Artykuł metodologiczny

Model ćwiczeniowy amputacji kończyny dolnej szczura poniżej kolana i natychmiastowa ingerencja mięśniowa

DOI:

10.3791/69119

⸱

22 maja 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic Surgery, Medical College of Wisconsin

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół pokazuje, jak wykonać amputację poniżej kolana u szczurów i natychmiast przeprowadzić ukierunkowaną reinnerwację mięśni (iTMR), aby zbadać strategie leczenia i zapobiegania bólowi związanemu z amputacją oraz lepiej zrozumieć mechanizmy bólu związane z amputacją.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ból związany z amputacją obniża jakość życia pacjentów, przyczynia się do używania opioidów i może zmniejszyć rehabilitację funkcjonalną i używanie protez. Modele przedkliniczne, które niezawodnie wywołują ból pooperacyjny po amputacji, zachowując jednocześnie ruchliwość, są niezbędne do badania mechanizmów biologicznych leżących u podstaw tych wyników. Przedstawiamy szczegółowy, możliwy do powtórzenia protokół chirurgiczny u gryzoni z wykorzystaniem szczurów Sprague-Dawley do modelowania amputacji kończyny dolnej poniżej kolana. Procedura polega na izolowaniu i przecięciu gałęzi nerwu udowego, w tym nerwu piszczelowego, wspólnego nerwu małego okrążającego i nerwu podkolanowego, co powoduje trwałe patologie nerwowe po amputacji i zachowania związane z bólem. Szczury dobrze regenerują się po tej procedurze i mogą natychmiast poruszać się po operacji bez żadnych trudności z jedzeniem lub piciem. Zwierzęta mogą następnie być oceniane za pomocą odruchowych i spontanicznych miar bólu. Zachowania związane z bólem, wynikające z tej procedury, są trwałe w czasie, a standardowe odruchowe zachowania związane z bólem można uzyskać z kończyny. Co ważne, zachowana ruchliwość umożliwia przeprowadzanie testów behawioralnych w czasie bez wpływu upośledzenia motorycznego. Chociaż ten protokół koncentruje się na amputacji, można go łatwo dostosować, aby włączyć ukierunkowaną reinnerwację mięśni (TMR) jako interwencję pooperacyjną poprzez połączenie przeciętych nerwów z pobliskimi gałęziami nerwowymi mięśnia dwugłowego uda i mięśnia półbłoniastego, co umożliwia badanie interwencji reinnerwacyjnych i ich wpływu na ból pooperacyjny. Wcześniej z powodzeniem wykorzystaliśmy ten model do oceny różnic płci w zachowaniach związanych z bólem po amputacji oraz do badania wpływu TMR. Ten protokół zapewnia solidną i elastyczną platformę do badania bólu związanego z amputacją, tworzenia neurom i wyników funkcjonalnych, z zastosowaniem do badań translacyjnych mających na celu poprawę bólu pooperacyjnego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ból przewlekły jest jednym z najbardziej uniemożliwiających życie komplikacji po amputacjach kończyn, dotyczących do 70% pacjentów1,2,3. Konwencjonalne strategie zarządzania bólem, takie jak interwencje farmakologiczne, fizjoterapia, blokady nerwowe i terapie psychologiczne, często zapewniają ograniczoną lub przejściową ulgę4. Dlatego nadal istnieje znaczne kliniczne zapotrzebowanie na skuteczne strategie długoterminowego zarządzania bólem.

Celowa reinnerwacja mięśni (TMR), początkowo opracowana w celu poprawy kontroli protez miyoelektrycznych, stała się obiecującym podejściem do łagodzenia bólu po amputacjach kończyn5. Technika chirurgiczna polega na przekierowywaniu przeciętych mieszanych nerwów ruchowo-czuciowych do pobliskich gałęzi ruchowych. Klinicznie TMR wykazało znaczne zmniejszenie bólu ciała pozornego, bólu resztkowego członu i objawów związanych z neuromą6,7,8. Regeneracyjne obwodowe interfejsy nerwowe (RPNI) to kolejne chirurgiczne zabiegi stosowane w bólu związanym z uszkodzeniem nerwu i amputacjami9. Wycięte końce nerwów są wszyte i następnie owinięte wolnym (denerwowanym, bezkrwiennym) przeszczepem mięśniowym9. Wycięte aksony innerwują denerwowane złącza nerwowo-mięśniowe, aby stworzyć skurcz mięśni w przeszczepie, który może być wykorzystany do stworzenia sygnału do kontroli mioproztez. W przeciwieństwie do TMR, RPNI było szeroko badane w modelu na gryzoniach. Podobnie jak TMR, RPNI wykazano, że zapobiega tworzeniu się neurom i zmniejsza ból związany z uszkodzeniem przecięcia nerwów10,11. Klinicznie wykazano, że RPNI zmniejsza zarówno ból ciała pozornego, jak i ból resztkowy kończyny u amputowanych12.

Mimo stosowania klinicznego, biologiczne mechanizmy leżące u podstaw działania przeciwbólowego TMR i RPNI pozostają słabo poznane. Modele przedkliniczne są niezwykle ważne dla wyjaśnienia tych mechanizmów. Poprzednie prace wykorzystywały modele przecięcia nerwów z modyfikacją w celu bezpośredniego testowania bólu neuromowego10,11. Modele te mogą sprecyzować ból neuromatowy poprzez bezpośrednie stymulację i ból neuropatyczny poprzez ocenę zachowań odruchów rdzeniowych w całym zasięgu zachowanego nerwu pozostającego w stopie. Na przykład uszkodzenie szczęki utrzymuje nerw stępkowy, a nerwy piszczelowy i stępkowy wspólny są przecięte. Testowanie zachowań bólowych przeprowadza się na bocznej części stopy13. Model amputacja tylnej kończyny reprezentuje najcięższą możliwą kontuzję kończyny. Jako taki, występuje rozległa utrata neuronów i znaczne zapotrzebowanie na stany zapalne i gojenie związane z obrażeniem tego rodzaju. Gdy występuje uszkodzenie nerwu, zdrowe neurony w DRG pomagają utrzymać uszkodzone neurony. W przypadku amputacji, populacja dostępnych zdrowych neuronów jest znacznie zmniejszona, a dla każdego uszkodzonego nerwu występuje większa utrata neuronów niż gdyby tylko jeden nerw był uszkodzony14,15,16. Wcześniejsze raporty na temat operacji przetrwania po amputacjach tylnych kończyn u gryzoni są rzadkie17,18. Jednakże, istnieją zalety w porównaniu z amputacjami górnych kończyn, takie jak obfitość danych historycznych badających ból i regenerację związaną z nerwem kulszowy, a także wiele testów behawioralnych ambulatoryjnych19,20.

Aby wypełnić tę lukę, niedawno opracowałeśmy model amputacja tylnej kończyny u szczurów z natychmiastową TMR (Rysunek 1). Technika stworzenia RPNI została wcześniej opublikowana i może być dostosowana do modelu amputacja tylnej kończyny21. Ten model w bliski sposób odbija procedury kliniczne, pozwalając nam na ocenę różnych zachowań bólowych, tworzenia się neurom i zachowania neuronów (Rysunek 2)22. Nasze badania wykazały znaczące korzyści przeciwbólowe TMR w porównaniu ze standardową amputacją, zapobieganie tworzeniu się neurom i wykazano seksualnie dymorficzne odpowiedzi w wrażliwości na zimno22,23.

Prezentowany tu protokół zapewnia szczegółowe, standaryzowane wizualne przedstawienie techniki chirurgicznej, zapewniające reproduktywalność i spójność w podejściach eksperymentalnych. Wyraźne przedstawienie kluczowych kroków, w tym izolację nerwu, precyzyjne przecięcie i bez naprężenia koaptację nerwu, protokół ten oferuje badaczom solidną ramę do badania mechanizmów leżących u podstaw działania przeciwbólowego TMR i zapobiegania tworzeniu się

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt muszą zostać zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Instytucjonalnymi (IACUC) i mieć zgodę z Przewodnikiem Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

UWAGA: Użyto samców i samic szczurów Sprague-Dawley (Charles River Laboratories), w wieku 8–10 tygodni i ważących 250–300 g.

  1. Włączyć podgrzewaną poduszeczkę i przygotować sterylne pole operacyjne. Umieścić sterylną poduszeczkę prostopadle do ciała szczura, aby zapewnić optymalne ułożenie.
  2. Ułóż wszystkie narzędzia chirurgiczne i materiały: sterylny roztwór słony (0,9% chlorku sodu), sterylny roztwór antyseptyczny powidenu jodowego, meloksikam, żarnik, 10-0 mikroszwy, 4-0 ściągalne szwę warstwiasto-splotową, linijkę i klej do skóry.
    ​UWAGA: Wszystkie instrumenty chirurgiczne powinny być sterylizowane metodą autoklawu lub sterylizacją gorącym ziarnem.
  3. Wprowadzić znieczulenie, umieszczając szczura w komorze indukcyjnej z 4% izofluanem, tlenem w ilości 10 L/min i powietrzem w 60%. Po 4 min lub gdy szczur staje się niereaktywny, przełączyć się na maskę i dostosować izofluanum do 1,5–2,0%, w zależności od wielkości szczura.
  4. Ogolić miejsce operacji od dolnej części grzbietu przez cały tylny kończyn. Wykonać potrójne przygotowanie z przemianowywaniem się roztworu antyseptycznego powidenu jodowego i alkoholowych wacików, kończąc na alkoholu.
  5. Podać 1 mg/kg meloksikamus podskórnie za pomocą strzykawy tuberkulinowej (zwykle 0,2 ml dla 200 g szczura).
    UWAGA: Przez cały czas trwania zabiegu zwierzę jest monitorowane pod kątem reakcji na szczypięcie palców i ogona oraz częstości oddechów. W razie potrzeby dostosowuje się szybkość przepływu izofluanu lub zabieg jest wstrzymany, aby wmieszać się.

2. Amputacji poniżej kolana (Rysunek 1)

  1. Użyć linijki do zaznaczenia linii stawu kolanowego i wykonania dwóch dodatkowych znaków 2 cm i 3 cm poniżej kolana.
  2. Wykonać okrągłą incję skóry 3 cm poniżej kolana za pomocą skalpela.
  3. Użyć tępej i ostrej dysekcji, aby oddzielić skórę okrężnie od tkanki mięśniowej, aż się swobodnie cofnie.
  4. Powtórzyć ten proces podminowania z podlegającymi mięśniami, starannie dysekując aż do kości, zachowując płaszczyzny tkanek. Zaznaczyć kości piszczelową/strzałkową 1 cm powyżej okrężnego nacięcia za pomocą sterylnego żarnika lub znacznika.
  5. Użyć małych nożyczek kości do przecięcia kości piszczelowej i strzałkowej w zaznaczonym miejscu. Użyć żarnika, aby osiągnąć hemostazę. Sprawdzić krawędź kości pod kątem ostrych krawędzi i zaokrąglić lub przyciąć w razie potrzeby.
  6. Używając 4-0 ściągalnej szwę warstwiasto-splotową, zamknąć przednie i tylne przedziały mięśniowe razem nad kością, aby stworzyć poduszeczkę mięśniową. Zacząć od przedniej krawędzi nad kością piszczelową, która jest głównym punktem nacisku. Zazwyczaj stosuje się 4–6 przerywanych szwów.
  7. Zamknij skórę bocznie za pomocą przerywanych 4-0 ściągalnych szwów warstwiasto-splotowych, unikając umieszczania bezpośrednio na kończynie nośnej. Nałożyć klej skórny wzdłuż linii nacięcia.

3. Operacja interwencji TMR (Rysunek 1)

  1. Wykonać 1,5–2 cm podłużne nacięcie rozdzielające pośladki około 5 mm poniżej ud.
  2. Użyć tępej dysekcji, aby oddzielić mięśnie pośladkowe i ścięgna udawe, eksponując nerw kulszowy tuż powyżej jego rozgałęzienia na nerw piszczelowy, wspólny nerw małodziążkowy (CP) i nerw strzałkowy.
  3. Zidentyfikować proksymalne gałęzie motoryczne: jedna duża gałąź przebiega pod mięśniem pośladkowym udawy (CFM), dając początek gałęzi CFM, mięśniowi półbłoniastemu (SM) i dwugłowemu uda (BF).
  4. Podnieść CFM wacikiem z wacikiem i podzielić go. Neurolizuj gałęzie SM i BF starannie za pomocą tępej dysekcji pod mikroskopem chirurgicznym za pomocą drobnych kleszczyków Dumonta.
    1. Użyć kleszczyków do chwycenia epineurium i, za pomocą drobnych zakrzywionych sprężynowych nożyczek, otworzyć epineurium i podzielić je wzdłużnie oraz oddzielić różne gałęzie od siebie.
    2. Zachować gałąź CFM i podzielić pozostałe w pobliżu pnia kulszowego. Zakrzywić gałęzie motoryczne ku dołowi, aby ułatwić koaptację.
  5. Neurolizuj rozgałęzienie kulszowe, otwierając epineurium i dzieląc je za pomocą drobnych zakrzywionych sprężynowych nożyczek. Delikatnie rozd

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten model amputacji kończyny tylnej niezawodnie wywoływał zachowania związane z bólem neuropatycznym, zachowując zdolność do poruszania się i eksploracji u szczurów. Jak pokazano na Rysunku 2, przecięcie nerwu obwodowego podczas amputacji bez dystalnego celu prowadzi do zdezorganizowanego wzrostu aksonów i formowania się neuromu w miejscu ściągnięcia, uwidocznionego przez barwienie immunologiczne na B-tubulinę i peptyd związany z genem kalcytoniny (CGRP). W przeciwieństwie do tego, amputowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje kluczowe kroki chirurgiczne, które zapewniają odtwarzalność modelu amputacji kończyny dolnej i wykazuje zachowanie zdolności do poruszania się i zaangażowania behawioralnego w badaniach po amputacji. Kluczowe zasady chirurgiczne, w tym staranna identyfikacja anatomiczna, minimalne manipulowanie nerwami i bez napięcia prowadzenie przeciętych nerwów, są podkreślane, aby zapewnić spójność i odtwarzalność wśród chirurgów. Te techniczne zagadnienia są kluczowe dla niezawodnego wywołania patolo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało wspierane przez Medical College of Wisconsin Neuroscience Research Center, Fundację Ritę Allen oraz Fundację Chirurgii Plastycznej. Autorzy dziękują Jednostce Medycyny Porównawczej za opiekę i wsparcie w zakresie opieki nad zwierzętami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10-0 nylon microsuture (Arosurgical)AROSurgicalT04A10N07-13Fine nerve coaptation suture. 10-0 micro suture. 
4-0 polyglycolic acid sutureEthiconAQ1268Closure suture for muscle and skin. Absorbable 4-0 suture. 
5-0 silk surgical sutureGenericGenericNerve ligation suture
Adult Sprague-Dawley ratsCharles River LaboratoriesGenericEksperymentalne zwierzę
Alcohol prep padsDukal CorporationGenericSkóra antyseptyk
Betadine 10%Avrio Health LPGenericAntiseptyk
Bone scissorsFST16030Instrument do cięcia kości
Cautery deviceFST18010-00Urządzenie do hemostaty
Cotton tip applicator (ProAdvantage)ProAdvantageRef 76100Narzędzie do manipulacji tkankami
Curved microdissector scissorsFST15019-10Drążki do nerwobólu
Forceps (fine Dumont)FST11254-20Narzędzie do manipulacji nerwami
Forceps (suture tying Dumont)FST11063-07Narzędzie do manipulacji szwami
Gauze USP type VII (Cardinal Health)Cardinal HealthRef 2146Utrzymuje sterylne pole
Heating pad warmer (TC1000 temperature controller)GenericTC1000Urządzenie do kontroli temperatury
Induction chamber (Braintree Scientific)Braintree Scientific Inc.GenericDo indukcji znieczulenia
Isoflurane (Isospire)PhoenixGenericŚrodek znieczulający
Meloxicam (Ostilox)VetONE5 mg/mLŚrodek przeciwbólowy
RulerGenericGenericNarzędzie do pomiaru punktów anatomicznych
Sterile salineBaxter0.9 Sodium Lot Y425131Roztwór do irygacyjny
Surgical blade 15 FST10015-00Narzędzie do nacięcia skóry
Tuberculin syringeGenericGenericPodawanie leku
Vaporizer (Surgivet model 100)SurgivetModel 100 S/N W2211123Do utrzymania znieczulenia
Vetbond tissue adhesiveWorld Precision InstrumentsGenericKlej do skóry

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Balakhanlou, E., Webster, J., Borgia, M., Resnik, L. Frequency and severity of phantom limb pain in veterans with major upper limb amputation: results of a national survey. PM R. 13 (8), 827-835 (2021).
  2. Resnik, L., Ekerholm, S., Borgia, M., Clark, M. A national study of veterans with major upper limb amputation: survey methods, participants, and summary findings. PLoS One. 14 (3), e0213578(2019).
  3. Ephraim, P. L., Wegener, S. T., MacKenzie, E. J., Dillingham, T. R., Pezzin, L. E. Phantom pain, residual limb pain, and back pain in amputees: results of a national survey. Arch Phys Med Rehabil. 86 (10), 1910-1919 (2005).
  4. R, L., et al. Prosthesis satisfaction in a national sample of veterans with upper limb amputation. Prosthet Orthot Int. 44 (2), 81-91 (2020).
  5. Kuiken, T. A., et al. Targeted muscle reinnervation for real-time myoelectric control of multifunction artificial arms. JAMA. 301 (6), 619-628 (2009).
  6. Valerio, I. L., et al. Preemptive treatment of phantom and residual limb pain with targeted muscle reinnervation at the time of major limb amputation. J Am Coll Surg. 228 (3), 217-226 (2019).
  7. Chang, B., Mondshine, J., Attinger, C., Kleiber, G. Targeted muscle reinnervation improves pain and ambulation outcomes in highly comorbid amputees. Plast Reconstr Surg. 148 (2), 376-386 (2021).
  8. Dumanian, G. A., et al. Targeted muscle reinnervation treats neuroma and phantom pain in major limb amputees: a randomized clinical trial. Ann Surg. 270 (2), 238-246 (2019).
  9. Woo, S. L., et al. Regenerative peripheral nerve interfaces for the treatment of postamputation neuroma pain: a pilot study. Plast Reconstr Surg Glob Open. 4 (12), e1038(2016).
  10. Dehdashtian, A., et al. Sexually dimorphic pattern of pain mitigation following prophylactic regenerative peripheral nerve interface (RPNI) in a rat neuroma model. Neurosurgery. 93 (5), 1192-1201 (2023).
  11. Senger, J., et al. A direct comparison of targeted muscle reinnervation and regenerative peripheral nerve interfaces to prevent neuroma pain. Neurosurgery. 93 (5), 1180-1191 (2023).
  12. Kuniak, C. A., et al. Prophylactic regenerative peripheral nerve interfaces to prevent postamputation pain. Plast Reconstr Surg. 144 (3), 421e-430e (2019).
  13. Decosterd, I., Woolf, C. J. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain. 87 (2), 149-158 (2000).
  14. Hu, P., McLachlan, E. M. Selective reactions of cutaneous and muscle afferent neurons to peripheral nerve transection in rats. J Neurosci. 23 (33), 10559-10567 (2003).
  15. Welin, D., et al. Survival and regeneration of cutaneous and muscular afferent neurons after peripheral nerve injury in adult rats. Exp Brain Res. 186 (2), 315-323 (2008).
  16. Jivan, S., Novikova, L. N., Wiberg, M., Novikov, L. N. The effects of delayed nerve repair on neuronal survival and axonal regeneration after seventh cervical spinal nerve axotomy in adult rats. Exp Brain Res. 170 (2), 245-254 (2006).
  17. Garg, R., Uygur, S., Cwykiel, J., Siemionow, M. Development of targeted muscle reinnervation model in hind limb amputated rats. J Reconstr Microsurg. 34 (7), 509-513 (2018).
  18. Lago, N., Navarro, X. Evaluation of the long-term regenerative potential in an experimental nerve amputee model. J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 108-120 (2007).
  19. Hogan, Q. Animal pain models. Reg Anesth Pain Med. 27 (4), 385-401 (2002).
  20. Sadler, K. E., Mogil, J. S., Stucky, C. L. Innovations and advances in modelling and measuring pain in animals. Nat Rev Neurosci. 23 (2), 70-85 (2022).
  21. Svientek, S. R., Ursu, D. C., Cederna, P. S., Kemp, S. W. P. Fabrication of the composite regenerative peripheral nerve interface (C-RPNI) in the adult rat. J Vis Exp. (156), e60841(2020).
  22. Zepeda, J. L., Mraz, G., Roth, E., Weihrauch, D., Hoben, G. Rat hindlimb amputation model shows analgesia and sexually dimorphic cold hypersensitivity with immediate targeted muscle reinnervation. J Pain. 33, 105460(2025).
  23. Roth, E., et al. Targeted muscle reinnervation prevents and reverses rat pain behaviors after nerve transection. Pain. 164 (2), 316-324 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model amputacji u szczuraamputacja ko czyny tylnejb l po amputacjiprzeci cie nerwu kulszowegozachowania b lowetworzenie si neuromatuwyniki funkcjonalnechirurgiczny protok dla gryzonizachowanie mobilno ci
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły