Artykuł metodologiczny

Kolekcja wielonarządowa z modeli mysich do badań starzenia

DOI:

10.3791/69128

⸱

12 grudnia 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten zapewnia standaryzowaną metodę pobierania narządów u młodych i starszych myszy do oceny zmian anatomicznych i histologicznych związanych z wiekiem w wielu tkankach, wspierając zarówno etyczne, jak i ekonomiczne projektowanie eksperymentów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Starzenie się to systemowy i wieloczynnikowy proces biologiczny, który stopniowo wpływa na niemal wszystkie narządy i tkanki, prowadząc do zmian strukturalnych, komórkowych i molekularnych. Protokół ten określa standaryzowane i powtarzalne podejście do oceny zmian anatomicznych i morfologicznych związanych z wiekiem u myszy poprzez kompleksowe zbieranie narządów do kolejnych analiz histologicznych i molekularnych. Korzystając z młodych (2-3 miesiące) i starszych (20-24 miesiące), szczegółowo szczegółowo opisujemy krok-po-kroku procedury grubego rozwarstwienia anatomicznego oraz systematycznego pobierania głównych narządów do dalszego przecięcia, barwienia histologicznego oraz oceny mikroskopowej. Protokół umożliwia pobranie szerokiego zakresu narządów i tkanek (w tym mózgu, oczu, przełyku, grasicy, serca, aorty, płuc, węzłów chłonnych, wątroby, trzustki, żołądka, jelita cienkiego, jelita grubego, śledziony, nerek, pęcherza, skóry, mięśni szkieletowych, kości oraz tkanki tłuszczowej) z jednego zwierzęcia. Maksymalizując wydajność danych na badanego, ten workflow wspiera etyczne wykorzystanie zwierząt poprzez redukcję, zwiększa powtarzalność w różnych badaniach oraz ułatwia integracyjne analizy starzenia się organizmów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Starzenie się to proces systemowy, który dotyka niemal wszystkie narządy, jednak większość badań eksperymentalnych koncentruje się na pojedynczej tkance, ograniczając wgląd w to, jak zmiany związane z wiekiem współwystępują lub oddziałują w organizmie. Starzenie się objawia się zarówno zmianami tkankowo-specyficznymi, jak i ogólnoustrojowymi, w tym zaburzeniami odpornościowymi, zmianami metabolicznymi, utratą zdolności regeneracyjnych oraz degeneracją strukturalną 1,2. Chociaż badania specyficzne dla narządów dostarczyły cennych wniosków, potrzebna jest szersza perspektywa, aby zrozumieć, jak starzenie się komórkowe w różnych systemach przyczynia się do zaniku funkcjonowania całego organizmu. Analiza wielonarządowa w przedklinicznych modelach in vivo, takich jak myszy, jest niezbędna do identyfikacji skoordynowanych zmian strukturalnych, komórkowych i molekularnych, które przyczyniają się do chorób związanych z wiekiem i utraty odporności fizjologicznej 3,4.

Mysz laboratoryjna pozostaje niezbędnym i dobrze ugruntowanym modelem przedklinicznym badań nad starzeniem się ze względu na swoją genetyczną podatność na leczenie, krótką długość życia, zachowane ścieżki starzenia się oraz zdolność do odtwarzania kluczowych cech starzenia się człowieka, w tym zaburzeń immunologicznych, włóknienia tkanek, spadku metabolizmu oraz zwiększonej liczby nowotworów 5,6,7. Jednak efektywne i ustandaryzowane protokoły wielonarządowych sekcji nie są szeroko stosowane. Takie protokoły są niezbędne do optymalizacji porównań histologicznych, ograniczenia użycia u zwierząt oraz integracji zbiorów danych omics na tkankach tego samego podmiotu 8,9.

Przedstawiamy tutaj powtarzalny, efektywny w czasie protokół dotyczący wielonarządowej perfuzji, sekcji i konserwacji u myszy. Protokół ten stanowi krok po kroku przewodnik po anatomicznym rozwarstwieniu i pobieraniu głównych narządów od młodych (2-3 miesiące) i starszych (20-24 miesiące), w tym mózgu, oczu, grasici, serca, płuc, aorty, węzłów pachwinowych, przewodu pokarmowego (przełyk, żołądek, jelito cienkie), jelita grubego), wątrobę, trzustkę, śledzionę, nerki, pęcherz moczowy, tkankę tłuszczową, mięśnie szkieletowe, kości i skórę. Szczegółowe instrukcje dotyczące zachowania tkanek zgodne z procesami histologicznymi, molekularnymi i kriosekcyjnymi są zawarte. To standaryzowane podejście umożliwia badaczom ocenę charakterystycznych dla poszczególnych organów i systemowych cech starzenia się u tych samych badanych, wspierając zintegrowane, wysokiej jakości badania nad starzeniemsię 4,10,11,12.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy C57BL/6J były utrzymywane na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco. Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnych (IACUC) i nadzorowane przez Centrum Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych. Myszy trzymano w 12-godzinnym cyklu światła-ciemność, z mniej niż pięcioma dorosłymi myszami w klatce. Eutanazja przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Amerykańskiego Stowarzyszenia Medycznych Weterynarji (AVMA) dotyczącymi eutanazji zwierząt13. W ramach tego protokołu młode myszy były ofiarowane w 3 miesiącach, a starsze w wieku 22 miesięcy. Przed rozwarstwieniem i pobraniem organów wydrukuj i wypełnij listę kontrolną przygotowania (Tabela 1) oraz listę kontrolną pobrania tkanek (Tabela 2). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przemieszczenie szyjki

UWAGA: Zwichnięcie szyjki macicy musi być wykonywane przez wykwalifikowaną osobę, aby zminimalizować nadmierne urazy struktur szyjki.

  1. Unieruchom mysz, mocno chwytając podstawę ogona jedną ręką.
  2. Połóż kciuk i palec wskazujący przeciwległej ręki u podstawy czaszki.
  3. Należy mocno i szybko ucisnąć, aby zwichnąć kręgi szyjne. Palpować szyję, aby potwierdzić oddzielenie czaszki od sąsiednich kręgów.
  4. Potwierdź pomyślną eutanazję (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi), zapewniając zatrzymanie oddechu i brak reakcji na szkodliwe bodźce przed rozpoczęciem działania.
  5. Zapisz masę ciała myszy przed perfuzją i pobraniem tkanek.

2. Torakotomia i perfuzja

UWAGA: Perfuzja jest opcjonalna. Wszystkie procedury z udziałem paraformaldehydu (PFA) wykonuj w certyfikowanym okapie chemicznym, nosząc odpowiedni sprzęt ochrony osobistej (PPE), w tym fartuch laboratoryjny, rękawice nitrylowe i okulary ochronne. Utylizuj roztwory PFA zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa chemicznego instytucji. Zbieranie wszystkich odpadów PFA oraz skażonych materiałów (np. rękawiczki, chusteczki, pojemniki) w wyraźnie oznaczonym pojemniku na odpady niebezpieczne i utylizowanie ich za pośrednictwem biura ds. zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego instytucji, zgodnie z protokołami zgodnymi z lokalnymi, stanowymi i federalnymi przepisami.

UWAGA: Jeśli używasz paradehydu (PFA) do utrwalania, wykonaj wszystkie kroki pod okapem oparowym, aby uniknąć kontaktu z oparami formaldehydu.

  1. Umieść pokrywkę ze styropianu pokrytą materiałem chłonnym, aby zbierać płyn z perfuzji, w tacce zbierającej. Umieść mysz na tej powierzchni sekcji w pozycji leżącej i zabezpiecz kończyny szpilkami, aby ustabilizować ciało: kończyny przednie ustawione bocznie, by otworzyć jamę piersiową, a tylne wyprostowane w spod nogi, tworząc delikatne napięcie na ścianie brzucha.
    UWAGA: Takie ustawienie poprawia widoczność, minimalizuje przeszkody i maksymalizuje przestrzeń roboczą do zbierania organów.
  2. Nałóż 70% etanolu na okolice klatki piersiowej.
  3. Użyj ostrych nożyczek, aby wykonać poprzeczne nacięcie na wysokości przepony, a następnie dwa cięcia w kształcie litery V, odsłaniające klatkę piersiową (Rysunek 1A).
  4. Używając kleszczy na końcach, delikatnie unieś skórę i ostrożnie przetnij pozostałe przystawki, aby całkowicie odsłonić okolice piersiowe.
  5. Wykonaj dwa nacięcia w kształcie litery V o długości około 2 cm po obu stronach klatki piersiowej, aby otworzyć jamę piersiową.
  6. Przyciągnij mostek i przypiąć go za ramię myszy obok głowy.
  7. Używając kleszczy z końcem, ostrożnie odsłoń serce. Usuń wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza z linii perfuzyjnej, a następnie włóż igłę motylkową lub kaniulę do czubka lewej komory na głębokość około 3-4 mm. Wykonaj nacięcie o długości około 5 mm w prawym przedsionku, aby umożliwić odpływ perfuzjatu (Rysunek 1B).
  8. Rozpocznij perfuzję od fizjologicznego roztworu bez wapnia i magnezu (np. PBS, sól fizjologiczna lub HBSS), aby oczyścić układ krążenia.
    UWAGA: Perfuzję można wykonać za pomocą strzykawki 20 mL, pompy lub systemu zasilanego grawitacją. Średnio potrzebne jest 15-20 ml roztworu perfuzyjnego na mysz, aby uzyskać całkowite oddzielenie krwi z naczyń. Dobre przechwycenie objawia się szybkim oczyszczaniem wątroby i płuc, a także bladym obszarem jamy ustnej i języka. Całkowita perfuzja prowadzi do czystego, wolnego od krwi wypływu z serca.
  9. W razie potrzeby rozpocznij perfuzję PFA, zmieniając linię perfuzyjną z roztworu fizjologicznego wolnego od wapnia i magnezu (używanego do przedpłukania i usuwania krwi) na strzykawkę 50 mL zawierającą 4% paradehydu (PFA), przy jednoczesnym zachowaniu igły na miejscu. Uważaj, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza do rury. Kontynuuj perfuzję 4% PFA, aż do oceny pożądanego stopnia utrwalenia na podstawie stopniowego usztywniania ciała. Około 30 ml utrwalacza wystarcza na jedną mysz.

3. Pobieranie organów i tkanek

UWAGA: Kolejność pobierania organów jest kluczowa przy porównywaniu młodych i starszych myszy. Narządy u starszych zwierząt są zwykle delikatne i podatne na autolizę lub uszkodzenia mechaniczne, co sprawia, że szybka i konsekwentna obsługa tkanek jest niezbędna. Standaryzacja kolejności pobierania minimalizuje zmienność pośmiertną, zmniejsza artefakty związane z manipulacją i zapewnia jednolitą jakość fiksacji u wszystkich zwierząt14,15. Spójność jest kluczowa dla wykrywania subtelnych zmian morfologicznych związanych z wiekiem, ponieważ opóźnione lub niespójne pobieranie próbek może wprowadzać błędy uprzedzenia. Jeśli nie wykonano perfuzji PFA, narządy należy pobrać szybko. Trzustka, żołądek, płuca i mózg są szczególnie podatne na szybką autolizę i degradację histologiczną, jeśli nie zostaną natychmiast przetworzone. Ponieważ u starszych myszy często pojawiają się zmiany nowotworowe, należy dokładnie zbadać śledzionę, wątrobę, węzły chłonne, płuca i grasicę pod kątem asymetrii, powiększenia, guzków lub przebarwień. Uwzględnij te wyniki jako część całkowitego obciążenia chorobą (patrz Tabela 2).

  1. Rozpocznij od zwierzęcia w pozycji leżącej po perfuzji lub zwichnięciu szyjki, aby pobrać główne narządy jamy piersiowej i brzusznej (Rysunek 1C).
  2. Po przypięciu delikatnie nałóż 70% etanolu za pomocą gazy lub butelki ze spryskiwaczem, co minimalizuje zanieczyszczenie futra i utrzymuje nawilżenie tkanek w wrażliwych miejscach. Ta metoda okazała się skuteczna w naszych rękach w redukcji zanieczyszczeń futra i poprawie widoczności podczas sekcji, jednocześnie unikając wad pełnego zanurzenia.
  3. Używając nożyczek i kłąb końców, ostrożnie otwórz jamę brzuszną, wykonując nacięcie środkowe od przepony do miednicy, a następnie dwa nacięcia boczne, jak wskazują czerwone linie na Rysunku 1A. Podciągnij skórę i ścianę brzucha, aby całkowicie odsłonić narządy wewnętrzne.
  4. Żołądek, jelito cienkie i jelito: Odłącz żołądek w miejscu połączenia przełyku, pozostawiając koniec odźwiernika połączony z jelitem cienkim. Delikatnie uwolnij przewód pokarmowy przez przecięcie więzadeł wspierających, a następnie usuń przewód, w tym jelito cienkie i jelito grube. Przeciąć dystelistycznie w odbytnicy.
    1. Aby oczyścić zawartość luminalną, przetnij jelito cienkie proksimalnie przy zgięciu dwunastniczym i dystymentalnie przy złączeniu kościowo-kręto-krętego. W przypadku jelita grubego odetnij blisko w okolicy ceku. Przepłukaj jelito cienkie i jelito grube około 20 ml roztworu fizjologicznego za pomocą strzykawki wyposażonej w igłę do karmienia, delikatnie zabezpieczając tkankę cienkimi kleszczemi, aby zapobiec uszkodzeniom.
  5. Przełyk: Odizoluj przełyk od połączenia szyjnego do żołądka.
  6. Śledziona i trzustka: Odizoluj śledzionę i trzustkę od otaczających tkanek za pomocą drobnej dyssektoracji, minimalizując uszkodzenia mechaniczne. Ostrożnie odłącz trzustkę od śledziony. Natychmiast rozciąć i przyciąć trzustkę na małe kawałki (≤5 mm) i zanurzyć je w utrwalaczu w ciągu 5 minut od eutanazji, aby zminimalizować autolizę i zachować optymalną morfologię tkanek. Zbadaj śledzionę, zwracając uwagę na rozmiar, kolor, kształt oraz obecność widocznych nieprawidłowości.
  7. Wątroba: Używając cienkich szczypiec, chwyć centralną tkankę łączną między płatami wątroby i delikatnie pociągnąć do góry, aby wywołać napięcie. Nożyczkami do sekcji ostrożnie odetnij wszystkie połączenia między wątrobą a sąsiednimi narządami. Sprawdź wątrobę pod kątem koloru, konsystencji oraz obecności guzków lub innych nieprawidłowości.
  8. Tłuszcz trzewny: Pobierz próbki z magazynów tłuszczu trzewnego.
    UWAGA: Młode zwierzęta zazwyczaj mają minimalną ilość tłuszczu trzewnego, natomiast starsze często wykazują zwiększone gromadzenie tłuszczu, szczególnie wokół jelit, nerek i okolic gonad.
  9. Nerki i pęcherz: Wyciąć obie nerki wraz z przymocowanymi moczowódami i pęcherzem. Ostrożnie odłącz nerki od otaczającej tkanki tłuszczowej i struktur łącznych za pomocą cienkich nożyczek lub szczypiec z końcami. Podążaj za moczowodami dystalnie do pęcherza, przecinając pozostałe przyczepy, aby odizolować cały układ moczowy. Przed dalszym przetworzeniem sprawdź nerki i pęcherz pod kątem rozmiaru, koloru i nieprawidłowości.
  10. Węzły chłonne: Odsunąć skórę od otrzewnej, aby odsłonić okolice pachwinowe. Zidentyfikuj węzły chłonne wewnątrz tłuszczu mlecznego wzdłuż naczyń limfatycznych. Odizoluj i usuń węzły za pomocą cienkich kleszczy, minimalizując zakłócenia otaczającego tkanki tłuszczowej i łącznej.
  11. Serce: Ostrożnie usuń serce, przecinając główne naczynia.
  12. Grasica: Ostrożnie wyciąć grasicę, aby zachować jej strukturę. Należy pamiętać, że grasica ulega inwolucji wraz z wiekiem, a u starych myszy może występować tylko minimalna lub żadna tkanka szubicowa.
  13. Płuca: Używając ostrych nożyczek i cienkich szczypiec, ostrożnie usuń płuca wraz z przyczepioną tchawicą w jednym kawałku.
  14. Aorta: Włóż zamknięte kleszcze między aortę a kręgosłup i delikatnie przesuń aortę, rozdzielając ją wzdłuż grzbietowej strony. Uważaj, aby nie rozerwać naczynia. Za pomocą kleszczy z cienką końcówką ostrożnie usuń otaczającą tkankę tłuszczową i łączną z aorty pod mikroskopem rozwarstwiennym.
  15. Mięśnie szkieletowe: Usuń skórę na tylnych kończynach, aby odsłonić kość udową i otaczające mięśnie. Za pomocą cienkich nożyczek ostrożnie odizoluj mięśnie przyczepione do kości udowej, odłączając je od otaczającej tkanki łącznej i przecinając przy przyczepach ścięgien, aby zachować integralność włókien.
  16. Kość (piszczel): Używając nożyczek do sekcji, usuń leżącą skórę i mięśnie, aby odsłonić piszczel. Używając nożyczek do sekcji i kleszczy, ostrożnie odłącz piszczelę w stawach kolanowych i kostkowych. Usuń pozostałe tkanki miękkie, nie uszkadzając kości.
  17. Oczy: Używając dużych nożyczek do sekcji, odetnij mysz głowę. Ostrożnie usuń oczy za pomocą cienkich szczypiec.
  18. Mózg: Usuń skórę głowy, aby odsłonić przednią część czaszki. Używając ostrych nożyczek lub skalpela, podążaj za szwami czaszki i odsuwaj segmenty kości, odsłaniając mózg (Rysunek 1D). Przetnij węchowe bulwy i przyrosty brzuszne. Delikatnie wyciągnij mózg z jamy czaszki. Natychmiast przetworz tkankę, aby zachować morfologię.
  19. Skóra: Jeśli usuwanie włosów jest konieczne przy dalszych aplikacjach, usuń włosy za pomocą elektrycznej trymerki. Uszczypnij część skóry pleców kleszczemi, wyciń nożyczkami i pobierz tkankę do dalszego przetwarzania.
  20. Po usunięciu wszystkich interesujących narządów umieść całą tusę myszy w pojemniku o pojemności 450 ml z dodatkiem 4% PFA, aby archiwizować go na nieoczekiwane znaleziska lub odpowiadać na pytania recenzentów, które mogą wymagać zwrotu do mokro utrwalonych tkanek.

4. Zachowanie i przetwarzanie tkanek

UWAGA: Aby zachować integralność tkanek, minimalizuj czas między sekcją a konserwacją. Opóźnienia mogą wpłynąć na morfologię tkanek i jakość molekularną; dalsze szczegóły dotyczące krytycznego momentu pobierania i konserwacji tkanek przedstawiono w Tabeli 2.

UWAGA: Jeśli używasz paradehydu (PFA) do utrwalania, wykonuj wszystkie kroki wewnątrz okapu oparowego, aby uniknąć kontaktu z oparami formaldehydu.

  1. Przetwarzaj tkanki bezpośrednio po sekcji, wybierając odpowiedni protokół (kroki 4.1, 4.2 lub 4.3) zgodnie z zamierzonym dalszym zastosowaniem.
    1. Utrwalanie paraformaldehydu (PFA): Umieść tkanki przeznaczone do analizy histologicznej w 4% PFA w temperaturze 4 °C przez 12-24 godziny. Po utrwaleniu dokładnie umyj tkanki solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), aby usunąć pozostałości utrwalającym, a następnie przelej je do etanolu 70% do przechowywania aż do zagłębienia parafiny i sekcji na sekcję.
  2. Optymalna temperatura cięcia (OCT) w połączeniu związku: Osadzanie świeżych tkanek w związku OCT. Umieść tkanki w formach wypełnionych związkiem OCT w formach, eliminując pęcherzyki powietrza, inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zamrażaj w fazie parowej ciekłego azotu. Uszczelnij folią aluminiową i przechowuj bloki OCT w temperaturze −80 °C aż do podziału na sekcje.
  3. Szybkie zamrażanie w fazie pary ciekłego azotu: Tkanki mrożące na szybko, przeznaczone do analizy RNA, białka lub metabolitów w fazie parowej ciekłego azotu, aby zminimalizować powstawanie kryształów lodu. Umieść tkanki w oznaczonych kriotubach i zawiesić je nad ciekłym azotem, aby szybko je zamrozić. Po całkowitym zamrożeniu przenieś próbki do przechowywania w temperaturze −80 °C.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas sekcji zwłok starsze myszy często wykazują zmiany nowotworowe i wymagają dokładnych badań w celu udokumentowania ustaleń patologicznych 13,14,16,17,18. Rysunek 2A pokazuje 22-miesięcznego samca myszy C57BL/6 leżącego na plecach po przefuzji. Całkowite blanszenie płuc potwierdza skuteczną perfuzję, podczas gdy wątroba wykazuje jedynie częściowe błożenie. Bliższa inspekcja wątroby wykazała liczne złośliwe guzki (Rysunek 2B), którym towarzyszą powiększone pęcherzyki nasienne (Rysunek 2A) oraz splenomegalia (Rysunek 2C). Te wyniki są powszechne u starszych myszy i powinny być udokumentowane jako część całkowitego obciążenia chorobowego18.

Rysunek 3 przedstawia makroskopowo prawidłowe narządy pobrane po sekcji i perfuzji, co pozwala ocenić integralność anatomiczną i skuteczność perfuzji. Przewód pokarmowy został przepłukany roztworem fizjologicznym, aby usunąć strawioną zawartość, co dało czysty, przezroczysty wygląd żołądka, jelita grubego i cienkiego (Rysunek 3A). Dodatkowe struktury, w tym przełyk, trzustka, śledziona, zbiorniki tłuszczu trzewnego, nerki z pęcherzem, węzły chłonne, serce i grasica, były wyraźnie identyfikowane i mogły być izolowane w całości do dalszych analiz (Rysunek 3B, C, E-I).

Jakość perfuzji oceniano poprzez badanie blanszowania w silnie unaczynionych tkankach. Jak pokazano na Rysunkach 3D i 3J, wątroba i płuca wykazywały wyraźne różnice między stanami nieperfuzyjnymi, dobrze przekrwionymi i częściowo przekrwionymi. Całkowite blanszowanie potwierdziło skuteczną perfuzję, natomiast niepełne blanszowanie wskazywało na zmienność techniczną lub ukryte nieprawidłowości. Izolowano inne tkanki, w tym aortę, mięśnie szkieletowe, piszczelowe, mózg, oko i skórę, z zachowaną morfologią, odpowiednią do dalszych zastosowań histologicznych, molekularnych lub obrazowania (rysunek 3K-P). Ta ustandaryzowana procedura sekcji zapewnia spójne odzyskiwanie nienaruszonych, dobrze zachowanych tkanek i organów oraz umożliwia ogólną ocenę anatomiczną wspierającą różnorodne analizy dalsze. Sekcja i pobranie organów wymagały około 40-60 minut na każde zwierzę, w zależności od doświadczenia operatora i obecności badań patologicznych.

Rysunek 4 pokazuje przykładowe zmiany związane ze starzeniem się w zebranych organach po osadzeniu parafiny, sekcjonowaniu oraz barwieniu hematoksyliny i eozyny (H&E). W przekrojach skóry starych myszy obserwowano przerzedzenie nabłonka oraz utratę mieszków włosowych w porównaniu z młodymi kontrolami (Rysunek 4A). Przecięcia nerek wykazały powiększenie torebek Bowmana wraz ze zmianami włóknistymi i martwiczymi, a także obszarami zgodnymi z chłoniakami (rysunek 4B). W przekrojach trzustki zaobserwowano wzrost liczby ciał apoptotycznych19 oraz obszarów chłonnych u starszych zwierząt, co wskazuje na osłabioną integralność tkanek wraz z wiekiem (Rysunek 4C). Przekroje śledziony przedstawiały osady amyloidowe i obszary chłoniaka u zwierząt starszych, co odzwierciedla dodatkowe cechy patologii związanej z wiekiem (rysunek 4D).

Wyniki te podkreślają reprezentatywne cechy histologiczne starzenia się w wielu tkankach, pokazując przydatność tego protokołu w wykrywaniu strukturalnych cech pogorszenia związanego z wiekiem.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczny przegląd procedur sekcji myszy i odsłonięcia narządów. (A) Miejsca nacięcia otwierające jamę piersiową i brzuszną (czerwone linie), w tym nacięcie poprzeczne na poziomie przepony, następnie nacięcia w kształcie litery V po obu stronach klatki piersiowej otwierające jamę piersiową oraz nacięcie w linii środkowej od przepony do miednicy z obustronnymi cięciami całkowicie odsłaniającymi jamę brzuszną. (B) Układ perfuzji polegający na włożeniu igły motylkowej do lewej komory i nacięciu prawego przedsionka w celu umożliwienia skutecznego odpływu krwi. (C) Anatomiczny układ głównych narządów piersiowych i jamy brzusznej po odsłonięciu jamy piersiowej. (D) Etapy sekcji głowy, w tym usunięcie skóry głowy i otwarcie czaszki wzdłuż szwów czaszkowych w celu odsłonięcia mózgu. Czerwone linie wskazują miejsca nacięcia. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Identyfikacja zmian nowotworowych u starzących się myszy. (A) Reprezentatywny 22-miesięczny samiec myszy C57BL/6 w pozycji leżącej na plecach po perfuzji z 4% PFA. Całkowite zblaszenie płuc (różowy grot strzały) potwierdza skuteczną przelewność, podczas gdy wątroba (zielona strzałka) wykazuje jedynie częściowe zblanienie. Niebieskie groty strzał oznaczają powiększone pęcherzyki nasienne. (B) Szczegółowy widok wątroby ujawniający liczne złośliwe guzki (czarne groty strzał). (C) Powiększona śledziona u starszej myszy C57BL/6 (prawa strona) w porównaniu do normalnej śledziony młodego zwierzęcia (lewa strona). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Przegląd głównych narządów myszy i integralności tkanek po sekcji i przechwyceniu. (A) Żołądek, jelito cienkie i jelito grube przed i po przepłukaniu roztworem fizjologicznym w celu usunięcia strawionej zawartości. (B) Przełyk. (C) trzustka z przyczepioną śledzioną. (D) Wątroba bez przelania, z całkowitym blaszeniem po skutecznej perfuzji oraz z częściowym blanszowaniem wskazującym na niepełne przelanie lub chorobę ukrytą. (E) Tkanka tłuszczowa trzewna. (F) Nerki z przypiętym pęcherzem. (G) Węzły chłonne pachwinowe. (H) Serce. (I) Grasica. (J) Płuca bez przelewu, z całkowitym blanszowaniem po skutecznej perfuzji oraz z częściowym blanszowaniem. (K) Aorta. (L) Mięśnie szkieletowe odizolowane od kończyny tylnej. (M) Kości piszczelowej z zachowaną strukturą kości. (N) Mózg. (O) Oko. (P) Skóra. Skala: 5 mm w A, C, D, E, F, J, L, N, P; 1 mm we wszystkich pozostałych panelach. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Histologiczna analiza głównych narządów z użyciem barwienia hematoksyliny i eozyny (H&E). (A) Cięcia skóry myszy w wieku 3 miesięcy (młodych) i 22 miesięcy (starszych). Fragmenty pochodzące od starszych zwierząt wykazują przerzedzenie nabłonka i utratę mieszków włosowych. (B) Fragmenty nerek podkreślające kapsułki Bowmana. Fragmenty starych zwierząt wykazują powiększenie torebki, zmiany włókniate i martwicze oraz chłoniaki (pomarańczowe groty strzał). (C) Przekroje trzustki u młodych i starszych zwierząt, z osobami starszymi wykazującymi zwiększoną liczbę ciał apoptotycznych (niebieskie groty strzał) oraz obszary chłoniaków (pomarańczowe groty strzał). (D) Cięcia śledziony u myszy w wieku 3 miesięcy (młode) i 22 miesiące (w wieku wieku). Fragmenty pochodzące ze starych zwierząt wykazują osady amyloidowe (limonkowozielone groty strzał) oraz obszary chłoniaka. Pasek skali (A-C) 100 μm. Pręt skali (D) 500 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Lista kontrolna przygotowania. Szczegółowa lista niezbędnych przygotowań do rozcinania i konserwacji tkanki myszy, w tym oznaczania rurek i form, przygotowania i utrwalających, przygotowania do kriogenicznego osadzania, sterylizacji narzędzi do sekcji sekcji, rozmieszczenia stanowiska roboczego oraz planowania dokumentacji. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Lista kontrolna pobierania tkanek. Użyj tabeli do rejestrowania zebranych tkanek. Dodaj czas pobrania i notatki o stanie lub nieprawidłowościach. Priorytetowo traktuj tkanki kluczowe dla badania; Zbierz najbardziej istotne narządy w zalecanym czasie, aby uniknąć autolizy/degradacji tkanek.*Zanotuj wszelkie nieprawidłowości (w tym przebarwienia narządów, guzki, wzrost złośliwy, nieprawidłowy rozmiar organów). **Rozważ dokumentowanie metody konserwacji (w tym utrwalanie PFA, osadzanie OCT lub zamrożenie na zaskoczenie). Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten zapewnia powtarzalną strategię systematycznego zbierania wielu układów narządowych u młodych i starszych myszy, umożliwiając analizy anatomiczne, histologiczne i molekularne. Na jakość wyników może wpływać kilka czynników technicznych i rozwiązywać ograniczenia opisanej metody. Po pierwsze, zmienność jakości perfuzji jest ważnym czynnikiem do rozważenia. Niepełna perfuzja może pozostawić resztki krwi, które utrudniają histologię, immunohistochemię i analizy molekularne. Perfuzja po zwichnięciu szyjki macicy może powodować urazy tkanek szyjnych i prowadzić do zanieczyszczenia płuc krwią. Zwichnięcia szyjki powinny być wykonywane wyłącznie przez wykwalifikowany personel. Dla optymalnych rezultatów perfuzję należy wykonywać w znieczuleniu terminalnym, jak opisano w innych miejscach20,21 zgodnie z wytycznymi IACUC i AVMA13. Po drugie, fiksacja jest kluczowym czynnikiem determinującym integralność tkanki. Chociaż paradehyd 4% (PFA) jest szeroko stosowany, może niedostatecznie przenikać przez duże lub gęste narządy, co skutkuje słabą histologią i zachowaniem antygenów. Ograniczenie to można złagodzić, stosując 10% neutralną buforowaną formalinę (NBF) lub krojąc tkanki na ≤5 mm sekcje w celu poprawy penetracji22. Po trzecie, niektóre tkanki, szczególnie trzustka, żołądek i mózg, poddają się szybkiej autolizie, co wymaga utrwalenia lub zamrażenia w ciągu 5-10 minut od eutanazji oraz użycia wcześniej schłodzonych narzędzi do sekcji23. U starych myszy nowotwory mogą dodatkowo zniekształcać anatomię i komplikować sekcję. Dodatkowe artefakty mogą powstać z powodu niewystarczającej objętości fiksacji lub zamarzania, prowadzących do kurczenia się i efektów krawędziowych; można je zminimalizować, utrzymując stosunek utrwalacza do tkanki co najmniej 10:1, unikając przeludnienia i wstępnie schładzając formy OCT przed wcieleniem. Wreszcie, stosowanie PFA i formaliny niesie ze sobą obawy dotyczące bezpieczeństwa i utylizacji; Utrwalacze na bazie glioksalu oferują mniej toksyczne alternatywy. Standaryzowane traktowanie, zoptymalizowane fiksowanie oraz precyzyjne wyczucie czasu są zatem niezbędne dla maksymalizacji powtarzalności, jakości tkanek oraz wiarygodności analiz dalszych24.

Dzięki pobieraniu tkanek z ponad 15 narządów w obrębie tego samego zwierzęcia, ten proces maksymalizuje biologiczną wydajność na osobę i jest zgodny z etycznymi wymogami ograniczania ich używania. Systematyczny zabieg można łatwo skalować do badań średnioprzepustowych badających związane z wiekiem spadek fizjologiczny oraz patologie specyficzne dla narządów25.

Szybkie przetwarzanie tkanek podatnych na autolizę jest niezbędne dla zachowania integralności histologicznej. Stosowanie roztworów fizjologicznych bez wapnia i magnezu, a następnie 4% PFA, niezawodnie zachowuje architekturę narządów i minimalizuje autolizę w wrażliwych tkankach, takich jak trzustka i układ trawienny. W przeciwieństwie do protokołów skupionych na pojedynczych narządach lub modelach chorób, to podejście umożliwia szybkie i spójne pobieranie wielu narządów, zmniejszając zmienność i poprawiając przepływ. Całe rozwarstwienie, od perfuzji po ostateczne wycięcie tkanki, można wykonać w ciągu 60 minut na każde zwierzę, co nadaje się do badań na dużą skalę lub pilnych czasowo 3,11,26. Przestrzeganie precyzyjnej sekwencji utrwalania perfuzji minimalizuje artefakty i umożliwia powtarzalne rezultaty.

Spójność w pobieraniu tkanek, ich przycinaniu i osadzaniu jest niezbędna do dokładnej oceny histologicznej, szczególnie w badaniach podłużnych lub wieloośrodkowych. Zmienność w sposobie traktowania tkanek może wprowadzać artefakty, niejasne wyniki patologiczne lub prowadzić do błędnej interpretacji obciążenia chorobą. Zrewidowane przewodniki dotyczące pobierania i przycinania organów u szczurów i myszy, takie jak przewodniki RENI trim, zawierają szczegółowe, standaryzowane protokoły minimalizujące takie niespójności22. Wdrożenie tych zharmonizowanych metod poprawia porównywalność danych między badaniami i instytucjami, wzmacnia powtarzalność oraz wzmacnia integralność wyników opartych na patologii w badaniach nad starzeniemsię 4,9.

Zbieranie wielu narządów jest szczególnie ważne w badaniach nad starzeniem się, gdzie zrozumienie, jak systemy narządów współdziałają, jest niezbędne, aby odkryć procesy napędzające spadek fizjologii całego ciała wraz z wiekiem. Chociaż takie podejście może być również korzystne dla różnych innych pytań badawczych, głównym celem tego protokołu jest wsparcie badań nad starzeniem, gdzie zmiany związane z wiekiem mogą jednocześnie wpływać na wiele układów narządów. Można jednak stosować go także w badaniach skupiających się na włóknieniu, regeneracji i starzeniu, zwłaszcza tych integrujących transkryptomikę lub odkrywanie wielotkankowych biomarkerów 9,27,28.

Oceny histologiczne wykazały charakterystyczne zmiany związane z wiekiem w wielu tkankach (rysunek 4). Na skórze starsze zwierzęta wykazywały przerzedzenie nabłonka i utratę mieszków włosowych. W nerkach wykroje starych myszy wykazały powiększenie torebki Bowmana wraz ze zmianami fibrotycznymi, martwiczymi i chłonnymi. Tkanka trzustkowa u starych zwierząt wykazała nagromadzenie ciał apoptotycznych i chłoniaków, natomiast przekroje śledziony ujawniły osady amyloidu i dodatkowe obszary chłoniaka. Obserwacje te są zgodne z ustalonymi fenotypami starzenia się myszy i pokazują użyteczność tego protokołu w wykrywaniu reprezentatywnych markerów histochronologicznychstarzenia się 1,18,19,27,29,30,31,32,33,34.

Podsumowując, protokół ten oferuje niezawodne, skalowalne ramy do zbierania i przechowywania tkanek w przedklinicznych modelach starzenia. Może być stosowany zarówno w badaniach eksploracyjnych, jak i opartych na hipotezach, aby odkryć tkankowo specyficzne i systemowe mechanizmy starzenia, degeneracji i odporności.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te zostały wsparte przez grant Start-Up Fundacji Larry'ego L. Hillbloma, grant AFAR i Glenn Foundation for Medical Research dla młodszych wykładowców, nagrodę Edwarda Mallinckrodta Jr. Fundacji Młodszego Badacza oraz nagrodę programu Przełomowych badań biomedycznych (PBBR) New Frontier Research dla Hanny Martens. Rysunek 1 został stworzony za pomocą BioRender.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Podkładka chłonna
Wiek C57BL/6J myszy  Laboratorium Jacksona  #000664
Tacy na zbiórkę 
Trójczownik bezprzewodowyBravMini+ CLP-41590Do usuwania owłosienia
Spray etanolowy 70%Fisher Scientific50-163-3592
Dodatkowe kleszcze 5 INOXDumontF6521-1EABardzo cienkie szczypce do węzłów chłonnych
KleszczeMilliporeSigmaXX6200006PKleszcze z końcem
Kleszcze 5 INOXDumontF6521-1EACienkie szczypce na końcówkach
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) 1x 500 mLGibco14025092
Nożyczki do mikro-rozcinania (proste, ostre/ostre, 25mm)Roboz SurgicalRS-5668Standardowe mikronożyczki, stal nierdzewna, ostrze 25 mm (M-37)
Nożyczki do mikro-rozcinania (proste, ostre/ostre, cienkie ostrza)Roboz SurgicalRS-5918Nożyczki do drobnego rozcinania, długość 4,5" (H-327)
NBFSigma HT501128Do fiksacji
Roztwór soli fizjologicznej normalnejCytiva76081-514
Optymalna temperatura cięcia (OCT)Fisher Scientific23730571
Paradehyd (PFA) 4%Nauki o mikroskopii elektronowej15710Do fiksacji
Szalki Petriego 100 mL x 15 mLMilliporeSigmaP5856-500EA
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)Gibco10010023
PinyEisco LabsDISPINS1Aby zabezpieczyć mysz podczas sekcji
Plastikowa strzykawka 20 mL, blokada luer lockFisherBrand302830Do perfuzji
Seal'N Freeze Box (Pojemnik Kriogeniczny)Ted Pella, Inc.20956
Seal'N Freeze CryotrayTed Pella, Inc.20956-1Do pozycjonowania próbek w pojemniku kriogenicznym
Igła motylowa Sol-Vet z adapteremSol-Millenium Medical110301070003do perfuzji
Pokrywka ze styropianu
Tissue-Tek Cyromold (biopsja)Sakura25608-922
Młode myszy C57BL/6JLaboratorium Jacksona  #000664

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lopez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. Hallmarks of aging: An expanding universe. Cell. 186 (2), 243-278 (2023).
  2. Schafer, M. J., et al. The senescence-associated secretome as an indicator of age and medical risk. JCI Insight. 5 (12), e133668(2020).
  3. Sladitschek-Martens, H. L., et al. Yap/taz activity in stromal cells prevents aging by controlling cGAS-STING. Nature. 607 (7920), 790-798 (2022).
  4. Tabula Muris, C. A single-cell transcriptomic atlas characterizes aging tissues in the mouse. Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).
  5. Farooqi, I. S., Xu, Y. Translational potential of mouse models of human metabolic disease. Cell. 187 (16), 4129-4143 (2024).
  6. Marttala, J., Andrews, J. P., Rosenbloom, J., Uitto, J. Keloids: Animal models and pathologic equivalents to study tissue fibrosis. Matrix Biol. 51, 47-54 (2016).
  7. Yuan, R., Peters, L. L., Paigen, B. Mice as a mammalian model for research on the genetics of aging. ILAR J. 52 (1), 4-15 (2011).
  8. Wang, Q., et al. The mouse multi-organ proteome from infancy to adulthood. Nat Commun. 15 (1), 5752(2024).
  9. Zhuang, J., et al. Comparison of multi-tissue aging between human and mouse. Sci Rep. 9 (1), 6220(2019).
  10. Basisty, N., et al. A proteomic atlas of senescence-associated secretomes for aging biomarker development. PLoS Biol. 18 (1), e3000599(2020).
  11. Wu, C., et al. Spatially resolved transcriptome of the aging mouse brain. Aging Cell. 23 (5), e14109(2024).
  12. Yousefzadeh, M. J., et al. Tissue specificity of senescent cell accumulation during physiologic and accelerated aging of mice. Aging Cell. 19 (3), e13094(2020).
  13. Treuting, P. M., Snyder, J. M. Mouse necropsy. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 223-233 (2015).
  14. Antal, C., et al. Tissue collection for systematic phenotyping in the mouse. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 29 (Unit 29A), 24(2007).
  15. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Mouse tissue fixation. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), pdb.prot073403(2014).
  16. Brayton, C., Justice, M., Montgomery, C. A. Evaluating mutant mice: Anatomic pathology. Vet Pathol. 38 (1), 1-19 (2001).
  17. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Limited mouse necropsy. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), pdb.prot073395(2014).
  18. Pettan-Brewer, C., Treuting, P. M. Practical pathology of aging mice. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 1, (2011).
  19. Xiong, Y., et al. Arginase-II promotes tumor necrosis factor-alpha release from pancreatic acinar cells causing beta-cell apoptosis in aging. Diabetes. 66 (6), 1636-1649 (2017).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65, e3564(2012).
  21. Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).
  22. Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 3. A joint publication of the Rita and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55 (6), 433-449 (2004).
  23. Zhao, H., et al. Identifying specific functional roles for senescence across cell types. Cell. 187 (25), 7314-7334 (2024).
  24. Aversa, Z., et al. Biomarkers of cellular senescence in idiopathic pulmonary fibrosis. Respir Res. 24 (1), 101(2023).
  25. Aghali, A., Koloko Ngassie, M. L., Pabelick, C. M., Prakash, Y. S. Cellular senescence in aging lungs and diseases. Cells. 11 (11), 1781(2022).
  26. Travaglini, K. J., et al. A molecular cell atlas of the human lung from single-cell RNA sequencing. Nature. 587 (7835), 619-625 (2020).
  27. Chen, S., et al. Integration of spatial and single-cell data across modalities with weakly linked features. Nat Biotechnol. 42 (7), 1096-1106 (2024).
  28. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).
  29. Hoj, K., et al. Age-related decline in pancreas regeneration is associated with an increased proinflammatory response to injury. Gastro Hep Adv. 3 (7), 973-985 (2024).
  30. Roeder, S. S., et al. Changes in glomerular parietal epithelial cells in mouse kidneys with advanced age. Am J Physiol Renal Physiol. 309 (2), F164-F178 (2015).
  31. Russell-Goldman, E., Murphy, G. F. The pathobiology of skin aging: New insights into an old dilemma. Am J Pathol. 190 (7), 1356-1369 (2020).
  32. Sparks, J., et al. Presence of systemic amyloidosis in mice with partial deficiency in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) in aging. App Sci. 11 (16), 7373(2021).
  33. Sun, P., Juskevicius, R. Histological and immunohistochemical features of the spleen in persistent polyclonal B-cell lymphocytosis closely mimic splenic B-cell lymphoma. Diagn Pathol. 7, 107(2012).
  34. Vannan, A., et al. Spatial transcriptomics identifies molecular niche dysregulation associated with distal lung remodeling in pulmonary fibrosis. Nat Genet. 57 (3), 647-658 (2025).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Aging Mouse ModelsHistological AnalysisMolecular AnalysisAnatomical DissectionMorphological ChangesTissue HarvestingMicroscopic EvaluationAnimal Aging StudiesEthical Animal Use

Powiązane artykuły