istotnego, złożonego odpowiednika skóry stanowi znaczący postęp w tej dziedzinie i otwiera drzwi do wielu nowych zastosowań w badaniach nad skórą.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Podziękowania

Dziękujemy naszym kolegom z hotelu hiPSC, Leiden University Medical Center, za udostępnienie linii hiPSC. Prace te zostały wsparte przez Centrum Medycyny Komórek Macierzystych Fundacji Novo Nordisk, wspierane przez Fundację Novo Nordisk w Danii (grant numer NNF21CC0073729) dla K.R. K.R. jest chargé de Recherche w Instytucie Narodowym i Naukowym Medikale (INSERM).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zaawansowane DMEM/F12Thermo Fisher Scientific#12634010określany w tekście jako Advanced Medium.
ALK5, hamuj. TGFb typ 1, SB431542Tocris Bioscience#1614Aliquot, sklep w temperaturze -20 i stopień; C i  trzymaj się 4 i stopni; C przez maksymalnie 7 dni 
Przeciwciało monoklonalne przeciwciało anty-CD104 szczura 439-9BBD Biosciences#555719NIE
Przeciwciało antykolagenowe typu IV – poliklonalneMerckMillipore#Ab769NIE
Anty-cytokeratyna 10 przeciwciało poliklonalne dla królikówBiolegenda#905401NIE
Przeciwciało anty-lorycynowe królikowe poliklonalneBiolegenda#905101NIE
przeciwciało monoklonalne przeciw myszy przeciw PMELNovus Biologicals#NBP2-29407 NIE
Suplement B-27, bez witaminy AThermo Fisher Scientific#12587010Aliquot, sklep w temperaturze -20 i stopień; C 
Wkładki do hodowli komórkowychGreiner Bio-one#66564112-dołkowa, por o rozmiarze 0,4 i mikro; m; przezroczysta (48 insertów/pudełko); https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/3d-cell-culture/thincert/3d-thincert-cell-culture-inserts/665641.html
Kolagen typu ICorning#354249Utrzymuj roztwór zapasowy na poziomie 4 i stopni; C
Jednorazowy skalpel sterylny 0507 nr 21Swann Morton#0507NIE
Dulbecco' s Fosforan-Buforowana sól fizjologiczna (DPBS)Thermo Fisher Scientific#14190094NIE
Essential 6 (E6) mediumThermo Fisher Scientific#A1516401określany jako minimalne medium hiPSC (hiMinM)  w tekście.
FasudilLC Labs#F-4660Mam roztwór 1000x zapasowy i przechowuj go w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu utrzymuj temperaturę 4 i stopnie; C przez maksymalnie 14 dni 
Delikatna dysocjacja komórkowa  OdczynnikTechnologie komórek mamiennych#100-0485NIE
Suplement GlutaMAXThermo Fisher Scientific#35050038NIE
Ludzki FGF-2 podstawowy poziom preniumMiltenyi Biotec#130-093-842Aliquot, przechowywanie w temperaturze -80 i stopień; C i  trzymaj się 4 i stopni; C przez maksymalnie 7 dni 
LDN 193189 dihydrochlorekTocris#6053Aliquot, światłoczuła, przechowywana w temperaturze -20 stopni; C 
Zredukowana matryca błony podstawowej czynnika wzrostu matrigeluCorning#354230Aliquot, sklep w temperaturze -20 i stopień; C i  trzymaj się 4 i stopni; C przez maksymalnie 7 dni 
2-MerkaptoetanolThermo Fisher Scientific#21985023Substancje niebezpieczne, toksyczne,, drażniące, zagrożenie dla zdrowia i środowiska.
NaOHMerck#567530-250MGSubstancja niebezpieczna, i drażniąca. Przygotuj rozwiązanie spontanicznie.
Ośrodek neurobazalnyThermo Fisher Scientific#21103049określane jako Neural Basal Medium  w tekście.
Normocyna 50 mg/mlInvivogen#ant-nr-1w teście określany jest suplementem antymikotycznym z antybiotykiem. Aliquot, sklep w temperaturze -20 i stopień; C i  trzymaj się 4 i stopni; C przez maksymalnie 14 dni 
Mikropłytka Nunclon Sphera 96-WellU-BottomThermo Fisher Scientific#174929NIE
Nunclon Sphera 174930 wielonaczyniowy z 24 dołkamiThermo Fisher Scientific#174930NIE
Suplement N2Thermo Fisher Scientific#17502048Aliquot, sklep w temperaturze -20 i stopień; C 
Orbitalny potrząsaczThermo Fisher Scientific#88881102NIE
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Scientific#15070063NIE
Rekombinowane ludzkie białko BMP4R& D Systems#314-BP-010Aliquot, przechowywanie w temperaturze -80 i stopień; C i  trzymaj się 4 i stopni; C przez maksymalnie 7 dni 
StemFlex (SF) mediumThermo Fisher Scientific#A3349401określany jako medium utrzymania hiPSC (hiMM)  w tekście.
SteriMax smart - SteriInfrared Loop SterilizatorWLD-TEC#4.002.000 Fakultatywny
PęsetaMerck#T4537-1EAStyl 5; Cienka igła i antymagnetyczna stal nierdzewna
WitronektynaTechnologie komórek mamiennych#07180NIE

Bibliografia

  1. Kolarsick, P. A. J., Kolarsick, M. A., Goodwin, C. Anatomy and physiology of the skin. J Dermatol Nurses Assoc. 3 (4), 203-213 (2011).
  2. Karimkhani, C., et al. Global skin disease morbidity and mortality: An update from the Global Burden of Disease Study 2013. JAMA Dermatol. 153 (5), 406(2017).
  3. Seth, D., et al. Global burden of skin disease: Inequities and innovations. Curr Dermatol Rep. 6 (3), 204-210 (2017).
  4. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing. J Invest Dermatol. 138 (10), 2095-2105.e1 (2018).
  5. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).
  6. Vig, K., et al. Advances in skin regeneration using tissue engineering. Int J Mol Sci. 18 (4), 789(2017).
  7. Chu, X., et al. Functional regeneration strategies of hair follicles: Advances and challenges. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 77(2025).
  8. Motter Catarino, C., Cigaran Schuck, D., Dechiario, L., Karande, P. Incorporation of hair follicles in 3D bioprinted models of human skin. Sci Adv. 9 (41), eadg0297(2023).
  9. Kageyama, T., Miyata, H., Seo, J., Nanmo, A., Fukuda, J. In vitro hair follicle growth model for drug testing. Sci Rep. 13 (1), 4847(2023).
  10. Abaci, H. E., et al. Tissue engineering of human hair follicles using a biomimetic developmental approach. Nat Commun. 9 (1), 5301(2018).
  11. Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
  12. Jung, S., et al. Wnt-activating human skin organoid model of atopic dermatitis induced by Staphylococcus aureus and its protective effects by Cutibacterium acnes. iScience. 25 (10), 105150(2022).
  13. Zhang, M., et al. Recessive cardiac phenotypes in induced pluripotent stem cell models of Jervell and Lange-Nielsen syndrome: Disease mechanisms and pharmacological rescue. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (5), E5383-E5392 (2014).
  14. Lee, J., et al. Generation and characterization of hair-bearing skin organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 17 (5), 1266-1305 (2022).
  15. Hu, M. S., et al. Embryonic skin development and repair. Organogenesis. 14 (1), 46-63 (2018).
  16. Li, K. N., Tumbar, T. Hair follicle stem cells as a skin-organizing signaling center during adult homeostasis. EMBO J. 40 (11), e107135(2021).
  17. Biggs, L. C., Kim, C. S., Miroshnikova, Y. A., Wickström, S. A. Mechanical forces in the skin: Roles in tissue architecture, stability, and function. J Invest Dermatol. 140 (2), 284-290 (2020).
  18. Gopee, N. H., et al. A prenatal skin atlas reveals immune regulation of human skin morphogenesis. Nature. 635 (8039), 679-689 (2024).
  19. Tokuyama, E., Nagai, Y., Takahashi, K., Kimata, Y., Naruse, K. Mechanical stretch on human skin equivalents increases the epidermal thickness and develops the basement membrane. PLoS One. 10 (11), e0141989(2015).
  20. Bai, X., et al. Organoid research: Theory, technology, and therapeutics. Organoid Res. 1 (1), 025040007(2025).
  21. Wang, Y., et al. Organoid research breakthroughs in 2024: A review. Organoid Res. 1 (2), 025040005(2025).
  22. Li, P., et al. Mpox virus infection and drug treatment modelled in human skin organoids. Nat Microbiol. 8 (11), 2067-2079 (2023).
  23. Kim, M. J., Ahn, H. J., Kong, D., Lee, S., Kim, D. H., Kang, K. S. Modeling of solar UV-induced photodamage on the hair follicles in human skin organoids. J Tissue Eng. 15, 20417314241248753(2024).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Indukowane pluripotencjalne kom rki macierzystetworzenie mieszk w w osowychp askie organoidy sk rybarwienie immunofluorescencyjner nicowanie nask rkaindukcja mezenchymalnagruczo y ojowein vitro model sk ry

Powiązane artykuły