Oś Mettl3/Nrf2 hamuje postęp choroby Parkinsona poprzez hamowanie pirostozy wywołanej NLRP3 w neuronach serotoniny

Choroba Parkinsona (PD) zajmuje drugie najczęstsze zaburzenie neurodegeneracyjne wśród osób starszych, dotykając około 2-3% osób w wieku 65 lat i starszych, co stanowi znaczące obciążenie zarówno dla rodzin, jak i społeczeństwa¹. Chociaż dokładne mechanizmy PD pozostają częściowo zrozumiane, narastające dowody wskazują na związek między rozwojem PD a wyzwaniami w transmisji neuronalnej, a także neurozapaleniem wywołanym przez komórki mikroglejowe, co jest cechą częstą u starzejących się mózgów i różnych chorób neurodegeneracyjnych, w tym PD 2,3,4,5 . Mikroglej pełni funkcję wrodzonych komórek odpornościowych w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i jest niezbędny do utrzymania homeostazy mózgu⁶. Jednak utrzymująca się nadmierna aktywacja tych mikrogleju może wywołać przewlekłe reakcje neurozapalne, co ostatecznie przyczynia się do postępu choroby neurodegeneracyjnej.

Zarówno centralne, jak i obwodowe procesy zapalne znacząco wpływają na patologię PD ^7,8. Aktywacja komórek mikrogleju wywołuje reakcje zapalne wpływające na przeżycie neuronów⁹, a pojawiające się dowody wskazują na jej primowanie przez ligazy ubiquityny¹⁰. Spośród różnych szlaków zapalnych aktywacja białka 3 (NLRP3) zawierającego domenę zapalną NOD, LRR oraz domenę pyrynową jest głównym czynnikiem^regulującym mikroglej11. Aktywacja prowadzi do ekspresji NLRP3 i późniejszego złożenia kompleksu inflammasomu składającego się z adaptera domeny aktywacji i rekrutacji kaspaz (CARD) oraz pro-kaspazy-1, co kończy się rozszczepieniem białek i uwalnianiem^cytokin12. U pacjentów z Parkinsonysem oraz w różnych modelach zwierzęcych choroby zaobserwowano podwyższoną aktywację NLRP3, co prowadzi do śmierci neuronów. Warto zauważyć, że hamowanie NLRP3 wykazało działanie ochronne przeciwko patologii Parkinsonowej w modelach myszych, podkreślając kluczową rolę inflamasomu NLRP3 w wystąpieniu PD^13,14.

Sygnalizacja serotoniny (5-HT) jest istotnym mechanizmem regulacji nerwowej, wpływającym na liczne zachowania i funkcje fizjologiczne poprzez interakcje z co najmniej 14 podtypami receptorów postsynaptycznych^15,16, w tym role w patologii OUN, jak opisano w kompleksowych przeglądach¹⁷. Rozległy neuromodulacyjny wpływ systemu 5-HT jest kontrolowany przez około 26 000 neuronów^{w mózgu} gryzoni. Podczas gdy znaczna literatura łączy PD głównie z utratą neuronów dopaminergicznych, związek między neuronami 5-HT a PD jest mniej dokładnie zbadany.

Modyfikacja N6-metyladenozyny (m6A), najpowszechniejsza modyfikacja mRNA w komórkach eukariotycznych, jest kluczowa dla regulacji splicingu, stabilności i eksportu mRNA, wpływając tym samym na różne aktywności komórkowe¹⁹. Poziomy m6A są modulowane przez metylotransferazy i demetyloazy. Podwyższone modyfikacje m6A w mózgu zostały powiązane z rozwojem nerwowym, którego dysregulacja jest ściśle powiązana z chorobami neurodegeneracyjnymi^20,21, w tym zmienioną ekspresją METTL3 w modelach choroby Alzheimera²². Na przykład nagromadzenie metylotransferazy 3 (METTL3) w nierozpuszczalnej frakcji tkanek mózgowych po śmierci pacjentów z chorobą Alzheimera zostało pozytywnie skorelowane z poziomami nierozpuszczalnego białka Tau²³. Ponadto znaczący spadek poziomu m6A w prążkowiu może prowadzić do znacznego spadku poziomu neuroprzekaźników dopaminy²⁴. Warto zauważyć, że dwanaście polimorfizmów pojedynczych nukleotydów związanych z m6A wykazało istotne powiązania z podatnością na PD²⁵. Protokół ten ustanawia kompleksowe metody badania sposobu, w jaki modyfikacje m6A za pomocą METTL3 regulują mikroglejową pirostozę na osi Nrf2/NLRP3, co ostatecznie wpływa na przeżywalność neuronów serotoniny w modelach Parkinson. Model ostrego MPTP in vivo oraz model LPS in vitro zostały wybrane ze względu na silną indukcję odpowiedzi neurozapalnych, choć przewlekłe paradygmaty mogą uzupełnić przyszłe badania, jak omówiono poniżej.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były przeprowadzane za zgodą Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Szpitala Ludowego w Feicheng (numer zatwierdzenia IACUC-2024-118) i przeprowadzane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi oraz ustalonymi zasadami etycznymi badań na zwierzętach laboratoryjnych. Protokoły badania zapewniły humanitarną opiekę i traktowanie wszystkich zwierząt, ze szczególnym naciskiem na minimalizację cierpienia i cierpienia, przy jednoczesnym przestrzeganiu zarówno standardów instytucjonalnych, jak i wytycznych ARRIVE dotyczących odpowiedzialnych praktyk badawczych na zwierzętach.

1. Model hodowli komórek i aktywacji mikrogleju

1. Przygotowanie i utrzymanie ogniw BV2
   1. Szybko rozmroz zamrożone zapasy komórek mikroglejowych BV2 w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 minuty, zapewniając delikatne mieszanie, aby zapobiec szokowi termicznemu.
   2. Wiruj rozmrożoną zawiesinę ogniwową w dawce 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT), aby usunąć krioprotektant.
   3. Odrzuć supernatant i ponownie zawiesijcie pellet komórkowy w 10 mL pełnego wysokoglukozowego pożywki DMEM, uzupełnionego o 10% FBS, 1% penicylin-streptomycyny oraz 2 mM L-glutaminy.
   4. Przeprowadz ocenę żywotności komórek metodą wykluczenia trypan blue (wymieszaj 10 μL zawiesiny komórkowej z 10 μL 0,4% trypan blue, licz za pomocą hemocytometru), zapewniając >95% żywotności przed dalszym rozpoczęciem.
   5. Komórki płytowe w kolbach hodowlanych T75 o gęstości 1×^{10 6} komórek w kolbie i przechowywane w nawilżonym inkubatorze hodowli komórek w temperaturze 37°C z 5%_CO2.
   6. Przepuszczanie komórek co 48 godzin przy osiągnięciu 80-85% konfluencji, stosując standardowe procedury trypsynizacji.
      UWAGA: Utrzymuj spójne numery fragmentów (fragmenty 3-8), aby zapewnić powtarzalne reakcje zapalne. Wszystkie eksperymenty z hodowlą komórek były niezależnie powtarzane co najmniej trzy razy, z trzema technicznymi replikacjami na warunki, aby zminimalizować zmienność.
2. Mikroglejowa aktywacja indukowana przez LPS
   1. Komórki BV2 zasiewaj w płytkach 6-dołkowych w odcinku 2 × 10^{5 komórek} na dołek w 2 mL kompletnego medium 24 godziny przed zabiegiem.
   2. Przygotuj roztwór LPS w stężeniu 1 mg/mL w sterylnym PBS, filtruj przez filtr 0,22 μm i przechowuj w jednorazowych alikwotach w temperaturze -20 °C.
   3. Zweryfikować aktywność LPS za pomocą testu lizatu amebocytów Limulus (LAL), aby potwierdzić stężenie endotoksyny przed każdym eksperymentem²⁶.
   4. Rozcieńcz materiał LPS do stężenia roboczego 1 μg/mL w bezsurowicowym DMEM tuż przed użyciem.
   5. Usuń podłoże hodowlowane z dołków i przepłucz komórki dwukrotnie sterylnym PBS.
   6. Dodaj 2 mL medium zawierającego LPS (1 μg/mL końcowe stężenie) do studni leczniczych oraz bezsurowicowego DMEM w celu kontrolowania studni.
   7. Inkubuj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5%_CO2 w celu aktywacji zapalnej.
   8. Uwzględnić dołki z dodatnim kontrolem leczone czynnikiem martwiczym guza 100 ng/mL (TNF)-α oraz dołki kontrolne ujemne wyłącznie z nośnikiem (PBS), aby potwierdzić odpowiedź zapalną.
      UWAGA: Przygotuj świeży roztwór LPS dla każdego eksperymentu, aby utrzymać stałą bioaktywność. Jeśli odpowiedź zapalna jest słaba (np.
3. Nadekspresja i nokdaun Mettl3
   1. Projektowanie i synteza małych sekwencji interferującego RNA (siRNA) skierowanych na Mettl3 oraz zaszyfrowane sekwencje kontrolne przy użyciu standardowych protokołów syntezy oligonukleotydów. Wybierz sekwencje docelowe z regionu kodującego mRNA Mettl3 (przystęp GenBank: NM_019721) o długości nukleotydów 19-21, zapewniając zawartość GC na poziomie 40-60%²⁷.
   2. Walidacja sekwencji siRNA za pomocą analizy BLAST, aby potwierdzić specyficzność i uniknąć efektów poza celem (zapewnić <70% homologii z genami niedocelowymi).
   3. Przygotować wektory nadekspresji zawierające pełnowymiarowe cDNA Mettl3 sklonowane do wektora pcDNA3.1 przy użyciu miejsc restrykcyjnych EcoRI i XhoI.
   4. Komórki transfekcyjne przy 70-80% konfluencji z wykorzystaniem kationowego reagenta transfekcyjnego lipidowego:
      1. Wymieszaj 2 μL odczynnika transfekcyjnego kationowego lipidowego z siRNA o pojemności 50 pmol lub 2 μg DNA plazmidowego w 100 μL ośrodka Opti-MEM.
      2. Inkubuj mieszankę przez 15 minut w RT.
      3. Dodawaj kompleks transfekcyjny kroplami do komórek i inkubuj przez 4-6 godzin, zanim przejdziesz do świeżego, kompletnego nośnika.
   5. Inkubować komórki transfekowane przez 48 godzin przed leczeniem LPS, aby umożliwić odpowiednie zmiany w ekspresji białka.
   6. Potwierdź efektywność transfekcji za pomocą ko-transfekcji fluorescencyjnej reporterowej (100 ng pEGFP-C1 na dołek), celując w >70% sprawności mikroskopią fluorescencyjną przed rozpoczęciem działania.

2. Rozwój modeli zwierzęcych i projektowanie eksperymentalne

1. Przygotowanie i randomizacja zwierząt
   1. Pobierz myszy C57BL/6J z Vital River Laboratory, zapewniając równy stosunek samców do samic, w wieku 8 tygodni, ważących 19-26 g.
   2. Zwierzęta domowe w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF) z cyklem światła i ciemności 12:12 godzin, kontrolowaną temperaturą (22 ± 2°C) oraz wilgotnością (50-60%).
   3. Pozwól na 7-dniowy okres aklimatyzacji z ad libitum dostępem do standardowego jedzenia i wody.
   4. Przeprowadz podstawowe oceny behawioralne podczas aklimatyzacji: Przeprowadz kompleksowe oceny behawioralne, w tym test umiejscowienia kończyn przednich (10 prób na stronę), przyspieszającą ocenę rotarodu (4-40 rpm w ciągu 5 minut) oraz analizę aktywności lokomotorycznej na otwartym polu (sesje 10-minutowe w aparatach o wymiarach 50 cm × 50 cm × 50 cm)28,29,30.
   5. Losowo przypisuj zwierzęta do grup eksperymentalnych (n = 6 na grupę) za pomocą komputerowej randomizacji, aby zminimalizować błędy: sham, Model, Model+Nrf2-KD, Model+oe-Nrf2.
   6. Wdroż projekt eksperymentu ślepego, w którym badacze prowadzący oceny behawioralne nie są świadomi przydziałów grupowych.
2. Model choroby Parkinsona indukowany przez 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydynę (MPTP)
   1. Przygotować roztwór MPTP w ilości 30 mg/kg w bezpłodnej soli fizjologicznej tuż przed wstrzyknięciem, rozpuszczając 15 mg chlorku MPTP w 5 ml soli fizjologicznej i dostosowując objętość do masy zwierzęcia.
      UWAGA: MPTP jest wysoce neurotoksyczny. Obchodzić się z nim w okapie chemicznym z odpowiednim sprzętem ochronnym, w tym podwójnymi rękawicami i fartuchem laboratoryjnym.
   2. Podawaj MPTP przez zastrzyk dootrzewnowy w dawce 30 mg/kg masy ciała (objętość zastrzyku 10 mL/kg) przez trzy kolejne dni o tej samej porze każdego dnia (09:00 ± 30 min).
   3. Wstrzykuj zwierzętom z grupy pozornej o równoważnych objętościach bezpłodnej soli fizjologicznej według identycznego harmonogramu podawania.
   4. Codziennie monitoruj zwierzęta pod kątem oznak stresu, utraty masy ciała (>15% uznawanej za punkt końcowy) lub reakcji niepożądanych podczas okresu podawania MPTP, korzystając ze standaryzowanych arkuszy punktacji.
   5. Utrzymuj zwierzęta przez 8 dni po ostatnim zastrzyku, aby umożliwić rozwój neurodegeneracji.
      UWAGA: Zwierzęta mogą być normalnie trzymane w tym okresie przy ciągłym monitorowaniu.
3. Stereotaktyczne zastrzyki wirusowe
   1. Przygotuj wektory wirusowe AAV9 poprzez potrójną transfekcję HEK293T komórek z użyciem polietyliminy (PEI; stosunek DNA:PEI 1:3), pozyskaj po 72 godzinach po transfekcji, oczyść za pomocą ultrawirowania gradientu joduksanolowego (177 000 × g przez 2 godziny) oraz skoncentruj za pomocą filtrów odśrodkowych, aby uzyskać 1 × 10 kopii genomu¹² na mL.
   2. Walidacja miana wirusa za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) za pomocą starterów skierowanych do regionów ITR, zapewniając miano osiągające 1 × 10¹² kopii genomu/mL przy standardowej analizie krzywej.
   3. Walidacja miarnika wirusa za pomocą ilościowego PCR opartego na SYBR Green z primerami specyficznymi dla ITR, wykonywanie seryjnego rozcieńczania znanych standardów oraz obliczanie kopii genomu za pomocą analizy krzywej standardowej. Potwierdz brak zakażenia wirusem zdolnym do replikacji za pomocą p24 ELISA.
   4. Znieczulanie myszy izofluranem (indukcja 3%, utrzymanie 1,5-2%) podanym z przepływem tlenu 0,8-1,0 l/min przez stożek nosowy, monitorując częstość oddechu (60-100 oddechów/min) oraz odruch szczypania palców przez cały zabieg. Zabezpiecz mysz w stereotaktycznej ramce i nałóż maść okulistyczną, aby zapobiec wysychaniu rogówki.
   5. Zabezpiecz mysz w stereotaktycznej ramce i nałóż maść okulistyczną, aby zapobiec wysychaniu rogówki.
   6. Wykonaj nacięcie na skalpę o średnicy 1,5 cm za pomocą sterylnego ostrza skalpela i zidentyfikuj punkt orientacyjny bregmy za pomocą współrzędnych stereotaktycznych z dokładnością 0,1 mm.
   7. Oblicz współrzędne wstrzyku dla prążkowania: pręcikowo-przednie-tylne -0,5 mm, przyśrodkowo-boczne ±2,0 mm, grzbietowo-brzuszne -3,0 mm od bregmy.
   8. Wykonaj pilotażowe zastrzyki z fluorescencyjnym znacznikiem (np. zielonym białkiem fluorescencyjnym [GFP]) w celu weryfikacji celowania, potwierdzając >80% współlokalizacji z markerami mikrogleju (Iba1) za pomocą immunohistochemii przed eksperymentalnymi iniekcjami.
   9. Obniż igłę do wtrysku (33-G) do głębokości z prędkością 1 mm/min i wstrzykni 2 μL zawiesiny wirusowej z prędkością 0,2 μL/min za pomocą mikropompki strzykawkowej z automatycznym kontrolerem. Obniż igłę do docelowej głębokości i wstrzyknij 2 μL zawiesiny wirusowej z prędkością 0,2 μL/min za pomocą pompy mikrostrzykawkowej.
   10. Utrzymuj pozycję igły przez 5 minut po wstrzyknięciu, aby zapobiec cofaniu się.
   11. Powoli wyjmuj igłę z prędkością 0,5 mm/min, zamykaj nacięcie szwami jedwabnymi 4-0 w wzorze przerwanym i pozwól na regenerację z narkoczenia na podgrzewanym podkładzie do regeneracji.
   12. Podawaj pooperacyjne środki przeciwbólowe (karprofen 5 mg/kg podskórnie raz dziennie przez 3 dni) i monitoruj rekonwalescencję przez 24 godziny za pomocą szczegółowych arkuszy obserwacyjnych.

3. Techniki i walidacja biologii molekularnej

1. Ekstrakcja RNA i kontrola jakości
   1. Pobranie komórek lub próbek tkanki mózgowej prążkowej bezpośrednio po eksperymentalnych punktach końcowych, poprzez humanitarne uśpienie zwierząt poprzez wdychanie_CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy; rozcinaj tkanki na lodzie, drobno mielę i enzymatycznie dysocjuj z 0,25% trypsyny przez 10 minut w temperaturze 37 °C, jeśli pobierasz komórki.
   2. Całkowite RNA należy wyodrębnić za pomocą odczynnika TRIzol (1 mL na 1 10^{6 komórek} lub 100 mg tkanki) z mechaniczną homogenizacją (20-25 pociągów w homogenizatorze dounce) oraz separacją fazową chloroformu (0,2 mL chloroformu na 1 mL TRIzolu).
   3. Ocena jakości RNA za pomocą spektrofotometrii (stosunek A260/A280 1,8-2,0) oraz elektroforezy żelowej (1% agarozy), aby potwierdzić pasma rybosomalne 28S i 18S.
   4. Ilościowo określ stężenie RNA za pomocą spektrofotometru.
   5. Przechowuj próbki RNA w temperaturze -80 °C w wodzie wolnej od nukleazy w temperaturze -80 °C z dodatkiem inhibitora RNazy (40 jednostek/μL) do czasu analizy.
2. Frakcjonowanie jądrowo-cytoplazmatyczne
   1. Należy zebrać komórki^{(2 ×} 10 6 minimalnie) i przemyć dwa razy lodowatym PBS (5 ml na płukanie, 5 minut wirowania przy 300 × g).
   2. Korzystaj z komercyjnego zestawu do frakcjonacji komórek zgodnie z następującym protokołem.
      1. Ponownie zawiesz pellet komórkowy w 200 μL buforu ekstrakcyjnego cytoplazmatycznego z inhibitorami proteazy.
      2. Inkubuj na lodzie przez 10 minut, z wirowaniem co 3 minuty.
      3. Wirować w 16 000 × g przez 5 minut w 4 °C i pobrać supernatant (frakcję cytoplazmatyczną).
      4. Przemyj granulek dwukrotnie buforem ekstrakcji cytoplazmatycznej.
      5. Ponownie zawiesić granulkę w 100 μL buforu ekstrakcyjnego jądrowego.
      6. Inkubuj na lodzie przez 40 minut, z wirowaniem co 10 minut.
      7. Wirówka na 16 000 × g przez 10 minut w 4 °C i pobiera supernatant (frakcję jądrową)
   3. Zweryfikować efektywność frakcjonowania poprzez analizę rozkładu markerów jądrowych (U6) i cytoplazmatycznych (GAPDH) za pomocą Western blot.
   4. Oddzielnie wyodrębniaj RNA z frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych.
   5. Analizuj poziomy mRNA Nrf2 w każdej frakcji za pomocą RT-qPCR z genami referencyjnymi specyficznymi dla frakcji.
3. Ilościowe PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)
   1. Syntetyzuj cDNA z 1 μg całkowitego RNA przy użyciu zestawu odczynników do transkrypcji odwrotnej z losowymi starterami.
   2. Wykonaj qPCR za pomocą zestawu Premix Ex Taq II z genetycznie specyficznymi starterami na systemie PCR w czasie rzeczywistym.
   3. Zweryfikować specyficzność zapalnika za pomocą analizy krzywej stopień i potwierdzić pojedynczy amplicon za pomocą elektroforezy żelowej.
   4. Stosuj następujące warunki cykliczne termiczne: początkowa denaturacja w 95 °C przez 10 minut, następnie 40 cykli 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s.
   5. Oblicz względne poziomy ekspresji mRNA za pomocą metody ^2-ΔΔCt z β-aktyną jako wewnętrznym punktem odniesienia.
   6. Uwzględnić kontrolę bez szablonu i zweryfikować stabilność genów referencyjnych w warunkach eksperymentalnych za pomocą analizy geNorm (wartość stabilności M < 0,5).
      UWAGA: Wyniki powtarzalności: współczynnik zmienności wewnątrz testu (CV) <10% w trzech niezależnych testach.
4. MeRIP-qPCR do analizy modyfikacji m6A
   1. Ekstrahować całkowite RNA (minimum 20 μg) i fragmentować do 100-200 nukleotydów za pomocą odczynnika fragmentacyjnego RNA (10 mM ZnCl₂, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0) w temperaturze 70 °C przez 5 minut.
   2. Wykonanie immunoprecypitacji z użyciem przeciwciał specyficznych dla m6A (2 μg na 20 μg RNA) przez noc w temperaturze 4 °C z rotacją (10 rpm) w buforze immunoprecipitacyjnym (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 750 mM NaCl, 0,5% NP-40).
   3. Zweryfikować specyficzność przeciwciał przy użyciu znanych kontrolnych RNA zmodyfikowanych i niemodyfikowanych m6A.
   4. Kompleksy immunoprecipitowane pięć razy przemyj buforem do mycia.
   5. RNA związane z elutem i transkrybują odwrotnie, używając losowych primerów.
   6. Odwrotne transkrybują eluowane RNA za pomocą przypadkowych starterów i wykonują analizę qPCR za pomocą primerów specyficznych dla Nrf2, obejmujących potencjalne miejsca m6A.
   7. Wykonaj analizę qPCR z użyciem primerów specyficznych dla Nrf2 i oblicz wzbogacenie względem wejściowego RNA.
      UWAGA: Jeśli wykrywanie jest niespójne, zoptymalizuj czas fragmentacji (4-6 min), aby poprawić powtarzalność; Ilościowy benchmark: stosunek sygnału do szumu >15:1 w porównaniu do sterowania IgG.

4. Analiza i walidacja białek

1. Ekstrakcja białek i ilościowa
   1. Komórki lizowe (1 × 10^{6 komórek} ) lub homogenizują próbki tkanek (100 mg tkanki prążkowej) w 200 μL buforu radioimmunoprecipitacyjnego (RIPA) zawierającego inhibitory proteazy (1 mM fenylometylosulfonylowofluorku (PMSF), 1 μg/mL leupeptyny, 1 μg/mL pepstatyny A) oraz inhibitory fosfatazy (1 mM ortowanadat sodu, 5 mM fluorku sodu).
   2. Inkubuj lizaty na lodzie przez 30 minut z okresowym wirowaniem (co 10 minut przez 10 sekund).
   3. Wirówka w 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe i zebrać supernatant.
   4. Ilościowo określ stężenie białka za pomocą testu kwasu bicynchoninowego (BCA) ze standardami zawierania albuminy surowicy bydłej (0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 μg/mL) w trzech pomiarach.
   5. Zweryfikować integralność białek, analizując poziomy białek housekeeping (GAPDH, oczekiwane MW: 36 kDa) we wszystkich próbkach za pomocą Western Blot.
2. Analiza zachodniej plamy
   1. Przygotuj próbki białka o równym obciążeniu (30-50 μg) w buforze elektroforezy elektroforezy sodowo-dodecylo-liakrylamidowej (SDS-PAGE) (końcowe stężenia: 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerol, 5% β-merkaptoetanol, 0,003% bromofenolowy błękit) i denaturuj w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
   2. Oddzielne białka przez SDS-PAGE przy użyciu żeli poliakrylamidowych 10%, pracując przy napięciu 80 V przez 30 minut, a następnie 120 V przez 90 minut w buforze Tris-glycine-SDS.
   3. Przenosi białka do membran poliwinylidenfluorku (PVDF) za pomocą systemu transferu półsuchego (400 mA przez 90 minut) w buforze transferowym (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 20% metanolu).
   4. Potwierdź efektywność transferu za pomocą odwracalnego barwienia białek (Ponceau S: 0,1% w 5% kwasie octowym przez 5 minut) przed przystąpieniem do inkubacji przeciwciał.
   5. Błony blokuj 5% mlekiem beztłuszczowym w TBST (TBS + 0,1% Tween-20) na 1 godzinę w RT z delikatnym mieszaniem.
   6. Inkubuj z pierwotnymi przeciwciałami rozcieńczonymi w 1:1000 w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C i delikatnie mieszając.
   7. Błony płucze się trzy razy metodą TBST (po 10 minut) i inkubuj z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP (rozcieńczenie 1:5000) przez 1 godzinę w RT.
   8. Wykrywanie pasm białek za pomocą zwiększonej chemiluminescencji i ilościowe za pomocą densytometrii.
   9. Normalizacja ekspresji białek docelowych do kontroli obciążenia (GAPDH) i walidacja specyficzności przeciwciał przy użyciu odpowiednich kontrol (blokowanie peptydów dla przeciwciał pierwotnych, kontrolne tylko wtórne).

5. Ocena behawioralna i analiza funkcjonalna

1. Test umiejscowienia kończyn przednich
   1. Pozwól myszy przyzwyczaić się do środowiska testowego (ciche pomieszczenie, 22 °C, słabe oświetlenie) przez 30 minut przed oceną.
   2. Chwyć mysz delikatnie za grzbietową skórę, zawieszając wszystkie cztery kończyny około 0,5 cm nad krawędzią stołu, jednocześnie upewniając się, że mysz nie widzi powierzchni stołu.
   3. Pędzlić wibrysy po obu stronach przy krawędzi stołu, aby wywołać odruch ustawiania i zapisać udane ułożenie kończyn przednich w ciągu 2 sekund.
   4. Wykonaj 10 prób na każdą stronę z 30-sekundowymi odstępami między próbami, naprzemiennie lewą i prawą stroną.
   5. Przeprowadzaj testy w stałych warunkach oświetleniowych (50-100 luksów) i o porze dnia (13:00-17:00), aby zminimalizować wpływ okołodobowy.
   6. Wskaźnik sukcesu oblicz jako procent udanych praktyk: (udane praktyki/łączna liczba prób) × 100.
2. Przyspieszenie testu rotarodów
   1. Ustaw aparat rotarod na początkową prędkość 4 obr./min z liniowym przyspieszeniem do 40 obr./min przez 5 minut.
   2. Trekuj myszy na rotarodzie przez 3 kolejne dni (3 próby dziennie, co 15 minut) przed testami, aby zminimalizować efekty nauki.
   3. Standaryzuj warunki testowe, w tym RT (22 ± 2 °C), oświetlenie (100 luksów) oraz poziomy szumu tła (<50 dB).
   4. Umieść mysz na obracającym się prętze i natychmiast rozpocznij protokół przyspieszania.
   5. Rekordowa latencja opadu (czas od początku do upadku myszy lub zakończenia 5-minutowej próby) dla każdego testu, testując 5 razy na zwierzę z 15-minutowymi przerwami na odpoczynek.
   6. Oblicz średnie opóźnienie z trzech najdłuższych prób, aby zminimalizować zmienność wynikającą z czynników motywacyjnych.
3. Test na otwartym polu
   1. Użyj aparatu na otwartym polu (50 cm × 50 cm × przezroczysta skrzynka akrylowa o średnicy 50 cm) z systemem śledzenia wideo umieszczonym 1 m nad areną.
   2. Czyść urządzenia 70% etanolem między zwierzętami (spryskanie i wycieranie, 5-minutowe suszenie na powietrzu), aby wyeliminować sygnały zapachowe.
   3. Umieść mysz na środku urządzenia i nagrywaj aktywność przez 10 minut przy stałym oświetleniu (200 luksów) z nagrywaniem wideo w 30 fps.
   4. Analizuj wiele parametrów za pomocą automatycznego oprogramowania do śledzenia:
      Całkowita przebyta odległość (cm)
      Czas strefy środkowej (definiowany jako 10 cm od ścian, podawany w s)
      Prędkość ruchu (cm/s)
      Czas spędzony na obrzeżach vs strefy środkowe
4. Zdefiniuj strefę centralną jako 10 cm od ścian i ilościowo określ czas spędzony oraz pokonany dystans w strefach centralnych w porównaniu do stref peryferyjnych.

6. Mikroskopia zaawansowana i obrazowanie

1. Barwienie DHE do wykrywania ROS
   1. Przygotowuj świeży roztwór dihydroetydu (DHE) w stężeniu 10 μM w PBS tuż przed użyciem (chronić przed światłem).
   2. Wykonaj kolorowanie koimmunofluorescencyjne łącząc DHE z przeciwciałem hydroksylazy tryptofanu 2 (TPH2) (rozcieńczenie 1:500), aby konkretnie zidentyfikować neurony serotoniny.
      UWAGA: To podwójne podejście oznaczania umożliwia rozróżnienie produkcji ROS w ciałach komórek neuronów TPH2 z powodu stresu oksydacyjnego w otaczających komórkach glejowych, opierając się na zasadzie, że DHE po utlenieniu przez nadtlenek tworzy fluorescencyjne produkty nieprzepustne membranie, które pozostają lokalizowane w komórce pochodzenia.
   3. Inkubuj przekroje tkanek (o grubości 20 μm) roztworem DHE przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemnych warunkach w nawilżonej komorze.
   4. Uwzględnić negatywne kontrole (brak DHE) i dodatnie (leczenie 100 μM_H2O2 przez 30 minut) w celu weryfikacji specyficzności detekcji ROS.
   5. Przemyj sekcje trzy razy PBS i montuj z medium anty-fade.
   6. Obraz wykonany mikroskopią fluorescencyjną (DHE: wzbudzenie 518 nm/emisja 605 nm, TPH2: wzbudzenie 488 nm/emisja 525 nm) z jednolitymi ustawieniami ekspozycji (200 ms) na wszystkich próbkach; Systemy obrazowania kalibrowano co tydzień za pomocą standardowych kulek fluorescencyjnych (stosunek sygnału do szumu > 20:1).
   7. Ilościowo określić intensywność fluorescencji tylko w komórkach TPH2-dodatnich, używając oprogramowania ImageJ ze standaryzowanymi protokołami analizy (próg: 50-255, rozmiar cząstek: 10-∞ pikseli²). Ustalenie granic ROI na podstawie immunoreaktywności TPH2, aby zapewnić pomiar stresu oksydacyjnego szczególnie w neuronach serotonergicznych, jednocześnie wykluczając sygnały z sąsiednich mikroglejów, astrocytów lub innych typów komórek. Dla każdego zwierzęcia przeanalizuj co najmniej 50 neuronów TPH2 w wielu przekrojach tkanek.
2. Immunohistochemia
   1. Utrwalić fragmenty tkanki w 4% paraformaldehydu w PBS przez 24 godziny w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem.
   2. Susz przez serię ethanolu z klasą (70%, 80%, 90%, 95%, 100% × 2, 1 godzinę każdy) i osadzaj w parafinie za pomocą automatycznego procesora.
   3. Wyciń przekroje o wymiarach 5 μm za pomocą mikrotomu i mocuj na naładowanych szkiełkach szklanych, zapewniając 3-4 przekroje na jeden przesuw.
   4. Odparaffiniuj fragmenty za pomocą ksylenu (2 × 10 minut) i nawodnij wodą przez oczyszczony etanol.
   5. Wykonaj pobranie antygenu za pomocą buforu cytrynianowego (10 mM cytrynianu sodu, pH 6,0) w mikrofalówce (750 W przez 10 minut z 2-minutowymi przerwami chłodzenia).
   6. Walidacja specyficzności przeciwciał przy użyciu odpowiednich negatywnych kontrol (brak pierwotnych przeciwciał) oraz tkanek kontrolnych (przekroje mózgu znane z ekspresji białek docelowych).
   7. Blokuj endogenną aktywność nadtlenku wodoru 3% w metanolu przez 10 minut w RT.
   8. Stosuj przeciwciała pierwotne przez noc w temperaturze 4 °C w nawilżonej komorze.
   9. Wykrywaj za pomocą przeciwciał wtórnych sprzężonych z HRP (rozcieńczenie 1:500, 1 godzina przy RT) oraz chromogenu DAB (inkubuj do momentu powstania brązowego koloru, zazwyczaj 2-5 minut).
   10. Nanoś kontrbarwę hematoksyliną (30 s), odsusz, przezroczystą i mocuj na stałym nośniku.
   11. Ilościowe komórki dodatnie za pomocą metod stereologicznych z systematycznym losowym próbkowaniem (co piąta sekcja, 3 klatki liczenia na sekcję, 40× powiększenie).

7. Analiza statystyczna i walidacja danych

1. Projekt i analiza statystyczna
   1. Wykonaj analizę mocy, aby określić odpowiednie rozmiary próbek do wykrywania biologicznie istotnych różnic (rozmiar efektu ≥ 0,8, moc ≥ 0,80, α = 0,05) przy użyciu oprogramowania G*Power 3.1.9.7.
   2. Zweryfikować normalność danych za pomocą testu Shapiro-Wilka i ocenić jednorodność wariancji za pomocą testu Levene'a przed analizą parametryczną.
   3. Analizuj dane za pomocą oprogramowania statystycznego z odpowiednimi testami statystycznymi opartymi na projektowaniu eksperymentów i rozkładzie danych.
   4. Zastosowanie jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) dla porównań jednoczynnikowych oraz dwukierunkowej ANOVA dla projektów faktorialnych (np. traktowanie × interakcji czasowych).
   5. Stosuj test post hoc Tukeya do wielokrotnych porównań, gdy ANOVA wykazuje istotność (p < 0,05), stosując korektę Bonferroniego tam, gdzie jest to stosowne.
   6. Ustaw próg istotności statystycznej na p < 0,05 dla wszystkich analiz z dodatkową notacją p < 0,01 oraz p < 0,001.
   7. Zgłoś rozmiary efektów (Cohen's d lub η²) oraz 95% przedziały ufności wraz z wartościami p, aby zapewnić kompleksową interpretację statystyczną.
   8. Dane przedstawione jako średnia ± SEM z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów, z poszczególnymi punktami danych pokazanymi przy n ≤ 10.
      UWAGA: Wszystkie eksperymenty hodowli komórkowej powinny być niezależnie powtarzane co najmniej trzy razy, przy czym każdy eksperyment powinien zawierać odpowiednie grupy kontrolne i wiele technicznych powtórzeń, a zaobserwowana zmienność (np. CV <15% dla danych behawioralnych) była minimalizowana poprzez zaślepianie i standaryzowane pomiary czasu.

Protokół skutecznie wykazuje, że ekspresja Mettl3 spada w komórkach mikroglejowych leczonych LPS (Rysunek 1), co potwierdzają zarówno spadki poziomu mRNA, jak i białek w porównaniu z grupami kontrolnymi (Rysunek 1B,C). Analiza ELISA potwierdza skuteczną aktywację zapalną wywołaną przez LPS poprzez podwyższone poziomy IL-6 i TNF-α w supernatantach hodowlowanych (Rysunek 1A).

Analiza MeRIP-qPCR ujawnia, że nadekspresja Mettl3 zwiększa metylację m6A mRNA Nrf2, co paradoksalnie zwiększa stabilność i ekspresję białek, zamiast sprzyjać degradacji, zgodnie z pojawiającymi się dowodami, że modyfikacje m6A mogą zwiększać efektywność translacji w określonych kontekstach komórkowych (rysunek 2A,B). Eksperymenty frakcjonowania jądrowo-cytoplazmatycznego wykazują, że podczas gdy rozkład mRNA Nrf2 pozostaje niezmieniony w przedziałach komórkowych, poziomy białek są istotnie modulowane przez status ekspresji Mettl3 (rysunek 2C,D).

Eksperymenty in vivo z wykorzystaniem modeli Parkin indukowanych przez MPTP pokazują, że deficyty behawioralne korelują ze zmianami molekularnymi na osi Mettl3/Nrf2. Wszystkie próbki tkanek pobrano z obszaru prążkowego (współrzędne: +0,5 do -0,5 mm od bregmy, ±1,5 do ±2,5 mm bocznie, -2,5 do -3,5 mm brzusznie). Myszy w grupie modelowej wykazują obniżoną dokładność umieszczania kończyn przednich, obniżoną wydajność rotarodów oraz zmniejszoną aktywność na otwartym polu w porównaniu z kontrolą pozorowaną (Rysunek 3A). Obniżenie poziomu Nrf2 pogłębia te deficyty, podczas gdy nadekspresja Nrf2 zapewnia częściową ochronę. Analiza immunohistochemiczna wykazuje zmniejszoną liczbę populacji mikroglii (komórek Iba1-dodatnich) w regionach prążkowych modeli Parkinsonowych, przy czym modulacja Nrf2 wpływa odpowiednio na przeżywalność mikrogleju (Rysunek 3B).

Poziomy cytokin prozapalnych (IL-1β, IL-18, TNF-α) wzrastają znacząco w modelach choroby, przy czym grupa modelowa wykazuje podwyższone poziomy w porównaniu z grupą kontrolną Sham, a nadekspresja Nrf2 zapewnia działanie przeciwzapalne (Rysunek 3C). Analiza molekularna wykazuje podwyższone markery piroptozy, w tym GSDMD-N, rozszczepioną kaspazę-1 i NLRP3 u zwierząt leczonych MPTP, a skorygowane wyniki Western blot pokazują właściwe markery masy cząsteczkowej (Rysunek 3D). Skaningowa mikroskopia elektronowa potwierdza zwiększone formowanie się ciał piroptotycznych u chorych zwierząt, przy czym modulacja Nrf2 wpływa na zakres śmierci komórek piroptotycznych (Rysunek 3E).

Barwienie DHE w połączeniu z immunofluorescencją TPH2 ujawnia podwyższone poziomy ROS, szczególnie w neuronach serotoniny modeli PD (Rysunek 4A). Współlokalizacja produktów utleniania DHE w ciałach komórek TPH2 wskazuje na endogenne generowanie nadtlenku w tych neuronach, co jest zgodne z zapalną dysfunkcją mitochondrialną wywołaną cytokinami oraz osłabioną obroną przeciwutleniaczy. Przestrzenny rozkład sygnału DHE odpowiada morfologii neuronalnej, a nie rozproszonej utlenianiu tkanek, co wspiera specyficzny dla typu komórki stres oksydacyjny. Immunohistochemia wykazuje zmniejszoną ekspresję markerów neuronów serotoniny TPH2 i SLC6A4 w grupach Model i Model+Nrf2-KD, z efektem ochronnym obserwowanym w grupie Model+oe-Nrf2 (Rysunek 4B). Wyniki te wskazują, że mikroglejowa pirostoza prowadzi do stresu oksydacyjnego i późniejszego uszkodzenia neuronów serotoninowych.

Ogólny szlak mechanistyczny jest podsumowany na Rysunku 5, który ilustruje, jak modyfikacja m6A Nrf2 za pomocą Mettl3 hamuje mikroglejową pirostozę i chroni neurony serotoniny.

Udane eksperymenty zazwyczaj wykazują wyraźne zależności dawka-odpowiedź między poziomami ekspresji Mettl3/Nrf2 a markerami zapalnymi w dalszej fazie. Wyniki poniżej możliwości mogą wystąpić z powodu niepełnej transdukcji wirusa, niewystarczającej aktywacji LPS lub problemów technicznych podczas przetwarzania tkanek. Eksperymenty kontrolne konsekwentnie wykazują prawidłową specyficzność przeciwciał oraz brak niespecyficznego wiązania w analizach immunohistochemicznych. Skuteczność infekcji wirusowej w prążkowym została potwierdzona poprzez współlokalizację z markerami Iba1 i NeuN, co potwierdza dominujące celowanie mikroglej.

Rysunek 1: Niedoskonała ekspresja Mettl3 w komórkach mikrogleju indukowanego przez LPS. (A) Pomiar poziomów IL-6 i TNF-α w komórkach mikroglejowych leczonych LPS metodą ELISA. (B) Pomiar RT-qPCR poziomu mRNA Mettl3 w komórkach mikrogleju leczonym LPS. (C) Pomiar poziomu białka Mettl3 w komórkach mikroglejowych obdany LPS, wykazujący Mettl3 na poziomie 64 kDa i GAPDH na poziomie 36 kDa. **Dane reprezentują średnią ± SEM, n = 6 na grupę. *p < 0,05, p < 0,01 vs. Grupa kontrolna. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Mettl3 wpływa na translację Nrf2 poprzez modyfikację m6A w komórkach mikrogleju indukowanego LPS. (A) Pomiar poziomów mRNA Nrf2 w grupach oe-NC i oe-Mettl3 metodą RT-qPCR. (B) Pomiar metylacji Nrf2 w grupach oe-NC i oe-Mettl3 metodą MeRIP-qPCR. (C) Pomiar RT-qPCR poziomu mRNA Nrf2 w jądrze i cytoplazmie grup eksperymentalnych. (D) Pomiar poziomu białka Nrf2 w grupach eksperymentalnych z Western blot, wykazujący Nrf2 na poziomie 110 kDa i GAPDH na poziomie 36 kDa. **Dane reprezentują średnią ± SEM, n = 6 na grupę. *p < 0,05, p < 0,01 vs. Grupa kontrolna. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Demonstracja in vivo wywoływania mikroglejowej pirostozy mikrogleju za pomocą inflammasomu NLRP3. (A) Oceny behawioralne, w tym umiejscowienie kończyn przednich, testy rotaryjne i na otwartym terenie. (B) Immunohistochemiczne wykrywanie ekspresji białka Iba w tkance mózgowej (skala = 50 μm). (C) Wykrywanie cytokin zapalnych w tkance mózgowej ELISA, wykazujące oczekiwany wzrost w grupach modelowych przy zmniejszeniu po nadekspresji Nrf2. (D) Detekcja markerów piroptozy western blot z anotacjami masy cząsteczkowej: NLRP3 przy 110 kDa, rozszczepiona kaspaza-1 przy 22 kDa, GSDMD-N przy 31 kDa oraz GAPDH przy 36 kDa. (E) Detekcja ciał piroptotycznych mikroskopem skaningowym (oznaczona białymi strzałkami ukazującymi charakterystyczne pęcherzyki otoczone błoną o średnicy 1-5 μm). Ilościowość oparta na 5 polach na sekcję, n = 6 zwierząt/grupa. **Dane reprezentują średnią ± SEM, n = 6 na grupę. *p < 0,05, p < 0,01 kontra grupa. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Pirostoza mikrogleju powoduje uszkodzenia mitochondriów i sprzyja apoptozie neuronów 5-HT. (A) Barwienie DHE w połączeniu z immunofluorescencją TPH2 do wykrywania ROS, szczególnie u neuronów 5-HT (skala = 50 μm). Podejście współlokalizacji umożliwia rozróżnienie stresu oksydacyjnego w ciałach komórek neuronalnych TPH2 od otaczających komórek glejowych. (B) Immunohistochemiczne wykrywanie ekspresji białek TPH2 i SLC6A4 w neuronach 5-HT (skala = 50 μm). **Dane reprezentują średnią ± SEM, n = 6 na grupę. *p < 0,05, p < 0,01 kontra grupa. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 5: Schematyczne przedstawienie hamowania progresji choroby Parkinsona za pośrednictwem Mettl3 poprzez modyfikację m6A Nrf2 oraz hamowanie śmierci neuronów 5-HT. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych ani konfliktów interesów związanych z tą pracą. Żaden autor nie ma żadnych relacji finansowych z firmami, których produkty są wymienione w tym artykule.