Test tkań zwierzęcych wykorzystuje detekcję scyntylacji jądrowej do określenia aktywności enzymatycznej syntazy glikogenu poprzez pomiar włączenia radioaktywnie znakowanej glukozy do glikogenu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena radiochemiczna aktywności enzymu syntazy glikogenowej w tkankach zwierzęcych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Glikogen jest ważnym metabolitem dla wielu komórek eukariotycznych, integralnym dla magazynowania energii i szybkiego uwalniania energii. Budowa cząsteczki zależy od syntazy glikogenu, silnie regulowanego enzymu, którego główną funkcją jest ułatwianie sekwencyjnego przywiązywania jednostek glukozy w rosnącym polimerze glikogenu. Enzym ten jest aktywowany allosterycznie przez glukozę-6-fosforan i hamowany w wielu miejscach przez fosforylację. Znajomość aktywności enzymatycznej syntazy glikogenowej jest kluczowym elementem zrozumienia metabolizmu glikogenu, poziomu energii mięśni oraz zaburzeń metabolicznych, takich jak cukrzyca i choroby związane z magazynowaniem glikogenu. Opisano tutaj wysoce czułą i skuteczną metodę określania aktywności syntazy glikogenowej w tkance mięśniowej zwierząt poprzez pomiar ilości zintegrowanej glukozy z radioznakowanej [14C]-UDP-glukozy do cząsteczek glikogenu. Procedura ta wykorzystuje radioaktywne 14C i będzie wymagać odpowiedniej autoryzacji oraz przestrzeni laboratoryjnej do użycia i utylizacji. Procedura ta wymaga również dostępu do licznika scyntylacji ciekłej.
Wprowadzenie
Glikogen, silnie rozgałęziony polisacharyd złożony z jednostek glukozy, stanowi ważny rezerw energii w różnych tkankach, w tym mięśniach, wątrobie i mózgu1. Jego synteza i rozkład są organizowane przez złożony system wyspecjalizowanych enzymów i białek regulacyjnych. Kluczowy dla jego biosyntezy jest enzym syntaza glikogenu (GYS), którego występują dwie izoformy (GYS1 i GYS2). GYS1 to enzym regulacyjny bezpośrednio odpowiedzialny za produkcję glikogenu z glukozy w komórkach niewątrobowych, natomiast GYS2 działa w wątrobie. Proces ten, znany jako glikogeneza, polega na kolejnym dodawaniu pojedynczej jednostki glukozy do rosnącego łańcucha glikogenu. GYS katalizuje transfer glukozy z pośredniej glukozy difosforanowej urydyny (UDP-glukoza) na koniec łańcucha glikogenowego, tworząc sprzężenie alfa-1,4-glikozydowe2. W koordynacji z enzymem rozgałęziającym glikogen, ta reakcja rozszerza cząsteczki glikogenu, zapewniając zarówno efektywne magazynowanie, jak i uwalnianie energii.
Istnieją techniki testowe do pomiaru aktywności enzymu, a jedną z częstszych grup są metody spektrofotometryczne 3,4. Testy te zazwyczaj opierają się na systemie pośrednich sprzężonych reakcji i mierzą absorpcję produktu końcowego, NADH, na 340 nm. Na każdą jednostkę UDP uwolnioną od UDP-glukozy przez syntazę glikogenową spożywa się jedną jednostkę NADH, co powoduje mierzalne wzbudzanie bezpośrednio powiązane z aktywnością syntazy glikogenowej 5,6. Chociaż testy spektrofotometryczne są stosunkowo tanie i dostępne, mają drobne wady polegania na reakcji pośredniej oraz poważne wady interferencji spowodowanej mętnością próbki i niższą czułością, co jest szczególnie problemem dla mniejszych próbek lub próbek z małą lub silną fosforylowaną syntazą glikogenową. Opracowano testy fluorometryczne, wykorzystujące opisane powyżej reakcje sprzężone, aby poprawić wrażliwość tkanki mięśniowej u człowieka7 i myszy8. Istnieją inne techniki ilościowej syntazy glikogenowej, takie jak immunoblotting9 oraz immunohistochemia10; Jednak techniki te są w stanie jedynie ilościowo określić fizyczną ilość enzymu i w najlepszym wypadku mogą wywnioskować aktywność z fosforylacji, ale nie bezpośrednio określić aktywności enzymu11.
Wśród tych technik testowania enzymów, metody radiochemiczne pozostają najczęściej stosowane do określania aktywności syntazy glikogenowej w tkankach ssaków ze względu na brak interferencji spowodowaną mętnością próbki oraz wysoką czułość 8,9. Testy te zawierają radioznakowaną glukozę z UDP-glukozy oznaczanej 14°C lub 3H 13 do glikogenu, co pozwala na bezpośrednie pomiary aktywności enzymu w określonym czasie. W następnym zabiegu próbka tkanki zawierająca syntazę glikogenu jest wystawiona na działanie UDP-glukozy oraz glikogenowego primeru. Syntaza glikogenu katalizuje reakcję przedstawioną w poniższym równaniu:
UDP-[14C]glukoza + (glikogen)n → (glikogen)n+1[14C] + UDP
Po określonym czasie reakcja zostaje przerwana, a glikogen zawierający glukozę znakowaną radiowo jest wytrącany na papierzefiltracyjnym 12 (jak opisano poniżej) lub poddawany filtracji żelowej, jak opisali Niederwanger i in.14 , mierzonej za pomocą detektora scyntylacyjnego. Metoda ta obejmuje również osobną, identyczną reakcję, która obejmuje glukozę-6-fosforan (G6P), allosteryczny aktywator syntazy glikogenowej. W warunkach wystarczających poziomów G6P aktywność syntazy glikogenowej jest maksymalnie aktywowana, co pokazuje absolutny potencjał aktywności syntazy glikogenowej w danej próbce. Opisana tutaj metoda została zmodyfikowana z Suzuki i współpracowników15 na format 96-dołków i jest zoptymalizowana do stosowania w tkance mięśniowej myszy; Jednak protokół ten może być zmieniony dla innych tkanek i gatunków zwierząt.
Pomimo inherentnych kosztów i kwestii bezpieczeństwa związanych z materiałami radioaktywnymi, testy radiochemiczne oferują znaczące przewagi nad alternatywami nieradioaktywnymi, pod warunkiem że dostępne są instrumenty. Poniższy zabieg opisuje wysoce czuły i solidny sposób określania aktywności syntazy glikogenu, kluczowego enzymu w metabolizmie glikogenu, w tkance mięśniowej zwierząt.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Ball State. Kohorty męskie i żeńskie B6; W tym manuskrypcie jako reprezentatywny przykład użyto myszy typu dzikiego 129-Gaatm1Rabn/J, w wieku 3 miesięcy. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie przed testem
- Pobieraj tkankę przez zwichnięcie szyjkimacicy 16 i natychmiast zamrażaj w płynnym N2, aby zachować zapasy glikogenu i przechowywać w płynnym N2 lub zamrażarce o ultraniskim poziomie do rozpoczęcia badania.
- Przygotuj roztwory bulwarowe przed rozpoczęciem testu syntazy glikogenowej (Tabela 1).
- Określ liczbę próbek myszy i wymagane kontrole dla testu. Każda próbka myszy wymaga czterech replikacji, po dwa dla każdej reakcji (obecności lub braku G6P) (patrz Rysunek 1 i Tabela 2).
- Pociąć papier chromatograficzny na paski o średnicy 4 cm. Glikogen przyczepia się do tego papieru i pozostaje związany podczas procesu mycia. Wykorzystując szerokość (6 mm) niszczarki do papieru, rozdrabniacz papier chromatograficzny na cienkie segmenty.
- Używając ołówka, oznacz oznaczone paski papieru z identyfikatorem myszy, pustymi punktami i sumami. Unikaj używania tuszu.
- Załaduj papiery chromatograficzne do szablonu drewnianego bloku. Każdy szablon mieści do 12 papierów, odpowiadających jednemu rzędowi płyty z 96 dołkami.
- Zdobądź zaciski do papieru chromatograficznego (podkładki do clipboardów).
- Przygotuj jeden zacisk do każdego rzędu reakcji, zaciskając krawędzie papierów chromatograficznych, pozostawiając powierzchnię większości papierów odsłoniętą. Upewnij się, że krawędzie oznaczone są widoczne.
- Oznacz 1,7 mL mikrofuge-probówki z identyfikacją próbki. Dwie probówki na próbkę; jeden dla homogenaty, drugi dla supernatantu.
- Przed rozpoczęciem testu przygotuj zarówno mieszaniny reakcji +, jak i G6P, zobacz Tabelę 3 dla więcej informacji. Przygotuj 2 400 μL aliquotów każdej mieszaniny reakcji.
2. Reakcja aktywności syntazy glikogenowej z radiochemią
UWAGA: Ten etap obejmuje użycie [14C]-UDP-glukozy, która jest materiałem radioaktywnym. Obchodzić się, przechowywać i utylizować w sposób zatwierdzony przez Komisję Regulacji Jądrowej (NRC).
- Dodaj 30 μL [14C]-UDP-glukozy (0,1 μCi/μL) do 2 400 μL aliquotów obu (+/- G6P) mieszanin reakcji, aby uzyskać końcowe stężenie 0,0012 μCi/μL. Ten przepis nadaje się do 18 próbek.
UWAGA: Objętość [14C]-UDP-glukozy można zmieniać, aby oszczędzać zużycie i zapewnić odpowiednią czułość. Na przykład użyj 50 μL dla tkanki mózgowej myszy i 25 μL dla serca myszy. - Mieszaniny reakcji wirowych i aliquot 50 μL do każdej studni płyty 96-dołkowej, która pomieści próbki, puste i sumy (Tabela 2). Następnie przykryj folią płytową i umieść w temperaturze 4°C.
- Ustaw inhibitory proteazy do rozmrażania w temperaturze pokojowej. Inhibitory te są szczegółowo opisane w Tabeli 4 wraz z dodatkowymi informacjami.
- Usuń 30-50 mg zamrożonej tkanki. ~30 mg jest optymalne dla próbek mięśni szkieletowych i serca; ~50 mg na mózg. Trzymaj tkanki i mikrofugujące rurki w płynnym N2 i szybko waż tkankę, aby upewnić się, że pozostanie zamrożona. Użyj ostygniętego tłuczka, aby dalej zmielić tkankę.
- Przygotuj bufor homogenizacyjny z inhibitorami proteazy na lodzie.
- Próbka po raz przenosi probówkę z tkanką z płynnego N2 do lodu z zimną kapsułką na 1 minutę. Dodaj zimną pokrywkę (pokrywkę w probówce z trzema małymi otworami schłodzonymi w cieczy N2) do probówki, gdy jest jeszcze w ciekłym N2. Zapobiega to utracie tkanek podczas parowania pozostałego N2 w rurce. Po wyjściu z ciekłego N2 próbki powinny pozostać w lodzie.
- Po umieszczeniu na lodzie dodaj objętość (10-30 μL/mg tkanki) buforu homogenizacyjnego do próbki i ujednolic ją za pomocą Tissue-Tearor. Po ukończeniu tych dwóch kroków przejdź do kolejnej próbki.
UWAGA: Objętość buforu dodawanego do próbek może być optymalizowana w zależności od źródła tkanki. Na przykład: 30 μL/mg dla mięśni szkieletowych, 15 μL/mg dla serca i 10 μL/mg dla mózgu. - Próbki w wirówce przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 3 600 g i przelewaj supernatant do czystej probówki mikrofuge. Uważaj, żeby nie dotykać granulki. Wiruj i dodaj ~150 μL do odpowiadających odwiertów w płytce z 96 dołkami w kształcie V na lodzie. Resztę zachowaj na nadnadanek do testu Bradforda (patrz krok 2.15)
UWAGA: W razie potrzeby dodatkowe alikwoty próbek mogą być zachowane na późniejsze testy, takie jak immunoblotowanie.
UWAGA: Kroki 2.9 do 2.14 wymagają obsługi 14C. Utylizacja wszystkich zanieczyszczonych materiałów w sposób zatwierdzony przez NRC. - Usuń płytę mieszanki reakcyjnej z 4 °C i podgrzej do 30 °C na termocyklerze z usuniętą warstwą. W tym czasie należy pobrać 1 L etanolu o temperaturze -20 °C 66% i dodać do zlewki z prętem mieszającym na płycie mieszanej.
- Inicjuj reakcję, dodając 25 μL supernatantu próbki do studni reakcyjnych oraz 25 μL buforu homogenizacyjnego do pustych i całkowitych otworów. Użyj pipety wielokanałowej, aby dodawać do jednego rzędu na płycie reakcyjnej naraz, czekając co najmniej 1 minutę między wierszami. Zanotuj czas inicjacji reakcji dla każdego wiersza. Zobacz Tabelę 2 po więcej informacji. Użyj pipety wielokanałowej i upewnij się, że dodane są równe ilości płynu.
- Daj 10-15 minut na reakcję; jednak czas wykonania powinien być identyczny między wierszami.
- Aspiruj 55 μL z każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej i nałóż na wcześniej przygotowane wcześniej papiery chromatograficzne. Wymieszaj reakcję, pipetując pipetami w górę i w dół przed aspiracją. Umieść ciecz na środku papierów chromatograficznych.
- Po wyjściu z odkrycia płynu z odkrycia z odkrycia wyjmów z zacisku usuwaj papiery z sumami sumami. Można je bezpiecznie rozłożyć na folii aluminiowej, aby wyschły. Wszystkie pozostałe papiery chromatograficzne wrzuć do mieszanej kąpieli z 66% etanolu. Glikogen jest nierozpuszczalny w 66% etanolu, natomiast [14C]-UDP-glukoza jest rozpuszczalna i zmywa papiery chromatograficzne.
- Powtórz kroki 2.11 i 2.12 dla każdego wiersza na płycie reakcyjnej. Upewnij się, że czas reakcji każdego rzędu jest taki sam, rejestrując godziny rozpoczęcia i zakończenia reakcji.
- Gdy wszystkie rzędy zostaną dodane do mieszanego etanolu 66%, myj przez 15 minut.
UWAGA: W trakcie tego etapu oraz kolejnych etapów płukania mogą być przygotowane aliquoty próbek do testów komplementarnych, takich jak test Bradforda, odpowiedzialny za określenie całkowitej objętości białka do normalizacji, co jest niezbędne do obliczenia aktywności enzymatycznej. - Pozbądź się 66% etanolu bez utraty papierów chromatograficznych. Myj 1 L nowego etanolu 66% przez 30 minut. Te 66% etanolu mogą być w temperaturze pokojowej.
- Powtórz poprzedni krok, aby uzyskać łącznie trzy 30-minutowe płukania po 66% etanolu.
UWAGA: W razie potrzeby można zachować 66% etanolu z ostatniego etapu mycia i przechowywać w temperaturze -20 °C do kolejnych testów. - Po usunięciu 66% etanolu zanurz wszystkie papiery chromatograficzne w zlewce do płukania w acetonie. Aceton ułatwia proces schnięcia.
- Wyjmij papiery chromatograficzne z acetonu i połóż je na folii aluminiowej. Zachowaj lub wyrzuć aceton.
- Papiery chromatografii suchej pod lampą grzewczą przez 15 minut.
UWAGA: Suche papiery mogą być przechowywane na czas nieokreślony. Dokumenty mogą być bezpiecznie przechowywane do czasu przystąpienia do wykrywania scyntylacji.
3. Pomiar aktywności za pomocą detekcji scyntylacyjnej
- Za pomocą kleszczy przenosi się papiery chromatograficzne do fiolek scyntylacyjnych przechowywanych w stojakach scyntylacyjnych. Zapisz, jak orientowane są przykładowe prace.
- Dodaj 5 ml płynu scyntylacyjnego do każdej fiolki za pomocą pompki pokrywkowej. Do każdej fiolki przykręcaj kapsułki.
- Załaduj próbki do detektora scyntylacyjnego i załaduj stojak zatrzymań za próbkami. Upewnij się, że wybrano program monitorowania 14C. Rozpocznij wykrywanie, wybierając Automatyczne liczenie.
- Wyniki druku
- Utylizować rurki i zawartość scyntylacyjne w sposób zatwierdzony przez NRC.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zgodnie z protokołem, wydruk utworzony z detektora scyntylacyjnego będzie zawierał zmierzoną ilość promieniowania jonizującego emitowanego z każdego papieru chromatycznego zawierającego fiolkę, bezpośrednio powiązaną z poziomem aktywności syntazy glikogenowej. Detektor scyntylacyjny oblicza liczbę promieniowania na minutę (CPM) dla każdej próbki, pustej i całkowitej w określonym czasie. Najpierw przelicz CPM na DPM (dezintegracje na minutę), co opiera się na efektywności użytego licznika scyntylacji (DPM = CPM/efektywnoś...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pomiar aktywności enzymu syntazy glikogenowej jest cennym narzędziem do monitorowania metabolizmu glikogenu w różnych stanach metabolicznych i chorobowych. Pomiar w przypadku braku i obecności glukozy-6-fosforanu (G6P) daje wgląd w status regulacyjny enzymu oraz pośredni wskaźnik stanu fosforylacji. [Inkorporacja glukozy U-14C]-UDP to wydajna i dobrze udokumentowana technika pomiaru aktywności enzymatycznej syntazy glikogenu, oferująca wysoką czułość, specyficzność podłoża oraz zdolność adaptacji do małych pró...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Finansowanie częściowo zapewniły Ball State University, Indiana University School of Medicine-Muncie oraz Aro Biotherapeutics.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| [14C] Urydyna 5-difosfo-glukoza | Amerykańskie radioznakowane chemikalia | ARC 0154 | |
| 31 Papier chromatografii ETCHR | Co, człowieku | 3031 915 | |
| Hydrat chlorowodorku benzzamidyny | Sigma | B6506 | |
| Merkaptoetanol beta-beta | Sigma | M3148 | |
| Kąpiel sucha | Torey Pines Scientific | SC25 | |
| Etanol (200 proof) | PharmcoAaper | 111000200 | |
| Kwas etylenglikolowy tetraoctowy (EGTA) | Sigma | E4378 | |
| Kwas etylendiaminetetraoctowy (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Sól sodowa glukoza-6-fosforan | Sigma | G7879 | |
| Glikogen z wątroby królików (typ III) | Sigma | G8876 | |
| Mikropłytka, płaskie dno, 96 dołków | Greiner | 655101 | |
| Mikropłytka, PCR, 96 dołków | DOT Scientific | 951-PCR | |
| Wielozadaniowy licznik scyntylacji | Beckman Coulter | LS 6500 | |
| Dihydrat fluorku potasu | Sigma | 221872 | |
| Koktajl inhibitorów proteazy | GoldBio | GB-108-2 | |
| Koktajl scyntylacyjny | Reasearch Products International | 111195 | |
| Fiolki scyntylacyjne | Reasearch Products International | 125509 | |
| Fluorek sodu | Sigma | S7920 | |
| Tearor tkanki | Produkty Biospec | Model 398 | |
| Tosyllysyna chlorometyloketon (TLCK) | Sigma | T7254 | |
| Baza Trizmy (99,9%) | Sigma | T1503 | |
| Trizma chlorowodorek | Sigma | T3253 | |
| Urydyna 5-difospo-glukoza | Sigma | U-4625 |
Bibliografia
- Preiss, J., Walsh, D. A. Biology of Carbohydrates. Ginsburg, V., Robbins, P. 1, John Wiley. 199-314 (1981).
- Pederson, B. A. Enzymology of Complex Alpha-Glucans. , CRC Press. 84-137 (2021).
- Wayllace, N. Z., et al. An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases. Mol Biol Rep. 39 (1), 585-591 (2012).
- Wilson, W. A. Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism. J Vis Exp. (174), e63046(2021).
- Danforth, W. H. Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis. J Biol Chem. 240, 588-593 (1965).
- Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose. Arch Biochem Biophys. 81 (2), 508-520 (1959).
- Schalin-Jantti, C., Harkonen, M., Groop, L. C. Impaired activation of glycogen synthase in people at increased risk for developing NIDDM. Diabetes. 41 (5), 598-604 (1992).
- Huang, X., Hansson, M., Laurila, E., Ahren, B., Groop, L. Fat feeding impairs glycogen synthase activity in mice without effects on its gene expression. Metabolism. 52 (5), 535-539 (2003).
- Holt, B. D., et al. A novel CD71 Centyrin: Gys1 siRNA conjugate reduces glycogen synthesis and glycogen levels in a mouse model of Pompe disease. Mol Ther. 33 (1), 235-248 (2025).
- Prats, C., et al. Phosphorylation-dependent translocation of glycogen synthase to a novel structure during glycogen resynthesis. J Biol Chem. 280 (24), 23165-23172 (2005).
- Perezleon, J. A., Osorio-Paz, I., Francois, L., Salceda, R. Immunohistochemical localization of glycogen synthase and GSK3beta: Control of glycogen content in retina. Neurochem Res. 38 (5), 1063-1069 (2013).
- Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. A rapid filter paper assay for UDP-glucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose. Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).
- Parker, G. J., Lund, K. C., Taylor, R. P., McClain, D. A. Insulin resistance of glycogen synthase mediated by O-linked N-acetylglucosamine. J Biol Chem. 278 (12), 10022-10027 (2003).
- Niederwanger, A., Kranebitter, M., Ritsch, A., Patsch, J. R., Pedrini, M. T. A gel filtration assay to determine glycogen synthase activity. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 820 (1), 143-145 (2005).
- Suzuki, Y., et al. Insulin control of glycogen metabolism in knockout mice lacking the muscle-specific protein phosphatase PP1G/RGL. Mol Cell Biol. 21 (8), 2683-2694 (2001).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Quick and humane sacrifice of a mouse by cervical dislocation. CSH Protoc. 2006 (1), prot4357(2006).
- Gomes, F. R., et al. Glycogen storage and muscle glucose transporters (GLUT-4) of mice selectively bred for high voluntary wheel running. J Exp Biol. 212 (Pt 2), 238-248 (2009).
- Greenberg, C. C., Jurczak, M. J., Danos, A. M., Brady, M. J. Glycogen branches out: new perspectives on the role of glycogen metabolism in the integration of metabolic pathways. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291 (1), E1-E8 (2006).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases. Anal Biochem. 47 (1), 20-27 (1972).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
