Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oś Mettl3/Nrf2 hamuje postęp choroby Parkinsona poprzez hamowanie pirostozy wywołanej NLRP3 w neuronach serotoniny

590 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69124

⸱

7 listopada 2025

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, Feicheng People's Hospital, 2Department of Neurology, Yantai Yantaishan Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół badający, jak Mettl3 reguluje Nrf2 poprzez modyfikację m6A, hamując mikroglej pirostozę i chroniąc neurony serotoniny w modelach choroby Parkinsona, z zastosowaniami w badaniach neurozapalnych epitranskryptomii.

Streszczenie

Dokładne mechanizmy patogenezy choroby Parkinsona (PD) pozostają niedo do końca poznane, szczególnie w kwestii roli zapalenia mikrogleju i przeżycia neuronów serotoninowych. Protokół ten przedstawia kompleksowe ramy wyjaśnienia, jak metylotransferaza podobna 3 (Mettl3) moduluje czynnik 2 powiązany z czynnikiem erytroidowym 2 (Nrf2) jądrową poprzez modyfikację N6-metyladenozyny (m6A), co tłumi mikroglejową pirostozę i zachowuje neurony serotoniny zarówno in vitro , jak i in vivo . Głównym celem jest dostarczenie naukowcom powtarzalnych metod do rozkładania epitranskryptomii na szlaki neurozapalne, zaczynając od mikroglejowej aktywacji mikrogleju indukowanej lipopolisacharydami (LPS) w komórkach BV2 w celu symulacji kaskad zapalnych, a następnie metodą ilościowego PCR immunoprecypitacji metylowanego RNA (MeRIP-qPCR) do analizy m6A. In vivo szczegółowo przedstawiamy ustanowienie mysiego modelu PD indukowanego przez MPTP, uzupełnionego stereotaktycznym dostarczaniem wektorów serotypu 9 (AAV9) związanego z adeno-adenomizacją do celowanej modulacji Nrf2 w prążkowiu. Oceny behawioralne obejmują umiejscowienie kończyn przednich, przyspieszające badania rotarodowe oraz testy na otwartym polu w celu ilościowego określenia deficytów ruchowych, natomiast testy molekularne obejmują Western blotting dla markerów piroptozy (np. NLRP3, rozszczepiona kaspaza-1), enzymatyczny immunosorbentny test (ELISA) dla cytokin oraz barwienie dihydroetydium (DHE) dla wykrywania reaktywnych form tlenu (ROS) w neuronach serotoniny. Zaawansowane techniki mikroskopowe, takie jak immunohistochemia dla Iba1 i TPH2, umożliwiają wizualizację dynamiki mikrogleju i integralności serotonergicznej. Wyniki potwierdzają, że niedobór Mettl3 nasila obniżenie poziomu Nrf2, hiperaktywację inflammasomu NLRP3, śmierć komórek piroptotycznych oraz w konsekwencji degenerację neuronów serotoninowych. Metoda ta nie tylko zapewnia solidne eksperymentalne podłoże do badania neuroprotekcji podleganej m6A, ale także wskazuje potencjalne możliwości terapeutyczne łagodzenia postępu Parkinsona poprzez ukierunkowaną modulację osi Mettl3/Nrf2 w kontekstach neurodegeneracyjnych.

Wprowadzenie

Choroba Parkinsona (PD) zajmuje drugie najczęstsze zaburzenie neurodegeneracyjne wśród osób starszych, dotykając około 2-3% osób w wieku 65 lat i starszych, co stanowi znaczące obciążenie zarówno dla rodzin, jak i społeczeństwa1. Chociaż dokładne mechanizmy PD pozostają częściowo zrozumiane, narastające dowody wskazują na związek między rozwojem PD a wyzwaniami w transmisji neuronalnej, a także neurozapaleniem wywołanym przez komórki mikroglejowe, co jest cechą częstą u starzejących się mózgów i różnych chorób neurodegeneracyjnych, w tym PD 2,3,4,5 . Mikroglej pełni funkcję wrodzonych komórek odpornościowych w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i jest niezbędny do utrzymania homeostazy mózgu6. Jednak utrzymująca się nadmierna aktywacja tych mikrogleju może wywołać przewlekłe reakcje neurozapalne, co ostatecznie przyczynia się do postępu choroby neurodegeneracyjnej.

Zarówno centralne, jak i obwodowe procesy zapalne znacząco wpływają na patologię PD 7,8. Aktywacja komórek mikrogleju wywołuje reakcje zapalne wpływające na przeżycie neuronów9, a pojawiające się dowody wskazują na jej primowanie przez ligazy ubiquityny10. Spośród różnych szlaków zapalnych aktywacja białka 3 (NLRP3) zawierającego domenę zapalną NOD, LRR oraz domenę pyrynową jest głównym czynnikiemregulującym mikroglej11. Aktywacja prowadzi do ekspresji NLRP3 i późniejszego złożenia kompleksu inflammasomu składającego się z adaptera domeny aktywacji i rekrutacji kaspaz (CARD) oraz pro-kaspazy-1, co kończy się rozszczepieniem białek i uwalnianiemcytokin12. U pacjentów z Parkinsonysem oraz w różnych modelach zwierzęcych choroby zaobserwowano podwyższoną aktywację NLRP3, co prowadzi do śmierci neuronów. Warto zauważyć, że hamowanie NLRP3 wykazało działanie ochronne przeciwko patologii Parkinsonowej w modelach myszych, podkreślając kluczową rolę inflamasomu NLRP3 w wystąpieniu PD13,14.

Sygnalizacja serotoniny (5-HT) jest istotnym mechanizmem regulacji nerwowej, wpływającym na liczne zachowania i funkcje fizjologiczne poprzez interakcje z co najmniej 14 podtypami receptorów postsynaptycznych15,16, w tym role w patologii OUN, jak opisano w kompleksowych przeglądach17. Rozległy neuromodulacyjny wpływ systemu 5-HT jest kontrolowany przez około 26 000 neuronóww mózgu gryzoni. Podczas gdy znaczna literatura łączy PD głównie z utratą neuronów dopaminergicznych, związek między neuronami 5-HT a PD jest mniej dokładnie zbadany.

Modyfikacja N6-metyladenozyny (m6A), najpowszechniejsza modyfikacja mRNA w komórkach eukariotycznych, jest kluczowa dla regulacji splicingu, stabilności i eksportu mRNA, wpływając tym samym na różne aktywności komórkowe19. Poziomy m6A są modulowane przez metylotransferazy i demetyloazy. Podwyższone modyfikacje m6A w mózgu zostały powiązane z rozwojem nerwowym, którego dysregulacja jest ściśle powiązana z chorobami neurodegeneracyjnymi20,21, w tym zmienioną ekspresją METTL3 w modelach choroby Alzheimera22. Na przykład nagromadzenie metylotransferazy 3 (METTL3) w nierozpuszczalnej frakcji tkanek mózgowych po śmierci pacjentów z chorobą Alzheimera zostało pozytywnie skorelowane z poziomami nierozpuszczalnego białka Tau23. Ponadto znaczący spadek poziomu m6A w prążkowiu może prowadzić do znacznego spadku poziomu neuroprzekaźników dopaminy24. Warto zauważyć, że dwanaście polimorfizmów pojedynczych nukleotydów związanych z m6A wykazało istotne powiązania z podatnością na PD25. Protokół ten ustanawia kompleksowe metody badania sposobu, w jaki modyfikacje m6A za pomocą METTL3 regulują mikroglejową pirostozę na osi Nrf2/NLRP3, co ostatecznie wpływa na przeżywalność neuronów serotoniny w modelach Parkinson. Model ostrego MPTP in vivo oraz model LPS in vitro zostały wybrane ze względu na silną indukcję odpowiedzi neurozapalnych, choć przewlekłe paradygmaty mogą uzupełnić przyszłe badania, jak omówiono poniżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były przeprowadzane za zgodą Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Szpitala Ludowego w Feicheng (numer zatwierdzenia IACUC-2024-118) i przeprowadzane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi oraz ustalonymi zasadami etycznymi badań na zwierzętach laboratoryjnych. Protokoły badania zapewniły humanitarną opiekę i traktowanie wszystkich zwierząt, ze szczególnym naciskiem na minimalizację cierpienia i cierpienia, przy jednoczesnym przestrzeganiu zarówno standardów instytucjonalnych, jak i wytycznych ARRIVE dotyczących odpowiedzialnych praktyk badawczych na zwierzętach.

1. Model hodowli komórek i aktywacji mikrogleju

  1. Przygotowanie i utrzymanie ogniw BV2
    1. Szybko rozmroz zamrożone zapasy komórek mikroglejowych BV2 w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 minuty, zapewniając delikatne mieszanie, aby zapobiec szokowi termicznemu.
    2. Wiruj rozmrożoną zawiesinę ogniwową w dawce 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT), aby usunąć krioprotektant.
    3. Odrzuć supernatant i ponownie zawiesijcie pellet komórkowy w 10 mL pełnego wysokoglukozowego pożywki DMEM, uzupełnionego o 10% FBS, 1% penicylin-streptomycyny oraz 2 mM L-glutaminy.
    4. Przeprowadz ocenę żywotności komórek metodą wykluczenia trypan blue (wymieszaj 10 μL zawiesiny komórkowej z 10 μL 0,4% trypan blue, licz za pomocą hemocytometru), zapewniając >95% żywotności przed dalszym rozpoczęciem.
    5. Komórki płytowe w kolbach hodowlanych T75 o gęstości 1×10 6 komórek w kolbie i przechowywane w nawilżonym inkubatorze hodowli komórek w temperaturze 37°C z 5%CO2.
    6. Przepuszczanie komórek co 48 godzin przy osiągnięciu 80-85% konfluencji, stosując standardowe procedury trypsynizacji.
      UWAGA: Utrzymuj spójne numery fragmentów (fragmenty 3-8), aby zapewnić powtarzalne reakcje zapalne. Wszystkie eksperymenty z hodowlą komórek były niezależnie powtarzane co najmniej trzy razy, z trzema technicznymi replikacjami na warunki, aby zminimalizować zmienność.
  2. Mikroglejowa aktywacja indukowana przez LPS
    1. Komórki BV2 zasiewaj w płytkach 6-dołkowych w odcinku 2 × 105 komórek na dołek w 2 mL kompletnego medium 24 godziny przed zabiegiem.
    2. Przygotuj roztwór LPS w stężeniu 1 mg/mL w sterylnym PBS, filtruj przez filtr 0,22 μm i przechowuj w jednorazowych alikwotach w temperaturze -20 °C.
    3. Zweryfikować aktywność LPS za pomocą testu lizatu amebocytów Limulus (LAL), aby potwierdzić stężenie endotoksyny przed każdym eksperymentem26.
    4. Rozcieńcz materiał LPS do stężenia roboczego 1 μg/mL w bezsurowicowym DMEM tuż przed użyciem.
    5. Usuń podłoże hodowlowane z dołków i przepłucz komórki dwukrotnie sterylnym PBS.
    6. Dodaj 2 mL medium zawierającego LPS (1 μg/mL końcowe stężenie) do studni leczniczych oraz bezsurowicowego DMEM w celu kontrolowania studni.
    7. Inkubuj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5%CO2 w celu aktywacji zapalnej.
    8. Uwzględnić dołki z dodatnim kontrolem leczone czynnikiem martwiczym guza 100 ng/mL (TNF)-α oraz dołki kontrolne ujemne wyłącznie z nośnikiem (PBS), aby potwierdzić odpowiedź zapalną.
      UWAGA: Przygotuj świeży roztwór LPS dla każdego eksperymentu, aby utrzymać stałą bioaktywność. Jeśli odpowiedź zapalna jest słaba (np.
  3. Nadekspresja i nokdaun Mettl3
    1. Projektowanie i synteza małych sekwencji interferującego RNA (siRNA) skierowanych na Mettl3 oraz zaszyfrowane sekwencje kontrolne przy użyciu standardowych protokołów syntezy oligonukleotydów. Wybierz sekwencje docelowe z regionu kodującego mRNA Mettl3 (przystęp GenBank: NM_019721) o długości nukleotydów 19-21, zapewniając zawartość GC na poziomie 40-60%27.
    2. Walidacja sekwencji siRNA za pomocą analizy BLAST, aby potwierdzić specyficzność i uniknąć efektów poza celem (zapewnić <70% homologii z genami niedocelowymi).
    3. Przygotować wektory nadekspresji zawierające pełnowymiarowe cDNA Mettl3 sklonowane do wektora pcDNA3.1 przy użyciu miejsc restrykcyjnych EcoRI i XhoI.
    4. Komórki transfekcyjne przy 70-80% konfluencji z wykorzystaniem kationowego reagenta transfekcyjnego lipidowego:
      1. Wymieszaj 2 μL odczynnika transfekcyjnego kationowego lipidowego z siRNA o pojemności 50 pmol lub 2 μg DNA plazmidowego w 100 μL ośrodka Opti-MEM.
      2. Inkubuj mieszankę przez 15 minut w RT.
      3. Dodawaj kompleks transfekcyjny kroplami do komórek i inkubuj przez 4-6 godzin, zanim przejdziesz do świeżego, kompletnego nośnika.
    5. Inkubować komórki transfekowane przez 48 godzin przed leczeniem LPS, aby umożliwić odpowiednie zmiany w ekspresji białka.
    6. Potwierdź efektywność transfekcji za pomocą ko-transfekcji fluorescencyjnej reporterowej (100 ng pEGFP-C1 na dołek), celując w >70% sprawności mikroskopią fluorescencyjną przed rozpoczęciem działania.

2. Rozwój modeli zwierzęcych i projektowanie eksperymentalne

  1. Przygotowanie i randomizacja zwierząt
    1. Pobierz myszy C57BL/6J z Vital River Laboratory, zapewniając równy stosunek samców do samic, w wieku 8 tygodni, ważących 19-26 g.
    2. Zwierzęta domowe w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF) z cyklem światła i ciemności 12:12 godzin, kontrolowaną temperaturą (22 ± 2°C) oraz wilgotnością (50-60%).
    3. Pozwól na 7-dniowy okres aklimatyzacji z ad libitum dostępem do standardowego jedzenia i wody.
    4. Przeprowadz podstawowe oceny behawioralne podczas aklimatyzacji: Przeprowadz kompleksowe oceny behawioralne, w tym test umiejscowienia kończyn przednich (10 prób na stronę), przyspieszającą ocenę rotarodu (4-40 rpm w ciągu 5 minut) oraz analizę aktywności lokomotorycznej na otwartym polu (sesje 10-minutowe w aparatach o wymiarach 50 cm × 50 cm × 50 cm)28,29,30.
    5. Losowo przypisuj zwierzęta do grup eksperymentalnych (n = 6 na grupę) za pomocą komputerowej randomizacji, aby zminimalizować błędy: sham, Model, Model+Nrf2-KD, Model+oe-Nrf2.
    6. Wdroż projekt eksperymentu ślepego, w którym badacze prowadzący oceny behawioralne nie są świadomi przydziałów grupowych.
  2. Model choroby Parkinsona indukowany przez 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydynę (MPTP)
    1. Przygotować roztwór MPTP w ilości 30 mg/kg w bezpłodnej soli fizjologicznej tuż przed wstrzyknięciem, rozpuszczając 15 mg chlorku MPTP w 5 ml soli fizjologicznej i dostosowując objętość do masy zwierzęcia.
      UWAGA: MPTP jest wysoce neurotoksyczny. Obchodzić się z nim w okapie chemicznym z odpowiednim sprzętem ochronnym, w tym podwójnymi rękawicami i fartuchem laboratoryjnym.
    2. Podawaj MPTP przez zastrzyk dootrzewnowy w dawce 30 mg/kg masy ciała (objętość zastrzyku 10 mL/kg) przez trzy kolejne dni o tej samej porze każdego dnia (09:00 ± 30 min).
    3. Wstrzykuj zwierzętom z grupy pozornej o równoważnych objętościach bezpłodnej soli fizjologicznej według identycznego harmonogramu podawania.
    4. Codziennie monitoruj zwierzęta pod kątem oznak stresu, utraty masy ciała (>15% uznawanej za punkt końcowy) lub reakcji niepożądanych podczas okresu podawania MPTP, korzystając ze standaryzowanych arkuszy punktacji.
    5. Utrzymuj zwierzęta przez 8 dni po ostatnim zastrzyku, aby umożliwić rozwój neurodegeneracji.
      UWAGA: Zwierzęta mogą być normalnie trzymane w tym okresie przy ciągłym monitorowaniu.
  3. Stereotaktyczne zastrzyki wirusowe
    1. Przygotuj wektory wirusowe AAV9 poprzez potrójną transfekcję HEK293T komórek z użyciem polietyliminy (PEI; stosunek DNA:PEI 1:3), pozyskaj po 72 godzinach po transfekcji, oczyść za pomocą ultrawirowania gradientu joduksanolowego (177 000 × g przez 2 godziny) oraz skoncentruj za pomocą filtrów odśrodkowych, aby uzyskać 1 × 10 kopii genomu12 na mL.
    2. Walidacja miana wirusa za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) za pomocą starterów skierowanych do regionów ITR, zapewniając miano osiągające 1 × 10¹² kopii genomu/mL przy standardowej analizie krzywej.
    3. Walidacja miarnika wirusa za pomocą ilościowego PCR opartego na SYBR Green z primerami specyficznymi dla ITR, wykonywanie seryjnego rozcieńczania znanych standardów oraz obliczanie kopii genomu za pomocą analizy krzywej standardowej. Potwierdz brak zakażenia wirusem zdolnym do replikacji za pomocą p24 ELISA.
    4. Znieczulanie myszy izofluranem (indukcja 3%, utrzymanie 1,5-2%) podanym z przepływem tlenu 0,8-1,0 l/min przez stożek nosowy, monitorując częstość oddechu (60-100 oddechów/min) oraz odruch szczypania palców przez cały zabieg. Zabezpiecz mysz w stereotaktycznej ramce i nałóż maść okulistyczną, aby zapobiec wysychaniu rogówki.
    5. Zabezpiecz mysz w stereotaktycznej ramce i nałóż maść okulistyczną, aby zapobiec wysychaniu rogówki.
    6. Wykonaj nacięcie na skalpę o średnicy 1,5 cm za pomocą sterylnego ostrza skalpela i zidentyfikuj punkt orientacyjny bregmy za pomocą współrzędnych stereotaktycznych z dokładnością 0,1 mm.
    7. Oblicz współrzędne wstrzyku dla prążkowania: pręcikowo-przednie-tylne -0,5 mm, przyśrodkowo-boczne ±2,0 mm, grzbietowo-brzuszne -3,0 mm od bregmy.
    8. Wykonaj pilotażowe zastrzyki z fluorescencyjnym znacznikiem (np. zielonym białkiem fluorescencyjnym [GFP]) w celu weryfikacji celowania, potwierdzając >80% współlokalizacji z markerami mikrogleju (Iba1) za pomocą immunohistochemii przed eksperymentalnymi iniekcjami.
    9. Obniż igłę do wtrysku (33-G) do głębokości z prędkością 1 mm/min i wstrzykni 2 μL zawiesiny wirusowej z prędkością 0,2 μL/min za pomocą mikropompki strzykawkowej z automatycznym kontrolerem. Obniż igłę do docelowej głębokości i wstrzyknij 2 μL zawiesiny wirusowej z prędkością 0,2 μL/min za pomocą pompy mikrostrzykawkowej.
    10. Utrzymuj pozycję igły przez 5 minut po wstrzyknięciu, aby zapobiec cofaniu się.
    11. Powoli wyjmuj igłę z prędkością 0,5 mm/min, zamykaj nacięcie szwami jedwabnymi 4-0 w wzorze przerwanym i pozwól na regenerację z narkoczenia na podgrzewanym podkładzie do regeneracji.
    12. Podawaj pooperacyjne środki przeciwbólowe (karprofen 5 mg/kg podskórnie raz dziennie przez 3 dni) i monitoruj rekonwalescencję przez 24 godziny za pomocą szczegółowych arkuszy obserwacyjnych.

3. Techniki i walidacja biologii molekularnej

  1. Ekstrakcja RNA i kontrola jakości
    1. Pobranie komórek lub próbek tkanki mózgowej prążkowej bezpośrednio po eksperymentalnych punktach końcowych, poprzez humanitarne uśpienie zwierząt poprzez wdychanieCO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy; rozcinaj tkanki na lodzie, drobno mielę i enzymatycznie dysocjuj z 0,25% trypsyny przez 10 minut w temperaturze 37 °C, jeśli pobierasz komórki.
    2. Całkowite RNA należy wyodrębnić za pomocą odczynnika TRIzol (1 mL na 1 106 komórek lub 100 mg tkanki) z mechaniczną homogenizacją (20-25 pociągów w homogenizatorze dounce) oraz separacją fazową chloroformu (0,2 mL chloroformu na 1 mL TRIzolu).
    3. Ocena jakości RNA za pomocą spektrofotometrii (stosunek A260/A280 1,8-2,0) oraz elektroforezy żelowej (1% agarozy), aby potwierdzić pasma rybosomalne 28S i 18S.
    4. Ilościowo określ stężenie RNA za pomocą spektrofotometru.
    5. Przechowuj próbki RNA w temperaturze -80 °C w wodzie wolnej od nukleazy w temperaturze -80 °C z dodatkiem inhibitora RNazy (40 jednostek/μL) do czasu analizy.
  2. Frakcjonowanie jądrowo-cytoplazmatyczne
    1. Należy zebrać komórki(2 × 10 6 minimalnie) i przemyć dwa razy lodowatym PBS (5 ml na płukanie, 5 minut wirowania przy 300 × g).
    2. Korzystaj z komercyjnego zestawu do frakcjonacji komórek zgodnie z następującym protokołem.
      1. Ponownie zawiesz pellet komórkowy w 200 μL buforu ekstrakcyjnego cytoplazmatycznego z inhibitorami proteazy.
      2. Inkubuj na lodzie przez 10 minut, z wirowaniem co 3 minuty.
      3. Wirować w 16 000 × g przez 5 minut w 4 °C i pobrać supernatant (frakcję cytoplazmatyczną).
      4. Przemyj granulek dwukrotnie buforem ekstrakcji cytoplazmatycznej.
      5. Ponownie zawiesić granulkę w 100 μL buforu ekstrakcyjnego jądrowego.
      6. Inkubuj na lodzie przez 40 minut, z wirowaniem co 10 minut.
      7. Wirówka na 16 000 × g przez 10 minut w 4 °C i pobiera supernatant (frakcję jądrową)
    3. Zweryfikować efektywność frakcjonowania poprzez analizę rozkładu markerów jądrowych (U6) i cytoplazmatycznych (GAPDH) za pomocą Western blot.
    4. Oddzielnie wyodrębniaj RNA z frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych.
    5. Analizuj poziomy mRNA Nrf2 w każdej frakcji za pomocą RT-qPCR z genami referencyjnymi specyficznymi dla frakcji.
  3. Ilościowe PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)
    1. Syntetyzuj cDNA z 1 μg całkowitego RNA przy użyciu zestawu odczynników do transkrypcji odwrotnej z losowymi starterami.
    2. Wykonaj qPCR za pomocą zestawu Premix Ex Taq II z genetycznie specyficznymi starterami na systemie PCR w czasie rzeczywistym.
    3. Zweryfikować specyficzność zapalnika za pomocą analizy krzywej stopień i potwierdzić pojedynczy amplicon za pomocą elektroforezy żelowej.
    4. Stosuj następujące warunki cykliczne termiczne: początkowa denaturacja w 95 °C przez 10 minut, następnie 40 cykli 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s.
    5. Oblicz względne poziomy ekspresji mRNA za pomocą metody 2-ΔΔCt z β-aktyną jako wewnętrznym punktem odniesienia.
    6. Uwzględnić kontrolę bez szablonu i zweryfikować stabilność genów referencyjnych w warunkach eksperymentalnych za pomocą analizy geNorm (wartość stabilności M < 0,5).
      UWAGA: Wyniki powtarzalności: współczynnik zmienności wewnątrz testu (CV) <10% w trzech niezależnych testach.
  4. MeRIP-qPCR do analizy modyfikacji m6A
    1. Ekstrahować całkowite RNA (minimum 20 μg) i fragmentować do 100-200 nukleotydów za pomocą odczynnika fragmentacyjnego RNA (10 mM ZnCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0) w temperaturze 70 °C przez 5 minut.
    2. Wykonanie immunoprecypitacji z użyciem przeciwciał specyficznych dla m6A (2 μg na 20 μg RNA) przez noc w temperaturze 4 °C z rotacją (10 rpm) w buforze immunoprecipitacyjnym (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 750 mM NaCl, 0,5% NP-40).
    3. Zweryfikować specyficzność przeciwciał przy użyciu znanych kontrolnych RNA zmodyfikowanych i niemodyfikowanych m6A.
    4. Kompleksy immunoprecipitowane pięć razy przemyj buforem do mycia.
    5. RNA związane z elutem i transkrybują odwrotnie, używając losowych primerów.
    6. Odwrotne transkrybują eluowane RNA za pomocą przypadkowych starterów i wykonują analizę qPCR za pomocą primerów specyficznych dla Nrf2, obejmujących potencjalne miejsca m6A.
    7. Wykonaj analizę qPCR z użyciem primerów specyficznych dla Nrf2 i oblicz wzbogacenie względem wejściowego RNA.
      UWAGA: Jeśli wykrywanie jest niespójne, zoptymalizuj czas fragmentacji (4-6 min), aby poprawić powtarzalność; Ilościowy benchmark: stosunek sygnału do szumu >15:1 w porównaniu do sterowania IgG.

4. Analiza i walidacja białek

  1. Ekstrakcja białek i ilościowa
    1. Komórki lizowe (1 × 106 komórek ) lub homogenizują próbki tkanek (100 mg tkanki prążkowej) w 200 μL buforu radioimmunoprecipitacyjnego (RIPA) zawierającego inhibitory proteazy (1 mM fenylometylosulfonylowofluorku (PMSF), 1 μg/mL leupeptyny, 1 μg/mL pepstatyny A) oraz inhibitory fosfatazy (1 mM ortowanadat sodu, 5 mM fluorku sodu).
    2. Inkubuj lizaty na lodzie przez 30 minut z okresowym wirowaniem (co 10 minut przez 10 sekund).
    3. Wirówka w 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe i zebrać supernatant.
    4. Ilościowo określ stężenie białka za pomocą testu kwasu bicynchoninowego (BCA) ze standardami zawierania albuminy surowicy bydłej (0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 μg/mL) w trzech pomiarach.
    5. Zweryfikować integralność białek, analizując poziomy białek housekeeping (GAPDH, oczekiwane MW: 36 kDa) we wszystkich próbkach za pomocą Western Blot.
  2. Analiza zachodniej plamy
    1. Przygotuj próbki białka o równym obciążeniu (30-50 μg) w buforze elektroforezy elektroforezy sodowo-dodecylo-liakrylamidowej (SDS-PAGE) (końcowe stężenia: 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerol, 5% β-merkaptoetanol, 0,003% bromofenolowy błękit) i denaturuj w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
    2. Oddzielne białka przez SDS-PAGE przy użyciu żeli poliakrylamidowych 10%, pracując przy napięciu 80 V przez 30 minut, a następnie 120 V przez 90 minut w buforze Tris-glycine-SDS.
    3. Przenosi białka do membran poliwinylidenfluorku (PVDF) za pomocą systemu transferu półsuchego (400 mA przez 90 minut) w buforze transferowym (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 20% metanolu).
    4. Potwierdź efektywność transferu za pomocą odwracalnego barwienia białek (Ponceau S: 0,1% w 5% kwasie octowym przez 5 minut) przed przystąpieniem do inkubacji przeciwciał.
    5. Błony blokuj 5% mlekiem beztłuszczowym w TBST (TBS + 0,1% Tween-20) na 1 godzinę w RT z delikatnym mieszaniem.
    6. Inkubuj z pierwotnymi przeciwciałami rozcieńczonymi w 1:1000 w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C i delikatnie mieszając.
    7. Błony płucze się trzy razy metodą TBST (po 10 minut) i inkubuj z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP (rozcieńczenie 1:5000) przez 1 godzinę w RT.
    8. Wykrywanie pasm białek za pomocą zwiększonej chemiluminescencji i ilościowe za pomocą densytometrii.
    9. Normalizacja ekspresji białek docelowych do kontroli obciążenia (GAPDH) i walidacja specyficzności przeciwciał przy użyciu odpowiednich kontrol (blokowanie peptydów dla przeciwciał pierwotnych, kontrolne tylko wtórne).

5. Ocena behawioralna i analiza funkcjonalna

  1. Test umiejscowienia kończyn przednich
    1. Pozwól myszy przyzwyczaić się do środowiska testowego (ciche pomieszczenie, 22 °C, słabe oświetlenie) przez 30 minut przed oceną.
    2. Chwyć mysz delikatnie za grzbietową skórę, zawieszając wszystkie cztery kończyny około 0,5 cm nad krawędzią stołu, jednocześnie upewniając się, że mysz nie widzi powierzchni stołu.
    3. Pędzlić wibrysy po obu stronach przy krawędzi stołu, aby wywołać odruch ustawiania i zapisać udane ułożenie kończyn przednich w ciągu 2 sekund.
    4. Wykonaj 10 prób na każdą stronę z 30-sekundowymi odstępami między próbami, naprzemiennie lewą i prawą stroną.
    5. Przeprowadzaj testy w stałych warunkach oświetleniowych (50-100 luksów) i o porze dnia (13:00-17:00), aby zminimalizować wpływ okołodobowy.
    6. Wskaźnik sukcesu oblicz jako procent udanych praktyk: (udane praktyki/łączna liczba prób) × 100.
  2. Przyspieszenie testu rotarodów
    1. Ustaw aparat rotarod na początkową prędkość 4 obr./min z liniowym przyspieszeniem do 40 obr./min przez 5 minut.
    2. Trekuj myszy na rotarodzie przez 3 kolejne dni (3 próby dziennie, co 15 minut) przed testami, aby zminimalizować efekty nauki.
    3. Standaryzuj warunki testowe, w tym RT (22 ± 2 °C), oświetlenie (100 luksów) oraz poziomy szumu tła (<50 dB).
    4. Umieść mysz na obracającym się prętze i natychmiast rozpocznij protokół przyspieszania.
    5. Rekordowa latencja opadu (czas od początku do upadku myszy lub zakończenia 5-minutowej próby) dla każdego testu, testując 5 razy na zwierzę z 15-minutowymi przerwami na odpoczynek.
    6. Oblicz średnie opóźnienie z trzech najdłuższych prób, aby zminimalizować zmienność wynikającą z czynników motywacyjnych.
  3. Test na otwartym polu
    1. Użyj aparatu na otwartym polu (50 cm × 50 cm × przezroczysta skrzynka akrylowa o średnicy 50 cm) z systemem śledzenia wideo umieszczonym 1 m nad areną.
    2. Czyść urządzenia 70% etanolem między zwierzętami (spryskanie i wycieranie, 5-minutowe suszenie na powietrzu), aby wyeliminować sygnały zapachowe.
    3. Umieść mysz na środku urządzenia i nagrywaj aktywność przez 10 minut przy stałym oświetleniu (200 luksów) z nagrywaniem wideo w 30 fps.
    4. Analizuj wiele parametrów za pomocą automatycznego oprogramowania do śledzenia:
      Całkowita przebyta odległość (cm)
      Czas strefy środkowej (definiowany jako 10 cm od ścian, podawany w s)
      Prędkość ruchu (cm/s)
      Czas spędzony na obrzeżach vs strefy środkowe
  4. Zdefiniuj strefę centralną jako 10 cm od ścian i ilościowo określ czas spędzony oraz pokonany dystans w strefach centralnych w porównaniu do stref peryferyjnych.

6. Mikroskopia zaawansowana i obrazowanie

  1. Barwienie DHE do wykrywania ROS
    1. Przygotowuj świeży roztwór dihydroetydu (DHE) w stężeniu 10 μM w PBS tuż przed użyciem (chronić przed światłem).
    2. Wykonaj kolorowanie koimmunofluorescencyjne łącząc DHE z przeciwciałem hydroksylazy tryptofanu 2 (TPH2) (rozcieńczenie 1:500), aby konkretnie zidentyfikować neurony serotoniny.
      UWAGA: To podwójne podejście oznaczania umożliwia rozróżnienie produkcji ROS w ciałach komórek neuronów TPH2 z powodu stresu oksydacyjnego w otaczających komórkach glejowych, opierając się na zasadzie, że DHE po utlenieniu przez nadtlenek tworzy fluorescencyjne produkty nieprzepustne membranie, które pozostają lokalizowane w komórce pochodzenia.
    3. Inkubuj przekroje tkanek (o grubości 20 μm) roztworem DHE przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemnych warunkach w nawilżonej komorze.
    4. Uwzględnić negatywne kontrole (brak DHE) i dodatnie (leczenie 100 μMH2O2 przez 30 minut) w celu weryfikacji specyficzności detekcji ROS.
    5. Przemyj sekcje trzy razy PBS i montuj z medium anty-fade.
    6. Obraz wykonany mikroskopią fluorescencyjną (DHE: wzbudzenie 518 nm/emisja 605 nm, TPH2: wzbudzenie 488 nm/emisja 525 nm) z jednolitymi ustawieniami ekspozycji (200 ms) na wszystkich próbkach; Systemy obrazowania kalibrowano co tydzień za pomocą standardowych kulek fluorescencyjnych (stosunek sygnału do szumu > 20:1).
    7. Ilościowo określić intensywność fluorescencji tylko w komórkach TPH2-dodatnich, używając oprogramowania ImageJ ze standaryzowanymi protokołami analizy (próg: 50-255, rozmiar cząstek: 10-∞ pikseli2). Ustalenie granic ROI na podstawie immunoreaktywności TPH2, aby zapewnić pomiar stresu oksydacyjnego szczególnie w neuronach serotonergicznych, jednocześnie wykluczając sygnały z sąsiednich mikroglejów, astrocytów lub innych typów komórek. Dla każdego zwierzęcia przeanalizuj co najmniej 50 neuronów TPH2 w wielu przekrojach tkanek.
  2. Immunohistochemia
    1. Utrwalić fragmenty tkanki w 4% paraformaldehydu w PBS przez 24 godziny w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem.
    2. Susz przez serię ethanolu z klasą (70%, 80%, 90%, 95%, 100% × 2, 1 godzinę każdy) i osadzaj w parafinie za pomocą automatycznego procesora.
    3. Wyciń przekroje o wymiarach 5 μm za pomocą mikrotomu i mocuj na naładowanych szkiełkach szklanych, zapewniając 3-4 przekroje na jeden przesuw.
    4. Odparaffiniuj fragmenty za pomocą ksylenu (2 × 10 minut) i nawodnij wodą przez oczyszczony etanol.
    5. Wykonaj pobranie antygenu za pomocą buforu cytrynianowego (10 mM cytrynianu sodu, pH 6,0) w mikrofalówce (750 W przez 10 minut z 2-minutowymi przerwami chłodzenia).
    6. Walidacja specyficzności przeciwciał przy użyciu odpowiednich negatywnych kontrol (brak pierwotnych przeciwciał) oraz tkanek kontrolnych (przekroje mózgu znane z ekspresji białek docelowych).
    7. Blokuj endogenną aktywność nadtlenku wodoru 3% w metanolu przez 10 minut w RT.
    8. Stosuj przeciwciała pierwotne przez noc w temperaturze 4 °C w nawilżonej komorze.
    9. Wykrywaj za pomocą przeciwciał wtórnych sprzężonych z HRP (rozcieńczenie 1:500, 1 godzina przy RT) oraz chromogenu DAB (inkubuj do momentu powstania brązowego koloru, zazwyczaj 2-5 minut).
    10. Nanoś kontrbarwę hematoksyliną (30 s), odsusz, przezroczystą i mocuj na stałym nośniku.
    11. Ilościowe komórki dodatnie za pomocą metod stereologicznych z systematycznym losowym próbkowaniem (co piąta sekcja, 3 klatki liczenia na sekcję, 40× powiększenie).

7. Analiza statystyczna i walidacja danych

  1. Projekt i analiza statystyczna
    1. Wykonaj analizę mocy, aby określić odpowiednie rozmiary próbek do wykrywania biologicznie istotnych różnic (rozmiar efektu ≥ 0,8, moc ≥ 0,80, α = 0,05) przy użyciu oprogramowania G*Power 3.1.9.7.
    2. Zweryfikować normalność danych za pomocą testu Shapiro-Wilka i ocenić jednorodność wariancji za pomocą testu Levene'a przed analizą parametryczną.
    3. Analizuj dane za pomocą oprogramowania statystycznego z odpowiednimi testami statystycznymi opartymi na projektowaniu eksperymentów i rozkładzie danych.
    4. Zastosowanie jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) dla porównań jednoczynnikowych oraz dwukierunkowej ANOVA dla projektów faktorialnych (np. traktowanie × interakcji czasowych).
    5. Stosuj test post hoc Tukeya do wielokrotnych porównań, gdy ANOVA wykazuje istotność (p < 0,05), stosując korektę Bonferroniego tam, gdzie jest to stosowne.
    6. Ustaw próg istotności statystycznej na p < 0,05 dla wszystkich analiz z dodatkową notacją p < 0,01 oraz p < 0,001.
    7. Zgłoś rozmiary efektów (Cohen's d lub η2) oraz 95% przedziały ufności wraz z wartościami p, aby zapewnić kompleksową interpretację statystyczną.
    8. Dane przedstawione jako średnia ± SEM z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów, z poszczególnymi punktami danych pokazanymi przy n ≤ 10.
      UWAGA: Wszystkie eksperymenty hodowli komórkowej powinny być niezależnie powtarzane co najmniej trzy razy, przy czym każdy eksperyment powinien zawierać odpowiednie grupy kontrolne i wiele technicznych powtórzeń, a zaobserwowana zmienność (np. CV <15% dla danych behawioralnych) była minimalizowana poprzez zaślepianie i standaryzowane pomiary czasu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół skutecznie wykazuje, że ekspresja Mettl3 spada w komórkach mikroglejowych leczonych LPS (Rysunek 1), co potwierdzają zarówno spadki poziomu mRNA, jak i białek w porównaniu z grupami kontrolnymi (Rysunek 1B,C). Analiza ELISA potwierdza skuteczną aktywację zapalną wywołaną przez LPS poprzez podwyższone poziomy IL-6 i TNF-α w supernatantach hodowlowanych (Rysunek 1A).

Analiza MeRIP-qPCR ujawnia, że ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istnieje kilka kluczowych kroków, które wymagają szczególnej uwagi, aby zapewnić powtarzalne wyniki. Czas aktywacji LPS jest kluczowy – reakcje zapalne osiągają szczyt po 24 godzinach po leczeniu, a do każdego eksperymentu zalecamy przygotowanie świeżego roztworu LPS, ponieważ przechowywane roztwory mogą stracić bioaktywność19,20. W analizie MeRIP-qPCR jakość przeciwciał jest kluczowa. Stwierdziliśmy, że walidacja przeciwciał przy użyciu znanych pozytywnych i uje...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych ani konfliktów interesów związanych z tą pracą. Żaden autor nie ma żadnych relacji finansowych z firmami, których produkty są wymienione w tym artykule.

Podziękowania

Autorzy dziękują personelowi technicznemu Szpitala Ludowego Feicheng oraz Szpitala Yantai Yantaishan za pomoc w procedurach eksperymentalnych i opiece nad zwierzętami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wektory wirusowe AAV9Obiekt Vector CoreZwyczajZawierające konstrukty Nrf2
Przyspieszający rotarodUgo Basile47600Do testów behawioralnych
Przeciwciało anty-GAPDHTechnologia sygnalizacji komórkowej5174Przeciwciało pierwotne, 1:5000
Przeciwciało przeciw GSDMDAbcamab219800Przeciwciało pierwotne, 1:1000
Przeciwciało przeciw Iba1Wako019-19741Przeciwciało pierwotne, 1:500
Przeciwciało anty-NLRP3AdipoGenAG-20B-0014Przeciwciało pierwotne, 1:1000
Przeciwciało anty-Nrf2Abcamab62352Przeciwciało pierwotne, 1:1000
Przeciwciało przeciw SLC6A4Novus BiologicalsNBP1-85726Przeciwciało pierwotne, 1:500
Przeciwciało przeciw TPH2MilliporeMAB847Przeciwciało pierwotne, 1:500
Zestaw do testowania białek BCAPrzebijać23225Dla ilościowej ilościowości białek
Komórki mikroglejowe BV2Biologia ShengenSG-BV2Linia komórek mikrogleja myszy
Myszy C57BL/6JLaboratorium Vital River2138-tygodniowe dziecko, 19-26 g
Zestaw do frakcjonowania komórekTechnologia sygnalizacji komórkowej9038Separacja jądrowo-cytoplazmatyczna
Całkowity wysokoglukozowy DMEMGibco11965092Pożywka hodowla komórkowa
DAB ChromogenLaboratoria VectorSK-4100Dla immunohistochemii
Wiertarka dentystycznaNarzędzia Nauki Ścisłej18000-17Do wiercenia dziurów z żarnem
DHE (dihydroetyd)Sondy molekularneD11347Wykrywanie ROS
ELISA Kit (IL-1β)R& D SystemsMLB00CMysz IL-1β wykrywanie
ELISA Kit (IL-18)R& D Systems7625Wykrywanie IL-18 przez mysz
ELISA Kit (IL-6)R& D SystemsM6000BWykrywanie IL-6 przez mysz
ELISA Kit (TNF i alfa;)R& D SystemsMTA00BMysz TNF i alfa; wykrywanie
Serum bydlęce płodoweGibco16000044Suplement hodowli komórkowej
Przeciwciało wtórne sprzężone z HRPJackson ImmunoResearch111-035-003Antykrólik, 1:10000
IzofluranNauki o życiu z napędem na tylne kołaR510-22Środek znieczulający
Zestaw do analiz LALLonza50-647UWalidacja aktywności LPS
Lipofektamin transfekcyjny reagentInvitrogen11668019Dla transfekcji komórkowej
LPS (lipopolisacharyd)Sigma-AldrichL2630Z E. coli, 1 mg/mL wywaru
Przeciwciało m6ASystemy synapcyjne202003Dla MeRIP, 1:200
Pompa mikrostrzykawkowaAparat Harvarda70-3007Dla wstrzyknięć stereotaktycznych
MPTPSigma-AldrichM0896Neurotoksyna, 30 mg/kg
Aparat otwartyANY-mazeZwyczaj50 cm i ostry; 50 cm i ostry; 50 cm
ParaformaldehydSigma-AldrichP61484% w PBS
Wektor pcDNA3.1InvitrogenV79020Wektor ekspresji
Penicylina-StreptomycynaGibco15140122Roztwór antybiotykowy
Premix Ex Taq II KitTakaraRR820ADla qPCR
Zestaw RT PrimeScriptTakaraRR037ATranskrypcja odwrotna
Membrana PVDFMilliporeIPVH00010Dla Western blot
Bufor RIPATechnologia sygnalizacji komórkowej9806Ekstrakcja białek
siRNA (Mettl3)RiboBioZwyczajWalidacja sekwencji docelowej
Stereotaktyczna ramaNauki o życiu z napędem na tylne koła68001Do operacji mózgu
Odczynnik TRIzolInvitrogen15596026Ekstrakcja RNA
Trypan BlueSigma-AldrichT8154Barwienie żywotności komórek

Bibliografia

  1. Poewe, W. Parkinson disease primer-a true team effort. Nat Rev Dis Primers. 6 (1), 31(2020).
  2. Badanjak, K., Fixemer, S., Smajić, S., Skupin, A., Grünewald, A. The contribution of microglia to neuroinflammation in Parkinson's disease. Int J Mol Sci. 22 (9), 4676(2021).
  3. Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140 (6), 918-934 (2010).
  4. Lee, Y., Lee, S., Chang, S. -C., Lee, J. Significant roles of neuroinflammation in Parkinson's disease:therapeutic targets for PD prevention. Arch Pharm Res. 42 (5), 416-425 (2019).
  5. Yao, L., et al. Translational evaluation of metabolic risk factors impacting DBS efficacy for PD-related sleep and depressive disorders:preclinical, prospective and cohort studies. Int J Surg. 111 (1), 543-566 (2025).
  6. Rodríguez-Gómez, J. A., et al. Microglia:agents of the CNS pro-inflammatory response. Cells. 9 (7), 1717(2020).
  7. Nguyen, M., Palm, N. W. Gut instincts in neuroimmunity from the eighteenth to twenty-first centuries. Semin Immunopathol. 44 (5), 569-579 (2022).
  8. Pajares, M., Rojo, A. I., Manda, G., Boscá, L., Cuadrado, A. Inflammation in Parkinson's disease:mechanisms and therapeutic implications. Cells. 9 (7), 1687(2020).
  9. Sampson, T. R., et al. Gut microbiota regulate motor deficits and neuroinflammation in a model of Parkinson's disease. Cell. 167 (6), 1469-1480.e12 (2016).
  10. Yao, L., et al. LRRK2 Gly2019Ser mutation promotes ER stress via interacting with THBS1/TGF-β1 in Parkinson's disease. Adv Sci. 10 (30), e2303711(2023).
  11. Haque, M. E., et al. Targeting the microglial NLRP3 inflammasome and its role in Parkinson's disease. Mov Disord. 35 (1), 20-33 (2019).
  12. Huang, Y., Xu, W., Zhou, R. NLRP3 inflammasome activation and cell death. Cell Mol Immunol. 18 (9), 2114-2127 (2021).
  13. Lee, E., et al. MPTP-driven NLRP3 inflammasome activation in microglia plays a central role in dopaminergic neurodegeneration. Cell Death Differ. 26 (2), 213-228 (2018).
  14. Humphries, F., et al. The E3 ubiquitin ligase Pellino2 mediates priming of the NLRP3 inflammasome. Nat Commun. 9 (1), 1560(2018).
  15. Berger, M., Gray, J. A., Roth, B. L. The expanded biology of serotonin. Annu Rev Med. 60 (1), 355-366 (2009).
  16. Filip, M., Bader, M. Overview on 5-HT receptors and their role in physiology and pathology of the central nervous system. Pharmacol Rep. 61 (5), 761-777 (2009).
  17. Yao, L., et al. MicroRNA-124 regulates the expression of MEKK3 in the inflammatory pathogenesis of Parkinson's disease. J Neuroinflammation. 15 (1), 13(2018).
  18. Fyodorov, D., Nelson, T., Deneris, E. Pet-1, a novel ETS domain factor that can activate neuronal nAchR gene transcription. J Neurobiol. 34 (2), 151-163 (1998).
  19. Deng, J., Chen, X., Chen, A., Zheng, X. m6A RNA methylation in brain injury and neurodegenerative disease. Front Neurol. 13, 995747(2022).
  20. Livneh, I., Moshitch-Moshkovitz, S., Amariglio, N., Rechavi, G., Dominissini, D. The m6A epitranscriptome:transcriptome plasticity in brain development and function. Nat Rev Neurosci. 21 (1), 36-51 (2019).
  21. Jiang, L., Li, X., Wang, S., Yuan, Z., Cheng, J. The role and regulatory mechanism of m6A methylation in the nervous system. Front Genet. 13, 962774(2022).
  22. Yao, L., et al. MicroRNA-124 regulates the expression of p62/p38 and promotes autophagy in the inflammatory pathogenesis of Parkinson's disease. FASEB J. 33 (7), 8648-8665 (2019).
  23. Huang, H., Camats-Perna, J., Medeiros, R., Anggono, V., Widagdo, J. Altered expression of the m6A methyltransferase METTL3 in Alzheimer's disease. eNeuro. 7 (5), (2020).
  24. Mathoux, J., Henshall, D. C., Brennan, G. P. Regulatory mechanisms of the RNA modification m6A and significance in brain function in health and disease. Front Cell Neurosci. 15, 671932(2021).
  25. Guo, F., et al. Genome-wide identification of m6A-associated single nucleotide polymorphisms in complex diseases of nervous system. Neurosci Lett. 817, 137513(2023).
  26. Romaschin, A. D., Klein, D. J., Marshall, J. C. Bench-to-bedside review:clinical experience with the endotoxin activity assay. Crit Care. 16 (6), 248(2012).
  27. Zhong, L., et al. METTL3 induces AAA development and progression by modulating N6-methyladenosine-dependent primary miR34a processing. Mol Ther Nucleic Acids. 21, 394-411 (2020).
  28. Justice, J. N., et al. Battery of behavioral tests in mice that models age-associated changes in human motor function. Age (Dordr). 36 (2), 583-592 (2014).
  29. Seibenhener, M. L., Wooten, M. C. Use of the Open Field Maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice. J Vis Exp. (96), e52434(2015).
  30. Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785(2014).
  31. Roundtree, I. A., Evans, M. E., Pan, T., He, C. Dynamic RNA modifications in gene expression regulation. Cell. 169 (7), 1187-1200 (2017).
  32. Song, M. -Y., Lee, D. -Y., Chun, K. -S., Kim, E. -H. The role of NRF2/KEAP1 signaling pathway in cancer metabolism. Int J Mol Sci. 22 (9), 4376(2021).
  33. He, F., Ru, X., Wen, T. NRF2, a transcription factor for stress response and beyond. Int J Mol Sci. 21 (13), 4777(2020).
  34. Schöller, E., et al. Interactions, localization, and phosphorylation of the m6A generating METTL3-METTL14-WTAP complex. RNA. 24 (4), 499-512 (2018).
  35. Li, G., et al. METTL3 plays a crucial function in multiple biological processes. Acta Histochem. 124 (6), 151916(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

piroptoza NLRP3zapalenie mikroglejumodyfikacja m6AMeRIP-qPCRmodel mysi MPTPWestern blotimmunohistochemia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.