Artykuł metodologiczny

In vitro Dyferencjacja komórek T CD8 w pamięci rezydentnej za pomocą systemu współhodowli komórek T nabłonkowych

DOI:

10.3791/69120

⸱

3 lutego 2026

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Brown University, 2Pathobiology Graduate Program, Brown University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby badać różnicowanie i funkcjonowanie komórek T CD8 in vitro, komórki T CD8 można wyizolować z myszy i długoterminowo współhodować z wcześniej zakażonymi nabłonkami nabłonka pochwy myszy. Tutaj opisujemy ten proces i oceniamy nabycie rezydentnych markerów komórek T pamięci podczas współhodowli.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Barierowe tkanki śluzowe odgrywają ważną rolę w różnicowaniu i funkcjonowaniu rezydujących komórek T. Wśród różnorodnych populacji komórek w tych tkankach, komórki nabłonkowe są kluczowymi czynnikami różnicowania limfocytów T. Jednak nasza wiedza na temat sygnałów pochodzących z nabłonka nabłonkowego, które kształtują biologię komórek T w środowiskach śluzowych, pozostaje ograniczona, głównie z powodu braku konkretnych narzędzi oraz złożoności dostępnych systemów modelowych. Tutaj opisujemy system współhodowli nabłonka pochwy myszy z komórkami T CD8, który modeluje dynamiczne interakcje między zakażonym nabłonkiem a specyficznymi dla wirusa komórkami T CD8. Protokół ten umożliwia fenotypową i funkcjonalną analizę odpowiedzi limfocytów T w fizjologicznie istotnym, trójwymiarowym mikrośrodowisku nabłonkowym. Za pomocą tego systemu demonstrujemy różnicowanie efektorowych komórek T CD8 do komórek T pamięci (TRM) rezydencyjnych w tkankach. Ten wszechstronny system hodowli in vitro daje redukcjonistyczne możliwości badania molekularnych szczegółów nabłonkowych sygnałów stojących za różnicowaniem komórek T CD8, które regulują odporność ochronną oraz immunopatologię narządów barierowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki T pamięci CD8 (TRM) stanowią unikalną populację komórek pamięci CD8, które są trwale zatrzymywane w tkankach obwodowych, bez rutynowego krążenia przez krew i tkanki limfatyczne. Te komórki TRM są strategicznie rozmieszczone w narządach barierowych, w tym skórze, płucach, jelicie i drógu rozrodczym, gdzie działają jako strażnicy przed patogenami i rodzącymi się guzami 1,2. Po wykryciu patogenu komórki CD8 TRM szybko uwalniają cytotoksyczne granulki, które bezpośrednio eliminują zainfekowane komórki, jednocześnie wydzielając cytokiny zapalne, które alarmują otaczające komórki tkankowe i rekrutują krążące efektory immunologiczne do powstrzymania rozprzestrzeniania patogenów 3,4. Skuteczność CD8 TRM w odporności przeciwpatogenowej oraz immunoterapii przeciwnowotworowej została już wykazana 5,6. W związku z tym umieszczenie obfitej ilości funkcjonalnie sprawnej TRM CD8 w tkankach błonowych bariery śluzowej jest kluczowym celem szczepionek i strategii immunoterapeutycznych.

Tworzenie i utrzymanie CD8 TRM w narządach obwodowych jest krytycznie zależne od lokalnego programowania tkankowego. Te lokalne sygnały środowiskowe obejmują unikalne cytokiny pochodzenia tkankowego i czynniki metaboliczne, a także interakcje międzykomórkowe, które wspólnie wymuszają tkankowo-specyficzną tożsamość TRM 7,8,9. To programowanie tkankowe pozwala TRM dostosować się do specyficznych wymagań tkankowych w wykonywaniu obowiązków immunonadzoru. Jednak nasza wiedza na temat natury tych interakcji jest niepełna z powodu braku solidnych systemów modelowych, które wiernie oddają te procesy. Modele małych zwierząt, choć bardzo informacyjne, często cierpią na silnie powiązaną, złożoną sieć interakcji, które utrudniają szybkie badania o wysokiej przepustowości.

Tutaj opisujemy alternatywę in vitro dla modelu mysza, która pozwoli na badanie szczegółów molekularnych sygnałów pochodzących z komórek nabłonkowych, które stoi za różnicowaniem CD8 TRM. Poprzez współhodowlowanie preformowanych nabłonkowych organoidów pochwy (VEO) z aktywowanymi komórkami T CD8, wygenerowaliśmy TRM CD8 in vitro. Szczegółowy opis procesu aktywacji i współhodowli komórek T CD8 umożliwi szersze wdrożenie tego procesu w tkankach, prowadząc do lepszego zrozumienia interakcji komórkowych kształtujących pamięć komórek T CD8 w tkankach na pierwszej linii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Brown (Protokół numer 22-10-0001).

1. Podstawowe ustawienie i przygotowanie płyty aktywacyjnej

  1. Dzień przed rozpoczęciem eksperymentu przygotuj nieobtraktowaną płytkę do hodowli tkankowej do zasiewania naiwnymi komórkami CD8 T. Przygotuj roztwór przeciwciał aktywujących w sterylnym dPBS przy końcowym stężeniu 1 μg/mL dla anty-CD3ε (2C11) i 0,167 μg/mL dla B7-1 Fc. Dla płytki na 24 dołki należy dozować 600 μL tego roztworu na dołek. Inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C, aż do użycia.
  2. Przygotuj Bufor wzbogacania limfocytów w sterylnym dPBS, dodając 2% węgla drzewnego FBS i 1 mM EDTA do sterylnego dPBS. Przechowuj w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowy do użycia.
  3. Przygotuj bufor lizowy do lizy amonu-chlorku i potasu (ACK RBC) w ddH20, dodając 10 mM wodorowęglanu potasu, 155 mM chlorku amonu oraz 0,1 mM EDTA. Przefiltruj, sterylizuj i trzymaj w temperaturze pokojowej.
  4. Przygotuj odpowiednią ilość podłoża zbiorowego w RPMI, dodając 5% FBS z węgla drzewnego. Przechowuj w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowy do użycia. Do każdej myszy do zbioru zaleca się 50 ml podłoża zbiorowego.
    UWAGA: Penicylina/streptomycyna i amfotericyna B są opcjonalne, ale końcowe stężenie 100 jednostek/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny oraz 0,2 μg/mL amfocerycyny B może pomóc zapobiec zanieczyszczeniu hodowli limfocytów T bakteryjnym i grzybiczym podczas izolacji tkanek, jeśli to stwarza problem.
  5. Przygotuj podłoże limfocytarne T w RPMI, dodając 10% FBS z węgla drzewnego, 2 mM L-glutaminy, 100 jednostek/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny, 1x nieistotnych aminokwasów oraz 1 mM pirotranianu sodu. Dla płyty 24-dołkowej użyj 2 mL medium z ogniwa T na wlot oraz 50 mL medium ogniwa T na pełną płytkę. Przechowuj w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowy do użycia.
  6. Przygotuj narzędzia do sekcji (nożyczki do mikrosekcji 0,4 mm oraz drobno zakrzywione mikro-sekcyjne ząbki o średnicy 0,8 mm) poprzez autoklawowanie w woreczku sterylizacyjnym lub moczenie w 70% etanolu.

2. Pobieranie i dysocjacja wtórnych narządów limfoidalnych dorosłych myszy

  1. Szybkie schładzenie wirówki do 4 °C z odpowiednimi adapterami do przechowywania stożkowych rurek 15 mL.
  2. Przygotuj lód do transportu tkanek i limfocytów podczas okresów pobierania i inkubacji.
  3. Przygotuj sterylną stożkową probówkę o pojemności 15 mL z co najmniej 5 mL podłoża zbiorczego na mysz do rozcięcia.
  4. Znieczulenie i uśpienie dorosłej myszy transgenicznej z komórkami CD8 T (~8 tygodni) zgodnie z protokołem instytucjonalnym w laminarnym okapu.
  5. Przypiąć kończyny myszy do czystej powierzchni z pianki polistyrenowej za pomocą igieł dowolnego rozmiaru i spryskaj tułów 70% etanolem, aby zapobiec zatkaniu i przyklejaniu się do narzędzi przez futro.
  6. Używając czystych mikro-sekcyjnych nożyczek i kleszczy, wykonaj pionowe nacięcie brzucha i oddziel skórę od cienkiej warstwy tkanki łącznej pod spodem. Przypiąć skórę do powierzchni pianki polistyrenowej za pomocą igieł dowolnego rozmiaru i przetnij pozostałą tkankę łączną, aby odsłonić narządy w tułowiu.
  7. Ostrożnie zlokalizuj i usuń śledzionę, usuwając nadmiar tłuszczu za pomocą zakrzywionych kleszczy, i przelej ją do stożkowej rurki o pojemności 15 mL zawierającej podłoże zbiorcze. Zostaw śledzionę na lodzie i wyizoluj jak najwięcej węzłów chłonnych (np. biodrową i pachwinową), aby połączyć się ze śledzioną w tym samym stożkowatym rurku na lodzie.
    UWAGA: Węzły chłonne biodrowe znajdują się po obu stronach żyły ogólnej w dolnej części brzucha pod przewodem pokarmowym, a węzły pachwinowe znajdują się w pobliżu rozgałęzień powierzchownej żyły nadbrzusznej po obu stronach dolnej części skóry tułowia. Izolować więcej węzłów chłonnych, aby zwiększyć wydajność komórek T CD8 po wzbogaceniu; jednak samo wyizolowanie śledziony zazwyczaj wystarcza, by uzyskać kilka milionów komórek T CD8.
  8. Przenieś śledzionę i węzły chłonne do naciętej misy o średnicy 60 mm i, używając płaskiego końca tłoka strzykawki o pojemności 3 mL, mechanicznie odłącz śledzionę i węzły chłonne, mieląc tkankę tak, by nie pozostały większe fragmenty.
  9. Zbieraj zawiesinę, przechodząc przez sterylne sitko komórek 70 μm do świeżej stożkowej rurki o pojemności 15 mL. Przemyj naczynie o średnicy 60 mm 5 mL materiału zbiorowego, aby zapewnić pełny transfer rozproszonych komórek, a następnie przefiltruj do tej samej stożkowej rurki o pojemności 15 mL.
  10. Wiruj zawiesinę w 584 × g przez 5 minut w 4 °C. Usuń supernatant i przeciągnij rurkę, szybko i mocno przesuwając dno po siatce uchwytu rurki wirówkowej, aby poluzować granulat.
  11. Lizuje erytrocyty poprzez ponowne zawieszenie poluzowanego pelletu w 2 mL buforu lizycznego RBC ACK. Wiruj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
  12. Po 2 minutach zneutralizuj bufor lizyczny, dodając 2 mL podłoża zbiorowego. Aspiruj zawiesinę za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 mL i przefiltruj przez sterylny filtr 70 μm z powrotem do tej samej stożkowej rurki o pojemności 15 mL.
    UWAGA: Ta filtracja jest ważna, aby zapewnić usunięcie wszystkich grudek.
  13. Wiruj zawiesinę w stężeniu 584 × g przez 5 minut w 4 °C. Usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet w 950 μL buforu wzbogacania limfocytów.

3. Wzbogacenie i aktywacja komórek T CD8

  1. Należy wzbogacać naiwne limfocyty CD8 z limfocytów za pomocą komercyjnie dostępnego zestawu izolacyjnego. Postępuj zgodnie z protokołem producenta.
  2. Po wzbogaceniu limfocytów T CD8 należy przenieść wzbogaconą zawiesinę do nowej sterylnej stożkowej rurki o pojemności 15 mL i napełnić objętość do 10 mL podłożem zbiorczym.
  3. Liczyć za pomocą hemocytometru.
    UWAGA: Z jednej dorosłej myszy można wyizolować co najmniej 5-10 milionów nieznanych komórek T CD8 o czystości >95%.
  4. Nakładaj co najmniej 500 000 komórek w 2 mL medium limfocytów T na dołek płytki 24-dołkowej. Dokładnie wymieszaj limfocyty T przed powlekaniem, aby zapewnić jednorodną zawiesinę pojedynczolową. Uzupełnij medium limfocytarowe o końcowe stężenie 100 jednostek/mL IL-2, 2,5 ng/mL IL-12 oraz 55 μM beta-merkaptoetanolu.
  5. Usuń wcześniej pokrytą przeciwciałami płytkę do hodowli tkankowej z 4 °C i ostrożnie zasysaj roztwór powłokowy, nie dotykając dna dołków.
  6. Natychmiast podaj płytki limfocytów T. Inkubuj w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez 2 dni.

4. Usuwanie sygnałów aktywacyjnych i spoczynkowe aktywowane komórki T CD8

  1. Obserwuj aktywowane studnie pod mikroskopem świetlnym. Po 2 dniach aktywacji szukaj małych skupisk limfocytów T w dołkach. Większe skupiska świadczą o większej aktywacji. Jeśli nie ma lub jest ich niewiele, inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez kolejny dzień, zanim przejdziesz do odpoczynku.
  2. Przygotuj lód do przechowywania zawiebiny limfocytów T podczas inkubacji oraz gdy nie jest używana.
  3. Ponownie zawiesnij limfocyty T za pomocą pipety P1000, pipetując w górę i w dół kilka razy w każdym rogu dołku. Gdy limfocyty T zostaną uniesione, przenieś zawartość dołka do sterylnej stożkowej rurki o pojemności 50 mL i liczyć.
    UWAGA: Płukanie każdej studni 1 mL dPBS jest opcjonalne, ale łączenie płukania dPBS z zawiesiną limfocytów T może zwiększyć wydajność ogniw T.
  4. Ponowne pokrycie limfocytów T w tym samym stężeniu co w kroku 3.4, 250 000 komórek/mL przy 2 mL na dołek. Przygotuj odpowiednią ilość pożywki limfocytów T, uzupełnioną o 100 jednostek/mL IL-2 oraz 55 μM beta-merkaptoetanolu.
  5. Wirówka zawiesiny w stężeniu 584 × g przez 5 minut w 4 °C, odrzuć supernatant i ponownie zawiesić pellet w odpowiedniej objętości medium limfocytu T przygotowanego w poprzednim etapie, aby uzyskać liczbę dołków do pokrycia. Dokładnie wymieszaj, aby zapewnić jednorodną zawiesinę jednokomórkową.
  6. Płytka 2 mL zawiesiny limfocytów T (500 000 komórek/dołek) w nowej, nieobtraktowanej płytce do hodowli tkankowej bez powłoki przeciwciał. Inkubuj w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez 2 dni.

5. Zakażenie już uformowanych nabłonków pochwy u myszy wirusem

UWAGA: Do przeprowadzenia infekcji organoidów stosowaliśmy zarówno wirusa opryszczki pospolitej-2 (HSV-2), jak i wirusa zapalenia choriomeningitis limfocytów (LCMV). Oba są uznawane za środki o poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2). Przeprowadz wszystkie procedury związane z czynnikami zakaźnymi w certyfikowanej szafie BSL-2 na zabezpieczenie biologiczne. Oczyść miejsca pracy z 70% etanolem zarówno przed, jak i po użyciu, a wszystkie materiały wyrzucić zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego biobezpieczeństwa. W ramach tego protokołu ustanowiliśmy VEO z komórek nabłonka pochwy pobranych z nabłonka pochwy samic myszy C57BL/6, jak opisano wcześniej10.

  1. Płytki VEO z gęstością 10 000 komórek w 20 μL ekstraktu z błony podstawnej (BME) na dołek płytki 24-dołkowej 7-10 dni przed infekcją.
  2. Dzień przed współhodowlą wyznaczył jeden dołek VEO do trypsynizacji i policzyć, aby uzyskać dokładną wielokrotność zakażeń (MOI). Podgrzewający 0,25% trypsyna-EDTA w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    UWAGA: 0,25% trypsyny-EDTA nie będzie stosowane podczas infekcji; jest to potrzebne tylko do rozłączania VEO podczas obliczeń MOI. Powłokowanie plastiku (np. końcówki pipet, stożkowe rurki) z 2,5% BSA w dPBS jest opcjonalne na tym etapie, ale może pomóc zmniejszyć utratę organoidów i komórek dla dokładniejszego liczenia.
  3. Aspiruj pożywkę komórkową z wyznaczonego dołka i przemyj dPBS.
  4. Do studni należy podać 600 μL podgrzanego 0,25% trypsyny-EDTA i dokładnie ponownie zawiesować pipetą P1000 pokrytą BSA, aby mechanicznie zakłócić BME. Przenieś zawartość studni do stożkowej rurki o pojemności 15 mL pokrytej BSA.
  5. Inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 minut. Po 5 minutach dodaj 10 ml 10% FBS w RPMI, aby stłumić trypsynizację.
  6. Wiruj zawiesinę w 500 x g przez 5 minut w 4 °C. Usuń supernatant i ponownie zawiesij za pomocą końcówki pipety pokrytej BSA w 100-300 μL pożywki hodowli komórek T lub zwykłego DMEM/F12.
    UWAGA: Objętość zależy od wielkości pelletu. Jeśli granulat jest ledwo widoczny, zawiesz go w mniejszej objętości.
  7. Liczyć za pomocą hemocytometru. Oblicz odpowiednią ilość wirusa potrzebną do osiągnięcia 0,1 MOI, używając znanego miarza wirusa i gęstości komórek na dołek VEO, zgodnie z następującym równaniem:
    figure-protocol-1
  8. Aspiruj podłoże hodowlane komórki z dołków VEO do zakażenia i myj 500 μL podgrzanego (37 °C) dPBS. Inkubuj studnie z dPBS przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  9. Po 5 minutach odrzuć dPBS i dodaj 500 μL ośrodka organoidowego na dołek zawierający wystarczającą ilość cząstek wirusowych, aby uzyskać MOI 0,1. Inkubuj w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez 1 godzinę, delikatnie obracając płytkę do hodowli co 20-30 minut.
  10. Po 1-godzinnej inkubacji aspiruj podłoże organoidalne wirusa i przemyj 500 μL podgrzanego (37 °C) dPBS. Aspiruj dPBS i zamień go na świeże ośrodki organoidalne.

6. Współhodowlowanie komórek T CD8 z zakażonymi wirusami, wcześniej uformowanymi mięśniami nabłonkowymi pochwy myszy

  1. Przed współhodowlą (najlepiej 4-24 godziny wcześniej) przenieś BME z -80 °C do 4 °C w celu rozmrażania. Przewiduj odpowiednią ilość BME do rozmrażenia na podstawie projektu eksperymentu ko-kulturowego: zaplanuj pokrycie 8 μL BME na odwiert płyty 96-dołowej oraz 20 μL BME na odwór płyty 24-dołowej.
    UWAGA: BME jest lepki, a dłuższy okres rozmrażania w temperaturze 4 °C obniży lepkość i poprawi zwrotność.
  2. Przygotuj 2,5% BSA w dPBS i przefiltruj sterylizację. Użyj tego rozwiązania BSA do pokrycia każdej plastikowej powierzchni, która ma kontakt z VEO (np. końcówki pipet, stożkowe rurki).
    UWAGA: Ta powłoka zapobiegnie przyklejaniu się VEO do powierzchni plastiku i tracieniu podczas obsługi.
  3. Sprawdź VEO pod mikroskopem świetlnym pod kątem rozmiaru i ogólnego stanu zdrowia. Potwierdź, że VEO są 7-10 dni po hodowli i średnio mają ~100 mikronów średnicy. Zdrowe VEO mają niewiele lub wcale pojedynczych komórek i charakteryzują się jednolitą, okrągłą morfologią.
    UWAGA: Ponowne nakładanie VEO w stosunku 1:1 w kokulturze, jeśli uprawiane są na 24-dołowej płycie i ponownie pokrywają na 24-dołowej (tzn. jedna studnia VEO ponownie zasiewa jedną studnię ko-komory T-komórki). Jeśli ponownie pokrywamy płytę z 96 dołków z płyty 24-dołkowej, ponownie nakładamy VEO 1:2 (tzn. jedna studnia VEO ponownie zasije dwa dołki kokultury komórek T).
  4. Umieść odpowiednią liczbę sterylnych płytek do hodowli tkanek 96- lub 24-dołkowe, przeznaczonych do współhodowli, w inkubatorze 37 °C.
    UWAGA: Podgrzewana płyta przyspiesza przyczepność i krzepnięcie BME.
  5. Przygotuj pożywkę hodowlową komórek T w DMEM/F12, dodając 2% suplement B-27, 2 mM L-glutaminy, 100 jednostek/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny, 1x nieistotnych aminokwasów, 1 mM pirotrowieriana sodu oraz 0,2 μg/mL amfocerycyny B. Przechowuj w 4 °C do momentu gotowości do użycia.
  6. Aspiruj podłoże hodowli komórkowych z dołków VEO i przemyj każdą jamkę 500 μL zimnego (2-8 °C) sterylnego dPBS.
  7. Aspiruj dPBS i dodaj 200-500 μL zimnego (2-8 °C) roztworu organoidowego (co najmniej 10x objętości kropli BME z organoidów). Pipeta w górę i w dół za pomocą pipety P200 pokrytej BSA, aby mechanicznie zakłócić BME.
  8. Inkubuj płytkę delikatnym potrząskiem (~100 obr./min) na orbitalnym shakerze w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Jeśli zimny orbitalny shaker nie jest dostępny, inkubuj płytę na lodzie, ręcznie potrząsając co 5 minut. Jeśli BME nie depolimeryzowało się po 20 minutach, wydłuż czas inkubacji w razie potrzeby.
  9. Przenieś zawartość studni za pomocą końcówki pipety pokrytej BSA do stożkowej rurki o pojemności 15 mL lub 50 mL pokrytej BSA na lodzie. Wiruj zawiesinę w temperaturze 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Usuń supernatant i myj VEO 5-10 mL zimnego (2-8 °C) dPBS (co najmniej 10x objętości połączonych kropelek BME z organoidów). Wiruj zawiesinę w 500 × g przez 5 minut w 4 °C.
  11. Usuń dPBS i ponownie zawiesij pellet w 1 mL pożywki do hodowli komórek T za pomocą końcówki pipety P1000 pokrytej BSA. Zostaw zawiesinę VEO na lodzie, aż limfocyty T będą gotowe do współhodowli.
  12. Zacznij zbierać limfocyty T do współhodowli. Sprawdź spoczynkowe komórki T pod mikroskopem świetlnym pod kątem rozmiaru i ogólnego stanu zdrowia. Bez aktywacji sygnałów limfocyty T spowolnią swoją proliferację, ale powinny nadal tworzyć pewne skupiska. Potwierdzaj, że nie ma resztek ani fragmentów komórek, a limfocyty T mają powiększoną morfologię. Ponownie zawiesnij limfocyty T za pomocą pipety P1000, pipetując w górę i w dół w każdym rogu studni i licząc łączną liczbę aktywnych komórek T CD8.
    UWAGA: Na dołek na płytę z 96 dołkami należy zasiać 100 000 komórek T dla każdej kokultury w 8 μL BME. Na dołek na 24-dołkową płytkę należy zasiać 200 000 komórek T dla każdej kokultury w 20 μL BME.
  13. Wiruj zawiesinę w 584 × g przez 5 minut w 4 °C. Usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet w 10 mL pożywki hodowli komórek T. Połącz komórki T z VEO, przekazując odpowiednią liczbę komórek T, aby dołki zostały powlekane, do stożkowej rurki zawierającej VEO.
  14. Wirówka w 584 × g przez 5 minut w 4 °C. Usuń supernatant i ponownie zawiesij VEO oraz limfocyty T w odpowiedniej ilości BME. Dokładnie wymieszaj za pomocą końcówki pipety pokrytej BSA i nakładaj na podgrzaną płytkę do hodowli tkanek, 20 μL na dołek z płytki 24-dołkowej lub 8 μL na dołek na płytkę 96-dołkową.
    UWAGA: Trzymaj BME na lodzie lub w bloku chłodzącym w temperaturze 4 °C podczas nakładania na płyty. Włożenie końcówek pipet do lodówki o temperaturze 4°C na 30 minut przed nakładaniem może pomóc zapobiec przedwczesnemu zastygnięciu BME.
  15. Umieść płytkę do góry nogami w inkubatorze 37 °C i odczekaj 30 minut na całkowitą przyczepność i zastygnięcie BME.
  16. W tym okresie inkubacji przygotuj kompletne medium hodowli komórek T, dodając 100 ng/mL EGF z myszy, 55 μM beta-merkaptoetanolu oraz 10 jednostek/mL IL-2 z myszy do gotowego pożywki hodowli komórek T.
  17. Po okresie inkubacji ostrożnie dodaj 500 μL kompletnego pożywki hodowlanej komórek T na dołek płytki 24-dołkowej lub 250 μL kompletnego medium hodowlanego limfocytów T na dołek płyty z 96 dołkami. Rozprowadzaj media przy bokach studni, aby nie zakłócać kropli BME. Zmieniaj podłoże co 2 dni, aż do zebrania do analizy.

7. Zbieranie współhodowanych komórek T CD8 do analizy cytometrii przepływowej

  1. Gdy kokultury osiągną co najmniej 7 dzień w hodowli, należy zebrać do analizy. Jeśli limfocyty T nie wykazują się ekspresją markerów podobnych do trm w współhodowli do 7. dnia, optymalizuj datę pobrania między dniem 7-14, w zależności od przejęcia fenotypowego oraz żywotności VEO i limfocytów T.
  2. Przygotuj bufor fluorescencyjnego aktywowanego sortowania komórek (FACS) do barwienia i analizy cytometrii przepływowej, dodając 0,2% zawarto-w surowicowej albuminy bydłej oraz 0,1% azotu sodu do dPBS.
    UWAGA: Azyd sodu to substancja o silnej wadze toksycznej. Przestrzegaj zaleceń instytucji dotyczących obsługi i utylizacji wszystkich odpadów zgodnie z przepisami instytucjonalnego dotyczącym bezpieczeństwa biologicznego.
  3. Przygotuj koktajl fluorescencyjnych przeciwciał w buforze FACS do barwienia powierzchniowego, w zależności od tego, które markery są potrzebne do analizy. Dla każdego dołku należy uwzględnić co najmniej 50 μL koktajlu przeciwciał.
  4. Przygotuj barwnik fluorescencyjny w dPBS. Dla każdego odwiertu uwzględnij co najmniej 50 μL barwnika żywotnego.
  5. Ostrożnie usuń medium z każdego dołku i dokładnie ponownie zawiesij w zimnym (2-8 °C) buforze FACS, pipetując 10-20 razy, aby mechanicznie zakłócić BME. Przenieś zawartość każdego dołku na oznaczoną płytę z 96 dołkami o okrągłym dnie.
  6. Wirówka w 859 × g przez 2 minuty w 4 °C. Obniż rampę zwalniania we wszystkich kolejnych etapach wirowania, aby zapobiec utracie próbki podczas remixowania pelletów.
  7. Usuń supernatant, odwracając płytę i wypychając ciecz jednym, zdecydowanym ruchem w dół. Ponownie zawiesi 50 μL koktajlu przeciwciał. Pipeta w górę i w dół co najmniej 5 razy za pomocą pipety wielokanałowej, aby zapewnić dokładną rezasję pelletu komórkowego.
  8. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze 4 °C lub w temperaturze pokojowej, w razie potrzeby, chroniony przed światłem. Po zakończeniu okresu inkubacji należy dodać 150 μL dPBS do każdego odwiertu za pomocą wielokanałowej pipety i wirówki w temperaturze 859 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
  9. Przelew supernatant, odwracając płytkę do góry nogami i raz w ciągłym ruchu szerzaj ją w dół. Ponownie zawiesić 50 μL barwnika żywotności. Pipeta w górę i w dół co najmniej 5 razy za pomocą pipety wielokanałowej, aby zapewnić dokładną rezasję pelletu komórkowego.
  10. Inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniony przed światłem. Po zakończeniu okresu inkubacji należy dodać 150 μL buforu FACS do każdego odwiertu za pomocą pipety wielokanałowej i wirówki w temperaturze 859 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
  11. Przelej supernatant jak wcześniej i ponownie zawiesz 150 μL buforu FACS, jeśli próbki zostaną natychmiast przeanalizowane na cytometrze przepływowym, lub zafiksuj 150 μL 0,5% paradehydu i pozostawij w temperaturze 4 °C. Pipetuj w górę i w dół co najmniej 5 razy za pomocą pipety wielokanałowej, aby zapewnić dokładną rezawisję pelletu komórkowego. Filtruj próbki stałe, aby zapobiec zatoraniu instrumentów i pracuj na cytometrze przepływowym w ciągu 12-36 godzin, aby zapobiec utracie fluorescencji.
    UWAGA: Paraformaldehyd jest uważany za substancję niebezpieczną. Przestrzegaj instytucjonalnych przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego w zakresie obsługi i utylizacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopowa wizualizacja współkultury organoidów zakażonych limfocytami CD8 T
Przygotowane mysie VEO zostały zakażone LCMV i współhodowane z limfocytami CD8 specyficznymi dla LCMV. Przeprowadziliśmy również te współhodowle z modelem zakażenia HSV-2, aby potwierdzić wszechstronność protokołu, ale pokazujemy dane mikroskopowe dla modelu LCMV i uwzględniliśmy dane różnicowania limfocytów T w modelu HSV-2 poniżej. LCMV wyraża żółte białko fluorescencyjne (YFP), dzięki czemu zakażone komórki można zobac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CD8 TRM opierają się na lokalnych sygnałach środowiskowych w celu rozróżnienia i konserwacji. Te sygnały wprowadzają programowanie specyficzne dla tkanek, które pozwala TRM CD8 dostosować się do otoczenia i wykonywać obowiązki immunosurveillance w razie potrzeby. Niestety, TRM nie przetrwały in vitro po wyodrębnieniu z tkanki, co ograniczyło ich szczegółową analizę12,13. W tym protokole przedstawiliśmy metodę, dzięki której komórki CD8 T mogą być współho...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konkurujących interesów do ogłoszenia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez grant Narodowych Instytutów Zdrowia R01AI177704-01A1, R21AI183017-01, grant nasienny Uniwersytetu Browna (dla L.K.B.) oraz F31AI186444 (dla Y.L.). Chcielibyśmy podziękować dr Dorianowi B. McGavernowi (NINDS, NIH) za dostarczenie wirusa zapalenia mózgów limfocytarnych ekspresujących YFP. Dziękujemy za pomoc dr. Sanghyunowi Lee i jego laboratorium za pomoc przy obrazowaniu Cytation-5 oraz rdzeniu cytometrii przepływowej Uniwersytetu Brown, który ułatwia testy oparte na przepływie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór wodny paraformaldehydu 16%Nauki o mikroskopii elektronowej15710-S
24-dołkowe płytki wielodołkowe z polistyrenem nieobrzeźbionymVWR International10861-558
2-MerkaptoetanolGibco21985023
3 mL sterylnych strzykawekFisher Scientific14-955-457
5 mL,  Snap Cap,  Jałowe probówki polistyrenowe o okrągłym dnieFalcon352058
Szalki Petriego 60 mmFisher ScientificFB0875713A 
70 & mu; m Sita komórek sterylnychFisher Scientific22-363-548
Mikropłyty z polistyrenem z okrągłym dnem z 96 dołkamiGreiner Bio-One650101
Wielodołkowe płytki do hodowli wielodołkowej z polistyrenem nieobrzedzonymVWR International10861-562
Albumina bydła/ułamek VChemikalia termonaukoweJ6465518
Chlorek amonuFisher ScientificA661-500
Amfocerycyna B Sigma-AldrichA9528-100MG
Dodatek B-27Gibco17504044
ioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader
DMEM/F12 1:1 MediumCytivaSH30271. FS
Roztwór soli buforowanej fosforanem Dulbecco 1xCorning21031CV
Kwas etylendiaminetetraoctowy (roztwór 0,5 m/pH 8,0)Fisher ScientificBP2482-500
Bardzo drobne nożyczki do mikro-rozcinaniaRoboz Surgical Instrument Co.RS-5882
Serum bydła płodu – leczone węglem drzewnym/dektranemR& D SystemsS11650
Oprogramowanie Flowjo v10Becton, Dickinson and CompanyFlowJo (RRID:SCR_008520)
Kleszcze GraefeRoboz Surgical Instrument Co.RS-5135
Rozwiązanie HEPESCytivaSH30237.01
L-glutamina (200 mM)GibcoA2916801
Magnes 5mLBiolegenda480019
Mysz CD8 Naï ve T Cell Isolation KitBiolegenda480044
Myszy EGF Rekombinowany BiałkoGibco315091MG
Roztwór aminokwasów nieistotnych (100x)Gibco11140050
Roztwór penicyliny i streptomycynyCytivaSV30010
Wodorowęglan potasuMP Biomedicals0215255780
Oczyszczony antymyszy CD3 i epsilon; PrzeciwciałaBiolegenda100360
Rekombinowana mysz B7.1 (CD80)-Fc Chimera (wolna od nośników)Biolegenda555406
Rekombinowana mysz IL-12 (p70) (bez nośników)Biolegenda577004
Rekombinowana mysz IL-2 (bez nośników)Biolegenda575406
Ekstrakt z bazowej błony o obniżonym współczynniku wzrostuR& D SystemsBME001-10
Multimedia RPMI 1640CytivaSH30027.LS
Azidek soduFisher ScientificS227I-25
Pirowinian sodu (100 mM)Gibco11360070
Trypsyna 0,25% proteaza z trypsyną wieprzowąCytivaSH30042.02
Barwnik żywotności (Red 780)Cytek Biosciences13-0865-T100

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosato, P. C., Beura, L. K., Masopust, D. Tissue resident memory T cells and viral immunity. Curr Opin Virol. 22, 44-50 (2017).
  2. Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nat Med. 21, 688-697 (2015).
  3. Schenkel, J. M., et al. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346 (6205), 98-101 (2014).
  4. Ariotti, S., et al. Skin-resident memory CD8 + T cells trigger a state of tissue-wide pathogen alert. Science. 346 (6205), 101-105 (2014).
  5. Christo, S. N., Park, S. L., Mueller, S. N., Mackay, L. K. The Multifaceted Role of Tissue-Resident Memory T Cells. Annu Rev Immunol. 42 (1), 317-345 (2024).
  6. Gavil, N. V., Cheng, K., Masopust, D. Resident memory T cells and cancer. Immunity. 57 (8), 1734-1751 (2024).
  7. Christo, S. N., et al. Discrete tissue microenvironments instruct diversity in resident memory T cell function and plasticity. Nat Immunol. 22 (9), 1140-1151 (2021).
  8. Pan, Y., et al. Survival of tissue-resident memory T cells requires exogenous lipid uptake and metabolism. Nature. 543, 252-256 (2017).
  9. Hasan, M. H., Beura, L. K. Cellular interactions in resident memory T cell establishment and function. Curr Opin Immunol. 74, 68-75 (2022).
  10. Ulibarri, M. R., et al. Epithelial organoid supports resident memory CD8 T cell differentiation. Cell Rep. 43 (8), 114621(2024).
  11. Evrard, M., et al. Single-cell protein expression profiling resolves circulating and resident memory T cell diversity across tissues and infection contexts. Immunity. 56 (7), 1664-1680.e9 (2023).
  12. Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8+ T Cell and Invariant NKT Subsets. J Immunol. 202 (7), 2153-2163 (2019).
  13. Künzli, M., et al. Long-lived T follicular helper cells retain plasticity and help sustain humoral immunity. Sci Immunol. 5 (45), eaay5552(2020).
  14. Kang, J. S., et al. Generation of induced alveolar assembloids with functional alveolar-like macrophages. Nat Commun. 16, 3346(2025).
  15. Lin, M., et al. Establishment of gastrointestinal assembloids to study the interplay between epithelial crypts and their mesenchymal niche. Nat Commun. 14, 3025(2023).
  16. Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 364 (6444), 960-965 (2019).
  17. Quintard, C., et al. A microfluidic platform integrating functional vascularized organoids-on-chip. Nat Commun. 15, 1452(2024).
  18. Vincenti, I., et al. Tissue-resident memory CD8+ T cells cooperate with CD4+ T cells to drive compartmentalized immunopathology in the CNS. Sci Transl Med. 14 (640), eabl6058(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Resident Memory T CellsCD8 T CellsEpithelial OrganoidsOrganoid Co cultureVaginal Epithelial OrganoidsFlow CytometryTissue ResidencyViral Infection ModelInterferon Gamma Production

Powiązane artykuły