Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Automatyczna analiza obrazów fluorescencyjnych C. elegans z użyciem SegElegans

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69094

⸱

10 października 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology-Hellas, 3Instituto de Automática e Informática Industrial, Universitat Politècnica de València

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiamy instrukcje dotyczące skutecznego wykorzystania SegElegans, systemu głębokiego uczenia, który opracowaliśmy do automatycznego segmentowania pojedynczych robaków na mikroskopii szerokopolowej, do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu do analizy obrazów, takiego jak ImageJ. Oferujemy możliwości korzystania z systemu zarówno online, jak i offline.

Streszczenie

Mikroskopia, szczególnie fluorescencjonująca, jest często używanym narzędziem w badaniach nad C. elegans . Analiza danych z eksperymentów mikroskopowych może jednak być dość żmudna i czasochłonna. Dlatego automatyzacja jest pożądana. Opracowaliśmy SegElegans, dwugłowy system sieci neuronowej splotowej oparty na sieci U-net, specjalnie zaprojektowany do automatycznego segmentowania robaków, nawet na obrazach z dużą liczbą osób dotykających się lub nakładających się na nich. Pierwsza część SegElegans składa się z jednego enkodera i dwóch dekoderów. Koder, oparty na modelu SmaAt AT, stosuje podwójne warstwy splotowe, po których następuje moduł Convolutional Block Attention Module (CBAM). Oba dekodery wykorzystują konwolucyjne LSTM: jeden wykonuje semantyczną segmentację obrazów robaków (ciało, krawędź, tło lub nakładanie się), podczas gdy drugi wyodrębnia liniowy szkielet wzdłuż każdego robaka. Druga część to algorytm postprocessingu, który łączy wyjścia obu dekoderów i wykorzystuje je do generowania dokładnych segmentacji instancji. Segmentacje te mogą być następnie przekazywane do ImageJ lub innych odpowiednich narzędzi do analizy obrazów. Przedstawiamy tutaj instrukcje, jak uzyskać dostęp i uruchomić ten system. Oferujemy implementację online, opartą na chmurze, a także dwie metody korzystania z modeli SegElegans offline, na komputerze lokalnym, jeśli dostępny jest potrzebny sprzęt.

Wprowadzenie

Caenorhabditis elegans to eukariotyczny organizm modelowy, szeroko stosowany w dziedzinach biologii komórkowej i molekularnej 1,2,3. Jest to mały (~1 mm dla dorosłych osobników typu dzikiego) żyjący w glebie nicieni, o szybkim cyklu życiowym (~trzy tygodnie) i dużej liczbie potomstwa (zazwyczaj genetycznie identycznych z samozapłodniającym się rodzicem). Pomimo względnej prostoty, zwierzę to jest nadal złożonym organizmem wielokomórkowym o wyraźnie określonych i odrębnych tkankach oraz organach, które dzięki niewielkim rozmiarom i przezroczystości można badać in vivo bez potrzeby utrwalania lub innych inwazyjnych zabiegów4. Zdolność robaka do badań in vivo za pomocą mikroskopu może być dodatkowo rozszerzona dzięki zastosowaniu fluorescencyjnym raportatorów, które umożliwiają łatwe rozróżnienie poszczególnych komórek lub nawet bezpośrednią wizualizację organelli/składników podkomórkowych, takich jak mitochondria, krople lipidowe czy agregaty białkowe, a także procesów takich jak transdukcja sygnału, ekspresja genów, fuzja pęcherzyków, autofagia, potencjały czynnościowe neuronów i mięśni itd.5,6,7,8,9,10,11. Ponadto nicienie są również bardzo podatne na modyfikację genetyczną poprzez mutagenezę12, transgenezę przez mikroiniekcję lub bombardowanie mikrocząstek13, edycję CRISPR14, a co najważniejsze, w przypadku łatwego i opłacalnego badania genetycznego RNAi15. Ta manipulacja pozwala na szeroko zakrojone badania genów i ich roli w samym nicieniu, a jednocześnie, dzięki znaczącej homologii genetycznej C. elegans wobec innych organizmów modelowych, dokonują fundamentalnych odkryć istotnych aż do ludzi16,17. Wreszcie, ta homologia/konserwacja czyni robaka idealnym początkowym polem do testowania leków i środków chemicznych, umożliwiając wyjaśnienie mechanizmów aktywności leków, identyfikację potencjalnych zmiennic genetycznych modyfikujących aktywność oraz odkrycie potencjalnych niepożądanych interakcji i efektów pozacelowych 18,19,20.

Wszystkie wymienione zalety sprawiły, że C. elegans stał się atrakcyjnym modelem do badań biologii komórkowej i molekularnej, szczególnie dla naukowców zainteresowanych in vivo oraz często monitorowaniem procesów w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii. Takie badania zazwyczaj obejmują znaczną ilość analizy obrazów za pomocą specjalnego oprogramowania, z najczęściej używaną opcją ImageJ 21,22,23. Wspólną cechą analizy za pomocą takiego oprogramowania jest konieczność określenia przez użytkownika/badacza Regionów Zainteresowania (ROI) do analizy za pomocą narzędzi selekcyjnych. Dość często każdy pojedynczy robak na obrazie jest wybierany jako własny ROI, z celem uzyskania informacji o prostych cechach morfologicznych (takich jak wymiary ciała) lub bardziej "zaawansowanych" odczytach eksperymentalnych, takich jak poziomy ekspresji genu (mierzone za pomocą fluorescencyjnego reportera), odczyt raportu ratiometrycznego, liczba i wielkość kropelek lipidowych, tworzenie agregatów białkowych, morfologia poszczególnych organelli i ich sieci itd.5,8,10,24,25,26,27. Te selekcje dla robaka są zazwyczaj dokonywane ręcznie, ponieważ automatyczne metody selekcji oparte na standardowych algorytmach przetwarzania obrazu zwykle nie są wystarczająco zdolne do rozróżnienia kształtów i cech robaka, zwłaszcza w obrazach ciemnopolowych, gdzie kontury robaków nie są wyraźnie widoczne, lub w obrazach jasnych z znaczną liczbą zwierząt, które się stykają i nakładają. Proces ręczny jest jednak powolny (od 20 s do 1 minuty na robak, w zależności od wymaganej precyzji i doświadczenia użytkownika), żmudny i podatny na błędy i błędy użytkownika.

Alternatywnym i znacznie potężniejszym podejściem do generowania indywidualnych ROI C. elegans (zadanie powszechnie określane jako segmentacja w dziedzinie widzenia komputerowego) jest automatyzacja tego z pomocą technik uczenia głębokiego/sieci neuronowych. Konwolucyjne sieci neuronowe oparte głównie na architekturach Mask R-CNN28 i U-net29 przyniosły przyzwoite wyniki w zadaniach segmentacyjnych na różnych biologicznych modelach 30,31,32, w tym w C. elegans 33,34,35,36,37,38,39 , ale żadne z nich nie zapewniło satysfakcjonującego rozwiązania problemu generowania segmentacji całego ciała, które poprawnie rozróżniałyby poszczególne zwierzęta (segmentacja instancji) na obrazach o wysokiej rozdzielczości z dużą liczbą stykających się lub wręcz nakładających się robaków. Aby sprostać tej potrzebie, opracowaliśmy SegElegans, model głębokiego uczenia specjalnie zaprojektowany i zoptymalizowany pod to zadanie40.

SegElegans składa się z dwóch głównych części (Rysunek 1). Pierwsza część to dwugłowicowa wariantowa sieć neuronowa U-net. Składa się z jednego bloku enkodera i dwóch bloków dekodera. Blok enkodera oparty jest na modeluSmaAt AT 41 i wykorzystuje podwójne bloki splotowe dla każdej warstwy zasilanej przez moduł Convolucional Block Attention Module (CBAM)42. Dwa bloki dekodera opierają się na sieci konwolucyjnej długiej pamięci krótkotrwałej (LSTM)43. Jeden z dekoderów odpowiada za kategoryzację każdego piksela obrazów jako części głównego ciała robaka, części krawędzi robaka, części tła lub obszaru, gdzie robaki nakładają się (zwykle nazywa się to segmentacją semantyczną). Drugi dekoder odpowiada za rysowanie liniowego "szkieletu" wzdłuż długości każdego robaka. Druga część to algorytm postprocessingu, który łączy wyjścia obu dekoderów i wykorzystuje je do generowania dokładnych segmentacji instancji. Początkowo identyfikuje segmenty prawdziwych nakładań, porównując wyjście semantycznej segmentacji z tą szkieletową. Następnie segmentacja instancji jest wyprowadzana bezpośrednio dla robaków bez nakładania się lub przez składanie jej z segmentów dla nakładających się40. Segmentacje te są zapisywane jako maski binarne oraz zgodne z ImageJ ROI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Poniższe sekcje zawierają szczegółowe instrukcje, jak skutecznie korzystać z SegElegans (Rysunek 2). Obejmują instrukcje dotyczące przygotowawczego pozyskiwania obrazów (Sekcja 1), jak uruchamiać model online (Sekcja 2) lub offline (Sekcje 3-5) oraz importu ROI do ImageJ lub innych narzędzi (Sekcja 6). Ponieważ ocena obrazów w modelu wymaga komputera z kompatybilną z CUDA Graphics Processing Unit (GPU), która posiada co najmniej 6 GB (najlepiej więcej) pamięci wideo (VRAM), większość użytkowników (pod warunkiem dostępu do usług Google) jest zalecana do korzystania z wersji online, która spełnia i przewyższa te wymagania sprzętowe poprzez przetwarzanie w chmurze (Sekcja 1 > Sekcja 2 > Sekcja 6). Alternatywnie, użytkownicy mającycy dostęp do odpowiednio wydajnego sprzętu i podstawową wiedzę o użyciu linii poleceń/terminala (lub użytkownicy nieposiadający dostępu do wspomnianych opcji chmury) mogą uznać uruchomienie modelu lokalnie za wygodniejsze (Sekcja 1 > Sekcja 3 > Sekcja 4 lub 5 > Sekcja 6).

1. Pozyskanie przykładowych i obrazów przewodników

  1. Używaj SegElegans do pozyskiwania segmentacji dorosłych robaków z dowolnego szczepu, niezależnie od tego, jakie fluorescencyjne raporty mogą wykazywać lub nie. Jeśli fenotyp(y)/dane są mierzone w obrazach jasnego pola, należy je zwykle uzyskiwać za pomocą mikroskopu szerokokątnego i kompatybilnego oprogramowania, używając obiektywu 4x lub podobnego.
    UWAGA: SegElegans potrafi analizować obrazy o szerokim zakresie jasności i kontrastu, choć lepiej nie ma nasyconych, jasnych ani ciemnych pikseli. Jeśli chodzi o wymiary, system został wytrenowany na obrazach 1328 x 1048, ale powinien działać z każdym obrazem o rozmiarze co najmniej 512x512.
  2. Jeśli fenotyp(y)/dane są mierzone w obrazach ciemnego pola (typowe przy użyciu jednego lub więcej transgenicznych fluorescencyjnych reporterów lub barwników), należy uzyskać obrazy w świetle pola obok danych, które będą używane jako obrazy przewodnikowe (jak wyjaśniono w kroku 1.1). Upewnij się, że obrazy przewodnika idealnie odpowiadają obrazom ciemnego pola kanału fluorescencji przestrzennie i jak najdokładniej czasowo, najlepiej korzystając z opcji wielokanałowego akwizycji dostępnych w oprogramowaniu operacyjnym mikroskopu. Zapisz ilustracje przewodnika w osobnym folderze od odpowiadających obrazów danych w ciemnym polu, używając tej samej nazwy dla obu.

2. Prowadzenie wersji online SegElegans

  1. Zaloguj się na konto Google w przeglądarce internetowej. Zaleca się utworzenie nowego, dedykowanego konta laboratoryjnego w tym celu.
  2. Wejdź na Google Drive (https://drive.google.com) i wgraj folder z obrazami brightfield (dane lub przewodnik). Jak wspomniano wcześniej, jeśli obrazy przewodnika są używane do generowania zwrotu z inwestycji dla obrazów ciemnych pól, nie włączaj tych obrazów danych ciemnych pól do tego folderu.
  3. Wejdź do https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 i kliknij plik SegElegans Body Prediction Interface.ipynb . Kliknij przycisk Otwórz w Colab na górze otwieranego pliku. Notebook/interfejs Jupyter dla SegElegans zostanie otwarty w Google Colab.
  4. Wykonaj blok kodu 1, naciskając przycisk play (figure-protocol-1) pod tytułem. Udziel środowisku wykonawczemu uprawnienia do uruchomienia kodu i obserwuj wyjście po zakończeniu wykonania (obok przycisku odtwarzania pojawia się zielony znaczek check). Colab powinien automatycznie uruchomić poprawny, kompatybilny z CUDA-czas uruchomienia i wyświetlić tabelę wyjściową NVIDIA-SMI. W przeciwnym razie wymusz użycie runtime T4 GPU przez menu Runtime > Zmień typ runtime .
  5. Wykonaj blok kodu 2, aby załadować zawartość Google Drive do środowiska uruchomieniowego. Akceptuj wszystkie dialogi potwierdzające i przyznaj wszystkie żądane uprawnienia.
  6. Wykonaj bloki kodu 3, potem 4. Blok 3 zajmie kilka minut, więc upewnij się, że pojawił się zielony znaczek zaznaczeniowy, zanim przejdziesz do 4.
  7. Otwórz ikonę z zakładką folderów po lewej stronie interfejsu Colab. To wyświetli pliki ładowane do runtime, w tym zaimportowaną zawartość Drive jako /content/drive/MyDrive. Kliknij prawym przyciskiem myszy na folder z obrazami, skopiuj ścieżkę i wklej ją do test_images formularza wejściowego bloku kodu 5. Upewnij się, że wygląda tak: /content/drive/MyDrive/Imagefolder. Podobnie określ ścieżkę dla wyjścia analizy (np. /content/drive/MyDrive/Imagefolder/Output). Należy zauważyć, że ścieżki w tym środowisku używają ukośnika do oddzielenia folderów (/).
  8. Wykonaj blok kodu 5.
  9. Określ dokładne rozszerzenie obrazów do analizy przez model w dostarczonej formie bloku kodu 6. Dla tego wejścia ".tif", ". TIF" i ".tiff" traktowane są jako różne rozszerzenia.
  10. Nie zmieniaj batch_crop_img wejścia w bloku kodu 6, jeśli system działa w domyślnym czasie działania GPU T4 (który jest dostępny bezpłatnie dla wszystkich użytkowników przez ograniczoną liczbę godzin dziennie, w zależności od poziomu użycia). Zmniejsz ją, jeśli czas działania powoduje problemy z dostępnością pamięci.
  11. Wykonaj blok kodu 6. Zajmie to trochę czasu, więc upewnij się, że zielony znaczek jest widoczny, zanim przejdziesz dalej.
  12. Wykonaj blok kodu 7. Nie dostosowuj jego wejść do domyślnego czasu działania T4, lecz zmniejsz liczbę podprocesów lub całkowicie wyłącz przetwarzanie równoległe, jeśli pojawią się problemy z dostępnością pamięci. To również zajmie sporo czasu.
  13. Uzyskaj dostęp do Google Drive w innym oknie przeglądarki lub zakładce i przejdź do folderu wyjściowego oznaczonego w wersji 2.7.
    UWAGA: Na tym etapie SegElegans zakończył wstępną ocenę i postprodukcję segmentacji oraz utworzył kilka podfolderów z wynikami. 0_summary wyniki zawierają wykresy podsumowujące wyniki każdego obrazu, z przypisanym numerem indeksowym dla każdego robaka. 1_complete_mask zawiera wyselekcjonowane maski binarne dla wszystkich segmentacji, które algorytm uznał za odpowiednie do analizy. 1_edge_small_mask zawiera maski binarne dla wszystkich segmentacji, które algorytm postanowił odrzucić, ponieważ zwierzęta są zbyt małe lub częściowo zasłonięte na krawędzi obrazu. 1_overlap_mask zawiera maski binarne dla wszystkich segmentacji robaków, które wykazywały rzeczywiste nakładanie się i domyślnie nie są dodawane do wyselekcjonowanego wyniku. 1_all_rois_results zawiera segmentacje WSZYSTKICH 3 typów, niezależnie od kuracji, w formacie ImageJ (pliki zip z ROI).
  14. W tym momencie wybierz jedną z trzech opcji:
    1. Wykorzystaj zwroty z inwestycji podanych w 1_all_rois_results w ImageJ i odrzuć niechciane zwroty po imunosie (patrz sekcja protokołu 6).
    2. Zaakceptuj wyselekcjonowane dobre maski bez ręcznej korekty (i bez nakładających się robaków) (przejdź do wersji 2.16).
    3. Ręcznie dostosuj kurację, wybierając robaki (w tym nakładające się), które mają być uwzględnione w wyjściu (kontynuuj do wersji 2.15).
  15. Aby ręcznie dostosować kurację, użyj bloku kodu 8. Przeanalizuj wyniki początkowej kuracji z grafów podsumowujących w folderze 0_summary results . Dla każdego obrazu, który wymaga korekty, wprowadź pełną nazwę (z rozszerzeniem) oryginalnego obrazu wejściowego w formie "name_image_change" oraz numery masek, które mają być zachowane (z grafu podsumowującego), oddzielone przecinkami w formie "index_images". Wykonaj blok kodu 8. Powtórz ten krok dla każdego innego obrazu, który wymaga korekty.
  16. Po poprawce lub jeśli użytkownicy zdecydują się zaakceptować początkową kurację bez poprawek (i bez nakładających się robaków), wykonaj blok kodu 9. Nowy podfolder zostanie utworzony w folderze outputs w Google Drive o nazwie 2_curated_rois_results. Zawiera wszystkie ostateczne, wyselekcjonowane segmentacje w formacie ImageJ (pliki zip z ROI).
  17. Aby wykonać proces ponownie dla innego folderu obrazów, zresetuj runtime przez menu Runtime > Restart Session i zacznij od początku.

3. Przygotowanie wersji offline SegElegans przed pierwszym użyciem

  1. Jako alternatywa dla uruchamiania SegElegans online na Colabie, dostępna jest wersja offline dla użytkowników, którzy nie mogą lub wolą nie korzystać z usług chmurowych Google. Wymaga to komputera PC (Windows lub Linux) z kartą graficzną kompatybilną z CUDA (https://developer.nvidia.com/cuda-gpus), która ma co najmniej 6 GB VRAM (choć zalecane jest 16 GB, jeśli jest dostępne i przystępne cenowo).
    UWAGA: Poniższe instrukcje w sekcjach 3-5 dotyczą systemu Windows, ale oprogramowanie może również działać na systemach opartych na Linuksie, z niewielkimi zmianami w używanych poleceniach.
  2. Pobierz instalator CUDA toolkit z https://developer.nvidia.com/cuda-downloads postępując zgodnie z instrukcjami, aby uzyskać odpowiednią wersję dla używanego urządzenia.
    UWAGA: SegElegans był testowany z wersjami 12.9 i 13.0 zestawu narzędzi oraz CUDA Version 11 na Windows, jednak oczekuje się, że przyszłe wersje zachowają kompatybilność wsteczną.
    1. Zainstaluj zestaw narzędzi, postępując zgodnie z instrukcjami samego instalatora. Visual Studio nie jest potrzebne.
  3. Pobierz odpowiednią wersję instalatora Pythona dla urządzenia z https://www.python.org/downloads/. Zainstaluj Pythona, postępując zgodnie z instrukcjami samego instalatora i upewniając się, że python.exe jest dodany do PATH.
    UWAGA: SegElegans został zbudowany i przetestowany w Pythonie 3.13, ale oczekuje się, że przyszłe wersje zachowają kompatybilność wsteczną.
  4. Idź do https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOffline/releases/tag/v1. Kliknij link do kodu źródłowego (poczt), aby pobrać pakiet z niezbędnymi plikami do lokalnej konfiguracji i uruchomienia SegElegans.
  5. Wyodrębnij plik zip. Umieść go w folderze wysokiego lub nawet najwyższego poziomu, na przykład C:\SegElegans. Zawartość pliku zip już znajduje się w podfolderze SegElegansOffline-1.
  6. Otwórz wiersz poleceń Windows (cmd.exe). Wpisz polecenie python -m venv "fullsegeleganspath", gdzie "fullsegeleganspath" to pełna ścieżka, w cudzysłowie, do podfolderu SegElegansOffline-1 .
    UWAGA: Na przykład, jeśli plik zip został rozpakowany w C:\SegElegans, pełna ścieżka to C:\SegElegans\SegElegansOffline-1, a polecenie to python -m venv "C:\SegElegans\SegElegansOffline-1". Należy zauważyć, że ścieżki w tym środowisku używają ukośnika do oddzielania folderów ("\").
  7. W wierszu poleceń użyj standardowych kontrolek do nawigacji w folderze SegElegansOffline-1 i wykonaj polecenia Scripts\activate. Przed kolejnym kursorem powinna pojawić się etykieta (SegElegansOffline-1), wskazująca, że środowisko Python jest już aktywne.
  8. W aktywnym środowisku (SegElegansOffline-1) uruchom polecenie install -r requirements.txt . Proces zajmie trochę czasu.
  9. Wprowadź i wykonaj polecenie python assemblenetworks.py .
    UWAGA: SegElegans jest już gotowy do startu. Dostępne są dwa sposoby na osiągnięcie tego: szybki skrypt, który automatycznie udostępni wszystkie segmentacje jako zwroty z inwestycji ImageJ bez możliwości ręcznej korekty kuracji (sekcja 4), oraz lokalny notes Jupyter, który oferuje opcję przeglądu i korekty kuracji (sekcja 5). To drugie podejście jest zalecane większości użytkowników.

4. Uruchamianie wersji offline SegElegans za pomocą szybkiego skryptu

  1. Otwórz wiersz poleceń Windows (cmd.exe). Jak opisano w kroku 3.7, przejdź do folderu środowiskowego SegElegans i aktywuj go.
  2. Aby użyć szybkiego skryptu, będąc w wierszu poleceń z aktywnym (SegElegansOffline-1) wejściem środowiskowym i wykonać polecenie python SegElegansBodyQuickEval.py -i "pathtoinputfolder" -x gdzie "pathtoinputfolder" to pełna ścieżka, w cudzysłowie, do folderu z obrazami brightfield (np. "D:\Data\Experiment12365\Condition 1"), a to dokładne rozszerzenie plików obrazów, które użytkownicy chcą analizować (Przykład ". TIF"). Wpisz polecenie python SegElegansBodyQuickEval.py -h , aby uzyskać instrukcje dotyczące dodatkowych parametrów, które można zmienić, aby przyspieszyć przetwarzanie przez skrypt, jeśli urządzenie to potrafi.
    UWAGA: W tym przypadku folder output zostanie utworzony wewnątrz folderu wejściowego (na przykład powyżej: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output"). W środku znajduje się seria podfolderów. 0_summary wyniki zawierają wykresy podsumowujące wyniki każdego obrazu, z przypisanym numerem indeksowym dla każdego robaka. 1_complete_mask zawiera wyselekcjonowane maski binarne dla wszystkich segmentacji nienakładających się, które algorytm uznał za odpowiednie do analizy. 1_edge_small_mask zawiera maski binarne dla wszystkich segmentacji, które algorytm zdecydował się odrzucić, ponieważ zwierzęta są zbyt małe lub częściowo zasłonięte na krawędzi obrazu. 1_overlap_mask zawiera maski binarne dla wszystkich segmentacji robaków, które wykazywały rzeczywiste nakładanie się. 1_all_rois_results zawiera segmentacje WSZYSTKICH 3 typów, niezależnie od kuracji, w formacie ImageJ (pliki zip z ROI). Ponieważ nie ma tu możliwości ręcznej korekty kuracji, 2_curated_rois_results domyślnie uwzględnia wszystkie segmentacje uznane przez algorytm za dobre ORAZ wszystkie nakładające się segmentacje w formacie ImageJ (pliki zip z ROI).

5. Uruchamianie wersji offline SegElegans z notebookiem Jupyter

  1. Otwórz wiersz poleceń Windows (cmd.exe). Jak opisano w kroku 3.7, przejdź do folderu środowiskowego SegElegans i aktywuj go.
  2. Aby korzystać z interfejsu Jupyter, będąc w wierszu poleceń w aktywnym środowisku (SegElegansOffline-1), wprowadź i wykonaj notatnik jupyter poleceń. To otworzy okno/kartę przeglądarki internetowej z lokalnie hostowaną stroną. Na początkowym ekranie wybierz plik SegElegansOfflineJupyterInterface.ipynb.
  3. Wykonaj kod w bloku kodu 1, wybierając go (kliknij po lewej poza faktycznym kodem) i naciskając przycisk play (figure-protocol-2) na pasku narzędzi powyżej. Pod blokiem kodu pojawi się komunikat potwierdzający po zakończeniu wykonania.
  4. Wykonaj blok kodu 2. To wygeneruje niektóre formy wejściowe w odczytie pod blokiem kodu. Wypełnij wygenerowane formularze ścieżką do folderu wejściowego z obrazami jasnego pola (Przykład: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1"), pożądaną ścieżką wyjścia analizy (Przykład: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output") oraz dokładnym rozszerzeniem pliku obrazów do analizy (Przykład". TIF"). Dostosuj dodatkowe dostępne ustawienia (zwiększenie liczby podupraw na partię do 9 lub 16 oraz uruchom wiele procesów równoległych po przetwarzaniu), jeśli urządzenie jest wystarczająco wydajne.
  5. Wykonaj blok kodu 3.
  6. Wykonaj blok kodu 4. To zajmie trochę czasu, więc upewnij się, że jest to kompletne, zanim zaczniesz kontynuować.
  7. Wykonaj blok kodu 5. To znów zajmie trochę czasu. Następnie przejdź do folderu wyjściowego wskazanego powyżej.
    UWAGA: Na tym etapie SegElegans zakończył wstępną ocenę i postprodukcję segmentacji oraz utworzył kilka podfolderów z wynikami. 0_summary wyniki zawierają wykresy podsumowujące wyniki każdego obrazu, z przypisanym numerem indeksowym dla każdego robaka. 1_complete_mask zawiera wyselekcjonowane maski binarne dla wszystkich segmentacji, które algorytm uznał za odpowiednie do analizy. 1_edge_small_mask zawiera maski binarne dla wszystkich segmentacji, które algorytm postanowił odrzucić, ponieważ zwierzęta są zbyt małe lub częściowo zasłonięte na krawędzi obrazu. 1_overlap_mask zawiera maski binarne dla wszystkich segmentacji robaków, które wykazywały rzeczywiste nakładanie się i domyślnie nie są dodawane do wyselekcjonowanego wyniku. 1_all_rois_results zawiera segmentacje WSZYSTKICH 3 typów, niezależnie od kuracji, w formacie ImageJ (pliki zip z ROI).
  8. Podobnie jak w wersji online SegElegans, skorzystaj z jednej z trzech poniższych opcji:
    1. Wykorzystaj zwroty z inwestycji podanych w 1_all_rois_results w ImageJ i odrzuć niechciane zwroty po imporcie (patrz sekcja protokołu 6).
    2. Zaakceptuj automatycznie dobrane maski bez ręcznej korekty (i bez nakładających się robaków) (przejdź do kroku 5.11).
    3. Ręcznie dostosuj kurację, wybierając robaki (w tym nakładające się), które mają zostać uwzględnione w wyświetle (przejdź do kroku 5.9).
  9. Aby ręcznie dostosować kurację, użyj bloków kodu 6 i 7. Najpierw wykonaj 6. To utworzy formularze wejściowe w odczytie pod kodem.
  10. Przeanalizuj wyniki początkowej kuracji z grafów podsumowujących w podfolderze 0_summary results . Dla każdego obrazu, który wymaga korekty, wpisz pełną nazwę obrazu INPUT (z rozszerzeniem) w obrazie, aby poprawić formę oraz numery masek, które mają być zachowane (z grafu podsumowującego), oddzielone przecinkami w Maski, aby zachować: formę. Wykonaj blok kodu 7 i upewnij się, że wykonanie jest zakończone. Powtórz ten krok dla każdego innego obrazu, który wymaga korekty.
  11. Po zakończeniu korekty kuracji lub jeśli użytkownicy zdecydują się zaakceptować początkową kurację bez poprawek (i bez nakładających się robaków), wykonaj blok kodu 8. Nowy podfolder zostanie utworzony w wyznaczonym folderze outputs o nazwie 2_curated_rois_results. Zawiera wszystkie ostateczne, wyselekcjonowane segmentacje w formacie ImageJ (pliki zip z ROI).
  12. Aby wykonać proces ponownie dla innego folderu obrazów, zresetuj czas działania przez menu Kernel > Restart Kernel i Clear Outputs of all Cells i zacznij od początku.

6. Importowanie segmentacji do ImageJ (lub alternatyw)

  1. Otwórz jeden z rzeczywistych obrazów danych na ImageJ.
  2. Otwórz odpowiadający plik zip z zwrotem z tego obrazu. To załaduje wybory do menedżera ROI ImageJ. Jeśli są to zwroty z inwestycji z 2_curated_rois_results wyjścia, są gotowe do analizy przy użyciu pożądanych metod zwykle stosowanych (najlepiej z użyciem makr do dalszej automatyzacji i przyspieszenia procesu).
  3. Jeśli są to zwroty z inwestycji z 1_all_rois_results , usuń niechciane segmentacje z menedżera ROI. Wybierz je i naciśnij przycisk Usuń w samym oknie menedżera. Nie naciskaj Delete na klawiaturze, ponieważ usuwa on zawartość zaznaczenia na obrazie.
  4. Jeśli do analizy potrzebne jest oprogramowanie inne niż ImageJ, format ROI najprawdopodobniej nie będzie kompatybilny. W takim przypadku importuj segmentacje w uniwersalnie stosowanej formie masek binarnych, które są dostępne w folderach 1_complete_mask i 1_overlap_mask . Sprawdź instrukcje oprogramowania odbiorcy, jak wykonać ten import.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując ten protokół, naukowcy powinni być w stanie wyodrębnić wysokiej jakości segmentacje robaków, nawet do analizy obrazów fluorescencyjnych bez widocznych krawędzi robaków. Jak omówiono w sekcji 6 protokołu, te segmentacje mogą być bezpośrednio importowane do ImageJ i wykorzystywane do szybkiego pomiaru istotnych właściwości, takich jak intensywność fluorescencjonujących reporterów (powszechnie stosowane do ilościowej ekspresji) czy liczba, rozmiar i morfologia obszarów oznaczonych fluorescencją (często wykorzystywa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metodologia powinna umożliwić użytkownikom analizę eksperymentów mikroskopii C. elegans w znacznie szybszym czasie bez utraty dokładności. Ponieważ wyodrębnia segmentacje z obrazów przewodników w świetle niezależności od faktycznej fluorescencji (jak omówiono w sekcji protokołu 1), może być stosowany z każdym szczepem i do każdego zastosowania wymagającego pomiaru fenotypów na poziomie pojedynczego robaka. Mogą to być zastosowania jednokanałowe, takie jak ilościowe określenie powstawania niep...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Podziękowania

Prace w laboratorium autorów są finansowane przez Sekretariat Generalny dla
Badania i Innowacje Greckiego Ministerstwa Rozwoju,
Unia Europejska - NextGenerationEU (kod projektu: TAEDR-0535850, skrót:
BrainPrecision) w ramach akcji "Flagowe Działania w
Interdyscyplinarne obszary naukowe ze szczególnym zainteresowaniem w powiązaniach
do tkanki produkcyjnej", w ramach Narodowego Ożywienia i Odporności
Plan "Grecja 2.0", Agencja Wykonawcza ds. Badań Komisji Europejskiej
Centrum Doskonałości "CHAngeing" (GA-101087071) oraz Fundacja Grecka
na rzecz badań i innowacji (H.F.R.I.) w ramach "1. Wezwania do H.F.R.I.
Projekty badawcze wspierające członków kadry naukowej i badaczy oraz
zakup drogiego sprzętu badawczego" (Numer projektu:
HFRI-FM17C3-0869, NeuroMitofagia).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komputer z dostępem do internetu (przykład: Dell Vostro Desktop)Kilka (na przykład Dell) -Pozwoli to uruchamiać SegElegans online w chmurze, zgodnie z zaleceniami, oraz korzystać z oprogramowania do analizy obrazów, takiego jak ImageJ.
Kompatybilna z CUDA jednostka graficzna z co najmniej 6 GB VRAM (przykład: MSI Geforce RTX  RTX3050 Ventus 2X 6GB) (opcjonalnie)NVIDIA + kilku producentów (na przykład Micro Star International)https://developer.nvidia.com/cuda-gpusPozwoli to uruchomić SegElegans offline na lokalnej maszynie.
kompatybilne chipsety GPU można znaleźć tutaj:
https://developer.nvidia.com/cuda-gpus
VRAM zależy od faktycznej implementacji chipsetu w GPU przez producenta.
UWAGA: Będziesz potrzebować drogiej i wydajnej karty CUDA, znacznie przekraczającej minimalne wymagania (16+ GB VRAM), aby dorównać wydajności osiąganej przez wersję chmurową.
Mikroskop epifluorescencyjny (Invitrogen EVOS FL Auto 2)ThermoFisher Scientific  AMAFD2000 na przykładZalecamy stosowanie systemu, który może automatycznie rejestrować obrazy zarówno z jasnego pola, jak i jednego lub więcej kanałów fluorescencyjnych niemal jednocześnie.
ImageJ (opcjonalnie)NIHhttps://imagej.net/software/fiji/downloadsPolecamy dystrybucję Fiji, dostępną tutaj:
https://imagej.net/software/fiji/downloads
PC z kompatybilnością z kartą NVIDIA (przykład: Dell Vostro Desktop) (opcjonalnie)  Kilka (na przykład Dell) -Jest to potrzebne w połączeniu z GPU do uruchamiania SegElegans offline na lokalnej maszynie.
GPU będzie wymagać sprzętu kompatybilnego z Windows z odpowiednimi slotami PCI na płycie głównej, miejsca na kartę oraz wystarczająco mocnego zasilacza.
SegElegans-https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 Zobacz manuskrypt po pełne instrukcje.

Bibliografia

  1. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).
  2. Markaki, M., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans as a model system for human diseases. Curr Opin Biotechnol. 63, 118-125 (2020).
  3. Zuryn, S. C. elegans as a model for health and disease. Semin Cell Dev Biol. 154 (Pt A), 1-3 (2024).
  4. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  5. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , 1-13 (2006).
  6. Feinberg, E. H., et al. GFP reconstitution across synaptic partners (GRASP) defines cell contacts and synapses in living nervous systems. Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).
  7. Hammarlund, M., Jin, Y. Axon regeneration in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 27, 199-207 (2014).
  8. Daniele, J. R., et al. UPR(ER) promotes lipophagy independent of chaperones to extend life span. Sci Adv. 6 (1), eaaz1441(2020).
  9. Yemini, E., et al. NeuroPAL: A multicolor atlas for whole-brain neuronal identification in C. elegans. Cell. 184 (1), 272-288.e11 (2021).
  10. Sinnige, T., et al. Kinetic analysis reveals that independent nucleation events determine the progression of polyglutamine aggregation in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (11), e2021888118(2021).
  11. Gkikas, I., Daskalaki, I., Kounakis, K., Tavernarakis, N., Lionaki, E. MitoSNARE assembly and disassembly factors regulate basal autophagy and aging in C. elegans. Int J Mol Sci. 24 (4), 4230(2023).
  12. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  13. Praitis, V., Maduro, M. F. Transgenesis in C. elegans. Methods Cell Biol. 106, 161-185 (2011).
  14. Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-guided genome engineering in Caenorhabditis elegans. Curr Protoc Mol Biol. 129 (1), e106(2019).
  15. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  16. Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch'ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10 (5), 703-713 (2000).
  17. Kuwabara, P. E., O'Neil, N. The use of functional genomics in C. elegans for studying human development and disease. J Inherit Metab Dis. 24 (2), 127-138 (2001).
  18. Ranganathan, R., Sawin, E. R., Trent, C., Horvitz, H. R. Mutations in the Caenorhabditis elegans serotonin reuptake transporter MOD-5 reveal serotonin-dependent and -independent activities of fluoxetine. J Neurosci. 21 (16), 5871-5884 (2001).
  19. Lackner, M. R., et al. Chemical genetics identifies Rab geranylgeranyl transferase as an apoptotic target of farnesyl transferase inhibitors. Cancer Cell. 7 (4), 325-336 (2005).
  20. Yoon, S., et al. Microfluidics in high-throughput drug screening: Organ-on-a-chip and C. elegans-based innovations. Biosensors (Basel). 14 (1), 55(2024).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  23. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  24. Valente, A. J., Maddalena, L. A., Robb, E. L., Moradi, F., Stuart, J. A. A simple ImageJ macro tool for analyzing mitochondrial network morphology in mammalian cell culture. Acta Histochem. 119 (3), 315-326 (2017).
  25. Ramki, K., Thiruppathi, G., Ramasamy, S. K., Sundararaj, P., Sakthivel, P. An aggregation-induced emission-based ratiometric fluorescent chemosensor for Hg(II) and its application in Caenorhabditis elegans imaging. Methods. 221, 1-11 (2024).
  26. Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions. WormBook. , 1-23 (2006).
  27. Braeckman, B. P., Smolders, A., Back, P., De Henau, S. In vivo detection of reactive oxygen species and redox status in Caenorhabditis elegans. Antioxid Redox Signal. 25 (10), 577-592 (2016).
  28. He, K., Gkioxari, G., Dollár, P., Girshick, R. Mask R-CNN. arXiv. , (2017).
  29. Ronneberger, O., Fischer, P., Brox, T. U-Net: Convolutional networks for biomedical image segmentation. arXiv. , (2015).
  30. Exploring deep learning architectures in NAECON 2018. Proc IEEE NAECON. Alom, M. Z., Yakopcic, C., Taha, T. M., Asari, V. K. IEEE National Aerospace and Electronics Conference, , 228-233 (2018).
  31. Micallef, N., Seychell, D., Bajada, C. J. Exploring the U-Net++ model for automatic brain tumor segmentation. IEEE Access. 9, 125523-125539 (2021).
  32. Plebani, E., et al. High-throughput segmentation of unmyelinated axons by deep learning. Sci Rep. 12 (1), 1198(2022).
  33. Fudickar, S., Nustede, E. J., Dreyer, E., Bornhorst, J. Mask R-CNN based C. elegans detection with a DIY microscope. Biosensors (Basel). 11 (8), 257(2021).
  34. Lalit, M., Tomancak, P., Jug, F. EmbedSeg: Embedding-based instance segmentation for biomedical microscopy data. Med Image Anal. 81, 102523(2022).
  35. Layana Castro, P. E., Garvi, A. G., Sanchez-Salmeron, A. J. Automatic segmentation of Caenorhabditis elegans skeletons in worm aggregations using improved U-Net in low-resolution image sequences. Heliyon. 9 (4), e14715(2023).
  36. A convolutional neural network model for worm imaging in 2020. Proc IEEE ISBI. Chen, L., et al. IEEE 17th International Symposium on Biomedical Imaging (ISBI), , 508-512 (2020).
  37. Guan, G., et al. Cell lineage-resolved embryonic morphological map reveals signaling associated with cell fate and size asymmetry. Nat Commun. 16 (1), 3700(2025).
  38. Cao, J., et al. Establishment of a morphological atlas of the Caenorhabditis elegans embryo using deep-learning-based 4D segmentation. Nat Commun. 11 (1), 6254(2020).
  39. Zhao, C., et al. EmbSAM: Cell boundary localization and Segment Anything Model for fast images of developing embryos. bioRxiv. , (2024).
  40. Castro, P. E. L., et al. SegElegans: Instance segmentation using dual convolutional recurrent neural network decoder in Caenorhabditis elegans microscopic images. Comput Biol Med. 190, 110012(2025).
  41. Trebing, K., Stańczyk, T., Mehrkanoon, S. SmaAt-UNet: Precipitation nowcasting using a small attention-UNet architecture. Pattern Recognit Lett. 145, 178-186 (2021).
  42. Woo, S., Park, J., Lee, J. Y., Kweon, I. S. CBAM: Convolutional block attention module. arXiv. , (2018).
  43. Shi, X., et al. Convolutional LSTM network: A machine learning approach for precipitation nowcasting. arXiv. , (2015).
  44. Stuhr, N. L., et al. Rapid lipid quantification in Caenorhabditis elegans by Oil Red O and Nile Red staining. Bio Protoc. 12 (5), e4340(2022).
  45. Kuzmic, M., et al. In situ visualization of carbonylation and its co-localization with proteins, lipids, DNA and RNA in Caenorhabditis elegans. Free Radic Biol Med. 101, 465-474 (2016).
  46. Fang, E. F., et al. In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. elegans, and mice. J Vis Exp. (129), e56301(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie C elegansmikroskopia fluorescencyjnaautomatyczna segmentacjasegmentacja g bokim uczeniemsegmentacja instancji nicienisie neuronowa U Netanaliza w programie ImageJsplotowy LSTMnak adaj ce si nicienieanaliza obraz w w chmurze
Automatyczna analiza obrazów fluorescencyjnych C. elegans z użyciem SegElegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.